專利名稱：：調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的鑒定方法調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的鑒定方法發(fā)明簡介本申請要求2008年8月21日提交的美國臨時專利申請系列號No.61/090，726，以及2007年10月22日提交的系列號No.60/981，548的優(yōu)先權(quán)，它們的內(nèi)容在此以其全文引為參考。
背景技術(shù)：
：任何具有線性染色體的生物體，在維持其DNA的末端序列中都面臨一個嚴(yán)重的障礙，通常被稱為“末端復(fù)制問題”(Blackburn(1984)Annu.Rev.Biochew.53163-194；Cavalier-Smith(1974)Nature250467-470；Cech&Lingner(1997)CibaFound.Symp.21120-34；Lingner等，(1995)Science2691533-1534；Lundblad(1997)Nat.Med.31198-1199；Ohki等，(2001)Mol.Cell.Biol.21:5753_5766)。真核細胞通過使用被稱為端粒酶的特化的DNA聚合酶解決這個問題。端粒酶向線性染色體的3’-末端添加串聯(lián)的、富含G的DNA重復(fù)序列(端粒)，用于保護染色體免于遺傳信息的喪失、染色體端對端融合、遺傳不穩(wěn)定性和衰老(Autexier&Lue(2006)Annu.Rev.Biochem.75:493_517；Blackburn&Gall(1978)J.Mol.Biol.12033-53；Chatziantoniou(2001)Pathol.Oncol.Res.7161-170；Collins(1996)Curr.Opin.CellBiol.8:374_380；Dong等，(2005)Crit.Rev.Oncol.Hemato1.54:85_93)。核心端粒酶全酶是RNA依賴性的DNA聚合酶(TERT)，與用作模板添加端粒序列的RNA分子(TER)配對(Blackburn(2000)Nat.Struct.Biol.7:847_850；Lamond(1989)TrendsBiochem.Sci.14:202_204；Miller&Collins(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA996585-6590；Miller等，(2000)EMBOJ.194412-4422；Shippen-Lentz&Blackburn(1990)Science247=546-552)。TERT由4個功能性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中一個與HIV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)具有相似性，因為它包含該蛋白家族標(biāo)志性的重要標(biāo)志基序(Autexier&Lue(2006)，同±；Bryan等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA958479-8484；Lee等，(2003)J.Biol.Chem.278:52531_52536；Peng等，(2001)Mol.Cell7:1201_1211)。含有端粒酶活性位點的RT結(jié)構(gòu)域被認為參與了與RNA模板的松散結(jié)合(Collins&Gandhi(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA958485-8490Jacobs等，(2005)ProteinSci.14:2051_2058)。但是，與其他反轉(zhuǎn)錄酶相比，TERT是獨特的，因為它在RT結(jié)構(gòu)域的N-末端方向含有兩個對于功能來說必需的結(jié)構(gòu)域。它們包括遠N-末端結(jié)構(gòu)域(TEN)，它至少在系統(tǒng)發(fā)育組之間是保守的，但是對適合的人類、酵母和具纖毛原生動物的體外端粒酶活性和端粒的體內(nèi)維持來說是必需的(Friedman&Cech(1999)GenesDev.13:2863_2874;Friedman等，(2003)Mol.Biol.Cell14:1-13)。TEN結(jié)構(gòu)域具有DNA和RNA兩種結(jié)合性質(zhì)。DNA結(jié)合便于端粒酶裝載到染色體上，而RNA結(jié)合是非特異性的，這種相互作用的功能還不清楚(Hammond等，(1997)Mol.Cell.Biol.17:296_308Jacobs等，(2006)Nat.Struct.Mol.Biol.13:218_225；Wyatt等，(2007)Mol.Cell.Biol.27=3226-3240)。第三個結(jié)構(gòu)域，端粒酶RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)，位于TEN和RT結(jié)構(gòu)域之間，與TEN結(jié)構(gòu)域不同，它在系統(tǒng)發(fā)育組之間是高度保守的，對于體外和體內(nèi)端粒酶的功能來說都是必需的(Lai等，(2001)Mol.Cell.Biol.21=990-1000)0TRBD包含參與RNA識別和結(jié)合的關(guān)鍵標(biāo)志基序(CP-和T-基序)，造成與TER的莖I和TBE的廣范圍接觸，TER的莖I和TBE二者都位于模板的上游(Bryan等，(2000)Mol.Cell6493-499；Cunningham&Collins(2005)Mol.Cell.Biol.254442-4454；Lai等，(2002)GenesDev.16:415_420；Lai等，(2001)同上；Miller等，(2000)同上；0‘Connor等，(2005)J.Biol.Chem.28017533-17539)。TRBD-TER相互作用對于全酶在體外和體內(nèi)的適當(dāng)組裝和酶活性來說是必需的，被認為在染色體末端處忠實地添加多個一致的端粒重復(fù)序列中發(fā)揮重要作用(盡管是間接的)(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)Mol.Cell11:1673-1683；Lai等，(2001)同上)。與TERT不同，TER的尺寸在種之間變化相當(dāng)大。例如，在嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中TER只有I59個核苷酸長(Greider&Blackburn(I989)Nature337331-337)，而酵母具有異常長的1167個核苷酸的TER(ZappulIa&Cech(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101=0024-10029)盡管存在尺寸和結(jié)構(gòu)上的巨大差異，但TER的核心結(jié)構(gòu)元件在系統(tǒng)發(fā)育組之間是保守的，表明了生物體之間端粒復(fù)制的共同機制(Chen等，(2000)Cell100503-514；Chen&Greider(2003)GenesDev.172747-2752；Chen&Greider(2004)TrendsBiochem.Sci.29183-192;Ly等，(2003)Mol.Cell.Biol.236849-6856；Theimer&Feigon(2006)Curr.Opin.Struct.Biol.16:307_318)。它們包括與RT結(jié)構(gòu)域松散結(jié)合，并為端粒合成提供編碼的模板，以及部分調(diào)控端粒酶的重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力的TBE。在嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中，TBE由莖II和側(cè)翼的單鏈區(qū)域形成，位于模板的上游并緊鄰模板(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)同上；Licht&Collins(1999)GenesDev.13:1116_1125)。在螺旋IV和嗜熱四膜蟲TER的模板識別元件(TRE)中也發(fā)現(xiàn)了低親和性的TERT結(jié)合位點。TERT的功能受到多種蛋白的調(diào)控，其中某些通過與TERT/TER復(fù)合物直接結(jié)合起作用，而其他的通過它們與端粒DNA的結(jié)合調(diào)控端粒酶與染色體末端的接近來起作用(Aisner等，(2002)Curr.Opin.Genet.Dev.1280-85；Cong等，(2002)Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:407-425;Dong等，(2005)同上；Loayza&deLange(2004)Cell117279-280；Smogorzewska&deLange(2004)Annu.Rev.Biochem.73177-208；Smogorzewska等，(2000)Mol.Cell.Biol.201659-1668；Witkin&Collins(2004)GenesDev.181107-1118；Witkin等，(2007)Mol.Cell.Biol.27:2074_2083)。例如，具纖毛原生動物嗜熱四膜蟲中的P65或其在小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus)中的類似物p43，是端粒酶全酶的不可缺少的成分(Aigner&Cech(2004)RNA101108-1118；Aigner等，(2003)Biochemistry425736-5747；0‘Connor&Collins(2006)Mol.Cell.Biol.262029-2036；Prathapam等，(2005)Nat.Struct.Mol.Biol.12:252_257；Witkin&Collins(2004)同上；Witkin等，(2007)同上)。p65和p43都被認為結(jié)合和折疊TER，這是全酶的適當(dāng)裝配和完全活性所必需的過程。在酵母中，端粒酶活性的募集和隨后的上調(diào)需要端粒酶結(jié)合蛋白Estl(Evans&Lundblad(2002)Genetics162:1101_1115;Hughes等，(1997)CibaFound.Symp.211:41_52；Lundblad(2003)Curr.Biol.13:R439_441；Lundblad&Blackburn(1990)Cell60529-530；Reichenbach等，(2003)Curr.Biol.13568-574；Snow等，(2003)Curr.Biol.13698-704)。Estl與端粒酶的RNA成分結(jié)合，這種相互作用通過與端粒結(jié)合蛋白Cdcl3的相互作用，促進了全酶向真核染色體末端的募集(Chandra等，(2001)GenesDev.15404-414；Evans&Lundblad(1999)Science286:117-120;Lustig(2001)Nat.Struct.Biol.8:297_299；Pennock等，(2001)Celll04:387_396)。端粒酶和相關(guān)的調(diào)控因子如何彼此物理相互作用并發(fā)揮功能以維持適合的端粒長度，還在研究之中。這些因子在隔離和彼此復(fù)合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)性質(zhì)，可用于確定TRBD結(jié)構(gòu)域與TER的莖I和TBE的相互作用如何促進全酶的適當(dāng)裝配，并促進全酶的重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力。盡管已經(jīng)發(fā)展了體外和體內(nèi)篩選方法來鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性或端粒結(jié)合的藥齊U，但焦點還沒有放在鑒定對特定結(jié)構(gòu)域或底物口袋具有一定程度特異性的藥劑上。參見美國專禾IjNos.7，067，283；6，906，237；6，787，133；6，623，930；6，517，834；6，368，789；6，358，687；6，342，358；5，856，096；5，804，380和5，645，986。發(fā)明簡述本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的鑒定方法。本發(fā)明的方法包括(a)設(shè)計或篩選與端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基，“拇指”結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基，“手掌”結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基和/或“手指”結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物；以及(b)測試在(a)中設(shè)計或篩選的化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力，從而鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物。在一個實施方案中，端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域包含在表1中顯示的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，“拇指(thumb)”、“手掌”和“手指(finger)”結(jié)構(gòu)域包含表2中顯示的氨基酸殘基。在其他實施方案中，步驟(a)在計算機上或在體外進行。通過本方法鑒定的化合物也被本發(fā)明所涵蓋。附圖簡述圖1顯示了端粒酶(TERT)的結(jié)構(gòu)。