專利名稱：：Cdca1肽和包含cdca1肽的藥劑的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及有效作為針對高表達細胞分裂周期相關l(celldivisioncycleassociated1)(⑶CAl)的癌癥(如肺癌和膽管細胞癌)的疫苗的新肽，和包括這些肽的用于治療和預防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
：近年來，肺癌患者的人數(shù)在全世界持續(xù)增加，而且目前全世界每年大約有一百萬人死于肺癌。而且在日本，肺癌死亡越來越多，估計于2015年將達到123，000人。肺癌在男性中更普遍男性_女性比例為三比一。在1993年，肺癌超越胃癌成為男性中癌癥死亡的首要原因。此外，隨著女性吸煙者數(shù)目逐漸增加，預期女性患者的人數(shù)會有所增加。自2000年來，肺癌已經(jīng)成為癌癥死亡的首要原因，而且隨著社會老齡化，預期患者數(shù)在未來會進一步增加。吸煙被認為是肺癌發(fā)生的最大原因，其他原因有吸入石棉、空氣污染等。早期檢測和立即治療對于肺癌治療來說是很重要的。然而，近來有人指出，體檢中實施的簡單胸部X-光和痰液測試對肺癌的早期檢測無效，而且它們并不能導致癌癥死亡的減少。由于預期肺癌死亡的數(shù)目在未來持續(xù)增加，開發(fā)新的治療策略是一項緊迫的任務。在日本，膽管癌死亡的數(shù)目正在增加，在2005年，有16，586人死于膽管癌。在大多數(shù)膽管癌病例中，在早期未發(fā)現(xiàn)主觀癥狀。與消化道腔體中形成的癌癥(如胃癌和結(jié)腸癌)相比，膽管癌在早期難以發(fā)現(xiàn)和診斷。因此，在許多病例中，當發(fā)現(xiàn)膽管癌時，癌癥已經(jīng)發(fā)展并且不能切除。除手術(shù)治療之外，放療和化療也被用于膽管癌，但它們療效不佳，需要建立新的治療方法。在另一個方面，分子生物學和腫瘤免疫學的近期發(fā)展闡明，細胞毒性(殺傷)T細胞和輔助T細胞可識別癌細胞中特異性高表達的蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的肽，且這些細胞經(jīng)由HLA分子被呈遞到癌細胞或抗原呈遞細胞的表面并引起免疫反應以破壞癌細胞。此外，已經(jīng)鑒定了源自這些細胞的刺激所述免疫反應以攻擊癌癥的許多腫瘤抗原蛋白質(zhì)和肽，而且抗原特異性腫瘤免疫治療正在得到臨床應用。HLAI類分子在身體的所有有核細胞的表面上表達。它結(jié)合于細胞質(zhì)或細胞核中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)降解所產(chǎn)生的肽，并表達在細胞表面。在正常細胞的表面，源自正常自體蛋白質(zhì)的肽結(jié)合于HLAI類分子，并且不被免疫系統(tǒng)的T細胞識別和破壞。在另一個方面，在形成癌癥的過程中，癌細胞有時大量表達在正常細胞中幾乎不表達或略微表達的蛋白質(zhì)。此時HLAI類分子結(jié)合于癌細胞內(nèi)特異性高表達的蛋白質(zhì)胞內(nèi)降解而產(chǎn)生的肽，然后在癌細胞的表面上表達肽，于是殺傷T細胞識別并僅破壞癌細胞。通過將所述癌癥-特異性抗原或肽施用于個體，可破壞癌細胞且可抑制癌生長而不傷害正常細胞。這稱為使用癌癥-特異性抗原的癌癥免疫療法。HLAII類分子主要在抗原呈遞細胞的表面上表達。所述分子結(jié)合于源自癌癥_特異性抗原的肽，其通過胞內(nèi)降解由細胞外并入抗原_呈遞細胞的癌癥_特異性的抗原而產(chǎn)生，然后在細胞的表面上表達肽。識別它們的輔助T細胞被活化，并通過產(chǎn)生活化其他免疫活性細胞的多個細胞因子來誘導或增強針對腫瘤的免疫反應。因此，如果開發(fā)靶向在癌癥中特異性高表達的抗原的免疫療法，這樣的療法可有效地僅僅消滅癌癥，而不引起對正常自體組織的任何有害事件。還期望的是療法可用于其他治療均無能為力的任何末期癌癥患者。此外，通過將癌癥特異性抗原和肽作為疫苗預先施用于具有發(fā)生癌癥的高風險的個體，可預防癌癥的發(fā)生。雖然存在對肺癌的多種治療方法，但與其他癌癥相比肺癌的預后不良，而且它是一種難治性的癌癥。其原因是，例如，進展快速，在很多病例中，在發(fā)現(xiàn)時癌癥已經(jīng)是晚期。此外，由于外科手術(shù)是高度侵襲性的，適于手術(shù)的患者是有限的，并且通過放療或化療難以完全治愈。如果能開發(fā)出靶向在肺癌中特異性高表達的抗原的免疫療法，則通過這樣的治療方法可以僅消除癌癥而不對正常自體組成造成任何損傷。此外，預期這樣的治療方法可適用于任何晚期癌癥患者，和由于極度肺功能惡化而無法實施其他治療的患者。此外，由于在吸煙者中肺癌發(fā)生的風險高，免疫療法可適用于在肺癌的高危人群中預防肺癌。本發(fā)明人先前通過使用cDNA微陣列的全基因組基因表達分析，在非小細胞肺癌的37個臨床病例中，在胚胎組織中，和在不同的正常成人組織中檢查了27，648個人類基因的表達譜(expressionprofile)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)⑶CAl(細胞分裂周期相關1，也稱為Nuf2的人同源物(hNuf2))(GenBank登錄號NM_145697)在許多肺癌病例中高度表達，而在胚胎的肝臟或者除了在從免疫系統(tǒng)分離的睪丸中之外的正常成人組織中幾乎不表達。此夕卜，CDCAl在膽管細胞癌、膀胱癌和腎細胞癌的所有病例中高度表達。還在前列腺癌、慢性fi細！fit生白血病(chronicmyelogenousleukemia)、惡f生林巴瘤(malignantlymphoma)>子宮頸癌(cervicalcancer)、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌的40%或更多病例的癌組織中觀察到高CDCAl表達。此事實說明CDCAl在很多癌癥中可作為癌癥-特異性抗原。HLA-A2無論在哪個種族的人群中都經(jīng)常出現(xiàn)，而且大約30%的日本人具有它。因此，如果能夠鑒定由HLA-A2呈遞于細胞毒性(殺傷)T細胞的癌癥抗原肽，那么可將它不僅廣泛應用于日本人，而且應用于白種人(Caucasian)等。因此，鑒定通過HLA-A2呈遞于殺傷T細胞的癌癥抗原肽是一項重要的任務。如果這樣的癌癥抗原肽可應用于在全世界具有高發(fā)病率和死亡率的肺癌的免疫治療，這將是非常有益的。與本發(fā)明有關的現(xiàn)有技術(shù)文件顯示如下。[非專利文件IjDeLucaJ.G.，Moree,B.，Hickey,J.M.，Kilmartin,J.V.，禾口Salmon,Ε.D.，hNuf2inhibitionblocksstablekinetochore-microtubuleattachment和inducesmitoticcelldeathinHeLacellJ.CellBiol.159:549_555，2002.[非專利文件2]DeLuca,J.G.，Dong,Y.，Hergert,P,Strauss,J.，Hickey,J.M.，Salmon,E.D.,McEwen,B.F.,HeclandNuf2AreCoreComponentsoftheKinetochoreOuterPlateEssentialforOrganizingMicrotubuleAttachmentSites.，Mol.Biol.Cell16:519-531,2005.[#專禾Ij文#3]Hayama,S.，Daigo,Y.，Kato,Τ.，Ishikawa,N.