專利名稱：增加端粒酶活性的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
和參考端粒酶端粒酶是用于催化端粒末端的端粒重復(fù)的增加的核糖核蛋白。端粒是可以對染色體末端封端的重復(fù)序列的長序列，并且認(rèn)為可穩(wěn)定染色體。在人體中，端粒典型具有7-10kb的長度并且包括序列-TTAGGG-的多個重復(fù)。端粒酶在絕大多數(shù)成人細(xì)胞中不表達，并且隨著復(fù)制的連續(xù)循環(huán)，端粒長度減小。在一定數(shù)量的復(fù)制循環(huán)之后，端粒的漸進性減短會使細(xì)胞進入端粒的臨界階段，該階段反過來會導(dǎo)致細(xì)胞的衰老。某些疾病與快速的端粒減短有關(guān)，從而導(dǎo)致細(xì)胞過早衰老。在人細(xì)胞中表達編碼人端粒酶蛋白的基因顯示能賦予其永生表型，推測可能是繞過了細(xì)胞的自然衰老路徑。此外，顯示具有短端粒的老化細(xì)胞中的端粒酶基因的表達會使端粒長度增加并且儲存典型與年輕細(xì)胞有關(guān)的表型。
與瘤細(xì)胞和某種干細(xì)胞相反，體細(xì)胞幾乎沒有或沒有端粒酶活性，并且當(dāng)至少一些染色體的端粒末端減短到臨界長度時會停止分裂，導(dǎo)致程序性的細(xì)胞衰老(細(xì)胞死亡)。由于在體細(xì)胞中導(dǎo)致衰老的端粒重復(fù)序列的損失會通過低端粒酶活性而增加，因此端粒酶活性的誘導(dǎo)(其具有將大量端粒重復(fù)序列加入到端粒中的效果)可以給予臨死的細(xì)胞增加的復(fù)制能力、給予衰老細(xì)胞增殖能力并且適當(dāng)?shù)厥沟脫p傷組織一旦修復(fù)而脫離細(xì)胞循環(huán)。
在體細(xì)胞中增加端粒酶活性的潛在治療優(yōu)勢包括，例如，AIDS治療(其特征在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD8+細(xì)胞)的過早衰老，該細(xì)胞作用是殺死感染的CD4+細(xì)胞)(見，Dagarag等人，2003)；阿爾茨海默氏患者的神經(jīng)保護(見，Mattson等人，2000)；例如腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的傷口愈合和保持(見，Thomas等人，2000)或者骨髓或基質(zhì)/間質(zhì)的移植細(xì)胞(見，Simonsen等人，2002)這些參考的全部引用如下。
討論端粒酶的這些和其它特征的參考包括Allsopp，R.C.等人，“Telomere shortening is associated with celldivision in vitro and in vivo”，Exp.Cell Res.220(1)194-200(1995年九月)。
Allsopp，R.C.等人，“Telomerase is required to slow telomereshortening and extend replicative lifespan of HSC during serialtransplantation”，Blood(e-publication)2003年3月27日。
Bodnar，A.G.等人，“Extension of life-span by introduction oftelomerase into normal human cells”Science 279(5349)349-52(1998年1月16日)。
Cech，T.R.等人，美國專利No.6,093,809(2000年7月25日)。
Cech，T.R.等人，美國專利No.6,166,178(2000年12月26日)。
Cech，T.R.等人，美國專利No.6,261,836(2001年7月)。
Chiu，C.P.等人，“Replucative senescence and cell immortalitytherole of telomeres and telomerase”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.214(2)99-106(1997年2月)。
Dagarag，M.等人，“Differential impairment of lytic and cytokinefunctions in senescent human immunodeficiency virus type 1-specificcytotox T lymphocytes”，J.Virol.77(5)3077-83(2003年3月)。
Farwell，D.G.等人，“Genetic and epigenetic changes in humanepithelial cells immortalized by telomerase”，Americal Journal ofPathology 156(5)1537-47(2000年5月)。
Fujimote，R.等人，“Expression of telomerase components in oralkeratinocytes and squamous cell carcinomas”，Oral Oncology 37(2)132-40(2001年2月)。
Funk，Walter D.等人，“Telomerase expression restores dermalintegrity to in vitro-aged fibroblasts in a reconstituted skin model”，Experimental Cell Research 258(2)270-278(2000年8月1日)。
Hannon，G.J.和Beach，D.H.，“Increasing proliferative capacity andpreventing replicative senescence by increasing telomerase activity andinhibiting pathways inhibiting cell proliferation”，PCT Int.Appl.Pubn.No.WO 2000/031238(2000年6月)。
Hannon，G.J.等人，Extension of cellular lifespan usingtelomerase-activating therapeutic agent”，PCT Int.Appl.Pubn.No.WO99/35243(1999年7月)。
Harle-Bachor，C.等人，“Telomerase activity in the regenerative basallayer of the epidermis in human skin and in immortal andcarcinoma-derived skin keratinocytes”，Proc.Natl Acad Sci USA93(13)6476-81(1996年6月25日)。
Harley，C.B.等人，“Telomeres shorten during ageing of humanfibroblasts”，Nature 345(6274)458-60(1990年5月31日)。
Harley，C.B.等人，“Telomeres，cell immortality，and cancer”，ColdSpring Harb Symp.Quant.Biol.59307-15(1994)。
Harley，C.B.等人，“Telomeres and Telomerase in aging and cancer”，Curr.Opin Genet.Dev.5(2)249-55(1995年4月)。
Harley，C.B.等人，“Telomerase and cancer”，Important Adv.Oncol.57-67(1996)。
Harley，C.B.等人，“Human aging and Telomeres”，Ciba Found.Symp.211129-39(1997)。
Harley，C.B.等人，“Telomerase is not an oncogene”，Oncogene21494-502(2002)。
Henderson，S.等人，“In situ analysis of changes in telomere sizeduring replucative aging and cell transformation”，J.Cell Biol.134(1)1-12(1996年7月)。
Jiang，X.R.等人，PCT Pubn.No.WO 02/91999。
Jiang，X.R.等人，“Telomerase Expression in human somatic cellsdoes not induce changes associated with a transformed phenotype”，NatureGenetics 21(1)111-4(1999年4月)。
Kang，M.K.等人，″Replicative senescence of normal human oralkeratinocytes is associated with the loss of telomerase activity withoutshortening of telomeres″，Cell Growth & Differentiation 9(1)85-95(1998年1月)。
Kim，N.W.等人，″Telomerase activity assays″，美國專利No.5,629,154(1997年5月)。
Lee，K.M.等人，″Immortalization with telomerase of theNestin-positive cells of the human pancreas″，Biochem Biophys ResCommun 301(4)1038-44(2003年2月21日)。
Ludwig，A.等人，″Ribozyme cleavage oftelomerase mRNA sensitizesbreast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase″，Cancer Res.，613053-3061(2001)。
Mattson，M.P.，″Emerging neuroprotective strategies for Alzheimer’sdiseasedietary restriction，telomerase activation，and stem cell therapy″，Exp Gerontol.35(4)489-502(2000年7月)。
Morales，C.P.等人，″Absence of cancer-associated changes in humanfibroblasts immortalized with telomerase″，Nature Genetics 21(1)115-8(1999年1月)。
Oh，H.和Schneider，M.D.，″The emerging role of telomerase incardiac muscle cell，growth and survival″，J Mol Cell Cardiol 34(7)717-24(2002年7月)。
Simonsen，J.L.等人，″Telomerase expression extends the proliferativelife-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrowstromal cells″，Nat Biotechnol 20(6)592-6(2002年6月)。
Thomas，M.，Yang，L.，和Hornsby，P.J.，″Formation of functional tissuefrom transplanted adrenocortical cells expressing telomerase reversetranscriptase″，Nat Biotechnol 18(1)39-42(2000年1月)。
Vasa，M.等人，″Nitric oxide activates telomerase and delaysendothelial cell senescence″，Circ.Res.87(7)540-542(2000)。
Villeponteau，B.等人，美國專利No.5,583,016(1996年12月)。
West，M.D.等人，″Methods of screening for compounds that derepressor increase telomerase activity″，美國專利No.6,007,989(1999年12月)。
White，M.A.，″Assembly of telomerase components and chaperoninsand methods and compositions for inhibiting or stimulating telomeraseassembly″，PCT Int.Appl.Pubn.No.WO 2000/08135(2000年2月)。
Yang，J等人.，″Telomerized human microvasculature is functional invivo″，Nature Biotechnology(United States)19(3)219-24(2001年3月)。
Yang，J.等人，″Human endothelial cell life extension by telomeraseexpression″，J.Biol.Chem.274(37)26141-8(1999年9月10日)。
Yudoh，K.等人，″Reconstituting telomerase activity using thetelomerase catalytic subunit prevents the telomere shorting and replicativesenescence in human osteoblasts″，J.Bone and Mineral Res.16(8)1453-1464(2001)。
從治療上增加端粒酶活性的方法在以下中進行研究，例如，Bodnar(1997)，White(2000)，Harmon等人(1999；2000)，F(xiàn)ranzese等人(2001)，and Yudoh等人(2001)，全部引用上述參考。在這些報告中，通常通過hTRT(編碼人端粒酶的蛋白組分的基因)的過量表達或者通過表達調(diào)節(jié)端粒酶裝配的蛋白，如熱休克蛋白來增加端粒酶活性(White)。Franzese等人研究說明Saquinavir(一種指定用于治療HIV感染的蛋白酶抑制劑)會增加周圍血液單核細(xì)胞中的端粒酶活性；Vasa等人描述了端粒酶的活性，以及通過施用一氧化氮(NO)前體而使內(nèi)皮衰老得到延遲。
黃芪甲苷和人參皂甙黃芪甲苷和人參皂甙族的化合物被報道具有多種生物作用。討論黃芪甲苷和人參皂甙的生物活性的參考包括Bedir，E.等人，″Immunostimulatory effects of cycloartane-typetriterpene glycosides from Astragalus species″，Biol & Pharm Bull23(7)834-7(2000)。
Binder，B.等人，″Use of triterpensaponins，such as notoginsenoside RI(NR1)and/or astragaloside(ASIV)for preparing medicaments″，美國專利No.5,770,578(1998年6月)。
Calzada，L.等人，″Effect of tetracyclic triterpenes(argentatins A，Band D)on the estradiol receptor of hormone-dependent tumors of humanbreast″，Medical Science Research 23(12)815-16(1995)。
Chen，X.等人，″Protective effect of ginsenoside Rgl ondopamin-induced apoptotis in PC12 cells″，Acta Pharmacol Sinica22(8)673-678(2001)。
Hashimoto，K.等人，″Skin tissue regeneration promoters comprisingginsenoside Rbl″，WO 200192289(2001)；EP 1295893 A1(2003)。