圖IA顯示了人類、酵母和嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)TERT的一級結(jié)構(gòu)，顯示了功能性結(jié)構(gòu)域和保守基序。圖IB是赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)TERT的一級結(jié)構(gòu)和保守基序。圖IC顯示了TERT的結(jié)構(gòu)域組織，具有描繪的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)，由“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域，以及“拇指”結(jié)構(gòu)域。圖2A和2B顯示了嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)的TRBDs(TETTH；SEQIDNO:1)，與來自具纖毛原生動物例如小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus)(EUPAE；SEQIDNO2)和Oxytrichatrifallax(0XYTR；SEQIDNO:3)，哺乳動物例如人類(SEQIDNO4)和小鼠(SEQIDNO:5)，真菌例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(SCHP0；SEQIDNO6)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(YEAST;SEQIDNO:7)，以及植物例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)(ARATH；SEQIDNO8)的TRBDs的序列比對和二級結(jié)構(gòu)示意圖，通過ALSCRIPTBarton(1993)ProteinEng.637-40)產(chǎn)生。標(biāo)出了關(guān)鍵標(biāo)志基序的保守殘基，也標(biāo)出了影響RNA結(jié)合和端粒酶功能的突變殘基。實心三角形定義了在本文的研究中使用的TRBD構(gòu)建物的邊界。圖3A-3C顯示了赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)TERT(TRICA；SEQIDNO9)與來自各種不同的系統(tǒng)發(fā)育組，包括哺乳動物例如小鼠(SEQIDN010)和人類(SEQIDNO11)，植物例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)(ARATH；SEQIDNO12),真菌例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(YEAST；SEQIDNO13)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(SCHP0；SEQIDNO14)，以及原生動物例如嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)(TETTH；SEQIDNO15)和小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus)(EUPAE；SEQIDNO16)的TERTs相比的序列比對和表面保守性，通過ClustalW2(Larkin等，(2007)Bioinformatics23:2947_2948)產(chǎn)生。標(biāo)出了關(guān)鍵標(biāo)識基序的保守殘基。也顯示了參與與DNA底物的骨架直接接觸的螺旋(110的1(210和“拇指”結(jié)構(gòu)域的極性殘基(K406,K416，K418，N423)。圖4是來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)的端粒酶的RNA成分(TER)的一級結(jié)構(gòu)。標(biāo)出了莖I、TBE和模板。發(fā)明詳述端粒酶，一種核糖核蛋白復(fù)合物，復(fù)制真核染色體的線性末端，從而處理“復(fù)制末端問題”。TERT包含必需和總的來說保守的結(jié)構(gòu)域(TRBD；圖1A)，造成與全酶的RNA(TER)成分廣泛接觸，這種相互作用促進TERT/TER的組裝和重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力。TRBD結(jié)構(gòu)域在系統(tǒng)發(fā)育組之間高度保守，對于端粒酶的功能是必需的。廣泛的生物化學(xué)和誘變研究已經(jīng)定位到TRBD與莖I和TEB結(jié)合，這種相互作用據(jù)認為對于TERT/TER復(fù)合物的適當(dāng)組裝和穩(wěn)定作用，以及全酶重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力是重要的。目前，已經(jīng)鑒定了TRBD結(jié)構(gòu)域的原子結(jié)構(gòu)，由此提供了關(guān)于TERT/TER結(jié)合的信息。TRBD的RNA結(jié)合位點是蛋白表面上延伸的溝，它在性質(zhì)上部分親水、部分疏水，由以前鑒定到的顯示出對端粒酶功能重要的T-和CP-基序形成。該溝的尺寸、組織和化學(xué)性質(zhì)表明，TRBD結(jié)構(gòu)域與雙鏈和單鏈核酸都發(fā)生相互作用，可能是莖I或II以及連接它們的ssRNA。除了TRBD結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)之外，現(xiàn)在已經(jīng)顯示，三個高度保守的結(jié)構(gòu)域——TRBD，反轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域和據(jù)認為代表了TERT的假設(shè)的“拇指”結(jié)構(gòu)域的C-末端延伸區(qū)，組織成了環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶、病毒RNA聚合酶和B-家族DNA聚合酶共有相同的特征。結(jié)構(gòu)域的組織將參與底物結(jié)合和催化的基序放置在環(huán)的內(nèi)部，所述環(huán)的內(nèi)部可以容納7到8個堿基的雙鏈核酸。RNA/DNA異源雙鏈體在該環(huán)內(nèi)部中的模擬，顯示出蛋白與核酸底物之間的完美契合，并將DNA引物的3’-末端定位于酶的活性位點處，為活性端粒酶延伸復(fù)合物的形成提供了證據(jù)。TRBD結(jié)構(gòu)域，以及RT和“拇指”結(jié)構(gòu)域，是在系統(tǒng)發(fā)育組之間高度保守的結(jié)構(gòu)域。因此，這些結(jié)構(gòu)域可以作為理想的候選者用于端粒酶抑制劑。就此而言，端粒酶是用于治療與細胞增殖和衰老相關(guān)的人類疾病、例如癌癥的理想靶。因此，本發(fā)明涉及使用嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)與赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)端粒酶的高分辨率結(jié)構(gòu)，來鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的效應(yīng)物分子。術(shù)語“效應(yīng)物”是指任何影響端粒酶活性的激動物、拮抗物、配體或其他因子。效應(yīng)物可以是但不限于肽類、糖類、核酸、脂類、脂肪酸、激素、有機化合物和無機化合物。從本發(fā)明的晶體結(jié)構(gòu)獲得的信息，顯示了可用于設(shè)計、分離、篩選和確定調(diào)節(jié)端粒酶活性的可能化合物的詳細信息。與TRBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合并例如空間阻斷TER結(jié)合或阻斷RNP組裝的化合物，用作有效的端粒酶特異性抑制劑，而模擬或促進TER結(jié)合或RNP組裝的化合物，用作有效的端粒酶特異性激活劑。結(jié)合并阻斷活性位點或核苷酸結(jié)合位點的化合物也可以調(diào)節(jié)端粒酶的活性。類似地，與端粒酶直接接觸DNA的一個或多個氨基酸殘基相互作用的化合物，可以阻斷DNA結(jié)合，并用作有效的端粒酶特異性抑制劑，而模擬DNA的化合物用作有效的端粒酶特異性活性劑。本發(fā)明的效應(yīng)物分子具有廣泛的各種用途。例如，已經(jīng)考慮到端粒酶調(diào)節(jié)劑將是治療人類疾病的有效治療藥劑。篩選激動劑提供了在細胞中增加端粒酶活性(包括端粒依賴性復(fù)制能力，或部分端粒酶活性)的組合物。這樣的刺激劑組合物提供了使正常的未轉(zhuǎn)化細胞、包括能夠表達有用蛋白的細胞永生化的方法。這樣的激動物也可以提供控制細胞衰老的方法。相反，篩選拮抗劑活性提供了降低端粒依賴性復(fù)制能力，從而使本來永生的細胞例如癌細胞死亡的組合物。篩選拮抗劑活性提供了降低端粒酶活性，從而阻止表現(xiàn)出不受調(diào)控的細胞生長的細胞、例如癌細胞的不受限制的細胞分裂的組合物?？偟膩碚f，無論需要增加還是降低細胞或生物體中的端粒酶活性，都可以使用本發(fā)明的效應(yīng)物分子。廣義來說，本發(fā)明的方法包括設(shè)計或篩選與本文公開的必需端粒酶結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的測試化合物；以及測試設(shè)計或篩選的化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法使用各種基于檢測端粒酶的一個或多個結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域殘基與測試化合物之間的相互作用的在計算機上、體外和/或體內(nèi)分析方法來進行。在本發(fā)明的上下文中，端粒酶是指通過添加端粒重復(fù)序列TTAGGG維持端粒末端的酶家族。端粒酶描述在例如Nakamura等，(1997)Science277(5328):955_9和0'Reilly等，(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(1):56_65中。在本發(fā)明中使用的示例性端粒酶在本文中顯示在SEQIDNOs1-16中(圖2A-2B和圖3A-3C)，本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的端粒酶的全長序列在GENBANK登記號Nos.AAC39140(嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)),NP_197187(擬南芥(Arabidopsisthaliana)，NP_937983(智人(Homosapiens)),CAA18391(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))，NP_033380(小H(Musmusculus)),NP_013422(IIMSl#(Saccharomycescerevisiae)),AAC39163(0xytrichatrifallax),CAE75641(小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus))和NP_001035796(赤擬谷盜(Triboliumcastaneum))下。出于本發(fā)明的目的，指稱端粒酶是指端粒酶的等位基因和合成變體，以及端粒酶的片段。合成變體包括與本文公開的端粒酶具有至少80%、優(yōu)選至少90%同源性的變體。更具體來說，這樣的變體對應(yīng)于本文提供的端粒酶序列，但是具有一個或多個，例如從1到10個，例如1到5個氨基酸取代、缺失或插入。端粒酶及其變體的片段大小優(yōu)選為至少20個，更優(yōu)選至少50個，最優(yōu)選至少200個氨基酸。示例性的片段包括包含了端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域的大約250個氨基酸殘基。其他片段包括“拇指”結(jié)構(gòu)域和反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域及其亞結(jié)構(gòu)域，即“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域。正如在圖IA和圖2A和2B中描述的，TRBD結(jié)構(gòu)域包含嗜熱四膜蟲(T.thermophila)端粒酶的254-519位處或附近的氨基酸殘基。如圖IB和圖3A-3C所示，反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域包含赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的160-403位處或附近的氨基酸殘基，“拇指”結(jié)構(gòu)域包含赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的404-596位處或附近的氨基酸殘基。基于圖2A、2B、3A和3B中描述的氨基酸序列比較，可以根據(jù)其他物種的端粒酶中對等氨基酸殘基的位置，容易地獲得來自其他物種端粒酶的適合的結(jié)構(gòu)域和片段。TRBD的近乎全螺旋的結(jié)構(gòu)提供了適合于TER結(jié)合的核酸結(jié)合折疊。蛋白表面上由兩個保守基序(CP-和T-基序)形成的延長的口袋，提供了TRBD的RNA結(jié)合口袋。該口袋的寬度和化學(xué)本性表明，它結(jié)合單鏈和雙鏈RNA二者，可能是莖I和模板邊界元件(TBE)。參與嗜熱四膜蟲(T.thermophila)端粒酶的RNP組裝和嗜熱四膜蟲(T.thermophila)端粒酶TRBD與TER之間的相互作用的必需氨基酸殘基，列于表1中。這些殘基在來自于其他生物體的端粒酶中的位置，也列于表1中。在具體實施方案中，本發(fā)明的化合物與表1中列出的一個或多個氨基酸殘基結(jié)合，由此調(diào)節(jié)端粒酶活性。