專(zhuān)利名稱(chēng)：：靶向細(xì)胞致死腫脹毒素檢測(cè)屬于彎曲桿菌屬的細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)靶向彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌的細(xì)胞致死腫脹毒素用于檢測(cè)試樣中是否存在彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法。本發(fā)明還涉及豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis)的細(xì)胞致死腫脹毒素及編碼其的多核苷酸，以及通過(guò)靶向豚腸彎曲桿菌的細(xì)胞致死腫脹毒素用于檢測(cè)試樣中是否存在豚腸彎曲桿菌的方法。
背景技術(shù)：
：迄今已鑒定了17種彎曲桿菌屬菌種。通常采用培養(yǎng)試驗(yàn)來(lái)鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)。然而，由于某些菌種僅根據(jù)其生化性質(zhì)難以進(jìn)行鑒定，因此該試驗(yàn)需要復(fù)雜且大量的工作。并且，該細(xì)菌是微需氧的，并且，取決于菌種，某些細(xì)菌需要在不同的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。此外，包括分離和鑒定在內(nèi)的針對(duì)彎曲桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)試驗(yàn)通常費(fèi)時(shí)(710天)。由于彎曲桿菌感染率和患者數(shù)量都存在增加的趨勢(shì)(“各種病原體食物中毒暴發(fā)(Foodpoisoningoutbreakforeachcausativeagent)),13jibSi^JF發(fā)用于鑒定不同種類(lèi)彎曲桿菌屬細(xì)菌更簡(jiǎn)單快速的方法。根據(jù)生化性質(zhì)難以快速鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)，并且由于某些彎曲桿菌接近的相似性，因此根據(jù)它們的生化性質(zhì)常常無(wú)法對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。例如，空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“C.jejuni”)和大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli,以下簡(jiǎn)稱(chēng)“C.coli”)就存在這樣的問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兪歉鶕?jù)馬尿酸酶活性的存在來(lái)進(jìn)行區(qū)分的，在酶活力低時(shí)，空腸彎曲桿菌被錯(cuò)誤地鑒定為大腸彎曲桿菌。為此，在實(shí)際試驗(yàn)中業(yè)已使用PCR的方法來(lái)檢測(cè)馬尿酸酶基因的存在。近年來(lái)，常使用16SrRNA基因分析法在基因水平上進(jìn)行細(xì)菌種類(lèi)鑒定。然而，空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌彼此之間高度同源，因此通過(guò)16SrRNA基因分析經(jīng)常無(wú)法相互區(qū)分。迄今，空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌分別占由腹瀉患者分離的彎曲桿菌屬細(xì)菌的約94%和4%。也就是說(shuō)，這兩種細(xì)菌占彎曲桿菌屬細(xì)菌的大多數(shù)。因而，在大多數(shù)情況下，臨床實(shí)踐中對(duì)于彎曲桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)僅涵蓋被指定為食物中毒細(xì)菌的空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌。此外，主要針對(duì)空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌開(kāi)發(fā)了常用于該檢測(cè)的選擇培養(yǎng)基，以及培養(yǎng)通常在42°C下進(jìn)行。另一方面，因?yàn)檩^少對(duì)其他細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行分離，因此這種細(xì)菌分離方法并不適用于除空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌以外的其他菌種。特別是，由于屬于彎曲桿菌屬的菌種之間存在著抗生素敏感性或最佳培養(yǎng)溫度的差異，因此依賴(lài)所使用的選擇培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，有時(shí)無(wú)法分離得到除空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌以外的菌種。也就是說(shuō)，很難說(shuō)該檢測(cè)覆蓋了溫度敏感特性不同的胚胎彎曲桿菌(Campylobacterfetus,以下縮寫(xiě)為“C.fetus”)，或其他彎曲桿菌屬細(xì)菌。與此同時(shí)，除空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌以外的菌種同樣分布于寵物、家畜和野生動(dòng)物等的胃腸道內(nèi)，因此感染人類(lèi)的概率被認(rèn)為與空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌一樣高。2005年在大阪大規(guī)模暴發(fā)了由胚胎彎曲桿菌引起的食物中毒。感染胚胎彎曲桿菌不僅導(dǎo)致諸如腹瀉的胃腸炎，還引發(fā)其他嚴(yán)重的癥狀，例如人類(lèi)的敗血癥和腦膜炎。此外，感染胚胎彎曲桿菌可能導(dǎo)致動(dòng)物(如牛)的不育、流產(chǎn)等。除了空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌外，紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacterlari,以下縮寫(xiě)為“C.Iari")、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacterupsaliensis，以下縮寫(xiě)為“C.upsaliensis”)和豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis,以下縮寫(xiě)為“C.hyointestinalis”)這三種細(xì)菌也是導(dǎo)致人類(lèi)的腸炎、敗血癥等的動(dòng)物傳染病細(xì)菌。因此，對(duì)用于檢測(cè)除空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌以外的彎曲桿菌屬細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)是很重要的。本發(fā)明人根據(jù)CapeTown實(shí)驗(yàn)方案在不使用抗生素的情況下培養(yǎng)、分離并鑒定了彎曲桿菌屬細(xì)菌。結(jié)果顯示約1.3%的由彎曲桿菌屬細(xì)菌引起的腹瀉患者被感染了豚腸彎曲桿菌(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。豚腸彎曲桿菌作為豬增生性腸炎的病原菌被分離。此外，已不時(shí)從人腸炎患者中分離到豚腸彎曲桿菌，暗示其與人體病理有關(guān)。盡管如此，尚未建立用于豚腸彎曲桿菌的快速診斷方法。因此，盡管認(rèn)為除空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌之外的彎曲桿菌屬細(xì)菌感染人的潛在概率很高，但是沒(méi)有針對(duì)它們的合適的分離/培養(yǎng)檢測(cè)方法。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人關(guān)注并進(jìn)行了針對(duì)彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素(CDT)的學(xué)術(shù)研究(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2和3)，并且開(kāi)發(fā)了一種利用細(xì)胞致死腫脹毒素基因(cdtA、cdtB和cdtC)檢測(cè)彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。然而，該檢測(cè)方法僅用于空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和/或胚胎彎曲桿菌，而對(duì)于包括豚腸彎曲桿菌在內(nèi)的其他彎曲桿菌屬細(xì)菌則尚未開(kāi)發(fā)合適的檢測(cè)方法。與在此描述的本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)如下所示。[專(zhuān)利文獻(xiàn)1]W02005/054472[非專(zhuān)利文獻(xiàn)1]LastovicaAJ.等，Campylobacter，第2版，89-120(2000)[非專(zhuān)利文獻(xiàn)2]AsakuraM.等，MicrobialPathogenesis42(2007)174-183[非專(zhuān)利文獻(xiàn)3]YamasakiS.等，ToxinReviews,2561-88,200
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述情況完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供豚腸彎曲桿菌的細(xì)胞致死腫脹毒素(CDT)及編碼其的多核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用cdt基因檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的新方法。如上所述，盡管彎曲桿菌屬細(xì)菌的致病因子還未完全闡明，但是對(duì)于除空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌以外的彎曲桿菌屬菌種感染的快速診斷仍有需求。按照慣例，會(huì)使用基于其血清型的鑒定細(xì)菌種類(lèi)的PCR引物、檢測(cè)CDT產(chǎn)生的通用引物等(J.AppliedMicrobiol.，941003-1014(2003))。然而，這些方法需要富集培養(yǎng)步驟，致使無(wú)法實(shí)現(xiàn)彎曲桿菌屬細(xì)菌的快速檢測(cè)。豚腸彎曲桿菌作為豬增生性腸炎的病原菌被分離。此外，已不時(shí)從人腸炎患者中分離到豚腸彎曲桿菌，暗示其與人體病理有關(guān)。盡管已報(bào)道過(guò)可能的豚腸彎曲桿菌致病因子的類(lèi)細(xì)胞毒素活性，但是細(xì)節(jié)仍未澄清。其間，Johnson和Lior發(fā)現(xiàn)了在大腸桿菌(E.coli)中的一種名為CDT的新毒素(JohnsonWM,LiorH.1988.MicrobialPathogen4，115-126.)，并報(bào)道了空腸彎曲桿菌也產(chǎn)生⑶Τ。隨后，Pickett等確定了空腸彎曲桿菌cdt基因的完整的核苷酸序列(PickettCL，等，1996.InfectImmun，64，2070-2078.)，從而揭示了CDT的確切特性。此外，Pickett等報(bào)道了豚腸彎曲桿菌同樣產(chǎn)生具有CDT活性的毒素，并且使用簡(jiǎn)并引物可以從豚腸彎曲桿菌擴(kuò)增得到相應(yīng)于cdtB基因的PCR產(chǎn)物。然而，來(lái)自豚腸彎曲桿菌的細(xì)菌DNA并不與針對(duì)空腸彎曲桿菌cdtB基因的探針發(fā)生反應(yīng)，因此豚腸彎曲桿菌所產(chǎn)生的CDT的確切特性依然不明。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供屬于彎曲桿菌屬的豚腸彎曲桿菌的CDT(其核苷酸序列尚未闡明)和編碼該CDT的多核苷酸，以便通過(guò)基因擴(kuò)增能快速檢測(cè)彎曲桿菌屬細(xì)菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用cdt基因檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的新方法。此外，本發(fā)明提供了用于同時(shí)檢測(cè)包括豚腸彎曲桿菌在內(nèi)的彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物。本發(fā)明人關(guān)注于最近被認(rèn)為是彎曲桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的致病因子的細(xì)胞致死腫脹毒素(CDT)，并開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)靶向cdt基因以物種特異性方式檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的簡(jiǎn)單快速方法。CDT是一種全毒素，由CdtA、CdtB和CdtC三個(gè)亞基組成。CdtA和CdtC亞基涉及細(xì)胞結(jié)合，而CdtB亞基則具有DNA酶活性，并且是毒素發(fā)揮毒性的主要單元。本發(fā)明人目的在于通過(guò)檢測(cè)cdt基因來(lái)鑒定分離自泰國(guó)的一位腸炎患者的類(lèi)彎曲桿菌屬細(xì)菌的種類(lèi)，并開(kāi)發(fā)和利用一種能通過(guò)靶向cdtA、cdtB和cdtC基因從而特異性檢測(cè)空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的多重PCR方法，以及一種使用通用引物同時(shí)檢測(cè)三種菌種的cdtB基因的PCR方法。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一株菌株，其cdt基因不被特異性針對(duì)三種細(xì)菌的多重PCR方法所擴(kuò)增，但是其cdtB基因被通用引物所擴(kuò)增。通過(guò)16SrRNA基因分析鑒定了該菌株為豚腸彎曲桿菌。然后，通過(guò)cdtB基因的上下游基因組步移測(cè)定了豚腸彎曲桿菌cdt基因的完整的核苷酸序列。一般通過(guò)反向PCR測(cè)定與已知基因鄰接的未鑒定基因的序列。然而在本發(fā)明中，第一次通過(guò)進(jìn)行隨機(jī)引物延伸和基因組擴(kuò)增、并對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行測(cè)序的方法測(cè)定了cdt基因的完整的核苷酸序列。此外，將所測(cè)定的核苷酸序列以及推測(cè)的氨基酸序列與以前報(bào)道過(guò)的空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的CdtA、CdtB和CdtC的序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示豚腸彎曲桿菌的cdtA和cdtC基因與空腸彎曲桿菌的cdtA和cdtC基因最具同源性，同源性分別為51.7%和52.5%。豚腸彎曲桿菌的CdtB基因與大腸彎曲桿菌的CdtB基因最具同源性，同源性為64.1%。因此，該同源性并不是非常高的。同時(shí)，測(cè)定了推測(cè)的CdtA、CdtB和CdtC氨基酸序列的同源性。結(jié)果顯示豚腸彎曲桿菌的三種Cdt亞基具有與大腸彎曲桿菌的三種Cdt亞基最高的同源性。然而，沒(méi)有獲得高同源性，因?yàn)楦髯缘陌被嵝蛄型葱苑謩e為35.7%、60.5%和28.9%。本發(fā)明涉及通過(guò)擴(kuò)增豚腸彎曲桿菌cdt基因用于檢測(cè)彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法。