Hong，H.-Y.等人，″Stimulatory effects of ginsenoside-Rg1 on p56lckkinase and cell proliferation in Jurkat T cells″，Korean J.Ginseng Sci.19(2)117-21(1995)。
Huang，Y.等人，″Selected non-timber forest products with medicinalapplications from Jilin Province in China″，參考題目Forest communitiesin the third millenniumLinking research，business，and policy toward asustainable non-timber forest product sector；Kenora，Ontario，Canada，1-4October，1999；General Technical Report-North Central Research Station，USDA Forest Service(No.NC-217)p.93-101(2000)。
Kaneko，M.等人，″Accelerated recovery from cyclophosphamide-induced leukopenia in mice administered a Japanese ethical herbal drug，Hochu-ekM-to″，Immunopharmacology 44(3)223-231(1999)。
Kinjo，J.等人，″Anti-herpes virus activity of fabaceous triterpenoidalsaponins″，Biological & Pharmaceutical Bulletin 23(7)887-9(2000年7月)。
Khushbaktova，Z.A.等人，″Influence of cycloartanes from plants ofthe genus Astragalus and their synthetic analogs on the contractive functionof the rnyocarbium and the activity of Na，K-ATPase″，Chem.Nat.Compounds 30(4)469-473(1994)。
Lee，Y.J.等人，″Ginsenoside-Rgl，one of the major active moleculesfrom Panax ginseng，is a functional ligand of glucocorticoid receptor″，MolCell Endocrinol 133(2)135-40(1997年10月)。
Liu，P.等人，″Effect of ginsenosides Rbl，Rgl，Rhl and Re onproliferation of cells m vitro″，Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 8(4)36-41(1996)；CAAbstract No.′1997400846。
Oda，K.等人，″Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponinsderived from medicinal and food plants″，Biol.Chem.381(1)67-74(2000)。
Pistelli，L.，等人，″Antimicrobial and antifungal activity of crudeextracts and isolated saponins from Axtragalus verrucosus″，F(xiàn)itoterapia73(4)336-339(2002)。
Prince，R.L.和Min，X.，″Compositions and method for treating orpreventing osteoporosis″，PCT Pubn.No.WO 2001/01996。
Sengupta，S.等人，″Pharmaceutically effective compounds and theiruse″，PCT Pubn.Nos.WO 2002/69980and WO 2002/07732。
Wang，S.等人，″Promoting effect of ginsenoside Re on theproliferation of murine bone marrow cells″，Baiqiuen Yike Daxue Xuebao23(2)141-142(1997)；CA Abstract No.1997570234。
Wang，Y-P.等人，″Effect of astragaloside IV on T，B lymphocyteproliferation and peritoneal macrophage function in mice″，ActaPharmacologica Sinica 23(3)263-6(2002年3月)。
Yasukawa，K.等人，″Sterol and triterpene derivatives from plantsinhibit the effects of a tumor promoter，and sitosterol and betulinic acidinhibit tumor formation in mouse skin two-stage carcinogenesis″，Oncology 48(1)72-6(1991)。
Yamamoto，M.等人，″The stimulatory effects of ginseng saponins onproliferation and DNA synthesis of human vascular endothelial cells andskin fibroblasts in relation to cytokines or growth factors″，Nissei ByoinIgaku Zasshi 24(1)12-13(1996)。
Zhang W.J.等人，″Regulation of the fibrinolytic potential of culturedhuman umbilical vein endothelial cellsastragaloside IV downregulatesplasminogen activator inhibitor-1and upregulates tissue-type plasminogenactivator expression″，Journal of Vascular Research 34(4)273-80(1997年7-8月)。
Zi-Pu，L.和Qian，C.，“Effects of astragaloside IV on myocardialcalcium transport and cardiac function in ischemic rates”，Acta PharmacolSin 23(10)898-904(2002年10月)。

發(fā)明內(nèi)容
通常，本發(fā)明涉及增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法以及用于此方法的組合物?？梢詫⒋朔椒ê徒M合物用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞(即體外或間接體內(nèi)、或直接體內(nèi)培養(yǎng))，例如在體內(nèi)(包括人體和非人類動物，尤其是非人類哺乳動物)組織上成長的細(xì)胞。
在特別的實施方案中，組合物包括具有下述通式I、II或III的化合物。本發(fā)明的方面包括用于化妝品、營養(yǎng)補充和藥物的應(yīng)用的這種化合物的配方，尤其在細(xì)胞中增加的端粒酶活性顯示出，或者希望顯示出有益處的應(yīng)用中。還提供了將所述化合物及其配方用于此類應(yīng)用中的方法，包括在確定需要或利于增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性之后，應(yīng)用或施用這類配方的方法。
本發(fā)明還包括，在一個方面，增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性的方法。所述方法包括使細(xì)胞或組織與具有下列通式I、II或III的孤立化合物的配方接觸。在優(yōu)選的實施方案中，化合物是具有下列通式I或II的。所述方法進一步包括確定細(xì)胞或組織中的端粒酶活性需要增加的前序步驟。
在具有通式I的化合物中 每個X1、X2和X3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈?，以使化合物含有最多三個苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；或者R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
優(yōu)選地，所述化合物包括0、1或2，更優(yōu)選地0或2個苷，其均沒有由其它苷取代。優(yōu)選地，每個所述苷是D(自然發(fā)生的)構(gòu)型的。
在選定的通式I實施方案中，每個X1和X2單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷；而X3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷。在進一步的實施方案中，X1是OH或苷，每個X2和OR1單獨地為OH或苷，而X3為OH或酮基。通式I的示例性化合物包括黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、和環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷。在選定的實施方案中，所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇或黃芪甲苷IV16-one。在一個實施方案中，化合物是黃芪甲苷IV。
在具有通式II的化合物中 每個X4和X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷，和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷，其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低酰基取代，以使化合物含有最多三個苷。
優(yōu)選地，所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代；每個所述苷有選是D構(gòu)型的。
在選定的具有通式II的實施方案中，每個X4和OR3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。在進一步的實施方案中，X4是OH或苷，而每個X5和OR3為OH。在一個實施方案中，X4是OH。
在具有通式III的化合物中
每個X6、X7和X8單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷，和OR4選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷，其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈允够衔锖凶疃嗳齻€苷。
優(yōu)選地，所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代；每個所述苷是D構(gòu)型的。
在選定的具有通式II的實施方案中，每個X6、X7、X8和OR4單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷，優(yōu)選羥基和苷。在進一步的實施方案中，每個X8和OR4是OH，而每個X6和X7單獨地選自羥基或苷。在更進一步的實施方案中，每個OR4、X6和X8為OH，而X7為苷。通式III的示例性化合物是人參皂甙RH1。
當(dāng)上述通式I、II或III的優(yōu)選化合物以1μg/ml或低于1μg/ml的濃度溶于溶劑進行配制時，該化合物在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中對產(chǎn)生一定水平的端粒酶活性(以TRAP法進行測定)有效，該水平比只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞中的水平高至少50％(以此處所述的TRAP法進行測定)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，該化合物在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中對產(chǎn)生一定水平的端粒酶活性(以TRAP法進行測定)有效，該水平比只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞中的水平高至少100％。
通式I-III的示例性化合物包括圖1中所描述的化合物和此處所指定的1(黃芪甲苷IV)、2(環(huán)黃芪醇)、3(黃芪醇)、4(黃芪甲苷IV16-one)、5(20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴)、6(環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙)、7(環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷)和8(人參皂甙RH1)。在選定的實施方案中，所述化合物選自此處所指定的1(黃芪甲苷IV)、2(環(huán)黃芪醇)、3(黃芪醇)、4(黃芪甲苷IV 16-one)、5(20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴)、6(環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙)或7(環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷)。在進一步的實施方案中，所述化合物選自此處所指定的1、2、3、4、或5。在一個實施方案中，所述化合物是黃芪甲苷IV(1)或環(huán)黃芪醇(2)。
使通式I、II或III的孤立化合物的配方與細(xì)胞或組織接觸的方法可以包括，在所述接觸之前，確定需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織。通過增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性而實現(xiàn)的優(yōu)點包括，例如，復(fù)制能力的增強和/或所述細(xì)胞或所述組織內(nèi)細(xì)胞的生命延長。
所述方法可以包括診斷主體需要增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性的情況，并且將配方施用于主體。優(yōu)選地，物體是哺乳類主體，例如人類主體或患者。這樣的情況可以包括，例如，HIV感染，各種變性疾病如神經(jīng)變性疾病、骨頭或關(guān)節(jié)變性疾病、黃斑病變、動脈粥樣硬化或貧血。這樣的情況還包括創(chuàng)傷或其它表皮的急性或慢性疾病，如燒傷、擦傷、割傷、錯位、由感染因子導(dǎo)致的傷害、慢性靜脈曲張性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓迫潰瘍、褥瘡、粘膜潰瘍或疤痕瘤形成。
因此，本發(fā)明提供通過增加病患細(xì)胞或組織中的端粒酶活性來治療病患如上所述的疾病的方法，所述方法包括對需要這類治療的病患施用如上定義的通式I、通式II或通式III的孤立化合物的配方?？梢酝ㄟ^各種途徑，如口服、局部或非腸道地使用組合物。
本發(fā)明進一步提供診斷處于病態(tài)的主體，使其通過增加主體細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性，且對需要所述治療的主體使用在藥物載體中的上述通式I、II或III的化合物，優(yōu)選通式I或II的化合物來進行治療。