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Tt，嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)；At，擬南芥(Arabidopsisthaliana)；Hs，智人(Homosapiens)；Sp,粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；Mm，小鼠(Musmusculus)；Sc，酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；Tc，赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)；0t,Oxytrichatrifallax以及Ea，小月空Κ卜蟲(Euplotesaediculatus)□1立置參照于全長嗜熱四膜蟲(T.thermophila)端粒酶。#位置參照于在圖2A和2B中描述的端粒酶序列，即SEQIDNOs:1_8。t位置參照于在圖3A-3C中描述的端粒酶序列。正如本文公幵的，赤擬谷盜(T.casteneum)端粒酶的結(jié)構(gòu)鑒定了反轉(zhuǎn)錄酶和“拇指”結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸殘基。具體來說，鑒定了核苷酸結(jié)合口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基，以及表現(xiàn)出與DNA底物的骨架直接接觸的氨基酸殘基。因此，本發(fā)明還包含了與端粒酶的核苷酸結(jié)合口袋的至少一個氨基酸殘基或與DNA直接接觸的殘基結(jié)合的化合物。這些殘基發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的“手掌”和“手指”亞結(jié)構(gòu)域和“拇指”結(jié)構(gòu)域中，并列于表2中。這些氨基酸殘基在其他物種中的位置也列于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Tt，嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)；At,擬南芥(Arabidopsisthaliana)；Hs,智人(Homosapiens)；Sp,粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；Mm,小鼠(Musmusculus)；Sc，酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；Tc,赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)；以及Ea，小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus)。*位置參照于在圖3A-3C中描述的端粒酶序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物與表2中列出的一個或多個氨基酸殘基結(jié)合，由此調(diào)節(jié)端粒酶活性。在另一個實施方案中，化合物與端粒酶的核苷酸結(jié)合口袋的一個或多個氨基酸殘基(即赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的K189、R194、Y256、Q308、V342和K372，或它們在來自其他物種的端粒酶中的等價氨基酸殘基)結(jié)合，以調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合。在另一個實施方案中，化合物結(jié)合端粒酶與DNA直接接觸的一個或多個氨基酸殘基(即赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的K210、K406、K416、K418或N423，或它們在來自其他物種的端粒酶中的等價氨基酸殘基)，以調(diào)節(jié)DNA結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計或篩選的化合物可以通過各種不同的異源相互作用，包括但不限于范德華接觸(vanderWaalscontacts)、氫鍵、離子相互作用、極性接觸或其組合，與本文公開的一個或多個結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基相互作用。一般來說，希望化合物與本文公開的結(jié)構(gòu)域的2、3、4、5、6個或以上氨基酸殘基相互作用，以增加化合物對一種或多種端粒酶蛋白的特異性。在一個實施方案中，化合物與QFP-基序、T-基序或CP-基序的一個或多個必需氨基酸相互作用。在另一個實施方案中，化合物與T-基序和CP-基序的一個或多個必需氨基酸相互作用。在另一個實施方案中，化合物與表1中顯示的一個或多個必需氨基酸相互作用。在具體實施方案中，化合物與表1中顯示的、以前沒有通過突變被鑒定為影響RNA結(jié)合和端粒酶活性的一個或多個必需氨基酸殘基相互作用。在另一個實施方案中，化合物與核苷酸結(jié)合口袋的一個或多個必需氨基酸相互作用。在另一個實施方案中，化合物與端粒酶直接接觸DNA的一個或多個必需氨基酸相互作用。在另一個實施方案中，化合物與表2中顯示的一個或多個必需氨基酸相互作用。在具體實施方案中，化合物與表2中顯示的、以前沒有通過突變被鑒定為影響核苷酸結(jié)合、DNA結(jié)合或端粒酶活性的一個或多個必需氨基酸殘基相互作用。根據(jù)本發(fā)明，可以使用分子設(shè)計技術(shù)來設(shè)計、鑒定和合成能夠與端粒酶的一個或多個氨基酸結(jié)合的化學(xué)實體和化合物，包括抑制性和刺激性化合物。端粒酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)可以與使用對接程序(dockingprogram)例如GRAM、DOCK、HOOK或AUT0D0CK(Dunbrack等，(1997)Folding&DeSign2:27_42)的計算機模擬技術(shù)一起使用，來鑒定端粒酶蛋白的潛在的調(diào)節(jié)物。該步驟可以包括將化合物對本文公開的結(jié)構(gòu)域進行計算機擬合，以例如確定化合物的形狀和化學(xué)結(jié)構(gòu)與TRBD結(jié)構(gòu)域互補得有多好；或用于比較化合物與TER在TRBD中的結(jié)合；或比較化合物與DNA分子在“拇指”結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合，或比較化合物與核苷酸底物在核苷酸結(jié)合口袋上的結(jié)合。計算機程序也可用于估算端粒酶蛋白與效應(yīng)物化合物的吸引、排斥和空間位阻。一般來說，擬合越緊密，空間位阻越低，吸引力越大，特異性越高，這是更可能與端粒酶蛋白而不是其他類型蛋白相互作用的特異性效應(yīng)物化合物的重要特點。由于本發(fā)明已經(jīng)鑒定了特異性參與底物結(jié)合的氨基酸殘基，因此本發(fā)明提供了迄今為止使用常規(guī)篩選分析方法不可能獲得的特異性?；蛘?，在端粒酶調(diào)節(jié)物或效應(yīng)物的設(shè)計中可以使用化學(xué)探針方法。例如，Goodford((1985)J.Med.Chem.28849)描述了幾種商業(yè)化軟件包，例如GRID(MolecularDiscoveryLtd.，Oxford,UK)，可用于使用不同化學(xué)探針，例如水、甲基、胺的氮、羧基氧和羥基來探測端粒酶結(jié)構(gòu)域。由此確定了端粒酶結(jié)構(gòu)域的這些區(qū)域或位點與每種探針之間相互作用的優(yōu)選位點，并從獲得的這些區(qū)域或位點的三維圖樣，可以產(chǎn)生推斷的互補分子。本發(fā)明的化合物也可以通過目測檢查端粒酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，以確定更有效的抑制劑或激活劑來進行設(shè)計。這種類型的模擬一般被稱為“手動”藥物設(shè)計。手動藥物設(shè)計可以利用目測檢查和使用圖形可視化程序進行分析，這樣的程序例如“0”(Jones等，(1991)ActaCrystallographicaSectionAA47:110_119)。一開始，效應(yīng)物化合物可以通過手動藥物設(shè)計來選擇。然后可以將由此設(shè)計的結(jié)構(gòu)類似物通過計算機模擬進行修改，以更好地確定最可能的有效候選物。減少潛在候選物的數(shù)量是有用的，因為大概不可能合成和篩選與已知抑制性分子可能具有某些相似性的無數(shù)數(shù)量的化合物變化。這種分析在開發(fā)HIV蛋白酶抑制劑中已顯示出有效(Lam等，(1994)Science263380-384；Wlodawer等，(1993)Ann.Rev.Biochem.62543-585；Appelt(1993)PerspectivesinDrugDiscoveryandDesignl23~48；Erickson(1993)PerspectivesinDrugDiscoveryandDesignl:109_128)?；蛘撸》肿游膸斓碾S機篩選可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)物，然后可以通過上述的計算機模擬方法分析它們的活性，以更好地確定它們作為抑制劑或激活劑的有效性。適合于搜索三維數(shù)據(jù)庫的程序包括MACCS-3D和ISIS/3D(MolecularDesignLtd,SanLeandro,CA)，ChemDBS_3D(ChemicalDesignLtd.，Oxford,UK)禾口Sybyl/3DBUnity(TriposAssociates,StLouis，MO)。適合于化合物選擇和設(shè)計的程序包括例如DISCO(AbbottLaboratories,AbbottPark,IL),Catalyst(Bio-CADCorp.,MountainView,CA)和ChemDBS-3D(ChemicalDesignLtd.，Oxford,UK)。使用本發(fā)明的信息設(shè)計的化合物可以結(jié)合所有端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域、核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或“拇指”結(jié)構(gòu)域，或其中的一部分，它們與已知的端粒酶抑制劑相比，可能更有力、更特異、毒性更低或更有效。設(shè)計的化合物也可以效力較低，但是在體內(nèi)和/或體外具有更長的半衰期，因此對于長時期在體內(nèi)和/或體外調(diào)節(jié)端粒酶活性來說更有效。這樣設(shè)計的調(diào)節(jié)物可用于抑制或活化端粒酶活性，以例如改變細胞的壽命或增殖能力。本發(fā)明還提供了使用分子設(shè)計技術(shù)，從小分子數(shù)據(jù)庫計算篩選能夠以與其天然底物類似的方式結(jié)合端粒酶的化學(xué)實體或化合物。這樣的計算篩選可以鑒定與本文公開的結(jié)構(gòu)域的一個或多個氨基酸殘基相互作用的各種不同基團，可用于合成本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。本發(fā)明也包括了體外(即溶液中)篩選分析方法。例如，這樣的分析方法包括將端粒酶、端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域(例如本文公開的)或帶有或不帶有TER的端粒酶TRBD結(jié)構(gòu)域的部分在溶液中混合，然后確定測試化合物是可以阻斷還是可以增加端粒酶活性。類似地，可以進行體外分析方法以監(jiān)測在存在或不存在測試化合物的情況下核苷酸或DNA的結(jié)合?？梢园凑毡景l(fā)明的方法篩選的化合物一般源自于藥劑或化合物的文庫。這樣的文庫可以包含純藥劑的集合或藥劑混合物的集合。純藥劑的例子包括但不限于蛋白、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、糖類、脂類、合成或半合成的化學(xué)物質(zhì)，以及純的天然產(chǎn)物。藥劑混合物的例子包括但不限于原核或真核細胞和組織的提取物，以及發(fā)酵培養(yǎng)基和細胞或組織培養(yǎng)上清液?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫也可以從許多來源獲得，包括劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心(CambridgeCrystallographicDataCentre)(Cambridge，UK)禾口化學(xué)摘要月艮務(wù)部(ChemicalAbstractsService)(Columbus,OH)。從頭設(shè)計程序包括Ludi(BiosymTechnologiesInc.,SanDiego,CA),Sybyl(TriposAssociates)禾口Aladdin(DaylightChemicalInformationSystems,Irvine,CA)。文庫篩選可以使用任何常規(guī)方法來進行，可以任何允許快速制備和處理多個反應(yīng)的格式執(zhí)行。對于體外篩選分析來說，可以手動制備測試化合物以及分析測試成分的儲液，所有隨后的吸取、稀釋、混合、洗滌、溫育、樣品讀取和數(shù)據(jù)收集，使用可商購的機器人吸取設(shè)備、自動化工作站和用于檢測分析產(chǎn)生的信號的分析儀器來進行。這樣的檢測器的例子包括但不限于照度計、分光光度計和熒光計，以及測量發(fā)生性同位素衰變的裝置。在設(shè)計或篩選了與本文公開的結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物后，然后測試化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力。端粒酶的這種活性包括端粒酶催化活性(可以是持續(xù)或不持續(xù)性的活性)，端粒酶的持續(xù)合成能力，常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄酶活性，核溶解活性，引物或底物(端粒或合成的端粒酶底物或引物)結(jié)合活性，dNTP結(jié)合活性，RNA(即TER)結(jié)合活性，以及蛋白結(jié)合活性(例如與端粒酶結(jié)合蛋白、端粒結(jié)合蛋白或蛋白-端粒DNA復(fù)合物結(jié)合)。