具體而言，本發(fā)明提供以下內(nèi)容[1]一種編碼細(xì)胞致死腫脹毒素的多核苷酸，其為以下(a)-(h)的任何一種(a)編碼包含SEQIDNO2~4中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含核苷酸序列SEQIDNO:1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的多核苷酸；(c)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQIDNO:2_4的任一氨基酸序列中具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列SEQIDNO:1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的DNA雜交的多核苷酸；(e)編碼包含SEQIDNO:6_8中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(f)包含核苷酸序列SEQIDNO:5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的多核苷酸；(g)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQIDNO:6_8的任一氨基酸序列中具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；和(h)在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列SEQIDNO:5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的DNA雜交的多核苷酸；[2]一種包含[1]的多核苷酸的載體；[3]一種包含[1]的多核苷酸或[2]的載體的宿主細(xì)胞；[4]一種由[1]的多核苷酸編碼的多肽；[5]一種產(chǎn)生[4]的多肽的方法，包括培養(yǎng)[3]的宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中收集所產(chǎn)生的多肽的步驟；[6]一種結(jié)合[4]的多肽的抗體；[7][6]的抗體，其中該抗體具有中和細(xì)胞致死腫脹毒素的活性；[8]一種在試樣中同時(shí)檢測(cè)一種或更多種彎曲桿菌屬細(xì)菌存在的方法，其包括步驟(a)使用特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)的混合物對(duì)試樣進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(b)基于擴(kuò)增自編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的片段的存在或其分子量確定彎曲桿菌屬細(xì)菌的存在；[9][8]的方法，其中下列(i)-(iv)引物對(duì)中的任一種或更多種被用作引物對(duì)(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDN0:25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDNO19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDN0:19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:32禾口SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO33所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；以及(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。[10][9]的方法，其中還使用下列(v)-(vii)引物對(duì)作為引物對(duì)(ν)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:26和SEQIDNO:27，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:26和SEQIDN0:27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:28和SEQIDNO:29，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO:28和29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO30和SEQIDNO:31，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO30和31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；[11]一種用于[8]的方法的試劑盒，其包含操作指南和一種或更多種特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)的混合物；[12][11]的試劑盒，其包含作為引物對(duì)的下列(i)-(iv)引物對(duì)中的任一種或更多種(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDN0:25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDNO19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDN0:19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:32禾口SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO:33所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；以及(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；[13][12]的試劑盒，其進(jìn)一步包含下列(v)-(vii)引物對(duì)作為引物對(duì)(ν)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDΝ0:26和SEQIDNO:27，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDΝ0:26和SEQIDΝ0:27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:28禾口SEQIDNO:29，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO30和SEQIDNO:31，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO30和SEQIDNO31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；[14]一種用于檢測(cè)試樣中豚腸彎曲桿菌存在的方法，其包括步驟(a)將試樣與[6]的抗體接觸；(b)測(cè)定試樣和[6]的抗體之間的結(jié)合；以及(c)如果在(b)中檢測(cè)到結(jié)合則確定豚腸彎曲桿菌存在；[15]一種用于[14]的方法的試劑盒，其包括操作指南和[6]的抗體。圖1是顯示使用能擴(kuò)增空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌CdtB基因的通用引物，針對(duì)來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株和其他彎曲桿菌屬細(xì)菌的PCR結(jié)果的照片。圖2是顯示彎曲桿菌屬細(xì)菌的推測(cè)的CdtB氨基酸序列比對(duì)圖。加框的氨基酸殘基被認(rèn)為是DNA酶活性所必需的?！癈.hyo#”指豚腸彎曲桿菌。圖3是顯示重組豚腸彎曲桿菌CdtB和抗血清的制備的圖和照片。圖4是顯示抗HisCdtB抗血清的特異性的照片。圖4A是顯示通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)Ch-CdtB的照片。圖4B是顯示通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Ch-CdtB的照片。泳道1分子量標(biāo)記；泳道2:25ng的Ch-rCdtB；泳道310μ1來(lái)自豚腸彎曲桿菌(Ch022)的粗毒素溶液。圖4C是顯示在凝膠雙擴(kuò)散中Ch-rCdtB抗血清的特異性的照片。rCjB1μg空腸彎曲桿菌rCdtB；α-Cj10μ1rCjB抗血清；rChB1μg豚腸彎曲桿菌rCdtB；α-Ch10μ1rChB抗血清。圖5是顯示使用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增豚腸彎曲桿菌ATCC菌株cdt基因的圖和照片。圖5A是顯示cdt基因和簡(jiǎn)并引物的位置的圖。圖5B是顯示PCR結(jié)果的照片。圖6是顯示來(lái)自豚腸彎曲桿菌的粗毒素溶液作用于HeLa細(xì)胞48、72和120小時(shí)后的毒活性檢測(cè)結(jié)果的照片。圖7是顯示來(lái)自豚腸彎曲桿菌的粗毒素溶液作用于HeLa細(xì)胞的毒活性檢測(cè)結(jié)果的圖和照片。圖7A-C是顯示在添加粗毒素溶液和抗Ch-rCdtB血清48小時(shí)后的吉姆薩(Giemsa)染色和顯微鏡觀察(xlOO)的HeLa細(xì)胞照片。圖7D-F顯示了在48小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行的HeLa細(xì)胞中DNA含量的測(cè)定。A和D=PBS；B和E粗毒素溶液(是⑶50的四倍)；F和G粗毒素溶液(是⑶50的四倍)和抗Ch-rCdtB血清。圖8是顯示針對(duì)彎曲桿菌屬細(xì)菌CdtB基因的通用引物的位置的圖。圖9是顯示豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的cdtB基因的PCR結(jié)果的照片。圖10是顯示使用針對(duì)cdtB基因的通用引物的PCR結(jié)果的照片。圖11是顯示使用針對(duì)cdtB基因的通用引物的PCR結(jié)果的照片。圖12是顯示使用特異性引物檢測(cè)豚腸彎曲桿菌泰國(guó)人型cdtB基因的PCR結(jié)果的照片。圖13是顯示使用特異性引物檢測(cè)豚腸彎曲桿菌ATCC型cdtB基因的PCR結(jié)果的照片。圖14是顯示了使用通用引物檢測(cè)豚腸彎曲桿菌ATCC型cdtB基因和泰國(guó)人型cdtB基因的PCR結(jié)果的照片。圖15是顯示基于空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和豚腸彎曲桿菌cdt基因的多重PCR結(jié)果的照片。圖16是顯示基于空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌、豚腸彎曲桿菌、紅嘴鷗彎曲桿菌和烏普薩拉彎曲桿菌cdt基因的多重PCR結(jié)果的照片。圖17是顯示來(lái)自泰國(guó)人的Ch022(SEQIDNO5)和ATCC(SEQIDNO1)菌株的豚腸彎曲桿菌的cdtB基因比對(duì)以及引物位置的圖。具體實(shí)施例方式在此，短語(yǔ)“細(xì)胞致死腫脹毒素”(CDT或CLDT)指屬于蛋白質(zhì)A-B型全毒素組的毒性因子。細(xì)胞致死腫脹毒素具有由三個(gè)亞基A、B和C組成的亞基結(jié)構(gòu)。據(jù)信亞基B是毒素的活性中心部位，并且亞基A和B涉及細(xì)胞粘附。當(dāng)該毒素作用于細(xì)胞時(shí)，其導(dǎo)致細(xì)胞變形例如細(xì)胞膨脹，并最終引起細(xì)胞死亡。當(dāng)在實(shí)驗(yàn)中將產(chǎn)毒大腸桿菌所產(chǎn)生的不耐熱腸毒素(LT)等作用于細(xì)胞時(shí)，還觀察到細(xì)胞變形如細(xì)胞膨脹。然而，在移除該毒素后細(xì)胞恢復(fù)并存活。相反，即使在CDT被移除的情況下，細(xì)胞也不會(huì)恢復(fù)，而是被殺死。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指由多個(gè)由核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸組成的堿基或堿基對(duì)組成的聚合物。多核苷酸包括單鏈DNA和雙鏈DNA。多核苷酸在此可包括未修飾的、天然存在的多核苷酸以及修飾的多核苷酸。修飾的堿基的實(shí)例是三苯甲基化堿基和特殊堿基例如肌苷。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多肽”指由多個(gè)氨基酸組成的聚合物。因此，寡肽和蛋白也包括在多肽的概念內(nèi)。多肽包括未修飾的、天然存在的多肽和修飾的多肽。多肽修飾的實(shí)例包括乙?；?；酰化；ADP核糖基化；酰胺化；共價(jià)結(jié)合黃素；共價(jià)結(jié)合血紅素部分；共價(jià)結(jié)合核苷酸或核苷酸衍生物；共價(jià)結(jié)合脂類(lèi)或脂類(lèi)衍生物；共價(jià)結(jié)合磷脂酰肌醇；交聯(lián)；環(huán)化；二硫鍵形成；去甲基化；共價(jià)交聯(lián)鍵形成；胱氨酸形成；焦谷氨酸形成；甲?；?；g_羧化；糖基化；GPI-錨著點(diǎn)形成；羥基化；碘化；甲基化；肉豆蔻?；谎趸?；蛋白水解處理；磷酸化；異戊二烯化；外消旋化；硒化；硫酸化；蛋白中的轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸添加例如精氨?；环核鼗?。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離物”指將一種物質(zhì)(例如，多核苷酸或多肽)從其原始環(huán)境(例如，對(duì)于天然產(chǎn)物而言的天然環(huán)境)中移出并“人工地”改變其天然狀態(tài)?！胺蛛x的”化合物指包括那些存在于基本上富含目標(biāo)化合物的樣本中，和/或那些存在于其中該目標(biāo)化合物被部分或基本上純化的樣本中的化合物。在此，術(shù)語(yǔ)“基本上純化”指從天然環(huán)境中分離得到的化合物(例如，多核苷酸或多肽)，其中至少60%、優(yōu)選75%、最優(yōu)選90%的在自然界中與該化合物相關(guān)的其他組分不存在。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變”指對(duì)氨基酸序列的氨基酸的改變，或?qū)塑账嵝蛄兄袎A基的改變(即一個(gè)或更多個(gè)氨基酸或核苷酸的取代、缺失、添加或插入)。因此，當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變體”指其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被改變的氨基酸序列，或其中一個(gè)或更多個(gè)核苷酸被改變的核苷酸序列。突變體中核苷酸序列的改變可能改變由標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列，也可能不改變。突變體可以是天然存在的，例如等位突變體，或自然界中尚未鑒定的。突變體可被保守地改變，其中取代的氨基酸保留與原始的氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性。罕見(jiàn)地，突變體可以是非保守取代的。本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，例如DNASTAR軟件，可用于確定哪些或多少個(gè)氨基酸殘基被取代、插入或缺失，而不會(huì)抑制生物活性或免疫活性。“缺失”是一種對(duì)氨基酸序列或核苷酸序列的改變，其中與天然存在的細(xì)胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列相比，丟失了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸殘基“插入”或“添加”是一種對(duì)氨基酸序列或核苷酸序列的改變，其中與天然存在的細(xì)胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列相比，添加了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸殘基?！叭〈笔且环N對(duì)氨基酸序列或核苷酸序列的改變，其中與天然存在的細(xì)胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列相比，一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸殘基被改變?yōu)椴煌陌被釟埢蚝塑账釟埢?。?dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“雜交”指一種其中通過(guò)形成堿基對(duì)將一條核酸鏈結(jié)合至其互補(bǔ)鏈上的過(guò)程。在此，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”指定性和定量測(cè)定?！