在另一方面，本發(fā)明提供治療表皮急性或慢性疾病的方法，包括使表皮細(xì)胞與如上所述的通式I、通式II或通式III的孤立化合物的局部配方接觸。在優(yōu)選實施方案中，化合物是具有通式I或通式II的。在進一步的實施方案中，化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷和20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(在此指定為5)。
與配方接觸的細(xì)胞也可以包括間接體內(nèi)地接觸的移植細(xì)胞，如用于基于細(xì)胞治療，或培養(yǎng)中的其它細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供一種增強體外或間接體內(nèi)的細(xì)胞的復(fù)制能力的方法，包括使所述細(xì)胞與有效量含有上述通式I、通式II或通式III的組合物(包括上述選定實施方案中的化合物)接觸。在優(yōu)選實施方案中，化合物是包括上述選定實施方案中的通式I或通式II的化合物。通常，細(xì)胞是非轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞；在選定實施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞，如骨髓干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、年輕或早期傳代的皮膚成纖維細(xì)胞、胰島前體細(xì)胞、神經(jīng)球細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、造骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和HIV-限制的CD8+細(xì)胞。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包括藥物上可接受載體中的如上所述通式I的化合物，其中每個X1、X2單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基，或苷；X3是酮基；OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈允够衔锖凶疃嗳齻€苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；或者在優(yōu)選的實施方案中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
優(yōu)選地，所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代，且每個所述苷是D構(gòu)型的。
在選定的實施方案中，每個X1是OH或苷，而每個X2和OR1單獨地是OH或苷。在一個實施方案中，所述化合物是黃芪甲苷IV 16-one(此處指定為4)。
或者，所述組合物包括，在藥物上可接受的載體中的，如上所述的通式I的化合物，其中X1和X2中的一個選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或酮基，而另一個是苷；每個X3和OR1單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈允够衔锖凶疃嗳齻€苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；或者在優(yōu)選的實施方案中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
優(yōu)選地，所述化合物包括1個苷，其沒有由其它苷取代，且所述苷是D構(gòu)型的。在一個實施方案中，所述化合物選自環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙(在此指定為6)或環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷(在此指定為7)。
或者，所述藥物組合物包括，在藥物上可接受的載體中的，如上所述的通式II的化合物。所述化合物的選定實施方案也如上所定義。在一個實施方案中，所述化合物是此處指定的5。
本發(fā)明還提供如上所述通式II的化合物，包括如上所述的選定實施方案。在一個實施方案中，所述化合物是此處指定的5。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供如上所述通式I、通式II或通式III的孤立化合物的局部藥物配方。所述化合物的選定實施方案也如上所定義。在優(yōu)選的實施方案中，化合物是具有下列通式I或II的。在進一步的實施方案中，化合物選白黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷和20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(在此指定為5)。局部配方典型包括一種或多種選自乳化劑、增稠劑或潤膚劑的成分。這樣的組合物可以用于創(chuàng)傷或其它表皮的急性或慢性疾病的治療。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供營養(yǎng)補充的組合物，包括如上所述通式I、通式II或通式III的孤立化合物的營養(yǎng)補充配方。所述化合物的選定實施方案也如上所定義。在優(yōu)選的實施方案中，化合物是包括選定的也如上所定義的實施方案，具有下列通式I或II的。在進一步的實施方案中，所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷和20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(在此指定為5)。在進一步的實施方案中，除所述通式I、II或III的孤立化合物以外，所述營養(yǎng)補充配方還包括營養(yǎng)補充的草本提煉精華，其可以是蒙古黃芪的提煉精華。
包括如上所述的選定實施方案的所述通式I、II或III的孤立化合物還可以用于治療可以通過增加細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性來進行治療的疾病的藥劑制備。這類疾病的例子在下面會詳細(xì)討論。相似地，包括如上所述的選定實施方案的所述通式I、II或III的孤立化合物還可以用于表皮的急性或慢性疾病治療的藥劑制備。在上述用途的優(yōu)選的實施方案中，所述孤立化合物是具有下列通式I或II的，包括如上所述的通式I或通式II的選定實施方案。
本發(fā)明還提供一種選擇對增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性有效的化合物的方法。根據(jù)這個方法，測試如上所述的通式I、通式II、通式III的化合物的衍生物增加角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞中端粒酶活性的能力，根據(jù)此處所述的TRAP法測定的。當(dāng)如果衍生物以溶劑配制，且以1μg/ml或低于1μg/ml的濃度使用，并對角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生一定水平的端粒酶活性(以TRAP法進行測定)有效，該水平比只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞中的水平高至少50％，優(yōu)選高至少100％時，可選擇此衍生物。然后可以將所述衍生物與局部、藥物或營養(yǎng)補充的載體進行配制。
在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供選擇治療表皮急性或慢性疾病的試劑的方法。根據(jù)這個方法，使用(皮膚)劃痕試驗方法測試如上所述的通式I、通式II、通式III的化合物的衍生物在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中的傷口愈合能力，如果相比于所述對照溶液處理的對照，使用1μg/ml或少于1μg/ml濃度的該衍生物高至少50％，優(yōu)選高至少100％的傷口愈合活性，則可以選擇該衍生物。然后可以將所述衍生物與局部載體進行配制。
當(dāng)本發(fā)明的下述詳細(xì)描述與附圖結(jié)合時，本發(fā)明的這些或其它主題和特征將會更為豐富地展示出來。


圖1A-H顯示出用于此處所述方法和組合物的示例性化合物的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示根據(jù)TRAP法確定的使用2(環(huán)黃芪醇)處理的新生兒角質(zhì)形成細(xì)胞中端粒酶活性的增加。
圖3顯示根據(jù)TRAP法確定與EGF(10nM)和溶劑對照相比，使用1(黃芪甲苷IV)處理的新生兒角質(zhì)形成細(xì)胞中端粒酶活性的增加。
圖4顯示根據(jù)“皮膚劃痕試驗方法”確定的一系列成人角質(zhì)形成細(xì)胞中1(黃芪甲苷IV)的傷口愈合活性的計算機生成圖像。
圖5顯示根據(jù)“皮膚劃痕試驗方法”確定的一系列年輕(yong)角質(zhì)形成細(xì)胞中1(黃芪甲苷IV)和2(環(huán)黃芪醇)的傷口愈合活性的計算機生成圖像。
圖6顯示一系列成人角質(zhì)形成細(xì)胞中具有或沒有端粒酶抑制劑的寡核苷酸(GRN163)或?qū)φ展押塑账?GRN137227)的1(黃芪甲苷IV)的傷口愈合活性的計算機生成圖像。
圖7是顯示成人新生角質(zhì)形成細(xì)胞(aging neonatal keratinocytes)中具有和沒有端粒酶抑制劑的寡核苷酸(GRN163)且與～2nM PDGF(血小板源生長因子)相比較的1(黃芪甲苷IV)的傷口愈合活性的曲線圖。
發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容I.定義此處所用的下列術(shù)語具有以下給出的含義，除非另外說明。
此處用于命名化合物的一般碳原子命名圖示如下。(注意到缺少19碳的結(jié)構(gòu)II的化合物和缺少18碳的結(jié)構(gòu)III的化合物顯示在這個圖中。因此，所述命名圖示并非試圖限制本發(fā)明的組合物)。
“烷基”是指含有含有碳和氫的完全飽和的無環(huán)族單價基，其可以是直鏈或支鏈的。烷基基團的例子是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和異丙基?！巴檠趸笔侵妇哂蠴R的基團，其中R為如上所述的烷基。“酰氧基”是指具有-OC(＝O)R的基團，其中R為如上所述的烷基。因此，“?；笔侵?C(＝O)R基團。
“低烷基”(或低烷氧基，或低酰氧基)是指具有1到6個碳原子的這樣的基團；在選定實施方案中，這樣的基團包括1到4個碳原子，1或2個碳原子，或者1個碳原子(即，甲基、甲氧基、乙酰氧基)。
“干細(xì)胞”是指在普通譜系中相對尚未分化的細(xì)胞，其會在出生后的生命中保持分裂和循環(huán)，以提供可以進一步分化并且成為特定細(xì)胞的細(xì)胞(例如，皮膚基底層或haematopoetic組織內(nèi)的干細(xì)胞，如分化自骨髓中的原始細(xì)胞的所有各種類型血細(xì)胞的)。
“對增加細(xì)胞中的端粒酶活性有效”對于化合物來說，表示根據(jù)此處所述的TRAP法測定的，含有濃度為1μg/ml或低于1μg/ml的化合物的組合物對角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生一定水平端粒酶活性有效，根據(jù)TRAP法測定的該水平高于，至少1.5倍于(即高于至少50％)不含化合物的相似配方產(chǎn)生的水平。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)此處所述的TRAP法測定的，化合物在濃度為1μg/ml或1μg/ml時在這樣的細(xì)胞中對產(chǎn)生一定水平端粒酶活性有效，根據(jù)TRAP法測定的該水平高于，至少2倍于(即高于至少100％)不含化合物的相似配方產(chǎn)生的水平。
關(guān)于對患者使用化合物，“有效量”表示對增加患者細(xì)胞或組織內(nèi)的端粒酶活性，以達到所需治療效果的有效量。關(guān)于體外或間接體外的細(xì)胞治療，“有效量”是指對增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性，由此增加細(xì)胞復(fù)制能力和/或生命期的有效量。
此處所以％(w/v)表示的濃度，100％(w/v)對應(yīng)于1g溶質(zhì)/ml溶劑。例如，0.1％(w/v)＝1mg/ml。
“孤立化合物的配方”是指通過將孤立化合物與一種或多種其它成分(可以是活性或非活性成分)合并而產(chǎn)生配方來制備配方。當(dāng)直接純化得自自然源的化合物時，術(shù)語“孤立化合物”是指與自然源的化合物相比時需要進行的純化不少于100褶(100-fold)的化合物(配方之前)。當(dāng)化合物非直接純化于自然源時，術(shù)語“孤立化合物”是指(配方之前)通過包括一個或多個化學(xué)合成步驟，而得到不少于5％(w/w)純度的制備的化合物的過程所產(chǎn)生的化合物。
II.增加端粒酶活性的方法和組合物根據(jù)本發(fā)明，提供增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的組合物和方法。根據(jù)所述方法，將細(xì)胞或組織與對增加細(xì)胞或組織內(nèi)增加端粒酶活性有效的量(與沒有所述化合物的細(xì)胞或組織內(nèi)的端粒酶活性水平相比)的此處公開的通式I、II或III的孤立化合物的配方接觸。所述方法還可以包括確定其中需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織的前序步驟。
在一個實施方案中，化合物以通式I表示 在通式I中，每個X1、X2和X3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；而OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷。在選定的實施方案中，每個X1和X2單獨地選白羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷。
在通式I的選定實施方案中，如描述的R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；在另一個實施方案中，R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵，如化合物1所示(見圖1)。
此處所用的“苷”對任何通式I、II或III的主體化合物(或其衍生物)來說，表示已知苷之一(即核糖核苷、阿拉伯糖苷、木糖苷、來蘇糖苷、阿卓糖苷、葡糖苷、甘露糖苷、古洛糖苷、艾杜糖苷、半乳糖苷和塔羅糖苷)。苷典型是6元環(huán)(吡喃糖)形式，例如，吡喃葡糖甙或吡喃甘露糖苷。在選定實施方案中，苷是D-苷；也就是，具有發(fā)現(xiàn)的自然發(fā)生的單糖的構(gòu)型。特別的例子包括D-吡喃核糖苷、D-吡喃阿拉伯糖苷、D-吡喃木糖苷、D-吡喃葡糖甙、吡喃甘露糖苷和D-吡喃半乳糖苷。優(yōu)選苷包括D-吡喃葡糖甙和D-吡喃木糖苷。在進一步的實施方案中，所述連接可以是β構(gòu)型的，例如，β-D-吡喃葡糖甙。
通式I、II或III的主體化合物或其衍生物中存在的苷環(huán)中的任何游離羥基基團可以進一步被其它苷、低烷基、或低?；缂籽趸蛞阴Ｑ趸〈?。優(yōu)選地，至多一個這樣的羥基被其它苷取代。更優(yōu)選地，沒有這樣的羥基基團被其它的苷取代，即，取代基是低?；缫阴；虻屯榛?，如甲基。在一個實施方案中，苷上的所有羥基均未被取代。
優(yōu)選地，通式I、II或III的主體化合物(或其衍生物)包括最多三個苷，更優(yōu)選地最多兩個苷。在選定的實施方案中，化合物包括0、1或2個苷，其均沒有被其它苷取代。在進一步選定的實施方案中，特別對通式I，化合物包括0或2個苷，其均沒有被其它苷取代。
在通式I選定的實施方案中，每個X1和X2單獨地選白羥基、低烷氧基、低酰氧基、吡喃葡糖甙或吡喃木糖苷，而X3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基、吡喃葡糖甙或吡喃木糖苷，優(yōu)選羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基。