參見例如在美國專利No.7，262，288中公開的分析方法。端粒酶催化活性打算包含端粒酶通過添加部分、一個或一個以上由模板核酸(例如TER)編碼的序列(例如TTAGGG)的重復(fù)序列，來延伸用作端粒酶底物的DNA引物的能力。該活性可以是持續(xù)或不持續(xù)性的。當(dāng)端粒酶RNP在DNA被酶復(fù)合物釋放之前向引物或端粒酶添加了多個重復(fù)序列時，發(fā)生持續(xù)性活性。當(dāng)端粒酶向引物添加一部分或僅僅一個重復(fù)序列然后就被釋放時，發(fā)生了不持續(xù)性活性。但是，在體內(nèi)，不持續(xù)性反應(yīng)可以通過結(jié)合、延伸和解離的連續(xù)循環(huán)，添加多個重復(fù)序列。這在體外也可以發(fā)生，但是在標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中一般不能觀察到，這是因為在標(biāo)準(zhǔn)的分析條件中，引物與端粒酶相比摩爾數(shù)極大過量。常規(guī)的用于測定端粒酶催化活性的分析方法公開在例如Morin(1989)Cell59:521;Morin(1997)Eur.J.Cancer33750；美國專利No.5，629，154；WO97/15687；WO95/13381；Krupp等，(1997)NucleicAcidsRes.25919；Wright等，(1995)Nuc.AcidsRes.233794；Tatematsu等，(1996)Oncogene13:2265中。端粒酶的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄酶活性描述在例如Morin(1997)同上，和Spence等，(1995)Science267:988中。因為端粒酶含有反轉(zhuǎn)錄酶催化活性所需的保守氨基酸基序，因此端粒酶具有轉(zhuǎn)錄某些外源(例如非TER)RNAs的能力。常規(guī)的RT分析方法測量酶通過延伸退火的DNA引物轉(zhuǎn)錄RNA模板的能力。反轉(zhuǎn)錄酶活性可以以本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的大量方式進行測量，例如通過監(jiān)測標(biāo)記的核酸引物(例如RNA或DNA)的尺寸的增加，或標(biāo)記的dNTP的摻入。參見例如Ausubel等，(1989)《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Johnffiley&Sons,NewYork,NY。因為端粒酶與TER特異性結(jié)合，可以認識到用于常規(guī)RT分析的DNA引物/RNA模板可以被修飾，以具有與TER和/或端粒DNA引物相關(guān)的特征。例如，RNA可以具有序列(CCCTAA)n，其中n是至少1，或至少3，或至少10或以上。在一個實施方案中，(CCCTAA)ng域位于RNA的5’末端處或附近(類似于端粒酶RNAs中模板區(qū)的5’位置)。類似地，DNA引物可以具有含有一部分TTAGGG端粒序列的3’末端，例如XnTTAG，XnAGGG等，其中X是非端粒序列，n是6-30。在另一個實施方案中，DNA引物具有不與RNA模板互補的5’末端，使得當(dāng)引物與RNA退火時，引物的5’末端保持未結(jié)合。可用于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄分析方法的其他修改，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的。端粒酶的核溶解活性描述在例如Morin(1997)，同上，和Collins&Grieder(1993)GenesDev.71364中。當(dāng)DNA的3，末端位于DNA模板序列的5，邊界處時，端粒酶傾向于從寡核苷酸的3’末端移除核苷酸，通常只有1個，在人類和四膜蟲中，該核苷酸是端粒重復(fù)序列(在人類中是TTAGG)的第一個G。端粒酶傾向于移除G殘基，但是具有針對其他核苷酸的核溶解活性。這種活性可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的常規(guī)方法來監(jiān)測。端粒酶引物(端粒)結(jié)合活性描述在例如Morin(1997)，同上；Collins等，(1995)Cell81677；Harrington等，(1995)J.Biol.Chem.2708893中。有幾種方式可以分析引物結(jié)合活性；但是，大多數(shù)方法共同的步驟是將標(biāo)記的DNA引物與端粒酶或端粒酶/TER在適合的結(jié)合條件下溫育。此外，大多數(shù)方法使用了將未結(jié)合的DNA與結(jié)合蛋白的DNA分離開的手段。這樣的方法可以包括例如凝膠遷移分析或基質(zhì)結(jié)合分析。DNA引物可以是任何對端粒酶具有親和性的DNA，例如端粒DNA引物例如(TTAGGG)n，其中n可以是1_10，典型為3-5。3’和5’末端可以在重復(fù)序列的任何位置結(jié)束。引物也可以具有非端粒DNA的5’或3’延伸，可以便于標(biāo)記或檢測。引物也可以被衍生，例如以便于檢測或分離。端粒酶的dNTP結(jié)合活性描述在例如Morin(1997)，同上，和Spence等，(1995)，同上，中。端粒酶需要dNTPs來合成DNA。端粒酶蛋白具有核苷酸結(jié)合活性，可以以與其他核苷酸結(jié)合蛋白相似的方式來分析dNTP結(jié)合(Kantrowitz等，(1980)TrendsBiochem.Sci.5124)。典型情況下，可以按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的用于非端粒酶RT蛋白的方法，監(jiān)測標(biāo)記的dNTP或dNTP類似物的結(jié)合。端粒酶RNA(即TER)結(jié)合活性描述在例如Morin(1997)，同上；Harrington等，(1997)Science275973；Collins等，(1995)Cell81:677中。本發(fā)明的端粒酶蛋白的RNA結(jié)合活性，可以以與同上描述的DNA引物結(jié)合分析相似的方式，使用標(biāo)記的RNA探針來進行分析。用于分離結(jié)合和未結(jié)合的RNA以及用于檢測RNA的方法，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，可以以與對于DNA引物結(jié)合分析所描述的相似的方式應(yīng)用于本發(fā)明的活性分析。RNA可以是全長TER、TER片段，或其他被證實對端粒酶或TRBD具有親和性的RNAs。參見美國專利No.5，583，016和W96/40868。為了進一步評估使用本發(fā)明的方法鑒定的化合物的效能，本領(lǐng)域技術(shù)人員人員將會認識到，任何涉及端粒酶的特定疾病或病癥的模型系統(tǒng)，都可用于評估化合物的吸收、分布、代謝和排泄，以及它在急性、亞慢性和慢性研究中的潛在毒性。例如，效應(yīng)物或調(diào)節(jié)物化合物可以在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中用于復(fù)制型壽命的分析方法中進行測試(Jarolim等，(2004)FEMSYeastRes.5(2)169-77)也參見McChesney等，(2005)Zebrafish1(4):349_355和Nasir等，(2001)Neoplasia3(4):351_359，其中描述了用于分析端粒酶活性的海洋哺乳動物和狗組織的模型系統(tǒng)。與本文公開的一個或多個端粒酶結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物，可用于調(diào)節(jié)(即阻斷或抑制，或增強或活化)端粒酶的方法中。這樣的方法包括將端粒酶在體外或體內(nèi)與有效量的與本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基相互作用的化合物相接觸，以便調(diào)節(jié)端粒酶活性。效應(yīng)物或調(diào)節(jié)性化合物的有效量，是與未接觸化合物的端粒酶相比，將端粒酶的活性降低或增加至少30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或100%的量。這種活性可以通過檢測端粒酶活性的酶法分析，或通過監(jiān)測已知與端粒酶相關(guān)或受端粒酶調(diào)控的蛋白的表達或活性，來進行監(jiān)測。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認識到，調(diào)節(jié)端粒酶活性可用于在模型系統(tǒng)中選擇性分析端粒酶信號傳導(dǎo)事件，以及用于預(yù)防或治療涉及端粒酶的疾病和病癥。用于預(yù)防或治療特定疾病或病癥的化合物的選擇，將依賴于具體的疾病或病癥。例如人類端粒酶參與癌癥，因此抑制端粒酶的化合物可用于預(yù)防或治療癌癥，包括實體腫瘤(例如乳腺、前列腺和結(jié)腸的腺癌；黑素瘤；非小細胞肺癌；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；以及骨骼、乳腺、消化系統(tǒng)、結(jié)腸直腸、肝臟、胰腺、垂體、睪丸、眼眶、頭頸部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、聽覺、骨盆、呼吸道和泌尿生殖腫瘤)，以及白血病(例如B細胞、混合細胞、裸細胞、T細胞、T細胞慢性、淋巴細胞性急性、淋巴細胞性慢性、肥大細胞和髓細胞性白血病)。表達端粒酶活性的癌細胞(例如惡性腫瘤細胞)(端粒酶陽性細胞)，可以通過降低或抑制內(nèi)源性端粒酶活性使其死亡。此外，因為端粒酶水平與疾病特征例如轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)(例如美國專利Nos.5，639，613；5,648，215；5,489，508；Pandita等，(1996)Proc.Am.Ass.CancerRes.37559)，因此端粒酶活性的任何降低可能將癌癥的攻擊性本性降低到更可控制的疾病狀態(tài)(增加傳統(tǒng)干預(yù)的效能)。作為說明，實施例3描述了基于細胞的分析方法，以及可用于評估腫瘤細胞生長被一種或多種本發(fā)明的化合物抑制的動物模型系統(tǒng)。另一種可用于評估本發(fā)明的化合物的抗癌癥活性的方法，包括由國立癌癥研究所(NationalCancerInstitute)進行的多種人類癌細胞株篩選分析方法(參見例如Boyd(1989)在《癌癥腫瘤學(xué)原理與實踐最新進展〉〉中(inCancer-PrinciplesandPracticeofOncologyUpdates)，DeVita等主編，PP.1-12)。這種含有大約60種不同人類癌細胞株的篩選組，是廣泛不同腫瘤類型的體內(nèi)抗腫瘤活性的有用指標(biāo)(Grever等，(1992)SeminarsOncol.19622；Monks等，(1991)Natl.CancerInst.83:757_766)，例如白血病、非小細胞肺、結(jié)腸、黑素瘤、卵巢、腎臟、前列腺和乳腺癌?？鼓[瘤活性可以用ED5Q(或GI5Q)表示，其中ED5Q是有效將細胞生長降低50%的化合物的摩爾濃度。具有較低ED5(1值的化合物與具有較高ED5(1值的化合物相比，傾向于具有較高的抗癌活性。在一種或多種體外分析中證實了化合物的潛在活性后，進一步的評估一般在實驗室動物中體內(nèi)進行，例如在患有B16黑素瘤的小鼠中測量肺部小結(jié)轉(zhuǎn)移的減少(例如Schuchter等，(1991)CancerRes.51:682_687)。也可以使用例如人類B-CLL在小鼠中的異體移植模型，來評估本發(fā)明的化合物單獨或作為藥物組合化學(xué)療法的效能(例如Mohammad等，(1996)Leukemia10:130-137)。這樣的分析方法典型地包含將原發(fā)腫瘤細胞或腫瘤細胞株注射到免疫受損的小鼠中(例如SCID小鼠或其他適合的動物)，并允許腫瘤生長。然后用本發(fā)明的化合物處理攜帶腫瘤的小鼠，并測量腫瘤尺寸以跟蹤治療的效果?；蛘?，可以在注射腫瘤細胞之前給藥本發(fā)明的化合物，以評估腫瘤的預(yù)防。最后，在人類臨床試驗中評估本發(fā)明的化合物的安全性和效能?；罨虼碳ざ肆Ｃ富钚缘幕衔锟捎糜谟蓪ο笾屑毎ダ纤T導(dǎo)或惡化的疾病或病癥的治療或預(yù)防方法；用于在例如衰老發(fā)生后降低對象衰老速度的方法；用于延長對象的壽命的方法；用于治療或預(yù)防與壽命相關(guān)的疾病或病癥的方法；用于治療或預(yù)防與細胞的增殖能力相關(guān)的疾病或病癥的方法；以及用于治療或預(yù)防由細胞損傷或死亡所引起的疾病或病癥的方法。某些衰老疾病的特征為由于細胞中端粒酶活性的缺乏(或低得多的水平)引起的端粒長度減小(與較年輕的細胞相比)所導(dǎo)致的與細胞衰老相關(guān)的變化。端粒酶活性和端粒的長度可以通過例如增加細胞中端粒酶的活性來增加。與細胞衰老相關(guān)的、可以用增加的端粒酶活性治療的病癥的部分名單包括阿茨海默氏病，帕金森氏癥，亨廷頓舞蹈癥以及中風(fēng)；體被與衰老相關(guān)的疾病例如皮膚萎縮、彈性組織分解和皮膚起皺，頭發(fā)發(fā)白和脫發(fā)，慢性皮膚潰瘍，以及與衰老相關(guān)的傷口愈合變?nèi)?；變性性關(guān)節(jié)病；骨質(zhì)疏松癥；與衰老相關(guān)的免疫系統(tǒng)缺損(例如涉及例如B和T淋巴細胞，單核細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，NK細胞以及它們相應(yīng)的祖細胞)；與衰老相關(guān)的血管系統(tǒng)疾?。惶悄虿。灰约芭c衰老相關(guān)的黃斑變性。此外，端粒酶活化劑可用于增加細胞的增殖能力或細胞永生化，以產(chǎn)生例如新的細胞株(例如大多數(shù)人類體細胞)。預(yù)防或治療典型地包含向需要治療的對象給藥含有有效的、本發(fā)明的篩選方法中鑒定到的化合物的藥物組合物。