岸俊边€指半定量測(cè)定。<多核苷酸>本發(fā)明提供編碼豚腸彎曲桿菌的細(xì)胞致死腫脹毒素的多核苷酸。本發(fā)明人鑒定了編碼來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的豚腸彎曲桿菌菌株細(xì)胞致死腫脹毒素的多核苷酸的核苷酸序列，本發(fā)明中包括該多核苷酸，稱(chēng)為SEQIDNO:1。該多核苷酸編碼的三種多肽的氨基酸序列示于SEQIDNO:2-4。序列SEQIDNO:2、SEQIDNO3和SEQIDNO4分別為CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列。此外，本發(fā)明人鑒定了編碼臨床分離的豚腸彎曲桿菌菌株細(xì)胞致死腫脹毒素的多核苷酸的核苷酸序列，如SEQIDN0:5所示。該多核苷酸編碼的三種多肽的氨基酸序列示于SEQIDNO:6-8。序列SEQIDNO:6、SEQIDNO7和SEQIDNO8分別為CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸包括編碼含氨基酸序列SEQIDNO:2_4的多肽的多核苷酸；含核苷酸序列SEQIDNO1的任一編碼區(qū)，特別是核苷酸序列SEQIDNO=I中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位的任一核苷酸序列的多核苷酸；以及包含不同于核苷酸序列SEQIDNO:1，但由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而編碼包含氨基酸序列SEQIDNO:2_4的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括編碼含氨基酸序列SEQIDN0:6-8的多肽的多核苷酸；包含核苷酸序列SEQIDNO:5的任一編碼區(qū)，特別是核苷酸序列SEQIDNO:5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及包含不同于核苷酸序列SEQIDNO:5，但由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而編碼包含氨基酸序列SEQIDNO:6-8的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)一步包括編碼與上述多核苷酸編碼的多肽在功能上等價(jià)的多肽的多核苷酸，并具有與所述多核苷酸的完整序列具有至少40%或更高、優(yōu)選60%或更高、更優(yōu)選80%或更高、還更優(yōu)選90%或更高、仍更優(yōu)選95%或更高、再更優(yōu)選97%或更高(例如9899%)的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列同一性可例如通過(guò)使用Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87=2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873_5877，1993)確定?；谠撍惴ㄒ验_(kāi)發(fā)了稱(chēng)為BLASTN的程序(Altschul等J.Mol.Biol.215=403-410,1990)。當(dāng)通過(guò)BLASTN分析核苷酸序列時(shí)，參數(shù)設(shè)定示例如下得分=100；字長(zhǎng)=12。當(dāng)使用BLAST和間隙BLAST程序時(shí)，對(duì)于各個(gè)程序使用缺省參數(shù)。用于這些分析方法的特定技術(shù)是已知的(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov)。本發(fā)明的多核苷酸包括具有與上述多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法從天然來(lái)源例如細(xì)菌細(xì)胞中的基因組DNA得到。或者，多核苷酸可從來(lái)源于細(xì)菌細(xì)胞中mRNA的cDNA庫(kù)得到。多核苷酸還可采用商業(yè)化的已知技術(shù)合成得到。具有與本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1和SEQIDNO5)顯著同源的核苷酸序列的多核苷酸可以通過(guò)下述技術(shù)制備，例如使用雜交技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&Sons出版，第6.3-6.4τ)禾口基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&Sons出版，第6.1_6.4節(jié))。具體而言，基于本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1和SEQIDNO5)或其部分，可使用已知的雜交技術(shù)分離與該序列高度同源的DNA。或者，可使用基于本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1和SEQIDNO5)的部分設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)基因擴(kuò)增技術(shù)分離與多核苷酸序列高度同源的多核苷酸。因此，本發(fā)明包括在嚴(yán)格條件下與具有核苷酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:5的多核苷酸雜交的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的嚴(yán)格雜交條件。例如，可在含有25%甲酰胺(或50%甲酰胺，用于更嚴(yán)格條件)、4xSSC、50mMHepes(pH7.0)、IOxDenhardt氏溶液，和20μg/ml變性鮭魚(yú)精子DNA的雜交液中于42°C下過(guò)夜預(yù)雜交；然后添加標(biāo)記探針并在42°C下溫育過(guò)夜進(jìn)行雜交。雜交后的洗滌可在以下的洗滌溶液和溫度條件下進(jìn)行:"lxSSC,0.1%SDS，37°C，，等，對(duì)于更嚴(yán)格的條件，“0.5xSSC,0.1%SDS,42°C”等，或?qū)τ谶€更嚴(yán)格的條件，“0.2xSSC，0.SDS，65°C”。隨著如上所述雜交洗滌條件嚴(yán)格性的增加，預(yù)期分離出與探針序列具有更高同源性的DNA。然而，上述SSC、SDS和溫度條件的組合僅是示例性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)適當(dāng)?shù)亟M合上述或其他決定雜交嚴(yán)格性程度的因素，例如探針濃度和長(zhǎng)度、以及雜交反應(yīng)時(shí)間，來(lái)得到與上述相同的雜交嚴(yán)格性。還可通過(guò)向核苷酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:5引入突變的方法制備包括與本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸序列具有顯著同源的核苷酸序列的多核苷酸(例如，位點(diǎn)定向誘變(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，Johnffiley&Sons出版，第8.1-8.5節(jié)))。也可通過(guò)天然存在的突變獲得這樣的多核苷酸。本發(fā)明包括編碼具有其中由于這樣的核苷酸序列突變，從而在氨基酸序列SEQIDN0:2-4或SEQIDNO6-8中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸被用于制備本發(fā)明的多肽時(shí)，該多核苷酸單獨(dú)包括成熟多肽或其片段的編碼序列，或位于與其他編碼序列(例如，前導(dǎo)或分泌序列，前蛋白序列、原蛋白序列或前原蛋白序列，或編碼其他融合肽部分的序列)相同的閱讀框內(nèi)的成熟多肽或其片段的編碼序列。例如，可編碼便于融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，優(yōu)選的標(biāo)記序列的實(shí)例包括，例如六組氨酸肽或Myc標(biāo)簽，由pcDNA3.1/Myc-His載體(Invitrogen)提供并描述于Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:821_824中。多核苷酸還可以包括5’和3’非編碼序列，例如，被轉(zhuǎn)錄而未被翻譯的序列、剪切和多聚腺苷酸化信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及mRNA穩(wěn)定序列。〈多肽〉本發(fā)明提供了由本發(fā)明人所鑒定的豚腸彎曲桿菌的細(xì)胞致死腫脹毒素多肽。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明人所鑒定的多肽在功能上等價(jià)的多肽。在此，“功能上等價(jià)”指目標(biāo)多肽具有與本發(fā)明人所鑒定的多肽相當(dāng)?shù)募?xì)胞致死腫脹毒素特性。將突變引入蛋白的氨基酸序列是一種用于制備與本發(fā)明人所鑒定的多肽在功能上等價(jià)的多肽的方法。這樣的方法包括例如，位點(diǎn)定向誘變(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&Sons出版，第8.1-8.5節(jié))。多肽中氨基酸突變也可能天然發(fā)生。本發(fā)明包括無(wú)論是人工還是天然產(chǎn)生的突變蛋白，其包括經(jīng)本發(fā)明人所鑒定的氨基酸序列(例如，SEQIDN0:2-4和SEQIDN0:6_8)，其中通過(guò)取代、缺失、插入和/或添加改變一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基，但仍在功能上等價(jià)于本發(fā)明人所鑒定的多肽。從保留蛋白的功能的角度出發(fā)，用于取代的氨基酸殘基優(yōu)選具有與被取代的氨基酸殘基相似的性質(zhì)(保守取代)。例如，Ala、Val.Leu,lie、Pro,Met,Phe和Trp均歸類(lèi)于非極性氨基酸，并被認(rèn)為具有相似的性質(zhì)。另外，無(wú)電荷的氨基酸的實(shí)例是Gly、Ser,Thr,Cys.Tyr.Asn和Gin。此外，酸性氨基酸的實(shí)例是Asp和Glu，堿性氨基酸的實(shí)例是Lys、Arg和His。對(duì)于這些多肽的氨基酸突變的數(shù)量和位點(diǎn)而言，不存在限制，只要突變后的多肽保留原始多肽的功能即可。突變的數(shù)目一般低于總氨基酸殘基的10%，優(yōu)選低于5%，更優(yōu)選低于1%。其他用于制備功能上等價(jià)于本發(fā)明人所鑒定的多肽的方法包括利用雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)的方法。更具體地說(shuō)，基于編碼本發(fā)明人所鑒定的多肽(SEQIDN0:1和SEQIDNO5)的DNA序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)使用雜交技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&Sons出版，第6·3-6.4節(jié))從來(lái)自相同或不同物種的DNA樣本中分離高度同源的DNA，從而獲得功能上等價(jià)于本發(fā)明人所鑒定的多肽的多肽。因此，這樣的由可與編碼本發(fā)明人所鑒定的多肽的DNA雜交的DNA所編碼的、與本發(fā)明人所鑒定的多肽在功能上等價(jià)的多肽也包括在本發(fā)明的多肽之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的嚴(yán)格雜交條件來(lái)分離編碼與本發(fā)明人所鑒定的多肽在功能上等價(jià)的多肽的DNA。例如，可在含有25%甲酰胺(或50%甲酰胺，用于更嚴(yán)格條件)、4xSSC、50mMH印es(pH7.0)、IOxDenhardt氏溶液，和20μg/ml變性鮭魚(yú)精子DNA的雜交液中于42°C下過(guò)夜預(yù)雜交；然后添加標(biāo)記探針并在42°C下溫育過(guò)夜進(jìn)行雜交。雜交后的洗滌可在以下的洗滌溶液和溫度條件下進(jìn)行“l(fā)xSSC,0.1%SDS，37°C”等，對(duì)于更嚴(yán)格的條件"0.5xSSC,0.1%SDS，42°C，，等，或?qū)τ谶€更嚴(yán)格的條件"0.2xSSC,0.1%SDS,65°C”。隨著如上所述雜交洗滌條件嚴(yán)格性的增加，預(yù)期分離出與探針序列具有更高同源性的DNA。然而，上述SSC、SDS和溫度條件的組合僅是示例性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)適當(dāng)?shù)亟M合上述或其他決定雜交嚴(yán)格性程度的因素(例如探針濃度、探針長(zhǎng)度、雜交反應(yīng)時(shí)間等)來(lái)得到與上述相同的雜交嚴(yán)格性。使用這樣的雜交技術(shù)分離的DNA編碼的多肽通常具有與本發(fā)明人所鑒定的多肽高度同源的氨基酸序列。在此，高度同源指至少40%或更多、優(yōu)選60%或更多、更優(yōu)選80%或更多、還更優(yōu)選90%或更多、仍更優(yōu)選至少95%或更多、以及再更優(yōu)選至少97%或更多(例如98%99%)的序列同一性。例如可使用Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993))測(cè)定氨基酸序列的同源性?；谠撍惴ǎ呀?jīng)開(kāi)發(fā)了稱(chēng)為BLASTX的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403_410(1990))。當(dāng)使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)設(shè)定例如得分=50和字長(zhǎng)=3。當(dāng)使用BLAST和間隙BLAST程序時(shí)，使用各個(gè)程序的缺省參數(shù)。用于這些分析方法的特定技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的?；诒环蛛x作為與編碼本發(fā)明人所分離的多肽的DNA序列高度同源的DNA的DNA片段，可使用基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&SonsSection出版，第6.1-6.4節(jié))來(lái)獲得與本發(fā)明人所分離的多肽在功能上等價(jià)的多肽?？苫诰幋a本發(fā)明人所鑒定的多肽(SEQIDNO:1和SEQIDNO5)的DNA序列的一部分設(shè)計(jì)引物，從而實(shí)現(xiàn)上述結(jié)果。〈多肽片段〉本發(fā)明還提供了本發(fā)明多肽的片段。這些片段是具有與上述本發(fā)明的多肽部分相同、而不是完全相同的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多肽片段通常包括8個(gè)氨基酸殘基或更多，優(yōu)選12個(gè)氨基酸殘基或更多(例如，15個(gè)氨基酸殘基或更多)。優(yōu)選的片段的實(shí)例包括截短的多肽，例如缺少一組包括氨基端或羧基端的氨基酸殘基的氨基酸序列，或缺少兩組氨基酸殘基的氨基酸序列，其中一組包括氨基端，另一組包括羧基端。此外，還優(yōu)選特征在于結(jié)構(gòu)或功能特性的片段，包括那些具有α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、β-折疊和β-折疊形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)、卷曲和卷曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α-兩親區(qū)、β-兩親區(qū)、可變區(qū)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)以及高抗原性指數(shù)區(qū)的片段。還優(yōu)選生物活性片段。生物活性片段介導(dǎo)本發(fā)明多肽的活性，并包括那些具有相似或改善的活性，或降低的不希望的活性的片段。例如，包括在動(dòng)物、尤其是人中具有抗原性或免疫原性的片段。這些多肽片段優(yōu)選保留本發(fā)明多肽的生物活性，例如抗原性。特定序列或片段的突變體同樣構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。優(yōu)選的突變體是那些由于用保守氨基酸進(jìn)行取代而不同于目標(biāo)多肽的突變體，即其中的一個(gè)殘基被性質(zhì)相似的其他殘基所取代的那些突變體。