，Yamabuki,Τ.,Miyamoto,Μ.,Ito,Τ.,Tsuchiya,Ε.,Kondo,S.,禾口Nakamura,Y.,ActivationofCDCAl-KNTC2,MembersofCentromereProteinComplex,InvolvedinPulmonaryCarcinogenesis.,CancerRes.66:10339_10348,2006.[非專利文件4]Liu,S.T.，Rattner，J.B.，Jablonski，S.Α·，和Yen,Τ·J.,Mappingtheassemblypathwaysthatspecifyformationofthetrilaminarkinetochoreplatesinhumancell.,J.CellBiol.175:41_53,2006.[非專利文件5]DeLuca,J.G.，Howell,B.J.，Canman,J.C.，Hickey，J.M.，F(xiàn)ang,G.,禾口Salmon,E.D.,等Nuf2禾口HeclAreRequiredforRetentionoftheCheckpointproteinMadl禾口Mad2toKinetochores.,CurrentBiology13:2103-2109,2003.[非專利文件6]Liu,D.，Ding,D.，Du，J.，Cai，Xin.，Huang,Y.，Ward,T.，Shaw,A.，Yang,Y.,Hu,R.,Jin,C.,禾口Yao,X.,HumanNUF2InteractswithCentromere-associatedProteinEandIsEssentialforaStableSpindleMicrotubule-KinetochoreAttachment.J.Biol.Chem.282:21415_21424，2007.
發(fā)明內(nèi)容[本發(fā)明要解決的問題]本發(fā)明要實現(xiàn)的目標是開發(fā)一種手段，用來實施通過增強癌癥患者的抗癌免疫力來抑制癌癥生長的免疫治療，作為一種新型治療方法來治療難以通過外科手術(shù)治療、化療和放療等作為肺癌、膽管癌等的治療方法治療的轉(zhuǎn)移性或難治性癌癥。本發(fā)明人鑒定了如下的肽，其源自在癌癥中特異性高表達的蛋白質(zhì)，且通過HLA-A2呈遞于殺傷T細胞，從而能夠使免疫治療可施用于大約30%的患有多種高表達CDCAl的癌癥的日本患者。[解決問題的手段]本發(fā)明人通過對肺癌組織的cDNA微陣列分析鑒定了在肺癌中高表達的⑶CAl基因(GenBank登錄號NM_145697)。在正常組織中，⑶CAl的表達僅僅在與免疫系統(tǒng)隔離的睪丸中觀察到。為了檢查抗腫瘤免疫力是否被CDCAl特異性殺傷T細胞誘導，使用了HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達大約30%的日本人所具有的HLA-A2。特別地，在此，本發(fā)明人檢查了當使用源自小鼠骨髓的、經(jīng)過具有HLA-A2結(jié)合基序的人CDCAl肽沖激的(pulsed)樹突細胞來免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠時，HLA-A2限制性肽特異性殺傷T細胞是否被誘導。殺傷T細胞識別通過HLA-A2呈遞的肽而活化，并產(chǎn)生Y-干擾素(IFN-γ)，通過使用ELISP0T測定法檢測這樣的Y_干擾素來檢查CDCAl肽特異性殺傷T細胞在免疫小鼠的脾細胞中是否被誘導出來。結(jié)果，鑒定了兩種類型的新CDCAl肽，它們能夠應用于靶向HLA-A2陽性癌癥患者的免疫治療。此外還證實，源自癌癥患者的和源自健康供體的、由這些肽活化的CTL，均顯示針對表達CDCAl的細胞的細胞溶解活性。就是說，預期所述肽可被HLA-A2限制性人殺傷T細胞所識別，并可適用于HLA-A2陽性癌癥患者的癌癥免疫治療。更具體地，本發(fā)明提供了如下[1]下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性。[2][1]的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[3][1]的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。[4]一種用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[5]一種用于治療和/或預防癌癥的藥劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[6]一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[7]一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種編碼[1]的肽的多核苷酸作為活性成分。[8]一種用于誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[9]針對[1]的肽的抗體。[10]使用[1]的肽誘導的輔助T細胞、細胞毒性(殺傷)T細胞或包含它們的免疫細胞群體。[11]一種抗原呈遞細胞，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復合物。[12][11]的抗原呈遞細胞，其是通過[6]或[7]的藥劑誘導的。[13]一種外來體，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復合物。[14][13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A2*0201)。[15]一種誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括使抗原呈遞細胞與[1]的肽接觸的步驟。[16]一種誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將編碼[1]的肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞的步驟。[17]一種誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的方法，其包括使T細胞與[1]的肽接觸的步驟。[18]一種誘導針對癌癥的免疫力的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步馬聚ο[19]一種治療和/或預防癌癥的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步驟。[20][1]的肽用于制備誘導針對癌癥的免疫力的試劑的用途。[21][1]的肽用于制備治療和/或預防癌癥的藥劑的用途。[22][1]的肽，用于誘導針對癌癥的免疫力。[23][1]的肽，用于治療和/或預防癌癥。附圖簡述圖IA顯示用于鑒定由HLA-A2限制性殺傷T細胞識別的⑶CAl肽的規(guī)程。從免疫的小鼠收集脾細胞的當天記為“第0天”。圖IB顯示ELISP0T測定結(jié)果。使用ELISP0T測定法檢查獲得自免疫小鼠的殺傷τ細胞是否特異性地響應于經(jīng)CDCAl肽沖激的細胞并產(chǎn)生IFN-γ。結(jié)果，被⑶CAl-I或⑶CA1-4肽誘導的殺傷T細胞特異性地識別經(jīng)⑶CAl肽沖激的T2A2細胞并產(chǎn)生IFN-γ。然而，對于被其他肽誘導的殺傷T細胞，沒有觀察到⑶CAl特異性的殺傷T細胞免疫反應。因此，確定了⑶CAl-I和⑶CA1-4肽是能夠誘導⑶CAl特異性HLA-A2限制性殺傷T細胞的表位肽。