在大多數(shù)情況下，對象是人類，但是農(nóng)業(yè)動物例如牲畜和禽類，以及伴侶動物例如狗、貓和馬，也明確地包含在本發(fā)明中?；衔锏膭┝炕蛴行Я勘贿x擇為具有所需的預(yù)防、減少或逆轉(zhuǎn)待治療疾病或病癥的至少一種征兆或癥狀的結(jié)果。用于在人類中治療癌癥和其他與端粒酶相關(guān)的疾病的方法，描述在美國專利Nos.5，489，508、5，639，613和5，645，986中。作為說明，患有癌癥(包括例如癌，黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤和白血病)的對象可能經(jīng)歷無法解釋的體重減輕、疲勞、發(fā)燒、疼痛、皮膚改變、不能愈合的瘡、乳腺或身體其他部分的增厚或結(jié)塊，或不斷的咳嗽或聲音嘶，其中使用本發(fā)明的化合物進行治療可以預(yù)防、減輕或逆轉(zhuǎn)這些癥狀中的一種或多種。藥物組合物可以采取可藥用的鹽和復(fù)合物的形式，可以以適合的劑量提供在可藥用載體中。這樣的藥物組合物通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法制備，并包含本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的載體。這樣的方法和成分的普遍認同的概要是《Remington藥物科學(xué)與實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),AlfonsoR.Gennaro主編，第20版，Lippincottffilliams&WilkinsPhiladelphia，PA，2000。可藥用載體、組合物或介質(zhì)，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封材料，參與了對象化合物從身體的一個器官或部分，向身體的另一個器官或部分的運載或運輸。每種載體必須在與制劑的其他成分相容，并且對被治療的對象無傷害的意義上是可接受的?？捎米骺伤幱幂d體的材料的例子包括糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；粉末黃耆膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂和栓劑用蠟；油類，例如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；Ringer‘s溶液；乙醇；pH緩沖溶液’聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及其他在藥物制劑中使用的無毒性相容物質(zhì)。潤濕劑、乳化劑和潤滑劑，例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包層劑、甜味劑、調(diào)味劑和增香劑、防腐劑和抗氧化劑，也可以存在于組合物中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實踐，本發(fā)明的組合物可以腸胃外(例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射)，局部(包括頰和舌下)，口服，鼻內(nèi)，陰道內(nèi)或直腸給藥。選擇的劑量水平將依賴于各種不同因素，包括使用的本發(fā)明的具體化合物的活性，給藥途徑，給藥時間，使用的具體化合物的排泄或代謝速度，治療的時間長度，與使用的具體化合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，待治療患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和以前的醫(yī)學(xué)史，以及醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的其他因素。具有本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)的醫(yī)生或獸醫(yī)，可以容易地確定和規(guī)定所需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以從低于為了獲得所需治療效果所需的水平的化合物劑量開始，并逐漸增加劑量，直到獲得所需療效。這被認為在專業(yè)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)，人們可以查閱關(guān)于特定化合物或類似化合物的現(xiàn)有文獻，以確定最適劑量。通過下面的非限制性實施例對本發(fā)明進行了更詳細的描述。實施例1嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)TERT的結(jié)構(gòu)蛋白表達和純化。嗜熱四膜蟲(T.thermophila)TERT的254-519位殘基通過有限蛋白水解進行鑒定，并克隆到在其N-末端含有可切開的6個組氨酸標(biāo)簽的修改版本的pET28b載體中。將蛋白在大腸桿菌E.coliBL21(pLysS)中，在20°C過表達4小時。細胞在50mMTris-HCl，10%甘油，0.5MKCl,5mM巰基乙醇和ImMPMSF,pH7.5中，在冰上通過超聲進行裂解。將蛋白首先在M-NTA柱上純化，然后用TEV在4°C過夜切開6個組氨酸標(biāo)簽。將TRBD/TEV混合物稀釋，使得咪唑的濃度為15mM，將蛋白混合物通過Ni_NTA柱以除去TEV、切開的標(biāo)簽和任何帶標(biāo)簽的蛋白。將Ni-NTA流出液濃縮到1ml，并稀釋到鹽濃度為0.15M。然后將稀釋的TRBD樣品通過P0R0S-HS柱(PerS印tiveBiosystems,Framingham,MA)。在該階段時，蛋白純度超過99%。最后將蛋白通過用50mMTris_HCl，10%甘油，0.5MKC1和2mMDTT，pH7.5預(yù)先平衡的SEPHADEX-S200孔徑排阻柱，以移除任何TRBD聚集物。將通過SDS-page和動態(tài)光散射分別顯示為純的、單一分散的蛋白，使用AMICON10K截留分子量(MILLIPORE，Billerica，MA)濃縮到8mg/ml，將蛋白儲存在4°C用于隨后的研究。在結(jié)晶試驗前將蛋白儲液在5mMTris-HCl,500mMKC1,ImMTCEP,pH7.5中透析。蛋白結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集。使用沉滴法，通過將一體積透析過的蛋白與一體積含有20%PEG3350,0.2MNaN03的儲液器溶液混合，在4°C下生長出衍射不佳(4入分辨率)的最初片狀的TRBD簇。通過將一體積透析過的蛋白與等體積的50mMHEPES(pH7.0),44%PEG400,0.4MNaN03,0.4MNaBr和ImMTCEP混合，在石蠟油下的微量批次托盤中，在4°C生長出單個的、衍射良好的晶體。將晶體收獲到含有25mMHEPES(pH7.0),25%PEG400,0.2MNaN03，0.2MNaBr和ImMTCEP的冷凍保護劑溶液中，在液氮中速凍。數(shù)據(jù)在NSLS，光束線X6A下收集，并用HKL-2000處理(Minor(1997)Meth.Enzymol.Macromole.Crystallogr.PartA276:307-326)(表3)。晶體屬于單斜晶系，在不對稱晶格中帶有一個單體。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*括號中的值對應(yīng)于最高分辨率外殼。結(jié)構(gòu)確定和改進。從使用蛋白與5mMHoC13共結(jié)晶制備的雙波長MAD鈥(Ho)衍生物，獲得了初始相。重原子位點使用SOLVE(Terwilliger(2003)MethodsEnzymol.374:22_37)定位，使用了MLPHARE對位點進行改進并計算新的相(CCP4(1994)ActaCrystallogr.D50:760_763)，如同在ELVES中執(zhí)行的(Hoiton&Alber(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:1537_1542)(表3)。初始的圖僅僅對一大半分子顯示出輪廓清晰的密度。分子的較小一半的密度弱的主要原因是相對于分子的較大一半來說內(nèi)在的移動性。與將模型構(gòu)建成密度相關(guān)的問題，由于缺少與特定側(cè)鏈例如硒代甲硫氨酸的位置有關(guān)的信息而進一步惡化。在構(gòu)建完整模型中關(guān)鍵的因素是在RESOLVE中的連續(xù)的PRIME^PSWITCH循環(huán)(Terwi11iger(2002)ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.581937-1940)，然后在COOT中手動構(gòu)建(Emsley&Cowtan(2004)ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.60:2126_2132)。模型使用CNS-S0LVE(Brunger等，(1998)ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.54:905_921)和REFMAC5(Murshudov等，(1997)ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.53=240-255)兩者進行改進。最后的改進循環(huán)使用如同在REFMAC5中進行的TLS限制來進行(表4)。圖在PYM0L中制備(DeLano(2002))，靜電表面在APBS中制備(Baker等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:10037-10041)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>TRBD結(jié)構(gòu)。為了研究端粒酶的必需RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)的功能，將通過有限蛋白水解鑒定的含有來自嗜熱四膜蟲的254-519位殘基的構(gòu)建物(圖1A)純化至均一。正如通過凝膠過濾和動態(tài)光散射二者所顯示的，該蛋白構(gòu)建物在溶液中是單體。將該構(gòu)建物的晶體容易地生長，并衍射到1.71A的分辨率(表3)。使用鈥衍生物，通過多波長反常色散(MAD)，將蛋白定相到2.7A的分辨率，并使用天然數(shù)據(jù)組將相擴展到1.71A的分辨率(表3)。在經(jīng)過改進的結(jié)構(gòu)中，257-266位和277-519位殘基存在清晰的密度。結(jié)構(gòu)含有12個a-螺旋，通過幾個長的環(huán)和兩個短的鏈連接在一起。螺旋被組織成使得分子被分成兩個不對稱的一半，通過三個延長的環(huán)相連。較大的一半由9個a-螺旋組成，其中之一(a11)沿著結(jié)構(gòu)域的中間并跨過其整個長度，與所有其他8個螺旋接觸。分子的較小一半由三個螺旋(α4，α5和α12)組成，它們都與蛋白的較大一半的平面以120°的角度排列。蛋白的較小一半比較大一半柔性稍微更大一些，正如由它的反映出該區(qū)域的內(nèi)在移動性的高B因數(shù)所表明的，并可以導(dǎo)致缺少可觀察的與RNA底物的接觸。結(jié)構(gòu)的一個有趣特點是由分別連接較大和較小一半的螺旋α11和α12的15個殘基形成的β-發(fā)夾。發(fā)夾從蛋白的兩個一半形成的裂縫的基部伸出，與分子的較小一半的平面成45°角。這種定位以及該發(fā)夾的密度輪廓清晰的事實，可以歸因于螺旋α7以及連接它與螺旋α8的環(huán)。這些元件都方便地定位在該發(fā)夾的背部，將它保持在位。使用Dali服務(wù)器(Holm&Sander(1996)Science273:595_603)在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中進行的搜索，沒有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)同源物，表明端粒酶的TRBD結(jié)構(gòu)域是一個新的核酸結(jié)合折疊。蛋白的兩個一半的總體組織與核酸識別和結(jié)合有顯著關(guān)聯(lián)。TRBD的RNA結(jié)合基序。TRBD結(jié)構(gòu)域與TER相互作用的能力，已經(jīng)歸因于被稱為CP-和T-基序的兩個保守基序，而第三個被稱為QFP-基序的基序被認為對于RNP的組裝是重要的(圖2A和2B)(Bosoy等，(2003)J.Biol.Chem.278:3882_3890；Bryan等，(2000)同上Jacobs等，(2005)同上；Xia等，(2000)Mol.Cell.Biol.20:5196_5207)。TRBD結(jié)構(gòu)顯示出，QFP-基序由幾個主要是疏水的殘基形成，它們位于分子的較大一半上，埋藏在結(jié)構(gòu)域的核心中，與周圍的殘基形成廣泛的疏水接觸，輔助蛋白的折疊。這些殘基包括Gln375，Ile376,Leu380,Ile383,Ile384,Cys387,Val388,Pro389,Leu392,Leu393,Asn397,Leu405,Phe408，Tyr422，11e423，Met426，Trp433和Phe434。QFP-殘基的位置和接觸表明它們不直接參與核酸結(jié)合。T-基序位于分子的中心，蛋白的兩個一半在那里相會，并且它由形成了β_發(fā)夾和螺旋α12二者的一部分的殘基構(gòu)成。這些結(jié)構(gòu)元件一起形成了狹窄的(10Α)、輪廓清晰的口袋(Τ-口袋)，由幾個暴露于溶劑的高度保守的殘基排列而成(Phe476，Tyr477,Thr479，Glu480，Tyr491，Arg492，Lys493和Trp496)。特別需要指出的是不變的殘基Tyr477和Trp496的側(cè)鏈，它們分別是β-發(fā)夾和螺旋α12的部分。這些殘基一起形成了“疏水鉗狀物”，可以夾住相互作用的RNA核苷酸的嘌呤/嘧啶基團。在該結(jié)構(gòu)中，Tyr477和Trp496的側(cè)鏈僅僅分開4A，不足以容納核苷酸堿基。