在通式I的進一步實施方案中，X1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或β-D-吡喃木糖苷；X2選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、β-D-吡喃葡糖甙；X3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)；而OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或β-D-吡喃葡糖甙。
在通式I的進一步實施方案中，X1是OH或苷，每個X2和OR1單獨地為OH或苷，而X3是OH或酮。在進一步實施方案中，每個X1和X2是OH或苷，OR1為OH，而X3是OH。在更進一步實施方案中，X1是β-D-吡喃木糖苷，X2是β-D-吡喃葡糖甙，OR1為OH，而X3是OH。在另一個實施方案中，每個X1、X2、X3和OR1是OH。
對這些所描述的實施方案的每一個來說，進一步的實施方案包括其中R2是甲基和 表示雙鍵的化合物，而其它的實施方案，通常優(yōu)選地，包括其中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)的化合物。
用于本發(fā)明方法的結(jié)構(gòu)I的示例性化合物包括圖1中所示的那些，并且此處指定為1(黃芪甲苷IV)、2(環(huán)黃芪醇)、3(黃芪醇)、4(黃芪甲苷IV 16-one)、6(環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙)和7(環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷)。
其它具有由3-β-D-吡喃葡糖甙取代的環(huán)黃芪醇(2)的主鏈結(jié)構(gòu)的化合物也可以用于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選地，化合物包括總數(shù)為1或2個附加在主鏈結(jié)構(gòu)的單獨碳上的苷(即，1個苷不會附加在其它苷上)。例子包括自然發(fā)生的化合物黃芪甲苷A、1、2、和7，以及astraverrucinsI和II(其可以從黃芪族疣螈(Astragalus verrucosus)中分離出來)。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其含有一種或多種通式I的化合物，其中X1和X2的一個選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮，而另一個是苷。在進一步的實施方案中，化合物選自那些指定為6或7的。在其它實施方案中，藥物組合物包括通式I的化合物，其中X3是酮；在一個實施方案中，化合物是指定為4的化合物。
在另一方面，本發(fā)明提供含有通式II顯示的化合物的組合物 通式II中，每個X4和X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷，和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷；其中“苷”及其各個實施方案如上所述。如上所述，化合物包括最多3個苷，更優(yōu)選最多2個苷。在選定的實施方案中，化合物含有0、1或2個苷，其均沒有被其它苷取代。
在通式II選定的實施方案中，X4選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷。在進一步的實施方案中，每個X4、X5和OR3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、吡喃葡糖甙或吡喃木糖苷。
在通式II的進一步實施方案中，每個X4和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷，優(yōu)選D-吡喃木糖苷或D-吡喃葡糖甙，而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。優(yōu)選地，在這些實施方案中，OR3選自羥基、低烷氧基或低酰氧基，更優(yōu)選羥基。
在通式II的進一步實施方案中，每個X4、X5和OR3單獨地為OH或苷，例如，D-吡喃木糖苷或D-吡喃葡糖甙。在更進一步的實施方案中，X4是OH或苷，而每個X5和OR3是OH。在一個實施方案中，每個X4、X5和OR3是OH。這個化合物(通常命名為20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴)在此指定為5。
本發(fā)明還提供上述通式II的化合物，其中每個X4和X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷，而OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷，其中所述苷上的任何羥基基團都可以進一步被其它苷、低烷基、或低?；〈Ｔ谶x定的實施方案中，化合物包括0、1或2個苷。優(yōu)選地，每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型的。在進一步的實施方案中，每個X4和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷，而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。在更進一步的實施方案中，X4是OH或苷，而每個X5和OR3是OH。在一個實施方案中，每個X4、X5和OR3是OH，即此處指定為5的化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供一種通過使細(xì)胞或組織與具有通式III的孤立化合物的配方接觸來增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶的方法。再次，本方法可以包括確定其中需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織的前序步驟。
在通式III中，每個X6、X7、X8和OR4單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷，其中“苷”及其各個實施方案如上所述。優(yōu)選地，化合物包括最多2個苷，更優(yōu)選最多1個苷，其均沒有被其它苷取代。優(yōu)選苷包括D-吡喃葡糖甙和D-吡喃木糖苷。
在結(jié)構(gòu)III選定的實施方案中，每個X6、X7、X8和OR4單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、或苷，且優(yōu)選選自羥基或苷。
在結(jié)構(gòu)III的進一步實施方案中，每個X8和OR4是OH，而每個X6和X7單獨地選自羥基或苷，例如β-D-吡喃葡糖甙。在進一步的實施方案中，OR4是OH。優(yōu)選地，每個X6和X8也單獨為OH，而X7是苷。結(jié)構(gòu)III的示例性化合物是人參皂甙RH1，此處指定為8。
III.通式I-III的化合物的來源和合成通式I、II和III的化合物通常是從天然存在的材料中分離出來或合成的。例如，黃芪甲苷I-VII可以從蒙古黃芪的根莖分離得到，如A.Kadota等人，JP Kokai No.62012791A2(1987)中所述。如此處所述，用MeOH回流從有益的藥草的多個來源中購得的根莖組織(8kg)，然后將濃縮后的精華(200g)在溶解在MeOH中并且使用CHCl3/MeOH/H2O混合物作為洗脫液通過硅膠柱色譜法對其進行分餾。使用相似的溶劑組合物，通過硅膠上的逆相色譜逐步進行每次分餾來給出下列近似數(shù)量的孤立化合物乙酰黃芪甙I(0.2g)、黃芪甲苷I(3.5g)、異黃芪甙I(0.3g)、黃芪甲苷II(2.3g)、黃芪甲苷III(1.0g)、黃芪甲苷IV(0.8g)、黃芪甲苷V(0.1g)、黃芪甲苷VI(0.3g)以及黃芪甲苷VII(0.1g)。還見Kitagawa等人，Chem.Pharm.Bull.31(2)698-708(1983b)。
還可以通過現(xiàn)在作者(present authors)從Ai Chunmei，Chengdu610041 P.R.China得到黃芪甲苷V(此處指定為1)。
通過用甲醇化HCl處理黃芪甲苷IV(1)，然后中和，標(biāo)準(zhǔn)處理，且用色譜純化來制備環(huán)黃芪醇(2)，如下面實驗部分所述(實施例1)。還可以通過對蒙古黃芪的丁醇提取物進行氧化降解(用氧和元素鈉進行處理)來得到環(huán)黃芪醇，如P-H Wang等人，J.Chinese Chem.Soc.49103-6(2002)所述。根據(jù)Kitagawa等人，Chem.Pharm.Bull.31(2)689-697(1983a)的方法還可以得到黃芪醇(3)和環(huán)黃芪醇(2)。
可以通過將黃芪甲苷IV(1)和硫酸的甲醇溶液進行回流，隨后進行標(biāo)準(zhǔn)處理和硅膠色譜來得到此處指定為6(環(huán)黃芩醇-6-β-D-吡喃葡糖甙)和7(環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷)的化合物，如下面實驗部分所述(實施例2)。也可以得到重排產(chǎn)物5和糖苷配基(即環(huán)黃芪醇(2))。
通過乙酰化黃芪甲苷IV的苷羥基基團，然后吡啶氯鉻酸鹽氧化16-羥基，并且通過硼氫化鈉處理來修復(fù)苷羥基，從而制備16-酮基化合物4(見，Kitagawa等人，1983b，上述引用)。
根據(jù)已知的有機合成方法，使用天然存在和/或市售的起始材料，如環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷或astraverrucins或人參三醇，結(jié)合所需的產(chǎn)物分離，來制備通式I-III的各種實施方案，例如具有不同程度烷基化或?；?，或酮基基團的化合物。在下面的實驗部分給出幾個例子。例如，越少的空間位阻，3-，6-，和/或16-羥基基團通?？梢赃x擇性地改性，例如，通過?；?。如果需要，可以如通過烷基化，隨后選擇性地除去酰基基團，來對未反應(yīng)的羥基基團分別改性。具有稠環(huán)丙基環(huán)的通式I的化合物(例如環(huán)黃芪醇)通過硫酸處理可以轉(zhuǎn)化成具有19-甲基基團且9-11雙鍵的化合物(例如黃芪醇)。這個反應(yīng)可以伴隨著去糖基化，如下實施例9B和10B的反應(yīng)所示。
I.生物活性的測定A.TRAP法使用TRAP(端粒重復(fù)擴增法)法來測定化合物增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的能力，該方法是本領(lǐng)域已知的(見，Kim等人，美國專利No.5,629,154；Harley等人，美國專利No.5,891,639)。如此處所用，“根據(jù)TRAP法測定的端粒酶活性”表示根據(jù)下列方法在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中測定的端粒酶活性。所述活性典型地與在這種細(xì)胞中相似的對照測定的活性相比較(例如，比對照溶劑中所觀察到的端粒酶活性高50％)。
可以從商業(yè)來源中(例如Cascade Biologics，Portland，OR，或4Cbiotech，Seneffe，Belgium)或從ATCC(American Type Culture Collectio)中得到適用于所述方法的細(xì)胞系，優(yōu)選正常人的成纖維細(xì)胞(NHF)或正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)。存在于ATCC網(wǎng)站上ATCC正常人成纖維細(xì)胞細(xì)胞系包括，例如，CCL135、CCL137和CCL151。
在培養(yǎng)基(例如Epi-Life培養(yǎng)基+角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子補充物+60mM CaCl2，由Cascade Biologics，Inc.提供)中，以約5000細(xì)胞/皿鋪盤并培養(yǎng)細(xì)胞兩天。將適當(dāng)溶劑中的測試組合物的(如95％乙醇或DMSO)以一系列的濃度加入到所選擇的皿中并孵育16-24小時。此處所報告的數(shù)據(jù)中，所使用的溶劑是DMSO。
通過將3.0mL NonidetP40、1.0mL CHAPS裂解緩沖液(見下)，以及1.0mL 10X TRAP緩沖液(見下)加入到5.0mL無脫氧核糖核酸酶-、無核糖核酸酶的水中(通過DEPC(雙乙基焦碳酸)處理或從賣主如Sigma購得而得到無脫氧核糖核酸酶-和無核糖核酸酶的水)而制備細(xì)胞裂解液。
首先在顯微鏡下觀察經(jīng)處理的細(xì)胞的形態(tài)，以證明沒有不規(guī)則生長的可視信號。從皿中除去培養(yǎng)基，并且用PBS(不含Ca和Mg)清洗細(xì)胞兩次。冷卻盤子，優(yōu)選用冰，并且加入細(xì)胞裂解緩沖液(見下)(約100μl每皿)，并且用移液管上下吸打幾次將其裂解。在冰浴中孵育細(xì)胞1小時。
CHAPS裂解緩沖液

a在使用裂解緩沖液之前加入CHAPS變性劑。此外，在提取步驟之前將AEBSF(4-(2-胺乙基)-苯磺酰氟HCl)加入到裂解緩沖液中。
10X TRAP緩沖液

合并下列材料以得到主要的PCR混合液。

a基于最后體積為40μl的PCR混合液加10μl細(xì)胞裂解液＝50μl。
PCR混合液包括以下組分Cy5-TS引物，一種具有5’-AAT CCGTCG AGC AGA GTT-3’序列(SEQ ID NO1)的5’-Cy5標(biāo)記的寡核苷酸，其是端粒酶底物。根據(jù)介質(zhì)中的端粒酶活性，將會向底物中加入端粒重復(fù)序列(具有...AGGGTT...的序列)，以形成端粒酶延伸產(chǎn)物，也稱作端粒酶產(chǎn)物或TRAP產(chǎn)物。具有5’-GCG CGG CTT ACC CTTACC CTT ACC CTA ACC-3’序列(SEQ ID NO2)的ACX引物是與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交的錨定回復(fù)引物(anchored return primer)。
為了定量的目的，以小的對照量加入TSU2內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(即，一種具有5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AAA AGG CCG AGA AGCGAT-3’的序列(SEQ ID NO3)的寡核苷酸，一種TS引物序列的延伸)。具有5’-ATC GCT TCT CGG CCT TTT序列(SEQ ID NO4)的U2引物是設(shè)計的與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的3’區(qū)域雜交的回復(fù)引物(return primer)。
將細(xì)胞裂解液(10μl)加入到反應(yīng)管中的40μl PCR混合物中，并且在室溫下(30℃)孵混合物30分鐘。通過在以下溫度以及時間下孵育來進行PCR94℃/30秒、60℃/30秒以及72℃/30秒；重復(fù)進行這個三步循環(huán)20-30次，優(yōu)選31次循環(huán)。
加入含有例如溴酚藍和二甲苯藍的加載染料，并且使樣品在0.6×TBE中進行10-15％非變性PAGE，直到溴酚藍泳動出凝膠。使用熒光成像儀檢測CY5標(biāo)記的端粒酶產(chǎn)物以觀察形成的產(chǎn)物(最大激發(fā)光的波長為650nm；最大發(fā)射波長為670nm)。
擴增后TSU2內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的最終量通常為5-10amol/50μl反應(yīng)混合物。內(nèi)對照產(chǎn)生了特定的36-mer PCR擴增產(chǎn)物，該產(chǎn)物顯示為凝膠上第一端粒附加產(chǎn)物之下的一條明顯的條帶(也就是，將一個端粒附加物加入到TS寡核苷酸，隨后用ACX復(fù)原引物擴增的產(chǎn)物)。這個內(nèi)對照條帶可以用來對不同樣品的PCR擴增進行標(biāo)準(zhǔn)化。