典型的取代是那些在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間，在Asn和Gln之間；在堿性殘基Lys和Arg之間；或在芳香族殘基Phe和Tyr之間的取代。〈多肽的制備〉本發(fā)明的多肽可通過(guò)任何一種合適的方法制備。這樣的多肽包括分離的天然存在的多肽，和通過(guò)基因重組、合成或其組合所制備的多肽。這些多肽的制備方法是本領(lǐng)域熟知的。例如可通過(guò)將插入有本發(fā)明的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)移至合適的宿主細(xì)胞中，并純化在所得到的轉(zhuǎn)化體中表達(dá)的多肽，從而制備重組多肽。另一方面，可使用例如固定有針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體(下文中有描述)的親和柱制備天然存在的多肽(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯(1987)，JohnWiley&Sons出版，第16.1-16.19節(jié))。用于親和純化的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明的多肽還可通過(guò)體外翻譯方法(例如，參見(jiàn)"OnthefidelityofmRNAtranslationinthenuclease-treatedrabbitreticulocytelysatesystem.”Dasso,Μ.C.禾口Jackson,R.J.(1989)NAR17:3129-3144)等進(jìn)行制備?？赏ㄟ^(guò)例如使用合適的肽酶切割本發(fā)明的多肽來(lái)制備本發(fā)明的多肽片段。〈探針和引物〉本發(fā)明提供具有至少15個(gè)核苷酸或20個(gè)核苷酸的鏈長(zhǎng)度的多核苷酸，例如，具有15100個(gè)核苷酸、20100個(gè)核苷酸、1535個(gè)核苷酸或2035個(gè)核苷酸的鏈長(zhǎng)度的多核苷酸，其與本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸互補(bǔ)(例如，具有核苷酸序列SEQIDNO1的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，和具有核苷酸序列SEQIDNO:5的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈)。在此，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)鏈”定義為由A:T(對(duì)于RNA為A:U)和G:C堿基對(duì)組成的雙鏈核酸的另一條鏈。另外，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”不僅包含與一段至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的連續(xù)區(qū)完全匹配，還包含在該區(qū)內(nèi)的至少70%、優(yōu)選至少80%、更加優(yōu)選90%和最優(yōu)選95%或更高的同源性?？墒褂帽疚拿枋龅乃惴ù_定同源性。用于檢測(cè)或擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸的探針和引物包括于這些多核苷酸中。典型的用作引物的多核苷酸長(zhǎng)度為15100個(gè)核苷酸，優(yōu)選1535個(gè)核苷酸?；蛘?，用作探針的多核苷酸長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸。它們包括本發(fā)明的DNA的至少一部分或完整的序列。當(dāng)使用本發(fā)明的核苷酸作為引物時(shí)，對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)并沒(méi)有特別限制，只要能獲得期望的擴(kuò)增產(chǎn)物即可。例如，反應(yīng)可以選自DNA擴(kuò)增反應(yīng)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及RNA擴(kuò)增反應(yīng)，如NASBA。優(yōu)選的方法是PCR。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的核苷酸是那些特異于編碼本發(fā)明多肽的DNA的核苷酸。術(shù)語(yǔ)“特異于”指在常規(guī)雜交條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下，與編碼某一多肽的DNA而非編碼其他多肽的DNA雜交。用于擴(kuò)增本發(fā)明人所鑒定的多核苷酸的一部分的引物的具體實(shí)例包括下列引物(i)和(ii)，其描述于本文的實(shí)施例中。(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDN0:25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；和(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDNO19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDN0:19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。如上所述，適用于本發(fā)明引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)并無(wú)特別限制，只要能夠產(chǎn)生期望的擴(kuò)增產(chǎn)物即可。例如，該反應(yīng)可以選自DNA擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、ICAN、LAMP,SDA和LCR，以及RNA擴(kuò)增反應(yīng)，如NASBA。優(yōu)選的方法是PCR?；谏鲜鲆?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)適合用于實(shí)施的核酸擴(kuò)增方法的突變引物。這樣的突變引物可合成制備。通過(guò)使用突變引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)并分析擴(kuò)增產(chǎn)物，可很容易地評(píng)估突變引物是否能擴(kuò)增與原始引物相同的基因組DNA區(qū)。這些弓I物可優(yōu)選地用于檢測(cè)試樣中豚腸彎曲桿菌的存在。<載體、宿主細(xì)胞和多肽的制備>本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)攜帶本發(fā)明的多核苷酸的載體、保留本發(fā)明的多核苷酸或所述載體的宿主細(xì)胞的方法以及利用所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明的載體沒(méi)有限制，只要插入載體的DNA能夠穩(wěn)定保留即可。例如，當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主時(shí)，PBluescript載體(Stratagene)是優(yōu)選的克隆載體。當(dāng)使用載體來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽時(shí)，表達(dá)載體是特別有用的。這些表達(dá)載體并無(wú)特別限制，只要它們?cè)隗w夕卜、在大腸桿菌中、在培養(yǎng)的細(xì)胞中或在體內(nèi)表達(dá)多肽即可。然而，優(yōu)選的實(shí)例包括用于體外表達(dá)的PBEST載體(ProMega)、用于在大腸桿菌中表達(dá)的pET載體(Invitrogen)、用于在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)的PME18S-FL3載體(GenBank編號(hào)AB009864)、以及用于體外表達(dá)的PME18S載體(Mol.CellBiol.8=466-472(1988))等。本發(fā)明的DNA可通過(guò)常規(guī)方法插入載體中，例如，通過(guò)使用限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的連接酶反應(yīng)(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯，(1987)，JohnWiley&Sons出版，第11.4-11.11節(jié))。本發(fā)明的載體被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞沒(méi)有特別限制，可根據(jù)本發(fā)明的目的使用不同的宿主細(xì)胞。例如，細(xì)菌細(xì)胞(例如鏈球菌屬(Str印tococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、真菌細(xì)胞(例如酵母、曲霉菌屬(Aspergillus))、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如果蠅S2、草地夜蛾SF9)、動(dòng)物細(xì)胞(例如CH0、C0S、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞是用于表達(dá)多肽的細(xì)胞的實(shí)例。可通過(guò)常規(guī)方法將載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，例如磷酸鈣沉淀法、電穿孔法(CurrentprotocolsinMolecularBiology，Ausubel等編輯，(1987)JohnWiley&Sons出版，第9.1-9.9節(jié))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺法(GIBCO-BRL)、微注射法等。在宿主細(xì)胞中，可以將合適的分泌信號(hào)整合入目標(biāo)多肽中，以便利于表達(dá)的多肽分泌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞周?chē)臻g或胞外環(huán)境中。這些信號(hào)可以是內(nèi)源信號(hào)或來(lái)自與目標(biāo)多肽不同物種的信號(hào)。當(dāng)將本發(fā)明的多肽分泌入培養(yǎng)基時(shí)，收集該培養(yǎng)基以收集本發(fā)明的多肽。當(dāng)本發(fā)明的多肽于胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，先裂解細(xì)胞，然后收集多肽。為了從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中收集和純化本發(fā)明的多肽，可使用本領(lǐng)域已知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析?！纯贵w〉本發(fā)明提供了結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。在此，術(shù)語(yǔ)“抗體”指多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體和包括Fab或其他的免疫球蛋白表達(dá)庫(kù)產(chǎn)物在內(nèi)的Fab片段。本發(fā)明的多肽、其片段和衍生物以及表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原用于產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。這樣的抗體優(yōu)選對(duì)本發(fā)明的多肽有免疫特異性?！懊庖咛禺愋浴敝概c其他多肽相比，抗體對(duì)本發(fā)明多肽具有實(shí)質(zhì)上更高的親和力。另外，更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體包括具有中和豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素活性的抗體?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。例如，可通過(guò)將本發(fā)明的多肽或其GST-融合蛋白注射到小動(dòng)物如兔以獲得血清從而得到多克隆抗體。通過(guò)硫酸銨沉淀；蛋白A或蛋白G柱；DEAE離子交換層析；偶聯(lián)有本發(fā)明多肽的親和柱等純化血清，從而制備多克隆抗體。另一方面，可通過(guò)例如下列方法制備單克隆抗體將本發(fā)明的多肽注射到小動(dòng)物如小鼠，然后將其脾臟切除并碾碎以分離細(xì)胞。接著使用諸如聚乙二醇的試劑將細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，并從這些融合的細(xì)胞(雜交瘤)中篩選得到能夠產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的克隆。然后將所得到的雜交瘤移植到小鼠腹腔中，并收集小鼠腹水?？赏ㄟ^(guò)使用例如硫酸銨沉淀；蛋白A或蛋白G柱；DEAE離子交換層析；偶聯(lián)有本發(fā)明多肽的親和柱等純化腹水來(lái)制備單克隆抗體。本發(fā)明的抗體還可用于檢測(cè)和純化試樣中的本發(fā)明的多肽。<試樣中彎曲桿菌屬細(xì)菌的存在的檢測(cè)>本發(fā)明提供了用于檢測(cè)試樣中彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法。試樣中彎曲桿菌屬細(xì)菌的存在的檢測(cè)可用于多種目的，例如診斷彎曲桿菌感染、快速檢測(cè)被豚腸彎曲桿菌污染的食物、食品加工各步驟的驗(yàn)證、以及鑒定造成食物中毒暴發(fā)的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)方法是一種用于檢測(cè)試樣中一種或更多種彎曲桿菌屬細(xì)菌存在的方法，其包括步驟(a)使用特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)的混合物對(duì)試樣進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(b)基于擴(kuò)增自編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的片段的存在或分子量確定彎曲桿菌屬細(xì)菌的存在。在本發(fā)明中，“特異于基因組DNA的引物”不限于特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA區(qū)域的引物，還包括特異于相應(yīng)于基因組DNA區(qū)域的mRNA區(qū)的引物?？赏ㄟ^(guò)上述方法制備與編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸引物。結(jié)合序列片段的引物沒(méi)有特別限制；然而，其可被設(shè)計(jì)為具有合適的限制酶切位點(diǎn)，容許在PCR擴(kuò)增后用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)引物片段進(jìn)行切割。對(duì)于結(jié)合序列片段的引物長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，其長(zhǎng)度為約2050個(gè)核苷酸，優(yōu)選約2030個(gè)核苷酸。此外，可在5’端用放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記等對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，使得在PCR擴(kuò)增后可通過(guò)電泳等分離單鏈DNA?；蛘撸瑸橹苽銻NA分子，5’端引物可被設(shè)計(jì)為具有合適的啟動(dòng)子，例如，T7啟動(dòng)子序列，以允許DNA分子轉(zhuǎn)錄為RNA分子。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括通過(guò)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法來(lái)鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)的步驟。在PCR-RFLP法中，使用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR-擴(kuò)增的DNA，然后基于所產(chǎn)生片段的長(zhǎng)度檢測(cè)多態(tài)性。