在兩個側(cè)鏈之間插入堿基將需要T-口袋的結(jié)構(gòu)重排，可能將分子的兩個一半外張分開。除了其疏水部分之外，T-口袋還包含幾個親水殘基，例如Arg492和Lys493，二者都是暴露于溶劑的，并位于T-和CP-口袋的界面處，將二者連接到一起。CP-基序由螺旋α3和隨后的環(huán)形成。與作為狹窄的輪廓清晰的口袋的T-基序相反，CP-基序構(gòu)成淺的、寬的(20Α)、高度帶正電荷的空腔，位于Τ-口袋入口的附近和下方。形成CP-基序的幾個保守殘基包括Phe323，Leu327,Lys328,Lys329,Cys331,Leu333和Pro334。這些殘基埋在較大一半的核心或連接分子的兩半的區(qū)域中，有助于蛋白折疊。特別有趣的是殘基Leu327、Cys331、Leu333和Pro334，它們都是被埋的，并與T-基序的結(jié)構(gòu)元件直接接觸，從而幫助了CP-和T-口袋二者的形成。例如，Leu327和Cys331在不變的Phe476的大的疏水側(cè)鏈和保守的Arg492的側(cè)鏈的脂族部分的范德華接觸范圍內(nèi)，后兩者形成了β-發(fā)夾的一部分。有趣的是，Arg492位于螺旋α12的基部，它與Leu327、Cys331和Leu333的接觸部分幫助了將該螺旋定位成與分子的較大一半平行的平面成45°角，從而進一步促進了T-口袋的形成。此外，Arg492與Leu327、Cys331和Leu333的相互作用幫助了將胍基團、該殘基的唯一溶劑暴露部分，定位于由CP-和T-口袋形成的界面處。CP-口袋還包含幾個本質(zhì)上主要是疏水的、表面暴露的、保守的殘基。它們包括Lys328和Lys329，二者位于T-口袋的下方，與Arg492和Lys493緊密接近，一起形成了幾乎跨越分子的整個側(cè)面的單一的、大的、帶正電荷的表面區(qū)域。TRBD結(jié)構(gòu)和現(xiàn)有突變體。已經(jīng)分離了幾個影響RNA結(jié)合和端粒酶活性的TERT的突變體。這些突變體中的幾個被發(fā)現(xiàn)在TRBD結(jié)構(gòu)域中，特別是在T-和CP-基序中。這兩個基序中的單個和兩個以及跨度為4-10個氨基酸的丙氨酸取代，當(dāng)與野生型酶相比時，顯示了RNA結(jié)合親和性和聚合酶活性的中度到嚴(yán)重喪失(20-100%)(Bryan等，(2000)同上；Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。一組突變體Phe476Ala,Tyr477Ala,Thr479Ala,Glu480Ala,Arg492Ala禾口Trp496Ala，顯示出RNA結(jié)合親和性和端粒酶活性的嚴(yán)重喪失(80-100%)，表明這些殘基介導(dǎo)了與RNA底物的直接接觸(Bryan等，(2000)同上；Lai等，(2002)同上)。所有5個殘基都是T-基序的一部分，并且除了Phe476之外，所有它們的側(cè)鏈都是溶劑暴露的。在結(jié)構(gòu)中，Tyr477和Trp496二者位于T-口袋的基部，它們的側(cè)鏈形成了“疏水鉗狀物”。假設(shè)這些殘基的溶劑暴露的側(cè)鏈參與與ssRNA的堆積相互作用，將它們突變成小的丙氨酸將可能損害底物結(jié)合，這可以解釋RNA結(jié)合親和性和端粒酶功能的急劇喪失。與Tyr477和Trp496相反，Phe476被埋，對于與核酸底物的相互作用來說是不可接近的。相反，Phe476位于β-發(fā)夾的基部，對T-口袋的形成有顯著貢獻。將該殘基的大的疏水側(cè)鏈突變成小的丙氨酸，將可能導(dǎo)致該口袋的構(gòu)象重排和RNA結(jié)合親和性和端粒酶活性的喪失。也已經(jīng)分離了第二組丙氨酸突變體Leu327Ala，Lys329Ala，Cys331Ala和Pro334Ala，它們顯示了RNA結(jié)合親和性和端粒酶活性的中度喪失(Bryan等，(2000)同上；Miller等，(2000)同上)。Leu327和Cys331與Phe476和Arg492側(cè)鏈的脂族部分直接接觸，二者都位于T-基序的基部。突變成較小的丙氨酸殘基可能導(dǎo)致T-口袋的重排，潛在地導(dǎo)致與核酸底物的相互作用的喪失和功能的喪失。同樣地，Pro334位于螺旋α12的背部，并與該結(jié)構(gòu)元件的殘基直接接觸。螺旋012含有不變的1~11)496和保守的1^8493，二者形成了T-口袋的一部分。將Pro334突變成丙氨酸，可能導(dǎo)致螺旋α10的位移，和T-口袋的重新組織，導(dǎo)致功能的喪失。Lys329也位于螺旋α3上，與Leu327Ala、Cys331Ala和Pro334Ala不同，是溶劑暴露的，可能與核酸底物直接接觸。將它突變成丙氨酸將導(dǎo)致RNA相互作用的失去以及RNA結(jié)合親和性和端粒酶活性的喪失。TRBD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的穩(wěn)定RNP復(fù)合物的形成和重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力。在體內(nèi)，端粒酶作為穩(wěn)定的核糖核蛋白復(fù)合物存在，蛋白(TERT)和RNA成分(TER)之間的接觸由TEN、TRBD和RT結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。廣泛的生物化學(xué)和誘變研究顯示，TRBD參與了與TER的莖I和TBE的廣泛的、特異性的相互作用(Lai等，(2001)同上；0'Connor等，(2005)同上)(圖4)。TRBD與TER之間的接觸被認為促進了RNP復(fù)合物的適合的組裝和穩(wěn)定性，并促進了重復(fù)序列添加的持續(xù)合成能力(Lai等，(2003)同上)。在纖毛蟲中，除了TRBD之外，位于TRBD結(jié)構(gòu)域N-末端方向的保守基序(CP2)被認為是TERT-TER組裝和模板邊界確定所必需的(Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。但是，到目前為止，還不清楚端粒酶TRBD如何執(zhí)行該過程。本分析表明，TRBD結(jié)構(gòu)域被分成兩個不對稱的一半，通過幾個長的形狀類似回飛棒(boomerang)的環(huán)連接，這種排列方式與RNA識別和結(jié)合有顯著關(guān)聯(lián)。分子兩葉的總體組織導(dǎo)致在蛋白表面上形成了兩個輪廓清晰的空腔(CP-和τ-口袋)，它們由幾個溶劑暴露的、不變/保守的殘基構(gòu)成。T-口袋是狹窄、深的空腔，位于分子的兩半的連接處，其一部分在本質(zhì)上是疏水的，而位于CP-口袋近端的部分帶正電荷。有趣的是，Tyr477和Trp496的疏水側(cè)鏈?zhǔn)侨軇┍┞兜?，彼此堆積形成了狹窄的“疏水鉗狀物”，在該結(jié)構(gòu)中不能容納核苷酸堿基。但是，值得注意的是，含有Trp496的螺旋α12相對于含有Tyr477的β-發(fā)夾來說有些柔性。螺旋α12以及因此Trp496可以移動的能力，可能將兩個側(cè)鏈外展分開，從而允許在它們之間容納核苷酸堿基所需的空間。另一種可能性是Tyr477和Trp496的極性基團可以一起發(fā)揮作為核苷酸堿基的作用，能夠允許與引入的核苷酸堿基形成假性Watson-Crick相互作用。假性Watson-Crick相互作用以前已經(jīng)在許多蛋白核酸復(fù)合物中觀察到，包括Rho轉(zhuǎn)錄終止因子(Bogden等，(1999)Mol.Cell3:487-493)以及信號識別粒子(Wild等，(2001)Science294:598_601)。T-口袋的疏水部分的寬度和組織表明它結(jié)合ssRNA，更可能是TBE，可能由堆積相互作用的網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)。與T-口袋相反，CP-口袋是帶正電荷的、淺的空腔，位于分子的側(cè)面，形成了T-口袋的延伸。T-口袋與CP-口袋的親水部分一起，排列有幾個賴氨酸和精氨酸，其側(cè)鏈?zhǔn)侨軇┍┞兜?，可能參與了與雙鏈RNA骨架的直接接觸。該口袋的寬度和化學(xué)本質(zhì)表明，它結(jié)合雙鏈RNA，更可能是莖I或莖II(圖4)。由TRBD結(jié)合口袋介導(dǎo)的蛋白/核酸相互作用的本質(zhì)和程度，提供了功能性核糖核蛋白酶的適當(dāng)組裝所需的穩(wěn)定性，并將TERT引導(dǎo)到與端粒酶功能有顯著關(guān)聯(lián)的TER結(jié)合位點上(在莖I和II之間)。端粒酶在線性染色體的末端處添加多個短的寡核苷酸重復(fù)序列的能力是獨特的。酶這樣作用的能力已被部分歸因于TRBD結(jié)構(gòu)域與TBE、以及在纖毛蟲中與TRBD和CP2基序二者的相互作用(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)同上；Miller等，(2000)同上)。TBE由莖II和側(cè)翼的ssRNA區(qū)域構(gòu)成，位于莖I的下游和RNA模板僅僅幾個核苷酸的上游(圖4)。TRBD的結(jié)構(gòu)表明，T-口袋，位于蛋白表面上只能夠容納ssRNA的狹窄的疏水空腔，可能在該過程中發(fā)揮重要作用。假設(shè)T-口袋與連接莖I和莖II的ssRNA結(jié)合，這種相互作用迫使莖II用作空間位阻，反過來迫使TRBD結(jié)構(gòu)域保持在莖I和莖II的邊界中。然后莖I和II鎖定的TRBD結(jié)構(gòu)域可以用作錨，限制了RT結(jié)構(gòu)域可以移動的距離，并防止它移動到RNA模板的邊界之外，從而促進了端粒酶添加的持續(xù)合成能力。但是，在纖毛蟲中，單獨的TRBD結(jié)構(gòu)域不足以用于確定模板邊界，它需要CP2基序的作用(Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。考慮到了CP2與TER的結(jié)合，通過有助于RNP復(fù)合物的穩(wěn)定化作用，或者象TRBD—樣，它可以用作錨阻止RT結(jié)構(gòu)域的活性位點滑動到RNA模板之外，來促進模板邊界的確定。實施例2赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)TERT的結(jié)構(gòu)蛋白表達和純化。將合成的赤擬谷盜(T.castaneum)全長TERT基因克隆到其N-末端含有可切開的6個組氨酸標(biāo)簽的修改版本的pET28b載體中。將蛋白在大腸桿菌E.coliBL21(pLysS)中，在30°C過表達4小時。細胞在50mMTris-HCl，10%甘油，0.5MKCl，5mMβ-巰基乙醇和ImMPMSF,ρΗ7.5中，在冰上通過超聲進行裂解。將蛋白首先在Ni-NTA柱上純化，然后在4°C過夜用TEV切開6個組氨酸標(biāo)簽。將TERT/TEV混合物透析以除去過量咪唑，然后將蛋白在第二個Ni-NTA柱上進一步純化，以除去所有帶組氨酸標(biāo)簽的產(chǎn)物。然后將Ni-NTA流出液通過POROS-HS柱(Pers印tiveBiosystems)，以除去任何痕量的蛋白污染物。在該階段時，蛋白純度超過99%。最后將蛋白在用50mMTris-HCl，10%甘油，0.5MKCl和ImM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，pH7.5預(yù)先平衡的SEPHADEX-S200孔徑排阻柱上純化，以移除任何TRBT聚集物，并使用AMICON30K截留分子量(MILLIP0RE)將蛋白濃縮到10mg/ml，并儲存在4°C用于隨后的研究。在結(jié)晶試驗前將蛋白儲液在IOmMTris-HCl,200mMKCl，ImMTCEP，pH7.5中透析。蛋白結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集。最初的單獨蛋白的結(jié)晶試驗不能產(chǎn)生晶體。蛋白與單鏈端粒DNA((TCAGG)3)的共結(jié)晶產(chǎn)生了兩種桿狀晶體形式，其中一種屬于斜方晶系P2A2”并衍射到2.71A,另一種屬于六方晶系Pe1,衍射到3.25A分辨率。在設(shè)置結(jié)晶試驗之前，通過將一體積透析過的蛋白與1.2倍過量的DNA底物混合，來制備蛋白核酸混合物。形成了兩種晶體，其中使用蒸汽擴散沉滴法，通過將一體積蛋白-DNA混合物與一體積儲液器溶液混合進行生長。斜方晶體在存在50mMHEPES(pH7.0)和1.5MNaNO3的情況下生長，而六方晶體在存在IOOmMTris(pH8.0)和2M(NH4)2SO4的情況下生長，都在室溫下進行。將斜方晶體收獲到含有50mMHEPES(pH7.0)，25%甘油，1.7MNaN03，0.2MKCl禾口ImMTCEP的冷凍保護劑溶液中，并在液氮中速凍。將六方晶體收獲到含有IOOmMTris(pH8.0),25%甘油，2M(NH4)2S04，0.2MKCl和ImMTCEP的冷凍保護劑溶液中，也在液氮中速凍。數(shù)據(jù)在NSLS，光束線X6A下收集，并用HKL-2000處理(Minor(1997)MethodsinEnzymologyMacromolecularCrystallography,partA276:307_326)(表5)。兩種晶體形式在不對稱晶格中含有二聚體。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*最高分辨率外殼顯示在括號中。結(jié)構(gòu)確定和改進。使用在兩種不同波長處(Hgl-1.00850A;Hg2-1.00800Α)從兩種不同的汞(CH3HgCl)衍生的晶體收集的數(shù)據(jù)組，使用帶有反常信號的單一同晶置換(SIRAS)方法，獲得了斜方晶體的初始相(表5)。衍生物通過將晶體用5mM甲基氯化汞(CH3HgCl)浸泡15分鐘來制備。最開始，使用SOLVE(TerwiIliger(2003)MethodsEnzymol.374:22_37)定位了12個重原子位點并改進，^ifflMLPHARE(CollaborativeComputationalProject4(1994)ActaCrystallogr.D50760-763)計算新的相。使用MLPHARE增強的相，通過將反常差異圖計算到3.5A分辨率，來鑒定剩余的重原子位點(總共22個)。