此方法所獲得的端粒酶產(chǎn)物分子(TM)的相對數(shù)量可以根據(jù)下式確定TM＝(TTRAP產(chǎn)物-TBKD1)/(T內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)-TBKD2)其中TTRAP產(chǎn)物是對凝膠上所有端粒酶產(chǎn)物測定的總強度，TBKD1是相當(dāng)于由端粒酶產(chǎn)物所占面積大小的空白道的面積所測定的背景強度，T內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條帶的強度，以及TBKD2是相當(dāng)于由內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條帶所占面積大小的空白道的面積所測定的背景強度。得到的數(shù)目是在給定孵育時間內(nèi)(為了測定TM的目的，此處指定為30分鐘)得到的端粒酶產(chǎn)物的分子的數(shù)目。
以上所述的通式I、II或III的優(yōu)選化合物(濃度為1μg/ml或小于1μg/ml)可以在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生一定水平的端粒酶活性，該水平比對照溶劑中所見的活性水平至少高25％。更優(yōu)選地，化合物(濃度為1μg/ml或小于1μg/ml)可以產(chǎn)生比對照溶劑中所見的活性水平至少高50％的端粒酶活性。甚至更有力的端粒酶活性可以適于一些應(yīng)用，例如可以產(chǎn)生比對照溶劑中的活性水平至少高75％、100％或500％的，根據(jù)所述的TRAP法測定的，濃度為1μg/ml或小于1μg/ml的化合物。
B.示例性TRAP法的結(jié)果對各種濃度的上述通式I的化合物，進行增加端粒酶活性的有效性的評估。根據(jù)上述方法，在HEKneoP細(xì)胞中(新生兒角質(zhì)形成細(xì)胞)進行測定。在DMSO中的濃度范圍為約0.03μM到10μM。
如圖2所示，對含有化合物1(黃芪甲苷IV)的組合物，隨著濃度的增加，端粒酶活性增至最多約360％于1.0μM的對照物，然后隨著濃度進一步增至10μM，端粒酶活性降低。如圖2所示，對含有化合物2(環(huán)黃芪醇)的組合物，端粒酶活性增至約300％于1.0μM的對比物(與由10nM EGF(表皮生長因子)處理的細(xì)胞中約200％相比較)，然后端粒酶活性會隨著濃度的增加而降低。
對含有圖1A-G所示的每個化合物的組合物，表1給出產(chǎn)生比DMSO對照物中的端粒酶活性水平高2倍(即高出100％)的端粒酶活性的化合物的最小有效濃度(MEC)。
表1

C.傷口愈合檢測方法通式I-III的化合物可以用來促進創(chuàng)傷、燒傷、擦傷或者表皮的其它急性或慢性疾病的愈合，如下進一步的討論。此處所用的“根據(jù)皮膚劃痕試驗方法測定的傷口愈合活性”是指根據(jù)下述方法在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中測定的活性，并且以下述公式中所示的WH值表示。
將細(xì)胞傳于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(5×105細(xì)胞每個培養(yǎng)瓶)，并且在潮濕的5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天。為產(chǎn)生“傷口”，輕輕在細(xì)胞表面拖動2ml塑料吸量管以“劃破”細(xì)胞表面。理想的創(chuàng)傷是約2-3mm寬且50mm長(沿著組織培養(yǎng)瓶的長軸)。用含有多個濃度溶劑(DMSO；對照樣品)或測試組合物再處理細(xì)胞。確定創(chuàng)傷面積，標(biāo)記燒瓶并且在連續(xù)孵育細(xì)胞3-4天后以圖片形式記錄細(xì)胞的外觀。
相對于溶劑處理或其它對照細(xì)胞的化合物處理的樣品，隨時間通過測量傷口的寬度來確定傷口封合。根據(jù)每個樣品在第1天(劃傷后立即)、2、3和4所獲得的圖象進行測量。根據(jù)下式計算傷口愈合的百分率(也表現(xiàn)為“傷口愈合活性”)WH＝100-[100×Wn/Wo]其中，Wn是傷口在第n天的寬度，Wo是傷口在第1天(即劃傷后立即)的寬度。
上述通式I-III的優(yōu)選化合物(濃度為1μg/ml或低于1μg/ml)可以在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞如上述的皮膚劃痕試驗中產(chǎn)生一定量的傷口封合(傷口愈合活性)，該量比未處理或?qū)φ占?xì)胞中所見的至少高25％。甚至更有力的活性可以適用于許多應(yīng)用，例如可以在劃痕試驗中的角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生相對于未處理或?qū)φ占?xì)胞中所見的至少高50％或100％的傷口封合(傷口愈合活性)的化合物。
D.示例性劃痕試驗方法的結(jié)果通過上述劃痕試驗方法，在成人角質(zhì)形成細(xì)胞中評估本發(fā)明化合物1(黃芪甲苷IV)和2(環(huán)黃芪醇)的傷口愈合活性。典型方法的結(jié)果顯示在圖4中，其中上一行的圖像表示對照細(xì)胞(用溶劑，DMSO處理的)，下一行顯示的是在相同溶劑中由0.1μg/ml(大約0.13μM)的1處理的細(xì)胞，在第4天處理的細(xì)胞融合，與對照細(xì)胞相反，其中可見的“傷口”保持到第4天。具有這個組合物和0.01μM 2(環(huán)黃芪醇)的在年輕人角質(zhì)形成細(xì)胞中的傷口中顯示相似結(jié)果，如圖5所示。
圖6顯示在成人角質(zhì)形成細(xì)胞中含有化合物1(黃芪甲苷IV)的組合物的傷口愈合活性，根據(jù)相似方法測定的，其具有或沒有端粒酶抑制劑寡核苷酸(GRN163)或?qū)φ盏墓押塑账?GRN137227)。如所示，端粒酶抑制劑寡核苷酸(GRN163)會阻斷1組合物的傷口愈合效果；對照的寡核苷酸(GRN137226)的作用最小的。(GRN 163是靶向端粒酶RNA組分的模板區(qū)域的端粒酶抑制劑寡核苷酸，特別地，GRN 163是13-mer N3’→P5’硫代磷酸醯胺寡核苷酸，詳細(xì)如PCT Pubn.No.WO 01/18015所述；GRN 137227是具有錯配序列的13-mer N3’→P5’硫代磷酸醯胺對照寡核苷酸。)
以下表2顯示圖5和6中用于劃痕試驗方法的化合物1和2的WH值(傷口愈合活性)，基于使用上述公式的這些方法的結(jié)果。
表2

圖7以圖解形式說明在成人角質(zhì)形成細(xì)胞中本發(fā)明化合物1(黃芪甲苷IV)以對照百分?jǐn)?shù)的傷口封合，其具有或沒有端粒酶抑配劑(GRN163)，以及50ng/mL(約2mL)PDGF(血小板源生長因子)相比。如所示，將1的有效性與PDGF的相比較，并且再次加入GRN163進行阻斷。
V.附加化合物的選擇本發(fā)明還涉及通過根據(jù)此處所述的TRAP法篩選通式I、II或III的化合物的衍生物來選擇對增加端粒酶活性有效的附加化合物的方法。在這一方面，“衍生物”包括通過下列一種或多種方法而使通式I、II或III的化合物進行改性而產(chǎn)生的化合物羥基向低烷基氨基甲酸酯、鹵素、硫醇、低烷基硫醚、氨基、低烷基氨基、低烷基酰胺、醛、或酮基團的轉(zhuǎn)變；將低烷基基團加入這樣的醛或酮基團，或加入到存在的酮基團(例如，烷基化，且形成其它的羥基基團)；將鹵素、羥基和/或氫加入到碳碳雙鍵上；羥基基團的去除(例如，轉(zhuǎn)化為氫)以及在一個或多個手性中心，優(yōu)選為含氧的手性中心中立體化學(xué)的轉(zhuǎn)化。如此處所用，“通過這類改性所產(chǎn)生的“衍生物”不包括上述通式I、II和III的化合物本身。
可以通過使用已知合成反應(yīng)，例如親核取代的標(biāo)準(zhǔn)合成反應(yīng)進行所有這些改性，該親核取代可以包括羥基向如甲苯磺酸酯的更易離去基團的轉(zhuǎn)化；酯化；烷基化；氧化；還原；鹵化；水合；氫化；等等。
通過上述角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的TRAP法對在一種或多種濃度下于適當(dāng)溶劑介質(zhì)中配制的通式I、II或III的化合物的衍生物進行篩選。用于選擇的優(yōu)選衍生物包括那些根據(jù)TRAP法測定的用溶劑配制的濃度為1μg/ml或低于1μg/ml的在角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中對產(chǎn)生一定水平端粒酶活性有效的衍生物，該水平比只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞中所測定的至少高50％。
或者，或此外，根據(jù)上述劃痕試驗方法測定在一種或多種濃度下于適當(dāng)溶劑介質(zhì)中配制的通式I、II或III的化合物的衍生物的傷口愈合活性。用于選擇的優(yōu)選衍生物包括那些在1μg/ml或更低的濃度下傷口愈合活性比對照溶劑中的活性至少高25％、更優(yōu)選高50％的衍生物。
VI.治療指示和處理方法本發(fā)明提供通過使細(xì)胞或組織與有效增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的量的上述部分II所公開的通式I、II或III的孤立化合物的配方接觸而增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法。所述方法還包括確定其中端粒酶活性需要增加的細(xì)胞或組織的前序步驟。所述細(xì)胞可以是培養(yǎng)物，即體外或間接體內(nèi)的，或者可以是主體或患者體內(nèi)的。
通過增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性而實現(xiàn)的優(yōu)點包括，例如被接觸細(xì)胞的復(fù)制能力的增強和/或生命期延長。所述方法可以進一步包括診斷患者需要增加細(xì)胞或患者組織內(nèi)端粒酶活性的主體或患者的情況，例如，診斷需要通過增加細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性而進行處理的疾病。由此，本發(fā)明提供通過增加所述患者細(xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性來治療患者疾病的方法，所述方法包括對需要這種治療的患者使用有效量的上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物?！坝行Я俊笔侵笇υ黾踊颊呒?xì)胞或組織內(nèi)端粒酶活性有效而達到治療效果的量。
這類疾病可以包括，例如，與細(xì)胞衰老相關(guān)的疾病或與沒有端粒酶時細(xì)胞增殖的速率增加相關(guān)的情況，后一情況會導(dǎo)致端粒重復(fù)序列的加速損失。“增殖的速率增加”表示與同細(xì)胞類型的正常細(xì)胞相比，或與其它個體中的同細(xì)胞類型的正常細(xì)胞相比，具有較高速率的細(xì)胞分裂。在這些細(xì)胞的非正常早期階段的衰老最終會導(dǎo)致疾病(見，West等人，美國專利No.6,007,989)。
在現(xiàn)存的各種疾病中的特定細(xì)胞類型中增加端粒酶活性是有益的。由此，本發(fā)明提供通過增加患者細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性而治療選自下列情疾病的患者的方法，該方法包括對需要這類治療的主體使用有效量上述通式I、II或III的化合物。在一些情況中，所述疾病還可以如下所述，使用相關(guān)的細(xì)胞類型(以圓括號作為指示)而使用間接體內(nèi)的細(xì)胞治療進行處理。
(a)阿爾茨海默病，帕金森氏病，亨廷頓舞蹈病，和中風(fēng)(中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，包括神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞)，(b)皮膚的與年齡相關(guān)疾病，例如皮膚萎縮和稀疏，彈性組織離解和皮膚起皺，皮脂腺增生或發(fā)育不全，老年斑和其它色素沉著異常，頭發(fā)泛灰以及掉發(fā)或頭發(fā)稀疏，或慢性皮膚潰瘍(成纖維細(xì)胞，皮脂腺細(xì)胞，黑素細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，朗格罕氏細(xì)胞，微血管內(nèi)皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞)，(c)關(guān)節(jié)變性疾病(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞、和lacunal和滑液的成纖維細(xì)胞)，(d)骨質(zhì)疏松和其它骨骼系統(tǒng)的變性疾病(骨骼系統(tǒng)的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞，骨髓基質(zhì)或間質(zhì)細(xì)胞，骨原細(xì)胞)，(e)血管系統(tǒng)的年齡相關(guān)和壓力相關(guān)疾病，包括動脈粥樣硬化，鈣化，血栓形成，和動脈瘤(心臟和血管系統(tǒng)的細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，和外膜成纖維細(xì)胞)，(f)年齡相關(guān)的黃斑變性(眼睛的細(xì)胞，如色素沉著的上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞)，(g)AIDS(HIV-限制的CD8+細(xì)胞)；(h)年齡相關(guān)和壓力相關(guān)的免疫系統(tǒng)損傷，包括組織更新的損傷(其隨著自然老化發(fā)生，癌癥，癌癥治療，急性或慢性感染，或?qū)е录?xì)胞加速更新的遺傳性失調(diào))，以及相關(guān)的貧血和其它變性疾病(免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞，包括淋巴、骨髓和紅細(xì)胞系的細(xì)胞，例如B和T淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，循環(huán)的和特定組織的巨噬細(xì)胞，中性白細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，NK細(xì)胞，及其各自的祖細(xì)胞)。
除了上述細(xì)胞類型以外，具有治療優(yōu)勢的進一步細(xì)胞類型可以包括，但不限于，肝細(xì)胞，內(nèi)分泌或外分泌細(xì)胞，平滑肌組織，或骨骼肌肉組織。
作為一個例子，在HIV感染個體的情況中，當(dāng)CD8+細(xì)胞試圖控制HIV感染的CD4+細(xì)胞時，會使CD8+細(xì)胞的更新加快。在AIDS(上述(g))中，確信疾病是由HIV限制的CD8+細(xì)胞的早期衰老而導(dǎo)致的。這種細(xì)胞的老化不能簡單地認(rèn)為是每個細(xì)胞復(fù)制中端粒序列的不正常量損失，此外，而是為了提高細(xì)胞的復(fù)制率，以使端粒消耗高于這組細(xì)胞的正常值。因此，本發(fā)明提供治療HIV感染主體，更特別地降低HIV感染主體內(nèi)HIV限制的CD8+細(xì)胞的早期衰老的方法，該方法通過對需要這種治療的主體使用有效量上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物而進行的。
端粒酶活性的增加可以對非分裂的細(xì)胞以及增殖細(xì)胞均為有益，例如在與由于壓力而使細(xì)胞死亡的敏感性增加相關(guān)的疾病中，如心臟衰竭或中風(fēng)的局部缺血(見，Oh和Schneider，J Mol Cell Cardiol34(7)717-24；Mattson，Exp Gerontol.35(4)489-502)。因此，本發(fā)明還提供通過主體細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的增加，降低主體內(nèi)，例如由于心臟衰竭或中風(fēng)而使組織內(nèi)局部缺血的疾病的由壓力或DNA損害誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，該方法包括對需要這種治療的主體使用有效量上述部分II公開的通式I、II或III的化合物。如上所述，所述方法包括對主體診斷顯示的疾病的前序步驟。