在本發(fā)明中待檢測(cè)的彎曲桿菌屬細(xì)菌的cdt基因序列隨著細(xì)菌種類(lèi)的不同而發(fā)生變化。因此，PCR-RFLP法可用于鑒定細(xì)菌種類(lèi)。在該步驟中，首先通過(guò)序列比對(duì)確定依細(xì)菌種類(lèi)不同而具有不同序列的位點(diǎn)(多態(tài)性位點(diǎn))，然后選擇識(shí)別任一細(xì)菌種類(lèi)中的多態(tài)性位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶。如果這樣的限制性?xún)?nèi)切酶已經(jīng)存在，則可通過(guò)進(jìn)行靶向cdt基因的PCR、用限制性?xún)?nèi)切酶消化所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物、并通過(guò)電泳比較片段長(zhǎng)度來(lái)確定包含多種彎曲桿菌屬菌種的樣本中具有多態(tài)性位點(diǎn)的菌種是否存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)將已知的彎曲桿菌屬細(xì)菌cdt基因與本發(fā)明提供的豚腸彎曲桿菌cdt基因進(jìn)行比較，并選擇合適的識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)鑒定具有不同序列的位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了優(yōu)選用于多態(tài)性檢測(cè)方法的引物，該多態(tài)性檢測(cè)方法基于獲得自用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化通過(guò)包括PCR-RFLP在內(nèi)的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的DNA的片段的長(zhǎng)度。本發(fā)明中的一個(gè)應(yīng)用PCR-RFLP法的實(shí)例是通過(guò)包含SEQIDNO18和SEQIDNO19序列的引物對(duì)(用于本文實(shí)施例中的引物cdtB通用U和cdtB通用R)擴(kuò)增片段，并單獨(dú)使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、XbaI、HindIII或Sau3AI或它們的組合來(lái)消化該片段；并可通過(guò)電泳來(lái)鑒定細(xì)菌種類(lèi)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的檢測(cè)方法包括例如，用于同時(shí)檢測(cè)試樣中一種或更多種彎曲桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)存在的方法，其包括使用下述任一種或更多種特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)胞致死腫脹毒素的DNA的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行試樣核酸擴(kuò)增反應(yīng)的步驟"(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO24和SEQIDNO25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，“(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO18和SEQIDNO:19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO18和SEQIDNO19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，"(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO33所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”；和“(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”。上述方法是通過(guò)擴(kuò)增特異于豚腸彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌和紅嘴鷗彎曲桿菌cdtB的基因組DNA或mRNA的區(qū)域來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的方法。用于上述方法的引物包括例如，用于豚腸彎曲桿菌的“包含序列SEQIDNO24和SEQIDNO25的引物對(duì)(用于本文實(shí)施例中的引物:ChspBU7和ChspBR7)”和“包含序列SEQIDNO:18和SEQIDNO19的引物對(duì)(用于本文實(shí)施例中的引物cdtB通用U和cdtB通用R)”，不限于此。可使用任何其他序列，只要它們是包含兩條能特異性結(jié)合豚腸彎曲桿菌cdtB基因組DNA或mRNA的多核苷酸，并擴(kuò)增使用豚腸彎曲桿菌cdtB基因組DNA為模板以及“包含序歹IjSEQIDNO24和SEQIDNO25的引物對(duì)”或“包含序列SEQIDNO18禾口SEQIDNO:19的引物對(duì)”所擴(kuò)增的區(qū)域或相應(yīng)的mRNA區(qū)域的引物對(duì)即可。在此，“特異性結(jié)合”指從“結(jié)合”中排除了偶發(fā)的或非特異性的結(jié)合。圖17顯示了上述用于檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的引物所結(jié)合的cdtB基因的位點(diǎn)?；蛘?，關(guān)于烏普薩拉彎曲桿菌，代表性的引物包括“包含序列SEQIDN0:32和SEQIDNO33的引物對(duì)(用于本文實(shí)施例中的引物CupspBU3和CupspBR4)”，但不限于這些序列?？墒褂萌魏纹渌蛄?，只要它們是能擴(kuò)增使用胚胎彎曲桿菌cdtB基因組DNA為模板以及“包含序列SEQIDN0:32和SEQIDNO:33的引物對(duì)”所擴(kuò)增的區(qū)域或相應(yīng)的mRNA區(qū)域的引物對(duì)即可。此外，關(guān)于胚胎彎曲桿菌，代表性的引物包括“包含序列SEQIDNO34和SEQIDNO35的引物對(duì)(用于本文實(shí)施例中的引物ClaspBU4和ClaspBR4)”，但不限于這些序列?？墒褂萌魏纹渌蛄?，只要它們是能擴(kuò)增使用胚胎彎曲桿菌cdtB基因組DNA為模板以及“包含序列SEQIDNO34和SEQIDNO35的引物對(duì)”所擴(kuò)增的區(qū)域或相應(yīng)的mRNA區(qū)域的引物對(duì)即可。在本發(fā)明的方法中，上述引物對(duì)(i)-(iv)可獨(dú)立使用?；蛘撸梢栽趩未魏怂釘U(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)使用多個(gè)引物對(duì)。其中在單次反應(yīng)(例如本文實(shí)施例中)使用多個(gè)PCR引物的PCR方法稱(chēng)為“多重PCR”。因此，可通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并檢測(cè)條帶大小來(lái)鑒定不同的菌種。本發(fā)明提供了通過(guò)核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法，代表性地包括上述使用優(yōu)選用于擴(kuò)增不同核酸區(qū)域的引物及其組合的多重PCR。在本發(fā)明中，對(duì)核酸擴(kuò)增方法的類(lèi)型沒(méi)有限制，只要其產(chǎn)生目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物即可。有可能選擇任何類(lèi)型的已知核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法(包括RT-PCR法)、ICAN法、LAMP法、SDA法、LCR法和NASBA法。PCR法是優(yōu)選用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的具體實(shí)例。本發(fā)明的方法可通過(guò)實(shí)時(shí)PCR等方法作為一種定量方法使用。在本發(fā)明的方法中，可使用上述引物對(duì)(i)-(iv)并結(jié)合以下引物對(duì)進(jìn)行單次核酸擴(kuò)增反應(yīng)“(ν)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO:27(用于本文實(shí)施例中的引物:Cj_CdtBU5和Cj_CdtBR6)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，“(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO:29(用于本文實(shí)施例中的引物:Cc_CdtBU5和Cc_CdtBR5)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，和“(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31(用于本文實(shí)施例中的引物Cf-CdtBTO和Cf_CdtBR3)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”。具體而言，本發(fā)明提供了在試樣中能同時(shí)檢測(cè)六種彎曲桿菌屬細(xì)菌豚腸彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌、紅嘴鷗彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌的方法。本發(fā)明人證實(shí)了可使用上述引物組合的核酸擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)上述6種彎曲桿菌屬細(xì)菌。如在本文實(shí)施例中所證實(shí)的，本發(fā)明的方法具有非常高的特異性，因?yàn)槠淠軝z測(cè)目標(biāo)彎曲桿菌屬細(xì)菌而不會(huì)錯(cuò)誤地測(cè)得其他種類(lèi)的彎曲桿菌屬細(xì)菌。在上述使用特異于六種彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的步驟之后，本發(fā)明的方法還包括“基于擴(kuò)增自彎曲桿菌屬cdt基因組DNA或mRNA的片段的存在或分子量確定彎曲桿菌屬細(xì)菌存在的步驟”或“對(duì)擴(kuò)增自彎曲桿菌屬cdt基因組DNA或mRNA的片段的數(shù)量定量的步驟”。本發(fā)明提供了用于本發(fā)明檢測(cè)方法的試劑盒。除引物對(duì)之外該試劑盒還包括操作指南。該試劑盒可進(jìn)一步包括其他材料，例如熒光探針、嵌入劑、用于制備多核苷酸的試劑和陽(yáng)性或陰性引物對(duì)。本發(fā)明的試劑盒的第一個(gè)實(shí)施方案包括包含至少一種下列引物對(duì)的試劑盒"(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:24禾口SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO24禾口SEQIDNO25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，“(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO18和SEQIDNO:19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO18和SEQIDNO19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，"(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO33所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”；和“(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”?；蛘?，上述試劑盒可進(jìn)一步包含“(ν)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO:27(用于本文實(shí)施例中的引物:Cj_CdtBU5和Cj_CdtBR6)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，“(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO:29(用于本文實(shí)施例中的引物:Cc_CdtBU5和Cc_CdtBR5)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”，和“(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31(用于本文實(shí)施例中的引物Cf-CdtBTO和Cf_CdtBR3)，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)”。因此，單獨(dú)特異于六種細(xì)菌豚腸彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌、紅嘴鷗彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌中每一種的引物均包含于本發(fā)明的試劑盒中，使得通過(guò)多重PCR等對(duì)上述彎曲桿菌屬細(xì)菌的混合感染的同時(shí)檢測(cè)成為可能。本發(fā)明檢測(cè)方法的另一實(shí)施方案包括用于檢測(cè)試樣中豚腸彎曲桿菌存在的方法，其包括步驟(a)將試樣與結(jié)合到本發(fā)明多肽的抗體接觸；(b)測(cè)定試樣和結(jié)合到本發(fā)明多肽的抗體之間的結(jié)合；以及(c)如果在(b)步驟中檢測(cè)到結(jié)合則確定豚腸彎曲桿菌存在。該檢測(cè)方法可使用通過(guò)上述方法制備的抗體。用于測(cè)定試樣和結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體之間的結(jié)合的方法包括下述方法蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和免疫熒光測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)使用這些方法檢測(cè)試樣中的豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素來(lái)檢測(cè)試樣中豚腸彎曲桿菌的存在。此外，可將上述抗體與其他材料相組合并裝入試劑盒以用于本發(fā)明的檢測(cè)方法。除了上述抗體和檢測(cè)試劑外，這樣的試劑盒還可包括蒸餾水、鹽、緩沖液、蛋白穩(wěn)定劑、防腐劑等。或者，為制備ELISA試劑，可將抗體與用于檢測(cè)酶標(biāo)記的顯色底物和用于洗滌固相的洗滌液相組合。此外，試劑盒中可附加描述測(cè)定程序的操作指南。所有在此引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均引入本說(shuō)明書(shū)中作為參考。實(shí)施例在下文，用實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述；然而，其不應(yīng)當(dāng)被視為限制。[實(shí)施例1]來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株的cdt基因的測(cè)序通過(guò)常規(guī)方法從Ch022株分離基因組基因。對(duì)IOOng分離的Ch022基因組基因進(jìn)行PCR，使用了ExTaqPCR試劑盒(TaKaRa)和能夠擴(kuò)增空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌cdtB基因的通用引物(圖1)。每種引物的濃度為0.5μM。將引物與5μ1IOxExTaq緩沖液、4μ1dNTPs和1.25UExTaq混合。用無(wú)菌水將體積調(diào)節(jié)至50μ1。對(duì)PCR混合物進(jìn)行由下述程序組成的PCR30個(gè)940C30秒、50°C30秒和72°C30秒的循環(huán)。在2%瓊脂糖凝膠上對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并用溴乙啶染色。