然后將使用所有重原子位點獲得的MLPHARE相用于帶有二倍NCS的DM中，使用收集到的高分辨率(2.71A)數(shù)據(jù)組，在1.00800A波長處進行相擴展，以計算初始實驗圖。這些圖對于在C00T中(Emsley&Cowtan(2004)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60:2126_32)進行模型構(gòu)建已足夠好。電子密度圖顯示出蛋白的所有596個殘基的清晰的密度。但是，結(jié)構(gòu)中核酸底物的密度沒有觀察到。使用CNS-S0LVE(Brunger等，(1998)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr54:905_21)禾口REFMAC5(Murshudov等，(1997)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr53240-55)二者對模型進行改進。最后一輪的改進使用如同在REFMAC5中進行的TLS限制來進行(表5)。使用P2A2:改進過的模型，通過使用PHASER(Potterton等，(2003)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr59:1131_7)進行分子置換，解析了以Pei結(jié)晶形式結(jié)晶的TERT的結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)在0.97980A波長處收集)。TERT結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。以2.71人分辨率測定了赤擬谷盜(T.castaneum)活性端粒酶的全長催化亞基TERT的結(jié)構(gòu)。正如顯示的，在不對稱晶胞(AU)中存在二聚體，但是單獨的蛋白在溶液中明顯是單體，正如通過凝膠過濾和動態(tài)光散射所顯示的，表明在晶體中觀察到的二聚體是晶體堆積的結(jié)果。這得到了下述事實的進一步支持，即同樣蛋白的不同結(jié)晶形式(表5)也在不同構(gòu)型的AU中包含二聚體。值得注意的是，來自該生物體的TERT不包含TEN結(jié)構(gòu)域，這是端粒酶的低保守區(qū)域(圖1B)。TERT結(jié)構(gòu)由三個不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，TER結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域以及被認為代表了TERT的推衍的“拇指”結(jié)構(gòu)域的C-末端延伸部分(圖IA和1B)。正如本文顯示的，TRBD主要是螺旋，在其表面上包含由兩個分別結(jié)合雙鏈和單鏈RNA的保守基序(CP和T)形成的缺口，已經(jīng)被定義為是端粒酶TER的RNA底物的模板邊界元件。來自赤擬谷盜的TRBD結(jié)構(gòu)域與來自嗜熱四膜蟲結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)比較顯示出兩種結(jié)構(gòu)是相似的(RMSD2.7A)，表明在不同系統(tǒng)發(fā)育組的生物體中這些結(jié)構(gòu)域之間的高度的結(jié)構(gòu)保守性。RT結(jié)構(gòu)域是組織成兩個亞結(jié)構(gòu)域的α-螺旋和β-鏈的混合物，這兩個亞結(jié)構(gòu)域最類似于反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶例如HIV反轉(zhuǎn)錄酶(PDBcodeID1Ν5Y；Sarafianos等，(2002)EMBOJ.21:6614-24)，病毒RNA聚合酶例如丙型肝炎病毒聚合酶(CodeID2BRL；DiMarco等，(2005)J.Biol.Chem.28029765-70)和B家族的DNA聚合酶例如RB69(PDBCodeIDlWAF;Wang等，(1997)Cell891087-99)的“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域，并包含這些蛋白家族的里程碑式的關(guān)鍵標(biāo)志基序(Lingner等，(1997)Science276:561_7)(圖3A-3C)。TERT與HIVRTs的結(jié)構(gòu)比較，顯示出TERT的“手指”亞結(jié)構(gòu)域(即基序1和2)相對于“手掌”亞結(jié)構(gòu)域(即基序A，B’，C，D和E)來說排列成開放的構(gòu)型，這與HIVRTs在缺少結(jié)合的核苷酸和核酸底物的情況下所采用的構(gòu)型非常一致(Ding等，(1998)J.Mol.Biol.284:1095-111)。TERT與HIV反轉(zhuǎn)錄酶的推衍的“手掌”結(jié)構(gòu)域之間的一個顯著差異，是TERT的基序A和B'之間被稱為IFD基序的長的插入片段，它為端粒酶的持續(xù)合成能力所必需(Lue等，(2003)Mol.CellBiol.23:8440_9)。在TERT結(jié)構(gòu)中，IFD摻入片段由位于環(huán)的外周上“手指”與“手掌”亞結(jié)構(gòu)域的界面處的兩個反向平行的α-螺旋(α13和α14)構(gòu)成。這兩個螺旋與環(huán)平面的中心軸幾乎平行定位，與螺旋α10和α15進行廣泛接觸，在RT結(jié)構(gòu)域的該部分的結(jié)構(gòu)組織中發(fā)揮重要作用。在病毒聚合酶中也存在類似的結(jié)構(gòu)排列，在這些結(jié)構(gòu)中，螺旋α10的等價物參與了與核酸底物的直接接觸(Ferrer-Orta等，(2004)J.Biol.Chem.279:47212_21)。與RT結(jié)構(gòu)域相反，C-末端延伸部分是細長的螺旋束，含有幾個表面暴露的長的環(huán)。在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中使用軟件SSM(Krissinel&Henrick(2004)ActaCryst.D602256-2268；Krissinel(2007)Bioinformatics23:717_723)進行的搜索沒有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)同源物，表明端粒酶的CTE結(jié)構(gòu)域采用了新的折疊。TERT與HIVRT、病毒RNA聚合酶和B家族的DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)比較，將這些酶的“拇指”結(jié)構(gòu)域和TERT的CTE結(jié)構(gòu)域放置在相對于“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域相同的空間位置中，表明端粒酶的CTE結(jié)構(gòu)域是酶的“拇指”結(jié)構(gòu)域，該發(fā)現(xiàn)與以前的生物化學(xué)研究非常一致(Hossain等，(2002)J.Biol.Chem.27736174-80)。TERT結(jié)構(gòu)域組織將構(gòu)成分子的末端結(jié)構(gòu)域的TRBD和“拇指”結(jié)構(gòu)域帶到一起，這種排列方式導(dǎo)致形成了類似汽車輪胎形狀的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1C)。幾條證據(jù)表明，本文提出的TERT結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域組織是生物學(xué)相關(guān)的。首先，在兩種不同晶體形式中觀察到的4個TERT單體的結(jié)構(gòu)域(每種不對稱晶胞中各2個)，其組織是相同的(所有4個單體之間平均RMSD=0.76A)。其次，TERT的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域之間的接觸是廣范圍的(1677A2)，在本質(zhì)上主要是疏水的，涉及氨基酸殘基174、1^876、11^79、611184、3吐81、His87、Asnl42、Hisl44、Glul45、Tyr411、His415、Phe417、Trp420、Phe422、Ile426、Phe434、Thr487、Ser488、Phe489和Arg592。這個觀察與以前的生物化學(xué)研究相一致(Arai等，(2002)J.Biol.Chem.277:8538_44)。第三，TERT結(jié)構(gòu)域的組織與其最接近的同源物HIV反轉(zhuǎn)錄酶(Sarafianos等，(2002)同上)、病毒RNA聚合酶(DiMarco等，(2005)同上)和B家族的DNA聚合酶，特別是RB69(Wang等，(1997)同上)的聚合酶結(jié)構(gòu)域(p66減去RNaseH結(jié)構(gòu)域)的組織相似。TERT結(jié)構(gòu)域的排列方式在顆粒的內(nèi)部產(chǎn)生了26A寬、21A深的孔，足以容納大約7到8個堿基長的雙鏈核酸，與現(xiàn)有的生物化學(xué)數(shù)據(jù)非常一致(Forstemarm&Lingner(2005)EMBORep.6361-6；Hammond&Cech(1998)Biochemistry37:5162_72)。TERT環(huán)結(jié)合雙鏈核酸。為了理解TERT環(huán)如何與RNA/DNA結(jié)合以形成功能性延伸復(fù)合物，使用TERT的最接近的結(jié)構(gòu)類似物HIV反轉(zhuǎn)錄酶-DNA復(fù)合物(Sarafianos等，(2002)同上)，將雙鏈核酸模擬到內(nèi)部。TERT-RNA/DNA模型立即顯示出某些顯著的特點，支持了TERT-核酸結(jié)合的模型。TERT環(huán)的孔和核酸異源雙鏈體突出以進行結(jié)合的部位排列有幾個該家族聚合酶標(biāo)志性的關(guān)鍵標(biāo)志基序，它們已經(jīng)被暗示參與了核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合和DNA合成。此外，這些基序的組織導(dǎo)致了在環(huán)的內(nèi)部形成了類似于雙鏈核酸骨架的幾何形狀的螺旋形。幾個被鑒定為與DNA底物的接觸點的基序，部分由帶正電荷的殘基形成，它們的側(cè)鏈朝向環(huán)的中心延伸并互相平衡，用于與DNA底物的骨架直接接觸。例如，高度保守的形成了螺旋α10的一部分的Κ210的側(cè)鏈，位于模型化的DNA的骨架的配位距離內(nèi)，從而提供了功能性端粒酶所需的穩(wěn)定性。螺旋α10位于RT結(jié)構(gòu)域的上部區(qū)段中，朝向環(huán)的內(nèi)部。該螺旋的位置和穩(wěn)定作用受到與IFD基序的廣范圍接觸的強烈影響，該IFD基序與端粒酶的持續(xù)合成能力相關(guān)(Lue等，(2003)Mol.CellBiol.238440-9)。通過該基序的缺失或突變破壞IFD與螺旋α10的接觸，將導(dǎo)致螺旋α10從其當(dāng)前位置的位移，反過來影響DNA結(jié)合和端粒酶功能。定位于環(huán)內(nèi)部的“拇指”結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)元件，也與模型化的DNA底物進行了幾處接觸。具體來說，將“手掌”連接到“拇指”結(jié)構(gòu)域上，并構(gòu)成了也被稱為端粒酶的“引物手柄”區(qū)的E基序的延伸部分的環(huán)(“拇指”環(huán))，在相當(dāng)大程度上保護了雙鏈核酸骨架的幾何形狀。形成了該環(huán)的一部分的幾個賴氨酸(例如LyS406，LyS416，LyS418)和天冬酰胺(例如Asn423)的側(cè)鏈，朝向TERT分子的中心延伸，位于模型化的雙鏈核酸骨架的配位距離之內(nèi)。特別有趣的是Lys406。該賴氨酸位于基序E的近端，其側(cè)鏈朝向核酸異源雙鏈體延伸并處于平衡中，以便與位于引入的DNA引物的3’末端的核苷酸的骨架直接接觸。因此，有可能該賴氨酸的側(cè)鏈與基序E—起，幫助促進了在端粒延伸過程中將引入的DNA底物的3’-末端放置在酶的活性位點處。來自廣范圍系統(tǒng)發(fā)育組的TERTs的“拇指”結(jié)構(gòu)域的序列比對，顯示出預(yù)測與DNA底物接觸的殘基總是極性的(圖3A-3C)?！澳粗浮苯Y(jié)構(gòu)域支持雙鏈核酸結(jié)合的另一個特點是螺旋α19，一個31(1螺旋(“拇指”31(1螺旋)，它延伸到環(huán)的內(nèi)部，顯示出將它自身?？吭谀Ｐ突p鏈核酸的小溝中，從而促進了RNA/DNA雜交體結(jié)合和穩(wěn)定化。在酵母和人類TERT中缺失或突變相應(yīng)的殘基，導(dǎo)致TERT的持續(xù)合成能力的嚴(yán)重喪失，明確表明了該基序在TERT功能中的重要作用(Hossain等，(2002)J.Biol.Chem.27736174-80；Huard等，(2003)NucleicAcidsRes.314059-70；Banik等，Mol.CellBiol.22:6234_46)。TERT的活性位點和核苷酸結(jié)合。本文顯示的赤擬谷盜TERT結(jié)構(gòu)是在不存在核苷酸底物和鎂的情況下結(jié)晶的，但是，在現(xiàn)有生物化學(xué)數(shù)據(jù)(Lingner等，(1997)同上)，并與其最接近的類似物HIV反轉(zhuǎn)錄酶(Das等，(2007)J.Moll.Biol.365:77-89)的聚合酶結(jié)構(gòu)域進行了結(jié)構(gòu)比較的基礎(chǔ)上確定了TERT的活性位點和核苷酸結(jié)合口袋的位置和組織。TERT活性位點由3個不變的天冬氨酸(Asp251，Asp343和Asp344)構(gòu)成，它們形成了基序A和C的一部分，這兩個基序是位于“手掌”亞結(jié)構(gòu)域上并與TERT的“手指”接近的兩個短的環(huán)。TERT與HIV反轉(zhuǎn)錄酶以及RNA和DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)比較顯示，在這些蛋白家族的活性位點之間存在高度相似性，表明端粒酶也使用雙金屬機制進行催化。