圖IB中顯示的CDCAl肽的編號對應于表1的“肽位置”下顯示的肽的編號，但與本申請所述的序列ID號不同。圖2顯示用于檢測特異性識別⑶CAl肽而活化的殺傷T細胞產(chǎn)生的IFN-γ的ELISP0T測定法的結(jié)果。圖2Α顯示用源自HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓、經(jīng)⑶CA165_73(No.1)(SEQIDN0:1)肽沖激的樹突細胞進行刺激，誘導殺傷T細胞的結(jié)果。當使用CDCAl肽沖激的T2A2細胞作為刺激細胞時，斑點計數(shù)和總斑點面積均顯著大于使用HLA-A2陽性非CDCAl沖激的T2A2細胞作為刺激細胞的情況。因而，確定了CDCAl-I肽是能夠誘導HLA-A2限制性殺傷T細胞的表位肽。圖2B顯示通過用源自HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓、經(jīng)⑶CA1351_359(No.4)(SEQIDNO:2)肽沖激的樹突細胞進行刺激，誘導殺傷T細胞的結(jié)果。當使用經(jīng)CDCAl肽沖激的T2A2細胞作為刺激細胞時，斑點計數(shù)和總斑點面積顯著大于當使用HLA-A2陽性非⑶CAl沖激的T2A2細胞作為刺激細胞的情況。因而，確定了⑶CA1351_359(No.4)肽是能夠誘導HLA-A2限制性殺傷T細胞的表位肽。圖3顯示從健康供體誘導的CTL的⑶CAl特異性免疫反應。圖3A顯示用于從PBMC誘導CDCAl特異性CTL的規(guī)程。自健康供體分離PBMC，使用微珠分離CD8+T細胞和CD14+細胞。然后，產(chǎn)生肽反應性⑶8+CTL，并通過在GM-CSF和IL-4存在的條件下培養(yǎng)五天從⑶14陽性細胞產(chǎn)生DC。將DC在32微球蛋白的存在下371培養(yǎng)四小時，用!11^42結(jié)合肽進行沖激。然后輻射照射經(jīng)肽沖激的DC并將其與自體⑶8陽性T細胞以120的比例混合。將細胞培養(yǎng)在含有補充有IL-7的2%自體血清的AIM-V中。三天后，將IL-2加入培養(yǎng)基。在第12和19天，用經(jīng)肽沖激的自體DC再刺激T細胞。DC在使用時制備。在第三次肽刺激五天和六天后進行IFN-yELISP0T測定和Cr釋放測定。圖3B和3C顯示將靶細胞與分別使用CDCA165_73(No.1)肽和CDCA1351_359(NO.4)肽自供體誘導的CTL共培養(yǎng)后，進行ELISP0T測定的結(jié)果。針對肽沖激的T2細胞的IFN-γ產(chǎn)生顯著高于針對非肽沖激的T2細胞。圖3D顯示由癌癥患者供體1和健康供體1的PBMC誘導的CTL針對經(jīng)⑶CAl肽沖激的T2細胞的細胞毒性。圖3E顯示由⑶CAl351,肽誘導的源自健康供體1的CTL的劑量-依賴性反應。CTL響應于用0.2μg/mL以上的肽E/T比例5沖激的T2細胞而產(chǎn)生大量的IFN-γ。圖4顯示由健康供體誘導的CTL針對CDCAl陽性癌細胞的特異性細胞毒活性。圖4Α顯示將CDCAl基因表達載體引入C0L0201細胞時在該細胞中的表達。使用慢病毒感染癌細胞系(C0L0201)三次，所述慢病毒中⑶CAl-HA表達在EF-Iα啟動子和CMV啟動子控制下被誘導；所述C0L0201表達HLA-A2而不表達⑶CAl。使用抗-HA抗體(中間)或抗-⑶CAl抗體(上部)對細胞裂解物進行Western印跡分析。圖4B、4C和4D顯示針對C0L0201/CDCA1的IFN-Y產(chǎn)生。經(jīng)轉(zhuǎn)化的C0L0201癌細胞系的IFN-γ產(chǎn)生顯著高于未轉(zhuǎn)化的C0L0201。此外，針對內(nèi)源表達CDCAl和HLA-A2兩者的PANCl的IFN-γ產(chǎn)生，顯著高于針對既不表達⑶CAl也不表達HLA-A2的Α549。圖4Ε和4F顯示將從供體誘導的CTL與靶細胞共培養(yǎng)時51Cr釋放測定的結(jié)果。觀察到了針對PANCl(⑶CA1+，HLA-A2+)的細胞毒性，而未觀察到針對Α549(CDCA1+，HLA-A2-)和C0L0201(CDCA1-，HLA-A2+)的細胞毒性。圖4G顯示CDCA1肽反應性CTL與⑶8陽性細胞中的HLA-A2-⑶CAl四聚體陽性CTL之間的關聯(lián)。左圖顯示使用肽沖激過的T2細胞作為靶細胞，E/T比例為5的ELISP0T測定。右圖顯示FACS分析的結(jié)果。左圖中分析的細胞是源自健康供體1的用肽沖激過的DC進行三次PBMC刺激的CTL。右圖中分析的細胞是由健康供體1的PBMC分離的初始(nai_ve)CD8陽性細胞。[實施本發(fā)明的方式]除非另外限定，本申請中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有的含義與本發(fā)明所屬領域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。本發(fā)明的肽是限制于HLA-A2的表位，HLA-A2為常見于日本人群和白種人群的HLA等位基因。特別地，使用與HLA-A2的結(jié)合親和力作為指標，選擇了源自CDCAl的候選HLA-A2結(jié)合肽。對于選擇的肽，評價了在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)殺傷T細胞是否被用所述肽沖激的源自HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細胞的樹突細胞(BM-DC)所誘導。在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，細胞毒性(殺傷)T細胞被CDCAl-I(YMMPVNSEV(SEQIDNO1))禾口⑶CA1-4(KLATAQFKI(SEQIDNO2))所誘導。由這些肽誘導的殺傷T細胞顯示對用這些肽沖激的T2A2細胞免疫應答反應。然而，這些殺傷T細胞對未經(jīng)肽沖激的T2A2細胞未顯示免疫應答反應。此外，源自癌癥患者和源自健康供體的、使用⑶CAl-I和⑶CA1-4誘導的CTL，顯示了針對表達⑶CAl的細胞系的細胞裂解活性。這些結(jié)果證明了源自⑶CAl的肽可用作誘導針對CDCAl呈遞細胞的免疫反應的肽，而且源自CDCAl的肽是HLA-A2限制性表位肽。已顯示CDCAl在肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌的大多數(shù)病例中在癌組織中高表達。由這些事實，認為⑶CAl可用作多種癌癥的免疫治療靶標。(1)本發(fā)明的肽和誘導針對癌癥的免疫力的包含所述肽的試劑本發(fā)明的肽是下述㈧至⑶中的任一個。(A)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽。(B)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加了一個、兩個或數(shù)個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞-誘導活性。(C)(B)的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。(D)(B)的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。在本申請中，“顯示誘導殺傷T細胞的活性的肽”是指“具有刺激殺傷T細胞(細胞毒性T細胞/CTL)的T細胞誘導活性的肽”。本發(fā)明的肽是具有少于約40個氨基酸，優(yōu)選少于約20個氨基酸，更優(yōu)選少于約15個氨基酸，且包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列，并顯示誘導殺傷T細胞的活性的表位肽。