在另一方面，所述組合物可以用于個體的治療，其中患者體內(nèi)的一種或多種類型細(xì)胞是有限的，并且通過擴展這些細(xì)胞的能力而持續(xù)復(fù)制或抵抗壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來延長生命。這組細(xì)胞的一個例子是唐氏綜合病患者中存在的淋巴細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供通過增加患者所述細(xì)胞的端粒酶活性，而增加唐氏綜合病患者中存在的淋巴細(xì)胞的復(fù)制能力和延伸生命期的方法，包括對這樣的患者使用有效量的上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物。所述組合物還可以用于改善在正常年齡中發(fā)生的對壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗。
在本發(fā)明進一步的方面，增加端粒酶活性對促進創(chuàng)傷、燒傷、擦傷、其它表皮急性或慢性疾病的愈合有效。因此，本發(fā)明提供治療表皮急性或慢性情況的方法，該方法通過對需要這種治療的患者，優(yōu)選地局部地對有影響的面積，使用有效量上述部分II所公開的通式I、II或III的孤立化合物的配方。
如此處所述，“表皮的急性或慢性疾病”包括急性疾病如由外傷、燒傷、擦傷、外部切口、供體錯位導(dǎo)致的損傷以及由感染因子產(chǎn)生的損傷，和慢性疾病如慢性靜脈曲張性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓迫潰瘍、褥瘡、粘膜表面的潰瘍或瘡。還包括由長期發(fā)炎疾病或感染或遺傳缺陷導(dǎo)致的皮膚或上皮表面的損害(例如，瘢痕瘤的形成和異常的血凝固)。見，例如，PCT Pubn No.WO02/91999。
在這類治療中端粒酶活性增加的理想效果包括在治療部位的細(xì)胞增殖或遷移，表面的上皮形成，傷口(如果存在)的封合，或正常生理功能的恢復(fù)。治療部位的“上皮形成”或“表皮再植”表示在作為應(yīng)用治療結(jié)果的部位上的上皮細(xì)胞密度的增加。
本發(fā)明還可以用于增強植入細(xì)胞的生長。在這類治療中端粒酶活性增加的理想效果包括治療部位的覆蓋率，植入細(xì)胞的存活，沒有免疫排斥，傷口(如果存在)的封合，或正常生理功能的恢復(fù)。植入細(xì)胞可以通過直接加入到愈合過程中(例如成為愈合組織的一部分)或通過覆蓋傷口由此提供促使宿主細(xì)胞進行愈合的環(huán)境而參與于傷口封合。
本發(fā)明還用于其它目的的皮膚處理和皮膚表面任何已知缺陷的修復(fù)，例如化妝品的增強作用。
在進一步的方面，本發(fā)明的方法和組合物可以通過增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性，來用于增強細(xì)胞培養(yǎng)物如間接體內(nèi)細(xì)胞治療中，或單克隆抗體產(chǎn)物的復(fù)制能力和/或延伸生命期。增加端粒酶活性會通過延緩端粒重復(fù)序列損失和/或改善細(xì)胞增殖中對壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性來增強這類細(xì)胞的復(fù)制能力。
在間接體內(nèi)應(yīng)用的情況中，將有效量上述的通式I、II或III的化合物加入到來自主體的外植細(xì)胞?！坝行Я俊北硎緦?xì)胞內(nèi)端粒酶活性增加有效的量，從而增加細(xì)胞復(fù)制能力和/或延伸生命期。
外植細(xì)胞可以包括，例如，干細(xì)胞如骨髓干細(xì)胞(美國專利No.6,007,989)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Simonsen等人，Nat.Biotechnol 20(6)592-6，2002)，或腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(Thomas等人，Nat Biotechnol 18(1)39-42，2000)例如上述(a)-(g)的疾病情況可以進行間接體內(nèi)基于細(xì)胞的治療。例子包括使用肌衛(wèi)星細(xì)胞治療肌營養(yǎng)不良，成骨細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療與年齡相關(guān)的黃斑變性，軟骨細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎，等等。
例如，在AIDS患者體內(nèi)用來控制感染的CD4+細(xì)胞擴散的功能性CD8+細(xì)胞是有限的這一認(rèn)識允許設(shè)計出治療方法，其中當(dāng)首先AIDS被鑒定時，在早期階段從HIV感染的個體中去除HIV限制的CD8+細(xì)胞，儲存起來，然后在個體不再具有需要的CD8+細(xì)胞時，在晚期階段再將HIV限制的CD8+細(xì)胞引入個體中。因此，可以通過包括在適當(dāng)?shù)臅r間點上個體限制細(xì)胞的連續(xù)使用的方法來延長個體生命。通過遵循CD8+細(xì)胞的衰老，或通過測定這類CD8+細(xì)胞中端粒的長度(作為當(dāng)這些細(xì)胞將要衰老時的指示)來確定適當(dāng)?shù)狞c。根據(jù)本發(fā)明，在減緩端粒重復(fù)序列損失的試劑(即上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物)存在下，可以從數(shù)字上擴增儲備細(xì)胞(restored cell)。
因此，本發(fā)明提供基于細(xì)胞間接體內(nèi)治療的方法，其包括從主體中得到細(xì)胞群體，然后間接體內(nèi)地擴增細(xì)胞群體，其中以對增加端粒酶活性有效，用上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物處理細(xì)胞群體且由此增加細(xì)胞群體的復(fù)制能力和/或生命期的量。所述方法通常包括對主體的需要進行基于細(xì)胞間接體內(nèi)治療的情況進行診斷，如上所述。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供干細(xì)胞增殖的方法，其中以對增加端粒酶活性有效量用上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物處理干細(xì)胞群體且由此增加細(xì)胞群體的復(fù)制能力和/或生命期。
VII.使用的配方和方法本發(fā)明包括制備藥物組合物的方法，該組合物用于增加細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性和/或促進傷口愈合。因此，上述部分II所公開的通式I、II或III的化合物可以與藥物賦形劑，和任選地其它藥物試劑，佐劑等(可以包括活性或非活性成分)結(jié)合。組合物可以是固體形式，半固體形式，凍干粉形式，液體劑量形式，例如片狀、膠囊、粉末、持續(xù)釋放配方、溶液、懸浮液、乳狀液、栓劑、乳脂、軟膏、洗液、氣溶膠等。所述配方可以以單位劑量的形式使用，其適用于精確劑量的簡單施用。
通式I、II或III的孤立化合物還可以配制成用作口服使用的食物補充或營養(yǎng)補充。對于營養(yǎng)補充配方，或口服藥物配方，適合的賦形劑包括藥物級載體，如甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、凝膠、硬脂酸鎂、糖酸鈉和/或碳酸鎂。對于口服液體配方的使用，通過適用于在水性載體(例如鹽水、葡萄糖水、甘油或乙醇，優(yōu)選水或普通鹽水)中水合的固體或液體形式來提供的作為溶液、懸浮液、乳狀液或糖漿制備所述組合物。如果需要，所述組合物可以包括最小量無毒性的輔助物質(zhì)，如潤濕劑、乳化劑或緩沖液。還可以將通式I、II或III的孤立化合物加入到已存在的營養(yǎng)補充配方中，例如常規(guī)所使用的，其還可以包括草本提煉精華，例如蒙古黃芪的提煉精華。
對于傷口愈合的使用或者表皮急性或慢性情況的處理，配制通式I、II或III的化合物來用于局部使用。用于局部使用的載體可以是例如洗液、乳脂、凝膠、藥膏、條狀物、噴霧或糊狀的各種形式中的一種。可以根據(jù)已知方法配制這些產(chǎn)物的形式。它們可以包括各種類型的載體，包括，但不限于，溶液、氣溶膠、乳狀液、凝膠或脂質(zhì)體。所述載體例如可以以乳狀液進行配制，該液具有水包油或油包水的基礎(chǔ)。用于乳狀液的適合的疏水性(油性)成分包括，例如，植物油、動物脂肪和油、合成碳水化合物，以及其酯和醇(包括聚酯和有機聚硅醚)。這樣的乳狀液還包括乳化劑和/或表面活性劑，例如非離子表面活性劑，如本領(lǐng)域已知的，其用來在連續(xù)相中分散不連續(xù)相和懸浮。
典型地，局部配方含有一種或多種選自結(jié)構(gòu)化試劑、增稠劑或膠凝劑、和軟化劑或潤滑劑的成分。經(jīng)常使用的結(jié)構(gòu)化試劑包括長鏈醇如硬脂醇，和甘油醚或酯和低聚(環(huán)氧乙烷)醚或其酯。增稠劑和膠凝劑包括，例如，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或其酯，聚丙烯酰胺和自然產(chǎn)生的增稠劑如瓊脂、角叉菜膠、白明膠、和果阿膠。軟化劑的例子包括甘油三酸酯、脂肪酸酯和酰胺、蠟如蜂蠟、鯨油或巴西棕櫚蠟、磷脂如卵磷脂、固醇及其脂肪酸酯。局部配方可以進一步包括其它本領(lǐng)域已知的組分，例如收斂劑、芳香劑、顏料、皮膚滲透增強劑、遮光劑等。
所述藥物組合物還可以配制來進行非腸道、經(jīng)真皮(transdermally)、或通過吸入的使用。用于非腸道使用的可注射組合物典型含有于適合的IV溶液(消毒后的生理鹽水)中的活性化合物。還可以以酯類或磷脂中，脂質(zhì)體懸浮液或水性乳狀液中的懸浮液來配制組合物。
對于吸入式的使用，可以以固體或液體氣溶膠顆粒來配制活性化合物。所述配方還可以包括推進劑和/或分散劑如乳糖，以促進氣溶膠的形成。對于經(jīng)真皮的使用，優(yōu)選地，使活性化合物包含在經(jīng)真皮的碎片中，其可將化合物緩慢運輸?shù)剿x定的皮膚區(qū)域中，并且可以包括滲透增強基質(zhì)，如脂肪醇或甘油。
制備這些配方的方法是已知的或者對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的；例如，見Remington’s Pharmaceutical Sciences(19thEd.，Williams&Wilkins，1995)。使用的組合物可以含有藥物上安全的且有效的量的選定化合物來用于增加靶向細(xì)胞或組織內(nèi)的端粒酶活性。
優(yōu)選地，藥物或營養(yǎng)補充的組合物含有至少0.1％(w/v)上述通式I、II或III的化合物，優(yōu)選高于0.1％(w/v)，至多約10％，優(yōu)選至多約5％，更優(yōu)選至多約1％(w/v)。適合濃度的選擇依賴于如所需劑量、頻率和活性試劑的傳送方法的這些因素。
對主體或患者的治療，如哺乳動物或人類病患，根據(jù)如主體的體重和整體健康、治療的情況、病癥的嚴(yán)重性等因素來確定劑量。確定劑量和濃度以產(chǎn)生所需的益處，同時避免任何不希望的副作用。主體化合物的典型劑量為一名患者約0.5到500mg/天，優(yōu)選約1-100mg/天。例如，較高的劑量控制包括如，50-100，75-100，或50-75mg/天，而較低的劑量控制包括1-50，25-50，或1-25mg/天。在特定的實施方案中，例如此處指定為2(環(huán)黃芪醇)的化合物的使用量為至少1mg/天，優(yōu)選至少5mg/天；此處指定為1(黃芪甲苷IV)的化合物的使用量為至少50mg/天，優(yōu)選至少100mg/天。
本發(fā)明的說明中指出通式I-III的化合物具有極好的生物可用性和低毒性。例如，代表性化合物(環(huán)黃芪醇(2))在5000μg/盤的水平上進行Ames測試，在逆轉(zhuǎn)細(xì)菌致突變(reverse bacterial mutation)的可能性方面為負(fù)，使用Salmonella Typhimurium測交品系TA98、TA100、TA1535、TA1537和E.coli測交品系WP2 uvrA。在單獨進行至多10mg/kg的靜脈注射以后，Sprague-Dawley小鼠中也具有很好的全身性耐受性。在男性和女性的行為(吃、喝)、總重量、器官重量(心臟、肺、肝、腎、腎上腺和脾臟)、血液學(xué)或臨床化學(xué)方面都沒有觀察到明顯的試劑依賴性變化。
實施例實施例1.黃芪甲苷IV(1)到環(huán)黃芪醇(2)的轉(zhuǎn)化 將黃芪甲苷IV(1)(5.00g，mmol)加入到“HCl-MeOH 10”(TClAmerica)(500mL)中，且在室溫下攪拌混合物7天。減壓且20℃(不需要加熱)下濃縮反應(yīng)混合物至約半體積。將混合物加入水性碳酸氫鈉和乙酸乙酯中。用乙酸乙酯再次萃取水層。合并有機層，用飽和氯化鈉溶液清洗，在無水硫酸鈉上干燥，并減壓濃縮。通過柱色譜法純化殘余物(20∶1-14∶1氯仿/甲醇)。為了用乙醇代替剩余溶劑，將純化物質(zhì)溶于乙醇中并且在減壓下去除溶劑以得到2(2.1g，64％)。
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.34(d，J＝4.7Hz，1H)，0.48(d，J＝4.3Hz，1H)，0.92(s，3H)，0.93(s，3H)，1.0-1.8(m，13H)，1.11(s，3H)，1.19(s，3H)，1.22(s，6H)，1.27(s，3H)，1.9-2.0(m，4H)，2.30(d，J＝7.8Hz，1H)，2.54(q，J＝11.8Hz，1H)，3.27(m，1H)，3.5(m，1H)，3.72(t，J＝7.4Hz，1H)，4.65(q，J＝7.4Hz，1H)。ESI-MS m/z正491(M+H)+，負(fù)549(M+AcO)-。TLC(Merck，Kieselgel60)Rf＝0.33(6∶1氯仿/甲醇)。
實施例2.得自黃芪甲苷IV(1)的化合物5、6和7的制備從黃芪甲苷IV(1)中去除苷，伴有和沒有重排
在黃芪甲苷IV(1)(1.00g，1.28mmol)的甲醇(80mL)溶液中加入硫酸(24ml)，將混合物回流1.5小時。冷卻到室溫之后，將混合物倒入乙酸乙酯和水中。用鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(20∶1-10∶1-7∶1氯仿/甲醇)以得到重排產(chǎn)物5(24mg，4.0％)，單苷6(172mg，21％)和7(29mg，3.6％)以及糖苷配基，環(huán)黃芪醇(2)(326mg，52％)。
GRN140724ESI-MS m/z 623(M+H)+C35H58O9＝622GRN140725ESI-MS m/z 653(M+H)+C36H60O10＝652GRN140726ESI-MS m/z 473(M+H)+C30H48O4＝472。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.72，0.85，0.95，1.05，1.11，1.17，1.18和1.25(s，3H，每個)，0.9-2.1(m，13H)，2.20(d，J＝7.4Hz，1H)，2.4-2.6(m，2H)，3.42(m，1H)，3.70(dd，J＝7.8，5.9Hz，1H)，4.63(q，J＝7.4Hz，1H)，5.45(br s，1H)，5.57(br s，1H)。
實施例3.1的乙?；?6-酮基10的形成根據(jù)上文引用的Kitagawa 1983b的方法得到下列化合物9和10。簡單地，黃芪甲苷IV(1)的乙?；梢蕴峁?，和較少量16-乙酸副產(chǎn)物。對9進行氯鉻酸吡啶氧化得到10。
實施例4對10進行去乙?；瘉碇苽?(見圖1)向上述10(10mg，0.0093mmol)的甲醇溶液中加入氫硼化鈉(10mg，0.26mmol)，然后在室溫下攪拌混合物過夜。用氯仿(3mL)稀釋混合物并且直接進行硅膠柱色譜法(3∶1氯仿/甲醇)來得到4(8.0mg，quant.)。ESI-MS m/z 783(M+H)+C41H66O14＝782。
實施例5環(huán)黃芪醇2形成三酮11根據(jù)Kitagawa等人，chem.Pham.Bull.31(2)689-697(1983a)的方法，通過對2進行CrO3氧化而得到環(huán)黃芪醇的3，6，16-三酮衍生物11。
實施例6環(huán)黃芪醇2的3-或6-羥基的乙?；?