這些TERT天冬氨酸的丙氨酸突變體導(dǎo)致TERT活性的完全喪失，表明這些殘基是端粒酶功能中不可缺少的角色(Lingner等，(1997)同上)。端粒酶核苷酸結(jié)合口袋位于TERT的“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域的界面處，由形成了參與模板和核苷酸結(jié)合的基序1、2、A、C、B'和D的保守殘基構(gòu)成(BOSOy&Lue(2001)J.Biol.Chem.27646305-12；Haering等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6367_72)。TERT與結(jié)合ATP的HIV反轉(zhuǎn)錄酶(Das等，(2007)同上)的結(jié)構(gòu)比較，支持了核苷酸底物位于該位置中。分別來自基序A和C的兩個高度保守的、表面暴露的殘基Tyr256和Val342，形成了疏水口袋，它靠近并位于三個催化性天冬氨酸的上方，可以容納核苷酸底物的基部。核苷酸結(jié)合在該油性口袋中，將三磷酸酯部分放置在酶的活性位點的近端，與一個Mg2+離子配位，同時它將核糖基團放置在不變的谷氨酰胺(Gln308)的配位距離內(nèi)，該谷氨酰胺形成了基序B’的一部分，該基序B’據(jù)認為是底物特異性的重要決定子(Smith等，(2006)J.Virol.807169-78)。蛋白與核苷酸的三磷酸酯部分的接觸由基序D介導(dǎo)，它是一個長的環(huán)，位于酶的活性位點下方。具體來說，不變的Lys372的側(cè)鏈在核苷酸的γ-磷酸的配位距離之內(nèi)，這種相互作用最可能在催化過程中幫之定位和穩(wěn)定三磷酸酯基團。一起形成了長的β-發(fā)夾、形成了“手指”亞結(jié)構(gòu)域的一部分的基序1和2的高度保守的Lysl89和Argl94的側(cè)鏈，也位于模型化的核苷酸的糖和三磷酸酯部分二者的配位距離內(nèi)。與核苷酸底物的糖部分和三磷酸酯中的任何一個或二者的接觸，將促進核苷酸結(jié)合和定位，以配位至丨J引入的DNA引物的3，-末端上。TRBD促進模板定位在TERT的活性位點處。與大多數(shù)DNA和RNA聚合酶相同，端粒酶進行的核酸合成需要TER的模板區(qū)域(通常為7到8個堿基或以上)與引入的DNA引物的配對(Lee&Blackburn(1993)Mol.CellBiol.13:6586_99)。TRBD-RT結(jié)構(gòu)域的組織在蛋白表面上形成了深的空腔，跨越分子壁的整個寬度，形成了允許從其側(cè)面進入環(huán)的孔的缺口。該空腔相對于環(huán)的中心孔的排列方式，提供了在TERT-TER組裝后，將RNA模板放置在環(huán)的內(nèi)部和酶的活性位點所位于的部位的精巧的機制。特別重要的是形成了T-基序的一部分的發(fā)夾的排列方式。該發(fā)夾從RNA結(jié)合口袋伸出，與“拇指”環(huán)和基序1和2進行廣泛接觸。該發(fā)夾與“手指”和“拇指”結(jié)構(gòu)域二者之間的接觸，將TRED口袋朝向環(huán)內(nèi)部的開口，放置到酶的活性位點附近。因此，有可能該β-發(fā)夾用作協(xié)同效應(yīng)物開關(guān)，將RNA在環(huán)內(nèi)部的結(jié)合，與RNA模板在酶的活性位點處的放置相偶聯(lián)。將模板放置在分子的內(nèi)部，將便于它與引入的DNA底物的配對，它們一起將形成端粒延伸所需的RNA/DNA雜交去。RNA/DNA配對是端粒合成的先決條件，因為它將引入的DNA引物的3’-末端帶到酶的活性位點附近用于核苷酸添加，同時異源雙鏈體的RNA成分為在染色體的末端忠實添加相同的DNA重復(fù)序列提供了模板。引人注目的是，RNA/DNA異源雙鏈體在TERT環(huán)內(nèi)部的模擬，將RNA底物的5’-末端放置在RNA結(jié)合口袋的入口處，預(yù)計TERT將與TER結(jié)合的位置，同時將引入的DNA引物的3’-末端放置在TERT活性位點處，提供了功能性端粒酶延伸復(fù)合物的組織的快照。實施例3端粒酶抑制劑的效能本發(fā)明的新的端粒酶抑制劑可以在各種系統(tǒng)中進行分析?；衔锟梢栽诖_定的、公知的、用于評估細胞通透性、毒性和藥物動力學(xué)效應(yīng)的模型系統(tǒng)中進行評估。這些分析方法包括基于細胞和基于動物的分析方法?；诩毎姆治龇椒?。將來自P388細胞株(CellGate，Inc.，Sunnyvale，CA)或人類惡性黑素瘤細胞株SK-MEL-2的細胞，生長在含有胎牛血清(10%)、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的RPMI1640細胞培養(yǎng)基中，每周分成兩份分裂兩次。所有化合物首先用DMSO稀釋。然后使用磷酸鹽緩沖的鹽水溶液進行連續(xù)稀釋。所有稀釋在玻璃小瓶中進行，最終的DMSO濃度一般低于0.5%體積。最后的2倍稀釋在96孔板中使用細胞培養(yǎng)基進行，使每個孔含有50μL。對所有化合物在多個濃度上進行分析。細胞濃度使用血細胞計數(shù)器測量，最終的細胞濃度用細胞培養(yǎng)基調(diào)整為大約IXlO4個細胞/mL。然后將獲得的細胞溶液(50μL)加入到每個孔中，將板在37°C、5%CO2下，在加濕的培養(yǎng)箱中溫育5天。然后向每個孔加入MTT溶液(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鐺溴化物，10μL)，將板在同樣條件下重新溫育2小時。然后向每個孔添加酸化異丙醇(150μL含有0.05ΝHCl的i_PrOH)并充分混合。然后將板在595nm掃描，并讀取吸光度(WallacVictorl420MultilabelCounter)。然后分析獲得的數(shù)據(jù)，以確定ED5tl值。殺死癌細胞，但是不殺死正常細胞的化合物，可以在癌癥的預(yù)防或治療中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用。小鼠卵巢癌異種移植模型。本發(fā)明的化合物在癌癥的卵巢癌異體移植物模型中，根據(jù)Davis等的描述((1993)CancerResearch53=2087-2091)進行評估。簡單來說，該模型包括將IXlO9個0VCAR3-icr細胞接種在雌性nu/nu小鼠的腹腔中。在例如注射腫瘤細胞之前或之后，將一種或多種測試化合物作為在甲基纖維素中的懸液通過口服途徑給藥，或作為在含有0.01%TWEEN-20的磷酸緩沖鹽水中的懸液腹膜內(nèi)給藥。在實驗得出結(jié)論時(4-5周)，對腹膜細胞的數(shù)量進行計數(shù)，并稱量任何實體腫瘤沉積物。在某些實驗中，腫瘤的發(fā)生通過測量腫瘤特異性抗原來監(jiān)測。大鼠乳腺癌模型。本發(fā)明的化合物在癌癥的H0SP.1大鼠乳腺癌模型中進行評估(Eccles等，(1995)CancerRes.56=2815-2822)該模型包括將2xl04個腫瘤細胞靜脈內(nèi)接種到雌性CBH/cbi大鼠的頸靜脈中。在例如注射腫瘤細胞之前或之后，將一種或多種測試化合物作為在甲基纖維素中的懸液通過口服途徑給藥，或作為在磷酸緩沖鹽水和0.01%TWEEN-20中的懸液腹膜內(nèi)給藥。在實驗得出結(jié)論時(4_5周)，將動物殺死，取出肺臟，在Methacarn中固定20小時后，對單個腫瘤進行計數(shù)。小鼠B16黑素瘤模型。在C57BL/6中的B16黑素瘤模型中評估了本發(fā)明的化合物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移潛力。用2X105個從體外培養(yǎng)物收獲的B16/F10鼠腫瘤細胞靜脈內(nèi)接種小鼠。抑制劑作為在甲基纖維素中的懸液通過口服途徑給藥，或作為在PH7.2磷酸緩沖鹽水和0.01%TWEEN-20中的懸液腹膜內(nèi)給藥。在細胞接種后14天殺死動物，取出肺臟并稱重，然后在Bouin's溶液中固定。然后計數(shù)每組肺臟表面上出現(xiàn)的集落的數(shù)量。權(quán)利要求用于鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的方法，包括(a)設(shè)計或篩選與端粒酶TRBD結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物；以及(b)測試在(a)中設(shè)計或篩選的化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力，由此鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中TRBD結(jié)構(gòu)域包含嗜熱四膜蟲(T.thermophila)端粒酶的254-519位氨基酸殘基，或它們在來自其他物種的端粒酶中的等價氨基酸殘基。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中化合物與TRBD結(jié)構(gòu)域的CP-基序、T-基序和/或QFP-基序的至少一個氨基酸殘基結(jié)合。4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中化合物與表1中顯示的至少一個氨基酸殘基結(jié)合。5.用于鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的方法，包括(a)設(shè)計或篩選與核苷酸結(jié)合口袋的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物；以及(b)測試在(a)中設(shè)計或篩選的化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力，由此鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物。6.權(quán)利要求5的方法，其中化合物與表1中顯示的手指亞結(jié)構(gòu)域和/或手掌亞結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合。7.權(quán)利要求5或6的方法，其中化合物與選自下列的至少一個氨基酸殘基結(jié)合赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的K189、R194、Y256、Q308、V342和K372，或它們在來自其他物種的端粒酶中的等價氨基酸殘基。8.用于鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的方法，包括(a)設(shè)計或篩選與直接接觸DNA的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物；以及(b)測試在(a)中設(shè)計或篩選的化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力，由此鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物。9.權(quán)利要求8的方法，其中化合物與表2中顯示的拇指亞結(jié)構(gòu)域和/或手掌亞結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中化合物與選自下列的至少一個氨基酸殘基結(jié)合赤擬谷盜(T.castaneum)端粒酶的K210、K406、K416、K418和Ν423，或它們在來自其他物種的端粒酶中的等價氨基酸殘基。11.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中化合物與至少2、3、4、5、6個或以上氨基酸殘基結(jié)合。12.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中端粒酶是嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila),it^f(Arabidopsisthaliana)，胃人(Homosapiens)，MMM^W母(Schizosaccharomycespombe)，小鼠(Musmusculus)，酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae),Oxytrichatrifallax，小腔游仆蟲(Euplotesaediculatus)或赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的端粒酶。13.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中步驟(a)在計算機上進行。14.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中步驟(a)在體外進行。15.權(quán)利要求1-14任一項的方法，其中化合物抑制端粒酶活性。16.權(quán)利要求1-14任一項的方法，其中化合物刺激端粒酶活性。17.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中化合物與沒有被通過突變鑒定為影響核苷酸結(jié)合、RNA結(jié)合、DNA結(jié)合或端粒酶活性的氨基酸殘基結(jié)合。18.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中化合物將端粒酶的活性與沒有接觸化合物的端粒酶相比調(diào)節(jié)至少30%。19.通過前述任一項權(quán)利要求的方法鑒定的化合物。全文摘要本發(fā)明涉及用于鑒定調(diào)節(jié)端粒酶活性的化合物的方法。本發(fā)明的化合物，通過設(shè)計或篩選與端粒酶的TRBD、“拇指”、“手指”和/或“手掌”結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸殘基結(jié)合的化合物，并測試化合物調(diào)節(jié)端粒酶活性的能力，來進行鑒定。文檔編號C12Q1/48GK101835899SQ200880112672公開日2010年9月15日申請日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日發(fā)明者埃曼努埃爾·斯科達拉克斯申請人:威斯特研究所