此外，本發(fā)明的肽(表位肽)可包括這樣的肽，其包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列，其中取代、缺失、插入和/或添加了一個、兩個或數(shù)個氨基酸，只要其保留誘導殺傷T細胞的能力即可。取代、缺失、插入和/或添加的殘基數(shù)目通常為五個氨基酸或更少，優(yōu)選四個氨基酸或更少，更優(yōu)選三個氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選一個氨基酸或兩個氨基酸。已知變體肽(即，包含通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基修飾原始氨基酸序列而獲得的氨基酸序列的肽)可保留原來的生物活性(MarkDF等，(1984)ProcNatlAcadSciUSA815662-6；ZollerMJ禾口SmithΜ,(1982)NucleicAcidsRes106487-500；Dalbadie-McFarlandG等(1982)ProcNatlAcadSciUSA796409-13)。氨基酸修飾優(yōu)選保留原始氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的實例包括疏水氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W,Y，V)；親水氨基酸(R，D，N,C，E，Q，G，H，K，S，T)；和共同具有如下官能團或性質(zhì)的側(cè)鏈脂族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳環(huán)側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。括號中的字母顯示氨基酸的單字母代碼。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽(免疫原性肽)是九肽(9-聚物)或十肽(10-聚物)。為了獲得具有高結(jié)合親和性和殺傷T細胞誘導活性的肽，可通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸來修飾天然存在的CDCAl的部分肽的氨基酸序列。在本申請中，術(shù)語“數(shù)個”指五個以下，優(yōu)選三個以下，更優(yōu)選兩個以下。此外，由于與HLA抗原具有高親和性的肽序列的規(guī)律性是已知的(KuboRT，等，(1994)J.Immunol.，152,3913-24；RammenseeHG，等，(1995)Immunogenetics.41178-228；KondoA，等(1995)J.Immunol.155:4307_12)，可基于所述規(guī)律性修飾本發(fā)明的肽(表位肽)，從而增強它們與HLA抗原的親和性。例如，可通過用賴氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起第二個氨基酸來獲得具有高HLA-A2結(jié)合親和性的肽。類似地，還可通過用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸來獲得具有高HLA-A2結(jié)合親和性的肽。當表位肽的序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白的氨基酸序列的某個部分相同時，可引起副作用如自身免疫病或針對特定物質(zhì)的變態(tài)反應癥狀。為了避免這樣的副作用，修飾的表位肽不應與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同。為此，需要使用可用的數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，以確認不存在與修飾的表位肽顯示100%同源性的具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)。通過此步驟，可以避免由上述用于增加與HLA抗原的結(jié)合親和性和/或用于增加殺傷T細胞誘導活性的氨基酸序列修飾引起的風險。雖然上述與HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽預期可以非常有效地作為癌癥疫苗，但需要檢查使用高結(jié)合親和性作為指標選擇的候選肽是否實際上具有殺傷T細胞誘導活性。殺傷T細胞誘導活性可通過如下確認誘導具有人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如，B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞)，更具體地，誘導源自人外周血單核白細胞的樹突細胞；用目標肽刺激它們；然后將它們與CD8陽性細胞混合；然后測量對于靶細胞的細胞毒活性。作為反應系統(tǒng)，可使用表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(如在，例如，BenMohamedL，等(2000)Hum.Immunol.61(8):764_79，RelatedArticles,Books,禾口Linkout中所描述的)。例如，為了測量細胞毒活性，用51Cr等放射標記靶細胞?？赏ㄟ^在具有固定化肽的抗原呈遞細胞存在的條件下測量由殺傷T細胞產(chǎn)生和釋放的IFN-γ；并使用抗-IFN-γ單克隆抗體在培養(yǎng)基中顯現(xiàn)IFN-Y產(chǎn)生區(qū)域，從而檢查對靶細胞的細胞毒活性。如實施例所示，檢查肽的殺傷T細胞誘導活性的結(jié)果顯示與HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽不一定具有高殺傷T細胞誘導活性。然而，含有CDCAl-I的氨基酸序列(YMMPVNSEV(SEQIDNO1))和CDCA1-4的氨基酸序列(KLATAQFKI(SEQIDNO2))的肽顯示特別高的殺傷T細胞誘導活性。如上所述，本發(fā)明提供顯示殺傷T細胞誘導活性的肽，更具體地，包括SEQIDNO1或2的氨基酸序列和其變體(即，取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列)的肽。優(yōu)選地，包括SEQIDNO:1或2的九個氨基酸或其變體的肽的氨基酸序列與其他內(nèi)源蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同。特別地，具有高HLA-A2結(jié)合親和性的肽可通過如下獲得用亮氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起的第二個氨基酸，和/或用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸。本發(fā)明的肽可包括修飾如糖基化、側(cè)鏈氧化和磷酸化，只要所述的肽不丟失它們的殺傷τ細胞誘導活性。其它修飾包括，例如，D-氨基酸和其它氨基酸類似物，其可用于增加肽的血清半衰期。用于獲得和產(chǎn)生本發(fā)明的肽的方法沒有特定的限制?；瘜W合成的肽或通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組肽是可以使用的。