脫色后，在紫外線下觀察擴(kuò)增條帶(圖1)。通過(guò)常規(guī)方法純化所得到的特異性擴(kuò)增的720-bp條帶，并使用通用引物進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)操作指南，使用BigDye終止子試劑盒1.1版(AppliedBiosystems)進(jìn)行測(cè)序?；谒鶞y(cè)定的序列設(shè)計(jì)基因組步移引物。通過(guò)多輪上游和下游基因組步移測(cè)定了覆蓋Cdt基因(SEQIDNO5)的4，069bp的全長(zhǎng)基因序列。此外，發(fā)現(xiàn)豚腸彎曲桿菌Ch022株的cdtA、cdtB和cdtC基因的ORF長(zhǎng)度分別為798bp(266aa；SEQIDNO:6)、804bp(268aa；SEQIDNO7)和537bp(178aa;SEQIDNO:8)。將這些序列與空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌cdtA、cdtB和cdtC基因的核苷酸序列進(jìn)行比較。豚腸彎曲桿菌cdtA和cdtC基因具有與空腸彎曲桿菌cdtA和cdtC基因最高的同源性，而豚腸彎曲桿菌CdtB基因則具有與大腸彎曲桿菌CdtB基因最高的同源性(表1)。同時(shí)，對(duì)推測(cè)的氨基酸序列CdtA、CdtB和CdtC的同源性比較揭示了豚腸彎曲桿菌的三個(gè)亞基顯示與大腸彎曲桿菌的Cdt亞基具有最高的同源性。對(duì)于CdtA、CdtB和CdtC,同源性分別為35.7%、60.5%和28.9%(表1)。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>豚腸彎曲桿菌Cdt基因的插入位置與空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的不同。在cdtA基因的下游發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與螺桿菌(Helicobacter)糖基轉(zhuǎn)移酶同源性為53.6%(128aa/239aa)的0RF。同時(shí)，在cdtC基因的下游發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與脫氮硫桿菌(T.denitrificans)糖轉(zhuǎn)移酶同源性為56.0%(155aa/277aa)的0RF。此外，豚腸彎曲桿菌CdtB推測(cè)的氨基酸序列具有已報(bào)道為其他種類(lèi)的細(xì)菌所產(chǎn)生的CdtB的DNA酶活性所必需的保守的氨基酸殘基(YamasakiS，等，2006.ToxinRev,25,61-88.)(圖2)。[實(shí)施例2]來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株的重組CdtB蛋白(Ch_rCdtB)的制備通過(guò)PCR擴(kuò)增其中已除去被預(yù)測(cè)為CdtB信號(hào)序列的CdtB的氨基酸1_17的來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株的cdtB基因，并克隆入pET-28(a)質(zhì)粒載體中，以獲得pWSY-2-一種來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株cdtB基因的重組克隆。用pWSY-2轉(zhuǎn)化用于重組蛋白表達(dá)的大腸桿菌BL-21(DE3)(Novagen)。在含有20μg/ml卡那霉素的600mlLB肉湯中大量培養(yǎng)所得到的克隆，然后用0.5mMIPTG在37°C下誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)重組蛋白(Ch-rCdtB)。將表達(dá)Ch_rCdtB的大腸桿菌進(jìn)行超聲破碎。使用鎳螯合的S印harose(GEHealthcare)來(lái)親和純化蛋白，并通過(guò)Superdex75(GEHealthcare)凝膠過(guò)濾進(jìn)行進(jìn)一步純化(圖3)。[實(shí)施例3]來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株的CdtB抗體的制備將250μg純化的Ch-rCdtB與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行混合。將所得到的乳液以皮下和肌內(nèi)注射到兔體內(nèi)(kbs:NZW)。然后，在第一次注射后四周開(kāi)始，以?xún)芍荛g隔持續(xù)約八周使用包含250μg的純化的Ch-rCdtB和等體積的弗氏不完全佐劑的乳液對(duì)兔共進(jìn)行五次免疫。從而制備得到抗血清，然后通過(guò)凝膠雙擴(kuò)散法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)其效價(jià)和特異性(圖4)。通過(guò)凝膠雙擴(kuò)散法估計(jì)抗Ch-rCdtB抗血清的效價(jià)為164。同時(shí)，抗體和空腸彎曲桿菌rCdtB之間不存在沉淀線。因而，其揭示了豚腸彎曲桿菌CdtB在免疫學(xué)上不同于空腸彎曲桿菌CdtB(圖4C)。使用純化的Ch-rCdtB和來(lái)自豚腸彎曲桿菌Ch022株的粗毒素溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。抗體與相應(yīng)于純化的Ch-rCdtB(分子量約30kD)和來(lái)自豚腸彎曲桿菌Ch022株粗毒素溶液的CdtB的條帶特異性反應(yīng)。因此，其暗示所制備的針對(duì)Ch-rCdtB的抗體的特異性是非常高的(圖4B)。[實(shí)施例4]豚腸彎曲桿菌ATCC35217的cdt基因的測(cè)序通過(guò)常規(guī)方法從豚腸彎曲桿菌ATCC35217株分離基因組基因。使用了簡(jiǎn)并引物(GNW和麗I)和ExTaqPCR試劑盒(TaKaRa)，對(duì)IOOng分離的豚腸彎曲桿菌ATCC35217基因組基因進(jìn)行PCR(圖5)。每種引物的濃度為0.5μM。將引物與5μIlOxExTaq緩沖液、4μ1dNTPs和1.25UExTaq混合。用無(wú)菌水將體積調(diào)節(jié)至50μ1。對(duì)PCR混合物進(jìn)行由下述程序組成的PCR30個(gè)94°C30秒、42°C30秒和72°C60秒的循環(huán)。在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物，并用溴乙啶染色。脫色后，在紫外線下觀察擴(kuò)增條帶(圖5)。使用常規(guī)方法純化所得到的特異性擴(kuò)增的960-bp條帶，并克隆到pT7Blue質(zhì)粒載體(Novagen)中以獲得PChATcdtA-B4。使用與該質(zhì)粒雜交的M13引物對(duì)所得到的PChATcdtA-B4質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)操作指南，使用BigDye終止子試劑盒1.1版(AppliedBiosystems)貝Ij·。通過(guò)BLAST對(duì)所測(cè)定的序列進(jìn)行同源性搜索。顯示該序列與cdtA和cdtB基因的一部分具有同源性?；谒鶞y(cè)定的序列設(shè)計(jì)基因組步移引物。通過(guò)多輪上游和下游基因組步移測(cè)定覆蓋了cdt基因(SEQIDNO1)的3，399bp全長(zhǎng)基因序列。此外，鑒定了CdtA、CdtB和CdtC的ORF。CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:2、SEQIDNO3和SEQIDNO:4。[實(shí)施例5]使用HeLa細(xì)胞進(jìn)行CTD活性測(cè)定(通用于泰國(guó)人和ATCC菌株)在37°C微需氧條件下(5%CO2UO%O2和85%N2)在馬血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)豚腸彎曲桿菌Ch022和ATCC35217株48小時(shí)。將所得到的細(xì)菌細(xì)胞以1.0的OD6tltl懸浮于MEM中，并進(jìn)行超聲破碎。離心后，上清液用薄膜濾器(孔徑0.22μm)滅菌。對(duì)所制備的粗毒素溶液樣本進(jìn)行連續(xù)稀釋并添加到HeLa細(xì)胞中。在48和120小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)的改變(圖6)。對(duì)于泰國(guó)人菌株，向該菌株中同時(shí)添加抗Ch-rCdtB抗血清以評(píng)價(jià)CDT活性的特異性。此外，在48小時(shí)后，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞DNA含量進(jìn)行定量(圖7)。毒素的效價(jià)定義為導(dǎo)致50%或更多細(xì)胞發(fā)生膨脹的粗毒素溶液的最大稀釋因數(shù)。將豚腸彎曲桿菌的粗毒素溶液加入HeLa細(xì)胞中，其在直至16x的稀釋下仍表現(xiàn)出48小時(shí)后的細(xì)胞膨脹活性和120小時(shí)后的細(xì)胞致死活性(圖6)。這些活性被抗Ch-rCdtB血清所中和。此外，在添加粗毒素溶液48小時(shí)后使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞DNA含量進(jìn)行定量。結(jié)果清楚地表明細(xì)胞被G2/M相捕獲。在沒(méi)有添加粗毒素溶液的陰性對(duì)照中，或當(dāng)粗毒素溶液和抗Ch-rCdtB血清都添加到細(xì)胞時(shí)，觀察到對(duì)應(yīng)于G0/G1而不是G2/M相捕獲的一個(gè)高峰(圖7)。上述結(jié)果表明豚腸彎曲桿菌產(chǎn)生了具有毒素活性的CDT。該毒素活性被歸因于CDT，因?yàn)槠浔豢笴h-rCdtB抗血清所中和。[實(shí)施例6]彎曲桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和試劑使用馬血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)彎曲桿菌屬細(xì)菌，該培養(yǎng)基包含CM271BLOODAGARBASENo.2(0X0ID；Basingstoke,UK)[7.5g蛋白胨、1.25g肝消化物、2.5g酵母膏、2.5g氯化鈉、6.Og瓊脂/500ml蒸餾水，pH7.4士0.2，25°C]，補(bǔ)充有5%除菌的去纖維蛋白馬血(NipponBio-Supp.Center,Tokyo)。對(duì)于簡(jiǎn)明彎曲桿菌(Campylobacterconcisus，以下縮寫(xiě)為“C.concisus"),另外在每個(gè)平板中加入0.25ml含有6%甲酸鈉和6%富馬酸的溶液。彎曲桿菌屬細(xì)菌在37°C微需氧條件(10%CO2,5%O2和85%N2)下使用低溫02/C02培養(yǎng)箱M0DEL-9200(WAKENYAKU,C0.，LTD.)培養(yǎng)24天。簡(jiǎn)明彎曲桿菌在10%CO2UO%H2禾口80%N2的無(wú)氧條件下培養(yǎng)37天。大腸桿菌在37°C下的LB-Lenox液體培養(yǎng)基(5.OgBacto胰蛋白胨、2.5gBacto酵母膏、2.5gNaCl/500ml蒸餾水；DifcoLaboratories，USA)或LB-Lenox瓊脂培養(yǎng)基(5.OgBacto胰蛋白胨、2.5gBacto酵母膏、2.5gNaCl、7.5g瓊脂/500ml蒸餾水；DifcoLaboratories)中培養(yǎng)16-20小時(shí)。Pfi^^i^itMi·^§NacalaiTesque>ffakoPureChemicalIndustriesSigmaChemicalCo.(St.Louis，M0，USA)。限制性?xún)?nèi)切酶、TakaraExTaq和多重PCR分析試劑盒均購(gòu)自TakaraBio0SeakemGTG瓊脂糖(一種用于電泳的瓊脂糖)購(gòu)自TakaraBio0分子量標(biāo)記購(gòu)自NewEnglandBiolabs(USA)。[實(shí)施例7]PCR和PCR模板DNA的制備從平板上刮取菌落，加入200μ1的TE溶液。懸浮液加熱10分鐘。加熱處理后將懸浮液在12，800xg下離心10分鐘。收集所得到的上清液并用作模板DNA。將大腸桿菌C600株用作陰性對(duì)照。使用GeneAmpPCRSystem2400(PerkinElmer)或GeneAmpPCRSystem9700(PerkinElmer)進(jìn)行所有PCR實(shí)驗(yàn)。使用MUPID(ADVANCE)在IOOV下于IxTAE緩沖液[40mMTris-乙酸鹽(pH8.5),ImMEDTA]中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，使用1.0yg/ml溴乙啶(Sigma)染色凝膠15分鐘。用蒸餾水脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)GelDoc2000(Bio-Rad)在紫外線(260nm)下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析和拍照。[實(shí)施例8]使用針對(duì)空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌CdtB基因的通用引物或針對(duì)ATCC菌株的cdtB基因引物對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的cdtB基因進(jìn)行PCR對(duì)豚腸彎曲桿菌cdt基因進(jìn)行測(cè)序并與其他種類(lèi)彎曲桿菌屬細(xì)菌cdt基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示在空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌cdtB基因的通用引物的結(jié)合位點(diǎn)處存在幾處突變(標(biāo)記為紅色)(圖8)。當(dāng)使用空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌cdtB基因的通用引物時(shí)，對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC菌株進(jìn)行的PCR產(chǎn)生了一條與其他種類(lèi)細(xì)菌相比更微弱的擴(kuò)增條帶或沒(méi)有產(chǎn)生條帶。3’端區(qū)域的同源性對(duì)于PCR引物而言是特別重要的。然而，在豚腸彎曲桿菌ATCC菌株cdtB基因的引物結(jié)合位點(diǎn)的3’端區(qū)發(fā)現(xiàn)了幾處突變(圖8)。在引物結(jié)合位點(diǎn)處，特別是在3’端區(qū)的突變被認(rèn)為是造成豚腸彎曲桿菌ATCC菌株cdtB基因的易變的PCR擴(kuò)增的原因。因此，設(shè)計(jì)了用于豚腸彎曲桿菌ATCC菌株cdtB基因的通用引物，并通過(guò)PCR與常規(guī)的通用引物進(jìn)行比較。菌株豚腸彎曲桿菌ATCC35217株豚腸彎曲桿菌Ch022株通用引物ComBU:5，-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3，(SEQIDNO14)ComBR:5，-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3，(SEQIDNO15)用于ATCC菌株的引物ChATcomBU:5，-ACTTGGAATATGCAAGGA-3，(SEQIDNO16)ChATcomBR:5，-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3，(SEQIDNO17)PCR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的ΙμPCR模板與引物(終濃度1μΜ)、TaKaRaExtaq(0.25U)、dNTPs(各200μΜ)禾口IOxExTaq緩沖液混合。以40μ1的總體積進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件如下94°C3分鐘，和30個(gè)94°C30秒、50°C30秒和72°C30秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。結(jié)果空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌CdtB基因的通用引物可以擴(kuò)增來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株，而不能擴(kuò)增豚腸彎曲桿菌ATCC35217株。