向環(huán)黃芪醇(2)(50mg，0.10mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入三乙胺(0.030mL，0.22mmol)和三甲基乙酰氯(0.014mL，0.12mmol)，然后在0℃下攪拌混合物過夜。將混合物直接進行硅膠柱色譜法(1∶1-1∶2己烷/乙酸乙酯)來得到12(17mg，30％)和13(3.3mg，2.9％)。
12ESI-MS m/z 575(M+H)+C35H58O6＝574。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.32(d，J＝4.7Hz，1H)，0.49(d，J＝4.7Hz，1H)，0.92(s，3H)，0.95(s，3H)，1.07(s，3H)，1.1-2.0(m，17H)，1.15(s，9H)，1.18(s，3H)，1.21(s，3H)，1.34(s，6H)，2.19(dd，J＝13.7，9.8Hz，1H)，2.36(d，J＝7.8Hz，1H)，3.27(m，1H)，3.51(td，J＝9.4，3.5Hz，1H)，3.71(t，J＝7.4Hz，1H)，5.32(td，J＝7.8，4.7Hz，1H)。
13ESI-MS m/z 575(M+H)+C35H58O6＝574。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.35(d，J＝4.3Hz，1H)，0.51(d，J＝4.3Hz，1H)，0.92(s，3H)，1.0-2.0(m，17H)，1.03(s，3H)，1.09(s，3H)，1.12(s，3H)，1.17(s，9H)，1.21(s，3H)，1.24(s，3H)，1.28(s，3H)，2.29(d，J＝7.8Hz，1H)，2.53(m，1H)，3.50(m，1H)，3.73(t，J＝7.2Hz，1H)，4.50(dd，J＝10.9，4.3Hz，1H)，4.65(m，1H)。
實施例7A環(huán)黃芪醇2的仲羥基的乙?；鶕?jù)上述Kitagawa 1983a的方法進行此反應(yīng)。簡單地，帶有醋酸酐/吡啶的乙?；玫?4(主要產(chǎn)物)和15(次要產(chǎn)物)的混合物。
實施例7B保留乙?；?，對3，6-二乙酰環(huán)黃芪醇(14)進行甲基化 在氮氣、0℃下將14(30mg，0.052mmol)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液加入到碘代甲烷(0.75mL，12mmol)和氫化鈉(60％油分散液，40mg，1.0mmol)中，然后在室溫下攪拌混合物過夜。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(4∶1己烷/乙酸乙酯)來得到16(29mg，92％)。
ESI-MS m/z 603(M+H)+C36H58O7＝602。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.33(d，J＝4.7Hz，1H)，0.56(d，J＝4.7Hz，1H)，0.82(s，3H)，0.89(s，3H)，0.96(s，3H)，1.06(s，3H)，1.1-1.9(m，17H)，1.13(s，3H)，1.19(s，3H)，1.23(s，3H)，1.97(s，3H)，2.02(s，3H)，2.3-2.4(m，2H)，3.05(s，3H)，3.23(s，3H)，3.81(dd，J＝9.0，6.6Hz，1H)，3.95(td，J＝7.8，5.1Hz，1H)，4.55(dd，J＝10.9，4.7Hz，1H)，4.70(td，J＝9.4，4.3Hz，1H)。
實施例7C16，25-二甲氧基環(huán)黃芪醇，17的制備去除16的乙酰基
在室溫下攪拌16(28mg，0.046mmol)和甲醇鈉(0.5mol/mL，甲醇中，6mL)的混合物48小時。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(2∶3己烷/乙酸乙酯)來得到二甲氧基二醇化合物17(23mg，96％)。
ESI-MS m/z 519(M+H)+C32H54O5＝518。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.32(d，J＝4.7Hz，1H)，0.47(d，J＝4.3Hz，1H)，0.90(s，3H)，0.93(s，3H)，1.06(s，3H)，1.1-1.9(m，17H)，1.13(s，3H)，1.20(s，3H)，1.22(s，3H)，1.23(s，3H)，2.3-2.4(m，2H)，3.06(s，3H)，3.23(s，3H)，3.27(m，1H)，3.51(td，J＝9.4，3.5Hz，1H)，3.81(dd，J＝9.4，6.6Hz，1H)，3.96(td，J＝7.8，5.5Hz，1H)。
實施例7D保留乙?；?，對3，6-二乙酰環(huán)黃芪醇(14)進行烷基化 在14(109mg，0.190mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入到二異丙基乙胺(1.0mL)和氯甲基甲基醚(0.5mL)中，然后在室溫下攪拌混合物24小時。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(3∶1己烷/乙酸乙酯)來得到18(114mg，90％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.31(d，J＝5.1Hz，1H)，0.56(d，J＝4.7Hz，1H)，0.8.(s，3H)，0.88(s，3H)，0.96(s，3H)，1.1-2.0(m，18H)，1.15(s，3H)，1.17(s，3H)，1.28(s，3H)，1.34(s，3H)，1.96(s，3H)，2.02(s，3H)，2.28(d，J＝8.2Hz，1H)，3.30(s，3H)，3.33(s，3H)，3.81(t，J＝7.2Hz，1H)，4.17(m，1H)，4.5-4.6(m，3H)，4.7-4.8(m，3H)。
實施例7E從18中去除乙?；?將上述18(環(huán)黃芪醇的3，6-二乙?；?16，25-二(甲氧基甲基)醚衍生物)(102mg，0.150mmol)和甲醇鈉(0.5mol/mL，甲醇中，10mL)的混合物室溫攪拌48小時。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(1∶1己烷/乙酸乙酯)來得到二(甲氧基甲基)醚化合物19(80mg，92％)。
ESI-MS m/z 579(M+H)+C34H58O7＝578。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.32(d，J＝4.7Hz，1H)，0.48(d，J＝4.3Hz，1H)，0.89(s，3H)，0.93(s，3H)，1.1-2.0(m，18H)，1.15(s，3H)，1.17(s，3H)，1.22(s，3H)，1.29(s，3H)，1.34(s，3H)，2.29(d，J＝8.6Hz，1H)，3.28(m，1H)，3.30(s，3H)，3.33(s，3H)，3.53(m，1H)，3.81(t，J＝Hz，1H)，4.18(td，J＝7.8，5.5Hz，1H)，4.50(d，J＝6.6Hz，1H)，4.54(d，J＝6.2Hz，1H)，4.71(d，J＝7.0Hz，1H)，4.76(d，J＝7.4Hz，1H)。
實施例8三乙?；h(huán)黃芪醇15的烷基化，隨后除去乙?；?
在氮氣、0℃下將15(30mg，0.049mmol)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液中加入碘代甲烷(0.75mL，12mmol)和氫化鈉(60％油分散液，40mg，1.0mmol)，然后在室溫下攪拌混合物過夜。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑。
向殘留液中加入甲醇鈉的甲醇溶液(0.5mol/L，6mL)，并且在室溫下攪拌混合物過夜。加入10％鹽酸，用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(1∶2己烷/乙酸乙酯)來得到20(23mg，93％)。
ESI-MS m/z 505(M+H)+C31H52O5＝504。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.33(d，J＝4.3Hz，1H)，0.48(d，J＝4.3Hz，1H)，0.8-2.1(m，17H)，0.91(s，3H)，0.93(s，3H)，1.04(s，3H)，1.14(s，3H)，1.20(s，3H)，1.22(s，3H)，1.23(s，3H)，2.28(d，J＝7.8Hz，1H)，2.60(q，J＝10.9Hz，1H)，3.17(s，3H)，3.27(m，1H)，3.51(td，J＝9.8，3.5Hz，1H)，3.72(dd，J＝9.0，5.5Hz，1H)，4.62(m，1H)。
實施例9A無羥基的環(huán)黃芪醇單苷6的烷基化
在氮氣、0℃下將6(50mg，0.077mmol)的二甲基甲酰胺(4mL)溶液中加入碘代甲烷(1.0mL，16mmol)和氫化鈉(60％油分散液，60mg，1.5mmol)中，然后在室溫下攪拌混合物過夜。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(3∶1己烷/乙酸乙酯)來得到過甲氧基(permethoxy)化合物21(33mg，57％)。
ESI-MS m/z 751(M+H)+C43H74O10＝750。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.21(d，J＝4.7Hz，1H)，0.47(d，J＝4.3Hz，1H)，0.8-2.0(m，17H)，0.87(s，3H)，0.89(s，3H)，1.05(s，3H)，1.13(s，3H)，1.17(s，3H)，1.22(s，3H)，2.3-2.4(m，2H)，2.67(dd，J＝11.0，4.1Hz，1H)，2.92(t，J＝8.2Hz，1H)，3.06(s，3H)，3.1-3.6(m，6H)，3.22(s，3H)，3.32(s，3H)，3.35(s，3H)，3.48(s，3H)，3.49(s，3H)，3.59(s，3H)，3.80(dd，J＝9.0，6.6Hz，1H)，3.94(m，1H)，4.24(d，J＝7.4Hz，1H)。
實施例9B3，16，25-三甲氧基黃芪醇22的制備從過甲氧基化合物21中去除苷，伴有重排 在21(30mg，0.040mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入硫酸(0.2mL)，將混合物回流10小時。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(4∶1己烷/乙酸乙酯)來得到22(3.6mg，17％)。
ESI-MS m/z 533(M+H)+C33H56O5＝532。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.73(s，3H)，0.8-2.0(m，18H)，0.85(s，3H)，1.00(s，3H)，1.03(s，3H)，1.06(s，3H)，1.14(s，3H)，1.24(s，3H)，1.25(s，3H)，2.3-2.4(m，2H)，2.58(dd，J＝10.9，3.9Hz，1H)，3.09(s，3H)，3.24(s，3H)，3.34(s，3H)，3.80(dd，J＝9.4，6.6Hz，1H)，3.98(m，1H)，5.25(br d，J＝5.5Hz，1H)。
實施例10A無羥基的環(huán)黃芪醇單苷7的烷基化 根據(jù)上述用于制備化合物21的方法，從7(30mg)中得到化合物23(18mg，53％)。
ESI-MS m/z 707(M+H)+C41H70O9＝706。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.20(d，J＝4.3Hz，1H)，0.44(d，J＝4.3Hz，1H)，0.8-1.9(m，17H)，0.90(s，3H)，0.93(s，3H)，1.05(s，3H)，1.11(s，3H)，1.13(s，3H)，1.18(s，3H)，1.23(s，3H)，2.3-2.4(m，2H)，2.9-3.6(m，6H)，3.09(s，3H)，3.20(s，3H)，3.22(s，3H)，3.42(s，3H)，3.58(s，3H)，3.59(s，3H)，3.80(dd，J＝9.0，6.6Hz，1H)，3.9-4.0(m，2H)，4.21(d，J＝7.4Hz，1H)。
實施例10B6，16，25-三甲氧基黃芪醇24的制備從過甲氧基化合物23中去除苷，伴有重排 根據(jù)上述用于制備化合物22的方法，從23(17mg)中得到化合物24(7.1mg，56％)。
ESI-MS m/z 533(M+H)+C33H56O5＝532。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.74(s，3H)，0.8-2.4(m，18H)，0.85(s，3H)，0.92(s，3H)，1.03(s，3H)，1.06(s，3H)，1.14(s，3H)，1.23(s，3H)，1.24(s，3H)，3.10(s，3H)，3.18(m，1H)，3.23(s，3H)，3.34(s，3H)，3.53(m，1H)，3.80(dd，J＝9.4，6.6Hz，1H)，3.97(m，1H)，5.24(d，J＝5.5Hz，1H)。
實施例11.3，6-二甲氧基環(huán)黃芪醇25的制備16，25-二(甲氧基甲基)醚化合物19的甲基化，且去除二(甲氧基甲基)醚基團 在氮氣、0℃下在19(30mg，0.052mmol)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液中加入碘代甲烷(0.75mL，12mmol)和氫化鈉(60％油分散液，40mg，1.0mmol)中，然后在室溫下攪拌混合物過夜。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑。
向殘留液中加入四氫呋喃(5mL)和10％鹽酸(1mL)，并且在室溫下攪拌混合物過夜。然后回流1小時。加入水，并且用乙酸乙酯萃取混合物。用水和鹽水清洗有機層并且在無水硫酸鈉上干燥。在減壓下去除溶劑且通過硅膠柱色譜法純化殘余物(3∶1-1∶1己烷/乙酸乙酯)來得到25(13mg，48％)和較少量的3，6-二甲氧基-16-(甲氧基甲基)-醚化合物26(7.4mg，25％)。
25ESI-MS m/z 563(M+H)+C34H58O6＝562。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.19(d，J＝4.7Hz，1H)，0.45(d，J＝4.3Hz，1H)，0.8-2.3(m，18H)，0.86(s，3H)，0.92(s，3H)，1.05(s，3H)，1.07(s，3H)，1.20(s，3H)，1.24(s，3H)，1.28(s，3H)，2.41(d，J＝8.2Hz，1H)，2.70(dd，J＝11.1，4.5Hz，1H)，2.90(m，1H)，3.19(s，3H)，3.326(s，3H)，3.330(s，3H)，3.71(t，J＝7.4Hz，1H)，4.37(m，1H)，4.53(d，J＝6.2Hz，1H)，4.59(d，J＝6.2Hz，1H)。
26ESI-MS m/z 519(M+H)+C32H54O5＝518。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)0.21(d，J＝4.3Hz，1H)，0.45(d，J＝4.3Hz，1H)，0.8-2.0(m，17H)，0.86(s，3H)，0.93(s，3H)，1.06(s，3H)，1.12(s，3H)，1.20(s，3H)，1.21(s，3H)，1.28(s，3H)，2.30(d，J＝7.8Hz，1H)，2.54(q，J＝10.2Hz，1H)，2.69(dd，J＝11.3，4.3Hz，1H)，2.89(td，J＝8.2，4.3Hz，1H)，3.19(s，3H)，3.32(s，3H)，3.72(t，J＝7.2Hz，1H)，4.66(m，1H)。
權(quán)利要求
1.一種增加細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性的方法，包括確定其中需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織，以及使所述細(xì)胞或組織與具有通式I的孤立化合物的配方接觸 其中，每個X1、X2和X3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低酰基取代，以使化合物含有最多三個苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；或者R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物包括0或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)；而 表示碳9和11之間的單鍵。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中每個X1和X2單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；而X3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中X1是OH或苷，每個X2和OR1單獨地為OH或苷，而X3為OH或酮基。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙或環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇或黃芪甲苷IV 16-one。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述化合物是黃芪甲苷IV。