本發(fā)明的化學合成的肽可根據(jù)化學合成方法如Fmoc方法(芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbony1)方法)禾口t_Boc方法(叔丁氧幾基(t-butyloxycarbonyl)方法)來合成。本發(fā)明的肽還可以利用多種商業(yè)上可得到的肽合成儀來合成?？赏ㄟ^獲得具有編碼肽的核苷酸序列的DNA，或其變體或同源物，并將它們引入合適的表達系統(tǒng)，來產(chǎn)生本發(fā)明的肽作為重組蛋白質(zhì)。使用的表達載體可優(yōu)選為任何能夠在宿主細胞中自主復制、或可整合入宿主細胞的染色體、并含有位于合適位置的啟動子以允許表達編碼肽的基因的載體?？赏ㄟ^將上述表達載體引入宿主來產(chǎn)生具有編碼本發(fā)明的肽的基因的轉(zhuǎn)化體。宿主可為任何細菌、酵母、動物細胞和昆蟲細胞，且可根據(jù)宿主的不同使用已知技術(shù)將表達載體引入宿主。在本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)如上所述制備的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累肽，并由培養(yǎng)物收集本發(fā)明的肽，從而分離重組肽。當轉(zhuǎn)化體是原核細胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細胞如酵母時，用于這些微生物的培養(yǎng)基可為天然或合成培養(yǎng)基，只要它包含碳源、氮源、礦物質(zhì)等，使得被微生物利用，并允許有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)條件可為常規(guī)用于培養(yǎng)微生物的條件。培養(yǎng)后，可使用用于肽分離和純化的常規(guī)方法來從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中分離和純化本發(fā)明的肽。本領域的技術(shù)人員基于關于編碼SEQIDNO1或2的氨基酸序列的DNA核苷酸序列的信息可適當?shù)禺a(chǎn)生或獲得包含在SEQIDNO:1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列的肽。具體地說，編碼包含在SEQIDN0:1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列并顯示殺傷T細胞誘導活性的肽的基因可通過本領域的技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，如化學合成、遺傳工程技術(shù)和誘變。例如，作為一種遺傳工程技術(shù)的定點誘變方法是有用的，因為它可將特定的突變引入特定的位置。其可根據(jù)MolecularCloning:AlaboratoryManual,H2片反，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.,1989(T^I^^^JMolecularCloning,第2版)禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38，JohnWiley&Sons(1987-1997)(下文中稱為CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的方法來進行。本發(fā)明的上述肽可誘導針對癌癥的免疫力，如下面在實施例中所示。因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的肽的用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑。本發(fā)明誘導免疫力的試劑可制備成與兩種以上表位肽組合的混合制劑。通過組合多種類型的肽配制的誘導免疫力的試劑可以是雞尾酒(cocktail)，或者也可以是通過標準技術(shù)相互結(jié)合的。要組合的表位肽可以是這樣的肽，它們具有源自相同基因的不同氨基酸序列，或者具有源自不同基因的氨基酸序列。當施用本發(fā)明的肽時，施用的肽被以高密度呈遞給抗原呈遞細胞的HLA抗原，隨后，誘導出能夠與由施用的肽和HLA抗原形成的復合物特異性反應的殺傷T細胞?；蛘?，通過將由受試者收集的樹突細胞與本發(fā)明的肽接觸(即，用本發(fā)明的肽沖激由受試者收集的樹突細胞)，可獲得將本發(fā)明的肽呈遞于其細胞表面的抗原呈遞細胞。通過將這些抗原呈遞細胞再施用回受試者，可在受試者體內(nèi)誘導殺傷T細胞，結(jié)果，可增強呈遞本發(fā)明的肽的靶細胞的免疫反應。當體外或體內(nèi)(優(yōu)選體外)使用時，本發(fā)明用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑可誘導輔助T細胞、殺傷T細胞或包括這些細胞的免疫細胞群體，從而提供針對癌癥的免疫力。(2)本發(fā)明用于治療和/或預防癌癥的試劑(癌癥疫苗)實施例中顯示，本發(fā)明的肽可在體內(nèi)誘導癌細胞特異性的殺傷T細胞。在另一方面，先前的發(fā)明顯示，CDCAl在肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌等的大多數(shù)病例中高表達。因此，包括一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分的誘導免疫力的試劑預期有效地作為用于治療和/或預防癌的試劑。就是說，預期可通過將本發(fā)明的肽連同合適的佐劑注入體內(nèi)，或通過用肽沖激抗原呈遞細胞如樹突細胞，然后將它們注入體內(nèi)，來誘導和活化能攻擊腫瘤的殺傷T細胞。從而可預期抗癌效果。此外，可將編碼本發(fā)明的肽的基因整合到合適的載體中。用重組DNA轉(zhuǎn)化的細菌如BCG結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和人抗原呈遞細胞(樹突細胞等)，或具有在其基因組整合了編碼本發(fā)明的肽的DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作用于治療和/或預防人癌癥的活疫苗。用于癌癥疫苗的劑量和施用方法與用于常規(guī)天花疫苗和BCG疫苗的那些相同。在本發(fā)明中，術(shù)語“疫苗”(又稱“免疫原性組合物”)指當施用于動物時誘導抗腫瘤免疫力或抑制多種癌癥的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，顯示包括SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽，其可誘導針對CDCAl呈遞細胞的強而特異性的免疫反應。因此，本發(fā)明也包括用于通過使用包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列或其包括取代、缺失或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸的變體的肽來誘導抗腫瘤免疫力的方法。通常，抗腫瘤免疫力包括如下免疫應答(1)誘導針對含有⑶CAl表達細胞的腫瘤的殺傷T細胞，(2)誘導識別含有⑶CAl表達細胞的腫瘤的抗體，和(3)誘導抗腫瘤細胞因子產(chǎn)生。當特定的肽通過接種于動物來誘導這些免疫反應中的任一種時，確定該肽具有抗腫瘤免疫力-誘導作用。通過肽誘導抗腫瘤免疫力可通過觀察宿主中的免疫系統(tǒng)對于肽的體內(nèi)或體外應答來進行檢測。例如，用于檢測誘導殺傷T細胞的方法是熟知的。