同時(shí)，ATCC菌株的引物可以同時(shí)擴(kuò)增來(lái)自泰國(guó)人的Ch022和ATCC35217株的豚腸彎曲桿菌(圖9)。[實(shí)施例9]用于廣譜檢測(cè)包括豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株在內(nèi)的彎曲桿菌屬細(xì)菌的PCR空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌CdtB基因的通用引物在之前的實(shí)驗(yàn)中僅產(chǎn)生一條微弱的擴(kuò)增條帶，并且在此描述的針對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC35217株的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有可檢測(cè)到的條帶。因此，使用新設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行PCR，以使豚腸彎曲桿菌cdtB基因的擴(kuò)增更穩(wěn)定。引物cdtB通用U:5，-ACTTGGAATWTGCAAGGM-3，(SEQIDNO18)cdtB通用R:5，-CYAAAWKTTAYHGGAAARTG-3，(SEQIDNO19)(W:A或T;M:A或C;Y:C或T;K:G或T；H:A、C或T；R=A或G)菌株空腸彎曲桿菌81-176株大腸彎曲桿菌Co1-243株胚胎彎曲桿菌Co1-187株紅嘴鷗彎曲桿菌ATCC43675株烏普薩拉彎曲桿菌ATCC43954株豚腸彎曲桿菌ATCC35217株豚腸彎曲桿菌Ch022株瑞士彎曲桿菌(C.helveticus)ATCC51209株大腸桿菌C600株P(guān)CR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的ΙμPCR模板與引物(終濃度1μΜ)、TaKaRaExtaq(0.25U)、dNTPs(各200μΜ)禾口IOxExTaq緩沖液混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C3分鐘，和30個(gè)94°C30秒、50°C30秒和72°C30秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。結(jié)果對(duì)于所使用的所有菌株都觀察到有效的PCR擴(kuò)增條帶(圖10)。[實(shí)施例10]通過(guò)DNA雜交評(píng)估豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的cdtB基因的拷貝數(shù)常規(guī)的通用引物和新設(shè)計(jì)的豚腸彎曲桿菌ATCC35217株的引物都可以在豚腸彎曲桿菌Ch022株中進(jìn)行擴(kuò)增。這暗示豚腸彎曲桿菌Ch022株具有兩個(gè)拷貝的cdtB基因。因而，通過(guò)DNA雜交估計(jì)了豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株cdtB基因的拷貝數(shù)，其中使用特異于每種菌株的探針。菌株空腸彎曲桿菌81-176株豚腸彎曲桿菌ATCC35217株豚腸彎曲桿菌Ch022株引物針對(duì)豚腸彎曲桿菌Ch022株的cdtB探針ComBU:5，-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3，(SEQIDNO14)ComBR:5，-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3，(SEQIDNO15)針對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC菌株的cdtB探針ChATcomBU:5，-ACTTGGAATATGCAAGGA-3，(SEQIDNO22)ChATcomBR:5，-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3，(SEQIDNO23)探針制備通過(guò)煮沸法從菌株中制備得到PCR模板。將μ的各種模板與用于菌株的引物(終濃度0.5μΜ)、TaKaRaExtaq(0.25U)、地高辛配基標(biāo)記的dNTPs(RocheDiagnositics)(各200μΜ)和IOxExTaq緩沖液混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C3分鐘，30個(gè)94°C30秒、50°C30秒和72°C30秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物，并用溴乙啶染色。脫色后，將檢測(cè)到的條帶切下并用QiagenPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，用作探針。染色體基因組DNA的制備和限制性?xún)?nèi)切酶消化使用IS0PLANT試劑盒(NIPPONGENE)純化染色體基因組DNA。從平板上刮取細(xì)菌細(xì)胞，將約30mg的細(xì)胞懸浮于150μ1提取緩沖液中，并加入300μ1裂解緩沖液裂解。50°C溫育15分鐘后，加入150μ1醋酸鈉緩沖液(ρΗ5.2)，并將其在冰上放置15分鐘。對(duì)水相進(jìn)行乙醇沉淀。將沉淀溶于TE[IOmMTris-HCl(ρΗ8.0)，ImMEDTA]，作為DNA溶液使用。使用分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。在終體積50μ1和37°C下，使用EcoRV或DraI(20U)對(duì)1μg的各基因組DNA消化5小時(shí)。DNA雜交在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳經(jīng)酶消化的細(xì)菌基因組，然后用溴乙啶染色。脫色后，確認(rèn)基因組DNA已經(jīng)被限制性?xún)?nèi)切酶消化。然后，用0.25NHCl處理凝膠15分鐘。用蒸餾水洗滌兩次后，將凝膠用0.5NNaOH處理30分鐘。在真空印跡裝置中使用IOxSSC處理90分鐘，將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜。每片尼龍膜加入2ml預(yù)雜交緩沖液[50%甲酰胺、5xSSC,0.01%SDS、ImMEDTA、Denhardt溶液、0.02%BSAUOOμg/ml熱變性的鯡魚(yú)精子DNA]。在42°C溫育膜1小時(shí)。然后，對(duì)豚腸彎曲桿菌Ch022或ATCC菌株的cdtB探針進(jìn)行熱變性，并在雜交緩沖液中以25ng/ml的濃度添加到尼龍膜上。在42°C下溫育尼龍膜過(guò)夜，然后在室溫下用含有0.1%SDS的2xSSC洗滌2次共15分鐘，并在65°C下用含有0.1%SDS的0.IxSSC洗滌2次共30分鐘。然后，用洗滌緩沖液洗滌尼龍膜2分鐘，并在室溫下用封閉緩沖液(緩沖液1，Ix封閉存儲(chǔ)溶液)平衡30分鐘。將抗-地高辛-堿性磷酸酶復(fù)合物(7，500U/ml)在新鮮的封閉緩沖液中稀釋10，000倍，并加至尼龍膜上。室溫下?lián)u動(dòng)30分鐘后，用緩沖液1洗滌膜2次共15分鐘，并使用AP9.5緩沖液平衡5分鐘。最后，加入用AP9.5緩沖液(4.5μ1ΝΒΤ，3·5μ1BCIP/lmlAP9.5緩沖液)稀釋的顯色底物溶液NBT/BCIP，將膜在暗處室溫下溫育30分鐘顯色。結(jié)果對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC和來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的染色體基因組DNA使用EcoRV消化，并用ATCC菌株cdtB探針進(jìn)行了DNA雜交。結(jié)果，在兩種菌株中檢測(cè)到相同位置處的條帶。此外，當(dāng)使用其他限制性?xún)?nèi)切酶(DraI)時(shí)，也在相同位置檢測(cè)到條帶。因此，暗示這兩種菌株具有ATCC菌株型的cdtB基因同系物(以下稱(chēng)為“ATCC型”)(圖11)。當(dāng)使用來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的cdtB探針進(jìn)行DNA雜交時(shí)，僅在來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株中檢測(cè)到條帶。此外，當(dāng)使用DraI對(duì)DNA進(jìn)行消化時(shí)，用ATCC株的cdtB探針檢測(cè)得到的條帶的位置與用Ch022株的cdtB探針檢測(cè)得到的條帶不同(圖11)。因此，暗示來(lái)自泰國(guó)人的豚腸彎曲桿菌Ch022株具有如下兩個(gè)拷貝的cdtB基因一個(gè)ATCC型cdtB基因和一個(gè)來(lái)自泰國(guó)人的Ch022株的cdtB基因同系物(以下稱(chēng)為“泰國(guó)人型”)。[實(shí)施例11]使用特異性引物用于檢測(cè)豚腸彎曲桿菌ATCC型cdtB基因和泰國(guó)人型cdtB基因的PCR對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC和泰國(guó)人菌株的cdtB基因進(jìn)行了比較。鑒定了特異于每種菌株的區(qū)，并基于所述區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。針對(duì)幾種動(dòng)物來(lái)源的豚腸彎曲桿菌菌株進(jìn)行PCR,以評(píng)估它們是否含有ATCC型和泰國(guó)人型cdtB基因。特異于豚腸彎曲桿菌泰國(guó)人型cdtB基因的引物Ch022spBU1:5，-TATCAGGCAATAGCGCAG-3，(SEQIDNO20)Ch022spBR1:5，-GGTTTGCACCTACATCAAC-3，(SEQIDNO21)特異于豚腸彎曲桿菌ATCC型cdtB基因的引物ChATspBU2:5，-CCTAGTAGCGCTACTTAG-3，(SEQIDNO22)ChATspBR2:5，-TACAAAGCTTGGGCGAAG-3，(SEQIDNO23)菌株豚腸彎曲桿菌Chl-1、Ch87-4、Ch2037、Ch2039、Ch2973、Ch3839、Ch3857、ATCC35217、Ch022大腸桿菌C600PCR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的1μ1PCR模板與引物(終濃度0.5μΜ)、TaKaRaExtaq(0.25U)、dNTPs(各200μΜ)禾口IOxExTaq緩沖液混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C3分鐘，30個(gè)94°C30秒、55°C30秒和72°C30秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。在2%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物。用溴乙啶染色凝膠，然后脫色。結(jié)果證實(shí)了被檢測(cè)的所有7株豚腸彎曲桿菌菌株都具有泰國(guó)人型(圖12)和ATCC型(圖13)cdtB基因。僅ATCC菌株不具有泰國(guó)人-型cdtB基因。[實(shí)施例12]使用通用引物對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC型cdtB基因和泰國(guó)人型cdtB基因進(jìn)行PCR對(duì)豚腸彎曲桿菌ATCC型和泰國(guó)人型cdtB基因進(jìn)行互相比較。鑒定了基因的共有區(qū)，并基于這些區(qū)進(jìn)行通用引物的設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小被設(shè)計(jì)為與以前報(bào)道的能夠檢測(cè)空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的多重PCR—致。對(duì)幾種動(dòng)物來(lái)源的豚腸彎曲桿菌菌株進(jìn)行PCR以評(píng)估引物。用于檢測(cè)豚腸彎曲桿菌ATCC型和泰國(guó)人型cdtB基因的通用引物ChspBU7:5，-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3，(SEQIDNO24)ChspBR7:5，-AATACCffAKAATWGGTCTTG-3‘(SEQIDNO25)(W:A或T;K:G或T)菌株豚腸彎曲桿菌Chl-1、Ch87-4、Ch2037、Ch2039、Ch2973、Ch3839、Ch3857、ATCC35217、Ch022大腸桿菌C600PCR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的1μ1PCR模板與特異性引物(終濃度0.5μΜ)、TaKaRaExtaq(0.25U)、dNTPs(各200μΜ)和IOxExTaq緩沖液混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C3分鐘，30個(gè)94°C30秒、55°C30秒和72°C30秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。在2%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物。用溴乙啶染色凝膠，然后脫色。結(jié)果對(duì)于被檢測(cè)的所有7株豚腸彎曲桿菌菌株都成功地?cái)U(kuò)增到豚腸彎曲桿菌cdtB基因(圖14)。[實(shí)施例13]用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和豚腸彎曲桿菌的基于CdtB基因的多重PCR的開(kāi)發(fā)由于已經(jīng)開(kāi)發(fā)了能夠有效地?cái)U(kuò)增豚腸彎曲桿菌ATCC型和泰國(guó)人型cdtB基因的引物，因此將該引物整合入常規(guī)的多重PCR中，以開(kāi)發(fā)能夠檢測(cè)更廣譜的彎曲桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)的多重PCR。菌株空腸彎曲桿菌81-176株大腸彎曲桿菌Co1-243株胚胎彎曲桿菌Co1-187株紅嘴鷗彎曲桿菌ATCC43675株烏普薩拉彎曲桿菌ATCC43954株豚腸彎曲桿菌Ch022株瑞士彎曲桿菌ATCC51209株簡(jiǎn)明彎曲桿菌ATCC33237株大腸桿菌C600株引物Cj-CdtBU5:5，-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3，(終濃度0·25μΜ)(SEQIDNO26)Cj-CdtBR6:5，-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3，(終濃度:0·25μΜ)(SEQIDNO27)Cc-CdtBU5:5，-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3，(終濃度:0·5μΜ)(SEQIDNO28)Cc-CdtBR5:5，-TCATTGCCTATGCGTATG-3，(終濃度:0·5μΜ)(SEQIDNO29)Cf-CdtBU6:5，-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3，(終濃度0·5μΜ)(SEQIDNO30)Cf-CdtBR3:5，-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3，(終濃度:0·5μΜ)(SEQIDNO31)ChspBU7:5，-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3，(終濃度0·5μΜ)(SEQIDNO24)ChspBR7:5，-AATACCffAKAATWGGTCTTG-3‘(終濃度0·5μΜ)(SEQIDNO25)(W:A或T；K=G或Τ)PCR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的1μ1PCR模板與特異性引物、0.2μ1多重PCRMix1(TakaraBio)禾口20μ12χ多重PCRMix2(TakaraBio)混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C1分鐘，30個(gè)94°C30秒、56°C90秒和72°C90秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。在2%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物。用溴乙啶染色凝膠，然后脫色。結(jié)果當(dāng)存在任何一種空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和豚腸彎曲桿菌時(shí)，靶向四種細(xì)菌的多重PCR都能夠有效檢測(cè)cdtB基因。