11.一種增加細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性的方法，包括確定其中需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織，以及使所述細(xì)胞或組織與具有通式II的孤立化合物的配方接觸 其中，每個X4和X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低酰基取代，以使化合物含有最多三個苷。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型的。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中每個X4和OR3單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中X4是OH或苷，而每個X5和OR5是OH。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中X4為OH。
17.一種增加細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性的方法，包括確定其中需要增加端粒酶活性的細(xì)胞或組織，以及使所述細(xì)胞或組織與具有通式III的孤立化合物的配方接觸 其中，每個X6、X7和X8單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR4選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈?，以使化合物含有最多三個苷。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型的。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中每個X6、X7、X8和OR4單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中每個X6、X7、X8和OR4單獨地選自羥基或苷。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中X8和OR4是OH，而每個X6和X7單獨地選自O(shè)H或苷。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中每個OR4、X6和X8為OH，而X7為苷。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述化合物是人參皂甙RH1。
25.一種通過增加所述患者的細(xì)胞或組織內(nèi)的端粒酶活性來對患者的一種疾病進行治療的方法，包括對需要這種治療的患者施用有效量的如權(quán)利要求1所述的通式I、如權(quán)利要求11所述的通式II或如權(quán)利要求17所述的通式III的孤立化合物的配方。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述孤立化合物具有通式I或通式II。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述疾病是HIV感染或變性疾病。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述變性疾病選自神經(jīng)變性疾病、骨或關(guān)節(jié)變性疾病、黃斑病變、動脈粥樣硬化或貧血。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述疾病是創(chuàng)傷或其它表皮的急性或慢性疾病。
30.一種藥物組合物，包括在藥物上可接受的載體中的通式I的化合物 其中每個X1、X2單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；X3是酮基；OR1選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈?，以使化合物含有最多三個苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵或者R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型的。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)；而 表示碳9和11之間的單鍵。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中每個X1是OH或苷，而每個X2和OR1單獨地是OH或苷。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述化合物是黃芪甲苷IV 16-one。
36.一種藥物組合物，包括在藥物上可接受的載體中通式I的化合物 其中X1、X2之一選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基，而另一個是苷；每個X3和OR1單獨選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈?，以使化合物含有最多三個苷；以及R2是甲基和 表示碳9和11之間的雙鍵；或者R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)，而 表示碳9和11之間的單鍵。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述化合物包括1個苷，其沒有由其它苷取代。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中每個所述苷是D構(gòu)型。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中R2與碳9一起形成稠環(huán)丙基環(huán)；而 表示碳9和11之間的單鍵。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述化合物選自環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙(在此指定作為6)、或環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷(在此指定作為7)。
41.一種藥物組合物，包括在藥物上可接受的載體中通式II的化合物 其中每個X4、X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈允够衔锖凶疃嗳齻€苷。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述化合物包括0、1或2個苷，其均沒有由其它苷取代。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中每個X4和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的組合物，其中X4是OH或苷，而每個X5和OR3為OH。
45.根據(jù)權(quán)利要求30、36和41任一所述的組合物，其中所述組合物中存在的所述化合物的濃度為至少0.1％(w/v)。
46.一種治療表皮的急性或慢性疾病的方法，包括使表皮細(xì)胞與如權(quán)利要求1所述的通式I、如權(quán)利要求11所述的通式II或如權(quán)利要求17所述的通式III的孤立化合物的局部配方進行接觸。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述孤立化合物具有通式I或通式II。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述配方中所述化合物的濃度至少為0.1％(w/v)。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述急性或慢性疾病選自創(chuàng)傷、燒傷、擦傷、割傷、錯位、由感染因子導(dǎo)致的傷害、慢性靜脈曲張性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓迫潰瘍、褥瘡、粘膜潰瘍或疤痕瘤形成。
50.一種藥物組合物，包括如權(quán)利要求1所述的通式I、如權(quán)利要求11所述的通式II或如權(quán)利要求17所述的通式III的孤立化合物的局部配方。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述孤立化合物是具有通式I或通式II的。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述配方中的所述化合物濃度為至少0.1％(w/v)。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述局部配方包括一種或多種選自乳化劑、增稠劑或潤膚劑的成分。
54.一種具有如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的孤立化合物的用途，其用于治療可以通過增加細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性來進行治療的疾病的藥劑制備。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的用途，其中所述疾病是HIV感染或變性疾病。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的用途，其中所述疾病是HIV感染。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的用途，其中所述變性疾病選自神經(jīng)變性疾病、骨或關(guān)節(jié)變性疾病、黃斑病變、動脈粥樣硬化或貧血。
58.一種具有如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的孤立化合物的用途，其用于表皮的急性或慢性疾病的治療的藥劑制備。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的用途，其中所述急性或慢性疾病選自創(chuàng)傷、燒傷、擦傷、割傷、錯位、由感染因子導(dǎo)致的傷害、慢性靜脈曲張性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓迫潰瘍、褥瘡、粘膜瘡或潰瘍或疤痕瘤形成。
60.根據(jù)權(quán)利要求54或59的用途，其中所述孤立化合物是具有通式I或通式II的。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的用途，其中所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷或20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(此處指定作為5)。
62.一種體外地或間接體內(nèi)地增強細(xì)胞復(fù)制能力的方法，包括使所述細(xì)胞與以有效提高所述細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性的量的如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的化合物接觸。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述化合物是具有通式I或通式II的。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷或20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(此處指定作為5)。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的細(xì)胞是得自患者的外植細(xì)胞。
66.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的細(xì)胞是干細(xì)胞。
67.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述細(xì)胞是HIV-限制的CD 8+細(xì)胞。
68.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、造骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。
69.一種選擇對增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性有效的化合物的方法，包括為增加角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中端粒酶活性的能力，根據(jù)TRAP法測定如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的化合物的衍生物，并且根據(jù)所述TRAP法測定，選擇相比于只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞，如果溶劑中濃度為1μg/ml的該衍生物對角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的端粒酶活性高于其至少50％的衍生物。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中根據(jù)所述TRAP法測定，選擇相比于只用所述溶劑處理的所述細(xì)胞，如果溶劑中濃度為1μg/ml的該衍生物對角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的端粒酶活性高于其至少100％的衍生物。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，進一步包括將所選衍生物與局部的、營養(yǎng)補充的或藥物的載體進行配制的步驟。
72.一種選擇治療表皮的急性或慢性疾病的試劑的方法，包括為了傷口愈合活性，根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的劃痕試驗方法測定如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的化合物的衍生物，并且相比較于所述對照溶液處理的細(xì)胞，選擇如果溶劑中的濃度為1μg/ml的該衍生物具有的傷口愈合活性至少高于對照50％的衍生物。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中根據(jù)劃痕試驗方法，相比較于所述對照溶液處理的細(xì)胞，選擇如果溶劑中的濃度為1μg/ml的該衍生物具有的傷口愈合活性至少高于對照100％的衍生物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，包括將所選衍生物與局部載體進行配制的步驟。
75.一種營養(yǎng)補充的組合物，包括如權(quán)利要求1的通式I、如權(quán)利要求11的通式II或如權(quán)利要求17的通式III的孤立化合物的營養(yǎng)補充配方。
76.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，所述孤立化合物是具有通式I或通式II的。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的組合物，所述化合物選自黃芪甲苷IV、環(huán)黃芪醇、黃芪醇、黃芪甲苷IV 16-one、環(huán)黃芪醇6-β-D-吡喃葡糖甙、環(huán)黃芪醇3-β-D-吡喃木糖苷或20R，24S-環(huán)氧-3β，16β，25-三羥基-9β-甲基-19-norlanost-1，5-二烯烴(此處指定作為5)。
78.根據(jù)權(quán)利要求75所述的組合物，其中除所述化合物以外，所述營養(yǎng)補充配方還包括營養(yǎng)補充的草本提煉精華。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的組合物，其中所述提煉精華是蒙古黃芪的提煉精華。
80.根據(jù)權(quán)利要求75所述的組合物，其中所述配方中的所述孤立化合物的濃度為至少0.1％(w/v)。
81.一種具有通式II的化合物 其中每個X4和X5單獨地選自羥基、低烷氧基、低酰氧基、酮基或苷；OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；其中所述苷上的任何羥基基團可以由其它的苷、低烷基或低?；〈?。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的組合物，其中所述化合物包括0、1或2個苷。
83.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中每個所述苷，如果存在，是D構(gòu)型。
84.根據(jù)權(quán)利要求81所述的組合物，其中每個X4和OR3選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或苷；而X5選自羥基、低烷氧基、低酰氧基或酮基(＝O)。
85.根據(jù)權(quán)利要求81所述的組合物，其中X4是OH或苷，而每個X5和OR3為OH。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的組合物，其中X4是OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及增加細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法和組合物。這樣的組合物含有藥物的(包括局部的)和營養(yǎng)補充的配方。所述方法和組合物通過增加患者細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)端粒酶活性的療法來用于治療疾病，例如，HIV感染、各種變性疾病、以及急性或慢性皮膚營養(yǎng)品(aliments)。它們還可以用于增加培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)制能力，正如間接體內(nèi)細(xì)胞療法和干細(xì)胞的增殖。
文檔編號C07J1/00GK1809364SQ200480017246
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者C·B·哈利, A·C·金, T·赤萬, N·Y-y·葉, Y-h·王, D·M·米勒-馬蒂尼 申請人:杰龍公司