侵入活體的外源物質(zhì)通過抗原呈遞細胞(APC)的作用呈遞于T細胞和B細胞。T細胞響應于通過抗原呈遞細胞以抗原特異性方式呈遞的抗原，通過抗原的刺激分化成殺傷T細胞(又稱細胞毒性T淋巴細胞或CTL)，然后增殖。在本申請中，此過程被稱為T細胞的“活化”。特定的肽對殺傷T細胞的誘導作用，可通過使用經(jīng)過該肽沖激的抗原呈遞細胞將該肽呈遞于T細胞，然后檢測殺傷T細胞的誘導來進行評價。此外，抗原呈遞細胞具有活化CD4+T細胞、CDS+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞(eosinophil)和NK細胞的作用。由于⑶4+T細胞在抗腫瘤免疫力方面也是重要的，因此肽的誘導抗腫瘤免疫力的作用可使用對于活化這些細胞的影響作為指標來進行評價。使用樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞誘導的殺傷T細胞的誘導效果的評價方法是本領域公知的。在抗原呈遞細胞中，DC具有最強的殺傷T細胞-誘導效果。在此方法中，首先，使測試肽與DC接觸，然后使DC與T細胞接觸。從與DC接觸后的T細胞中檢測出對靶細胞具有細胞毒作用的T細胞。如果T細胞顯示針對靶細胞的細胞毒活性，這意味著測試肽具有誘導細胞毒T細胞的活性。例如，可使用51Cr-標記的腫瘤細胞的裂解作為指標，檢測殺傷T細胞針對靶細胞如腫瘤的活性?；蛘?，腫瘤細胞損害的程度可使用3H-胸腺嘧啶攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評價。通過這些方法證實具有殺傷T細胞誘導活性的測試肽是具有DC-活化作用和隨后的殺傷T細胞誘導活性的肽。因此，誘導針對腫瘤細胞的殺傷T細胞的肽可用作針對呈現(xiàn)CDCAl的癌癥的疫苗。此外，已通過與肽接觸而獲得了誘導針對癌癥的殺傷T細胞的能力的抗原呈遞細胞可用作針對癌癥的疫苗。此外，作為通過抗原呈遞細胞呈遞肽的結(jié)果而獲得了細胞毒性的殺傷T細胞還可用作針對癌癥呈遞CDCAl的疫苗。利用依靠抗原呈遞細胞和殺傷T細胞的抗腫瘤免疫來治療癌癥的方法稱為細胞免疫療法(cytoimmunotherapy)。通常，當使用肽進行細胞免疫療法時，可通過組合具有不同結(jié)構(gòu)的多個肽來增強誘導殺傷τ細胞的效率。因此，當用蛋白質(zhì)片段刺激DC時，有利的是使用多個類型的肽片段的混合物。通過肽誘導抗腫瘤免疫力還可通過觀察針對腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導來評價。例如，當通過用肽免疫實驗室動物來誘導針對肽的抗體，而且它們抑制腫瘤細胞的生長、增殖和/或轉(zhuǎn)移時，確定的是肽誘導抗腫瘤免疫力?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的疫苗來誘導抗腫瘤免疫力，而為治療和/或預防癌癥提供可能。治療癌癥和/或預防癌癥發(fā)生的效果可包括抑制癌細胞生長、癌細胞的退行(regression)和癌細胞產(chǎn)生的抑制?；及┌Y的個體的死亡率降低、血中的腫瘤標志物減少、和與癌癥有關的可檢測癥狀的減少也包括在治療和/或預防癌癥的效果中。優(yōu)選地，疫苗針對癌癥的治療和/或預防效果與無疫苗施用的對照的情況相比是統(tǒng)計學上顯著的。例如，優(yōu)選效果是以5%以下的顯著性水平觀察到的。統(tǒng)計學方法如Studentt_檢驗、Mann-WhitneyU檢驗、ANOVA等可用于確定統(tǒng)計顯著性。在本發(fā)明中，受試者優(yōu)選是哺乳動物。哺乳動物的實例包括人、非人靈長類(non-humanprimate)、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛(cattle)，但不限于此。本發(fā)明的肽可體內(nèi)或回體(exvivo)施用于受試者。此外，為了產(chǎn)生用于治療和/或預防癌癥的免疫原性組合物，可使用本發(fā)明的免疫原性肽，也就是，選自SEQIDNOs1和2的氨基酸序列的九肽和其突變肽。更具體地，本發(fā)明提供用于治療腫瘤和/或預防腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等的藥劑，其包括一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分。本發(fā)明的肽特別有用于治療腫瘤如肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌。本發(fā)明的肽可作為通過常規(guī)配制方法配制的藥劑直接施用于受試者。這樣的制劑除了本發(fā)明的肽之外，可根據(jù)需要包含可藥用的載體、賦形劑等。本發(fā)明的藥劑可用于治療和/或預防多種腫瘤。此外，為了有效地建立細胞免疫力，包含一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分的用于治療和/或預防腫瘤的藥劑中可混入佐劑。所述藥劑可與其他活性成分(如抗腫瘤劑)一起共施用。適當?shù)闹苿┻€包括顆粒。適當?shù)淖魟┟枋鲇谖墨I(JohnsonAG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.,7277-89)中。佐劑的實例包括弗氏不完全佐劑、BCG、海藻糖二霉酚酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)、脂多糖(LPS)、硫酸鋁鉀佐劑、硅石佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬(alum)，但不限于此。此外，可方便地使用脂質(zhì)體配制物、其中藥物結(jié)合于具有數(shù)微米直徑的珠子的顆粒制劑和其中脂質(zhì)結(jié)合于上述肽的制劑。施用方法可為口服施用、皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射等，并可包括全身施用(systemicadministration)和靶腫瘤附近的局部施用。本發(fā)明的肽的劑量可根據(jù)要治療的疾病、患者的年齡和體重、施用方法等而適當?shù)卣{(diào)節(jié)。劑量通常為0.OOlmg至lOOOmg，優(yōu)選0.Olmg至lOOmg，更優(yōu)選0.Img至10mg。優(yōu)選地，幾天一次到幾個月一次進行施用，但本領域的技術(shù)人員可容易地選擇適當?shù)膭┝亢褪┯梅椒ǎ欢疫@些參數(shù)的選擇和優(yōu)化完全在常規(guī)技術(shù)的范圍內(nèi)。制劑的形式?jīng)]有特定的限制，可以是為通過加入賦形劑(如糖)而?；幕蚶鋬龈稍锏摹？杉尤氡景l(fā)明的藥劑用于增加殺傷T細胞誘導活性的助劑(auxiliaryagent)包括BCG細菌等的菌體組分，包括胞壁酰二肽(MDP)；Nature,vol.344,p873(1990)中描述的ISCOMJ.Immunol,vol.148，pl438(1992)中描述的皂苷系列(saponinseries)的QS-21；脂質(zhì)體和氫氧化鋁等。此外，還可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香菇多糖(Ientinan)、西佐喃(sizofiran)和溶鏈菌(picibanil)作為助劑。還可以使用增強T細胞的生長和分化的細胞因子等，如IL-2、IL-4、IL-12、IL-I、IL-6和TNF，以及活化NK-T細胞的α“半乳糖基神經(jīng)酰胺，以及通過結(jié)合于Toll-樣受體來活化天然免疫系統(tǒng)的脂多糖(LPS)和CpG，等等，作為助劑。