此外，甚至在多種細(xì)菌存在的情況下，還觀察到菌種特異性的基因擴(kuò)增(圖15)。[實(shí)施例14]靶向幾乎所有彎曲桿菌屬病原菌的新型多重PCR在彎曲桿菌屬細(xì)菌中，空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌和豚腸彎曲桿菌具有過(guò)氧化氫酶活性并在42°C下生長(zhǎng)。這些種類(lèi)的細(xì)菌被稱(chēng)為“嗜熱彎曲桿菌”，大多數(shù)與食物中毒有關(guān)的菌種即屬于這個(gè)組。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了能夠同時(shí)檢測(cè)六種彎曲桿菌屬細(xì)菌的多重PCR，其中除了屬于嗜熱彎曲桿菌的五種細(xì)菌外還包括胚胎彎曲桿菌，后者對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物例如家畜具有致病性。菌株空腸彎曲桿菌81-176株大腸彎曲桿菌Co1-243株胚胎彎曲桿菌Co1-187株紅嘴鷗彎曲桿菌ATCC43675株烏普薩拉彎曲桿菌ATCC43954株豚腸彎曲桿菌Ch022株引物Cj-CdtBU5:5，-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3，(終濃度0·25μΜ)(SEQIDNO26)Cj-CdtBR6:5，-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3，(終濃度0·25μΜ)(SEQIDNO27)Cc-CdtBU5:5，-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO28)Cc-CdtBR5:5，-TCATTGCCTATGCGTATG-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO29)Cf-CdtBU6:5，-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3，(終濃度0·375μΜ)(SEQIDNO30)Cf-CdtBR3:5，-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO31)ChspBU7:5，-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3，(終濃度0·375μΜ)(SEQIDNO24)ChspBR7:5，-AATACCffAKAATWGGTCTTG-3‘(終濃度0·375μΜ)(SEQIDNO25)CupspBU3:5，-CATAGTTAGTCGCGTCCA-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO32)CupspBR4:5，-CCAGTTAATCTCAGGACG-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO33)ClaspBU4:5，-GTATCCATGCTTTATCAAGA-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO34)ClaspBR4:5，-GTAGGCCTATAAGAGAACC-3，(終濃度:0·375μΜ)(SEQIDNO35)(W:A或T；K=G或Τ)PCR將通過(guò)煮沸法從各種菌株制備得到的0.5μ1PCR模板在給定的終濃度下與0.2μ1多重PCRMix1(TakaraBio)禾口20μ12χ多重PCRMix2(TakaraBio)混合。在40μ1的總體積下進(jìn)行PCR。PCR條件如下94°C1分鐘，30個(gè)94°C30秒、56°C90秒和72°C90秒的循環(huán)，然后72°C5分鐘。在2%瓊脂糖凝膠上電泳所得到的PCR產(chǎn)物。用溴乙啶染色凝膠，然后脫色。結(jié)果當(dāng)存在任何一種彎曲桿菌屬細(xì)菌時(shí)，靶向六種細(xì)菌的多重PCR都能夠有效檢測(cè)CdtB基因。此外，甚至在所有六種細(xì)菌存在的情況下還觀察到菌種特異性的基因擴(kuò)增(圖16)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了可以有效地用于檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的cdt基因。證實(shí)了通過(guò)cdt基因的毒素產(chǎn)生。如上所述，從公共衛(wèi)生的角度看，豚腸彎曲桿菌是一種重要的細(xì)菌，因?yàn)樗鼘?dǎo)致食物中毒。然而，由于常規(guī)的培養(yǎng)和檢測(cè)方法僅靶向空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌，因此很難檢測(cè)到豚腸彎曲桿菌。此外，由于豚腸彎曲桿菌cdt基因相對(duì)于空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌cdt基因的同源性不高(大約60%)，因此使用已知的用于相同屬細(xì)菌的基因探針難以鑒定本發(fā)明的豚腸彎曲桿菌cdt基因。由于有可能特異性檢測(cè)豚腸彎曲桿菌，因此本發(fā)明促使快速和精確地測(cè)定導(dǎo)致食物中毒等的細(xì)菌成為可能。本發(fā)明的方法不僅在臨床上非常有用，而且還可用于食品生產(chǎn)等的工藝管理、工廠衛(wèi)生管理等。本發(fā)明還提供了包括豚腸彎曲桿菌在內(nèi)的六種彎曲桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法靶向的彎曲桿菌屬細(xì)菌除了胚胎彎曲桿菌以外都是能夠生長(zhǎng)于42°C微需氧條件下的細(xì)菌種類(lèi)，因而被稱(chēng)為“嗜熱彎曲桿菌”。幾乎所有與食物中毒有關(guān)的彎曲桿菌屬細(xì)菌都被認(rèn)為屬于嗜熱彎曲桿菌。本發(fā)明使得簡(jiǎn)單和快速地鑒定食物中毒細(xì)菌成為可能。權(quán)利要求一種編碼細(xì)胞致死腫脹毒素的多核苷酸，其為以下(a)-(h)的任何一種(a)編碼包含SEQIDNO2-4中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含核苷酸序列SEQIDNO1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的多核苷酸；(c)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQIDNO2-4的任一氨基酸序列中具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列SEQIDNO1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的DNA雜交的多核苷酸；(e)編碼包含SEQIDNO6-8中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(f)包含核苷酸序列SEQIDNO5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的多核苷酸；(g)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQIDNO6-8的任一氨基酸序列中具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；和(h)在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列SEQIDNO5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的DNA雜交的多核苷酸。2.一種包含權(quán)利要求1的多核苷酸的載體。3.一種包含權(quán)利要求1的多核苷酸或權(quán)利要求2的載體的宿主細(xì)胞。4.一種由權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的多肽。5.一種產(chǎn)生權(quán)利要求4的多肽的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中收集所產(chǎn)生的多肽的步驟。6.一種結(jié)合權(quán)利要求4的多肽的抗體。7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體具有中和細(xì)胞致死腫脹毒素的活性。8.—種在試樣中同時(shí)檢測(cè)一種或更多種彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌存在的方法，其包括步驟(a)使用特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)的混合物對(duì)試樣進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(b)基于擴(kuò)增自編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的片段的存在或其分子量確定彎曲桿菌屬細(xì)菌的存在。9.權(quán)利要求8的方法，其中下列(i)-(iv)引物對(duì)中的任一種或更多種被用作引物對(duì)(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO:24和SEQIDNO25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDNO19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDN0:19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacterupsaliensis)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:32和SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO:32和SEQIDN033所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；以及(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacterlari)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO34和SEQIDNO35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。10.權(quán)利要求9的方法，其中還使用下列(v)-(vii)引物對(duì)作為引物對(duì)(v)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO:27，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO:29，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO28和SEQIDNO29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌(Campylobacterfetus)細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO30和SEQIDNO31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。11.一種用于權(quán)利要求8的方法的試劑盒，其包含操作指南和一種或更多種特異于編碼彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)的混合物。12.權(quán)利要求11的試劑盒，其包含作為引物對(duì)的下列(i)-(iv)引物對(duì)中的任一種或更多種(i)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO24和SEQIDNO:25，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:24和SEQIDNO:25所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(ii)用于擴(kuò)增編碼豚腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDNO19，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:18禾口SEQIDN0:19所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(iii)用于擴(kuò)增編碼烏普薩拉彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:32禾口SEQIDNO:33，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO32和SEQIDNO33所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；以及(iv)用于擴(kuò)增編碼紅嘴鷗彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:34和SEQIDNO:35，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:34和SEQIDN0:35所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。13.權(quán)利要求12的試劑盒，其進(jìn)一步包含下列(v)-(vii)引物對(duì)作為引物對(duì)(v)用于擴(kuò)增編碼空腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO:27，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDNO26和SEQIDNO:27所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vi)用于擴(kuò)增編碼大腸彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:28和SEQIDNO:29，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:28和SEQIDN0:29所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)；(vii)用于擴(kuò)增編碼胚胎彎曲桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31，或能擴(kuò)增與引物對(duì)SEQIDN0:30和SEQIDNO:31所擴(kuò)增的相同基因組DNA區(qū)域的引物對(duì)。14.一種用于檢測(cè)試樣中豚腸彎曲桿菌存在的方法，其包括步驟(a)將試樣與權(quán)利要求6的抗體接觸；(b)測(cè)定試樣和權(quán)利要求6的抗體之間的結(jié)合；以及(c)如果在(b)中檢測(cè)到結(jié)合則確定豚腸彎曲桿菌存在。15.一種用于權(quán)利要求14的方法的試劑盒，其包括操作指南和權(quán)利要求6的抗體。全文摘要本發(fā)明的目的是提供豚腸彎曲桿菌的細(xì)胞致死腫脹毒素(CDT)和編碼它的多核苷酸，以及使用cdt基因檢測(cè)豚腸彎曲桿菌的新方法。本發(fā)明人關(guān)注于彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死腫脹毒素(CDT)，并對(duì)分離自泰國(guó)的一位腸炎患者的類(lèi)彎曲桿菌屬的cdt基因進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種菌株，其cdtB基因在空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌中為通用引物所擴(kuò)增，但是不為可特異性檢測(cè)三種細(xì)菌cdtA、cdtB和cdtC基因的多重PCR所擴(kuò)增。通過(guò)16SrRNA基因分析鑒定該菌株為豚腸彎曲桿菌。此外，通過(guò)cdtB基因上游和下游的基因組步移鑒定了該cdt基因完整的核苷酸序列。文檔編號(hào)C12N1/19GK101835897SQ200880113260公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日發(fā)明者山崎伸二,方粉水,朝倉(cāng)昌博申請(qǐng)人:公立大學(xué)法人大阪府立大學(xué);扶桑藥品工業(yè)株式會(huì)社