本發(fā)明的疫苗組合物包含引發(fā)殺傷T細胞的組分。脂質(zhì)已被鑒定為用于針對病毒抗原進行體內(nèi)初次刺激(priming)的物質(zhì)。例如，可將棕櫚酸殘基結(jié)合于賴氨酸殘基的ε-氨基和α-氨基，然后與本發(fā)明的免疫原性肽連接。脂質(zhì)化的肽可通過摻入膠束或顆粒，或封裝入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化來直接施用。脂質(zhì)初次刺激的另一個實例是用大腸桿菌脂蛋白如三棕櫚酰-S-甘油基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycery1-cysteinyl-seryl-serine)(P3CSS)當將其共價結(jié)合于合適的肽時進行引發(fā)(DeresK.，等，(1989)Nature342:561_4)。本發(fā)明的免疫原性肽可通過病毒載體或細菌載體表達。適當表達載體的實例包括無毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如，可以使用痘苗病毒作為載體來表達編碼所述肽的核苷酸序列。將重組牛痘病毒引入宿主細胞，表達出免疫原性肽，弓丨發(fā)免疫應答。也可以使用例如在美國專利No.4，722，848中描述過的使用牛痘載體的免疫方法。也可以使用卡介苗(BacilleCalmette-Guerin)(BCG)。StoverCK等，(1991)Nature31456-60中描述了BCG載體。其他多種可用于治療性施用或免疫的載體在本領域內(nèi)是已知的，這些載體包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒樣桿菌(傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi))載體和脫毒的炭疽毒素載體。參見，例如，ShataMT等，(2000)Mol.Med.Today6:66_71；ShedlockDJ和WeinerDB等，(2000)J.Leukoc.Biol.68793-806；和HippJD等，(2000)InVivo14:571-85?？赏ㄟ^如下方式在患者體內(nèi)有效地誘導殺傷性T細胞在體外將抗原肽添加至從患者收集的細胞或來自另一個與之共有部分HLA等位基因的個體的細胞(同種異體細胞(allogeneiccell))，并呈遞抗原，然后將這些細胞血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處等?；蛘?，通過將肽添加至患者的外周血淋巴細胞并在體外培養(yǎng)它們而在體外誘導殺傷T細胞，而后可將這些細胞可以血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處等。這樣的細胞轉(zhuǎn)移治療已經(jīng)被實施作為癌癥治療，并且是本領域技術(shù)人員中熟知的一種方法。本發(fā)明的癌癥類型無特別限制，具體的例子包括肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌等。適合應用本發(fā)明的癌癥的實例包括肺癌。(3)本發(fā)明的抗體本發(fā)明還涉及能夠識別作為表位(抗原)的本發(fā)明上述的肽的一部分或完整的肽的抗體，并涉及通過使用該蛋白或該肽體外刺激而誘導的殺傷T細胞。通常，殺傷T細胞顯示出比抗體更強的抗腫瘤活性。此外，與本發(fā)明的肽相似，本發(fā)明抗體可用作針對表達CDCAl的癌癥的預防劑和/或治療劑，只要這些抗體能抑制CDCAl癌癥抗原的活性即可。在實際應用中，本發(fā)明的肽或抗體可以按原樣施用，或通過與可藥用載體和/或稀釋劑，視需要加上佐劑，一起注射施用?；蛘撸鼈兛梢酝ㄟ^噴霧方法等經(jīng)粘膜通過透皮吸收施用。更具體地，在本申請中，人血清白蛋白是載體的實例；而PBS、無菌水等是稀釋劑的實例。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并可以用本領域技術(shù)人員已知的方法來生產(chǎn)。例如，多克隆抗體可通過如下獲得用本發(fā)明的肽作為抗原免疫哺乳動物或鳥類物種，并從哺乳動物或鳥類物種收集血液，從收集的血液中分離和純化抗體。例如，可免疫哺乳動物，如小鼠、倉鼠、豚鼠、家禽(chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊和牛、或鳥類物種。免疫的方法是本領域技術(shù)人員已知的，抗原可例如在例如7到30天的間隔施用2到3次。劑量可以是，例如，每次施用約0.05毫克到2毫克的抗原。對施用途徑?jīng)]有特定限制，且可以合適地選自皮下施用、皮內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用等。此外，抗原可以在溶解于適當?shù)木彌_液，例如，含常規(guī)的佐劑如弗氏完全佐劑或氫氧化鋁的緩沖液后施用。將經(jīng)免疫的哺乳動物或鳥類物種飼養(yǎng)一段時間后，當抗體效價增加時，可將另外用例如100微克到1000微克的抗原對它們進行免疫。最后施用后一到兩個月，可從經(jīng)免疫的哺乳動物或鳥類物種收集血液，血液可以通過常規(guī)方法來分離，來獲得識別本發(fā)明肽的多克隆抗體作為多克隆抗血清，所述的常規(guī)方法如離心、用硫酸銨或聚乙二醇沉淀、層析如凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。在另一方面，單克隆抗體可以通過制備雜交瘤獲得。例如，雜交瘤細胞可以通過將產(chǎn)生抗體的細胞與骨髓瘤細胞系的細胞融合而獲得。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以通過細胞融合獲得，如下文所示的方法。使用來自于經(jīng)免疫動物的脾細胞、淋巴結(jié)細胞、B淋巴細胞等作為產(chǎn)生抗體的細胞。將本發(fā)明的肽用作抗原?？捎眯∈蠛痛笫蟮葎游镒鳛槊庖邉游?，將抗原施用于這些動物可通過常規(guī)方法來進行。例如，通過將作為抗原的本發(fā)明的肽的懸浮液或乳劑與佐劑如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑以靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)等施用于動物幾次來免疫動物。從經(jīng)免疫動物中獲得產(chǎn)生抗體的細胞，如脾細胞，并可以通過已知方法(G.Kohler等，Nature,256，495(1975))將它們與骨髓瘤細胞融合來產(chǎn)生雜交瘤。對于小鼠，用于細胞融合的雜交瘤細胞系的實例包括，例如，P3X63Ag8、P3U1、Sp2/0等。將融合促進劑如聚乙二醇和仙臺病毒用于細胞融合，而且在細胞融合后將次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基用于通過常規(guī)方法選擇雜交瘤。通過細胞融合獲得的雜交瘤可以通過有限稀釋法等進行克隆。根據(jù)需要，產(chǎn)生特異識別本發(fā)明肽的單克隆抗體的細胞系可以通過使用本發(fā)明的肽在以酶免疫測定方法的篩選中獲得。除上述方法之外，可以通過使用本發(fā)明的肽、表達所述肽的細胞、或其裂解物體外刺激人淋巴細胞(如感染了EB病毒的淋巴細胞)來調(diào)節(jié)免疫細胞?？膳c本發(fā)明的肽結(jié)合的人抗體可以通過將經(jīng)免疫的淋巴細胞與人來源的骨髓瘤細胞如U266(特開昭63-17688(未審查、已公開的日本專利申請))進行融合來獲得。為了從這樣獲得的雜交瘤產(chǎn)生需要的單克隆抗體，可以用常規(guī)培養(yǎng)方法或腹水形成方法培養(yǎng)雜交瘤，并可以從培養(yǎng)物上清液或腹水中純化單克隆抗體。從培養(yǎng)物上清液或腹水中純化單克隆抗體可以通過常規(guī)方法進行。例如，可將硫酸銨分級、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等合適地組合和使用?？梢允褂帽景l(fā)明肽，表達所述肽的細胞、或其裂解物來免疫具有一組人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物。可以從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動物中收集產(chǎn)生抗體的細胞，并將它們與上述骨髓瘤細胞系融合以獲得雜交瘤。然后可以從雜交瘤中產(chǎn)生需要的單克隆抗體(W092/03918;W094/02602；W094/25585；W094/33735；W096/34096)。此外，也可以使用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細胞(如經(jīng)免疫的淋巴細胞)永生化，并用來制備單克隆抗體。這樣獲得的單克隆抗體也可以使用基因操作技術(shù)(Borrbaeck和Larrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies)進行調(diào)節(jié)。例如，可通過從產(chǎn)生抗體的細胞(如雜交瘤和經(jīng)免疫的淋巴細胞)克隆編碼抗體的DNA，將其插入合適的載體，和將后者引入宿主細胞來制備重組抗體。本發(fā)明的抗體還可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它們可與本發(fā)明的肽結(jié)合即可。抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv、或單鏈Fv(scFv)，其中scFv中源自H和L鏈的Fv片段以合適的接頭連接在一起(Huston等，(1998)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具體地，可通過用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co等，(1994)JImmunol152:2968-76;Better禾口Horwitz，(1989)MethodsEnzymol178476-96；Pluckthun禾口Skerra，(1989)MethodsEmzymol178497-515；Lamoyi(1986)MethodsEnzymol121652-63；Rousseaux等，(1986)MethodsEnzymol121:663_9;Bird和Walker,(1991)TrendsBiotech9132-7)處理抗體來制備抗體片段。本發(fā)明的抗體包括通過將抗體與多種分子如聚乙二醇(PEG)結(jié)合而獲得的修飾抗體?？赏ㄟ^本
技術(shù)領域：
已知的常規(guī)的化學修飾方法來進行修飾抗體。本發(fā)明的抗體包括嵌合抗體和人源化抗體，嵌合抗體包含源自非人抗體的可變區(qū)和源自人抗體的恒定區(qū)，人源化抗體包括源自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)和源自人抗體的恒定區(qū)。這樣的抗體可以用本
技術(shù)領域：
已知的常規(guī)方法制備。人源化抗體可通過用具有需要的結(jié)合活性的嚙齒動物的CDR區(qū)取代人抗體的CDR序列區(qū)而獲得(Verhoeyen等，(1988)Science239:1534-6)。因此，與嵌合抗體相比，人源化抗體是其中人抗體的較小區(qū)域被非人來源的相應區(qū)域取代的抗體。還可以制備除人的框架區(qū)和恒定區(qū)外還具有人可變區(qū)的完整人抗體。例如，在一種體外方法中，可以使用展示人抗體片段的噬菌體重組文庫來進行篩選(Hoogenboom和Winter，(1992)JMolBiol227:381-8)。類似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座引入內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生人抗體(US6，150，584、US5,545，807、US5,545，806、US5,569，825、US5,625，126、US5,633，425和US5,661，016)。如上所述獲得的抗體可通過本領域的常規(guī)方法純化至均質(zhì)。例如，可以使用普通的蛋白質(zhì)分離和純化方法。可通過柱層析法如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等的組合來分離和純化抗體；然而，分離和純化方法不限于此(Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow禾口DavidLane，(1988)ColdSpringHarborLaboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。蛋白A柱用的實例包括HyperD、P0R0S禾口SepharoseRF(Pharmacia)0除了親和層析外，層析的實例包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層|1τ>吸附M·(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.等)。層析也可以使用液相層析如HPLC和FPLC。本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合親和力可使用，例如，吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)和免疫熒光測定法來測量；然而，方法不限于此。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，加入本發(fā)明的肽，然后加入含有產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)物上清液或純化抗體的樣本。隨后，加入具有可檢測標記且能夠識別抗原結(jié)合親和力待測的抗體的第二抗體。洗滌平板后，加入用于檢測第二抗體的標記的試劑，并測量吸光度等。例如，酶如堿性磷酸酶可以用作第二抗體的標記，酶底物如磷酸對硝基苯酯可用作檢測試劑。BIAcOre(Pharmacia)也可以用于評估抗體活性。本發(fā)明的抗體可檢測包含在樣品中的本發(fā)明的肽。具體地，例如，可通過將癌組織的活檢樣本與本發(fā)明的抗體接觸來確認本發(fā)明的肽在癌組織中的存在。在將本發(fā)明肽用于癌癥的治療性和/或預防性處理之前，可能的是通過使用本發(fā)明的抗體評價本發(fā)明肽在將待治療的癌癥中的表達，在治療開始前預測效果在測試受試者中是否有希望。此外，由于本發(fā)明抗體可識別⑶CAl肽的片段，而該肽的表達在多種癌細胞中增力口，所以預期它們的應用不僅可用于診斷中而且還用于治療。(4)輔助T細胞，殺傷T細胞，或包含它們的免疫細胞群本發(fā)明還涉及通過用本發(fā)明的肽體外刺激誘導的殺傷T細胞和輔助T細胞，或包含殺傷T細胞和輔助T細胞的免疫細胞群。例如，當使用本發(fā)明肽在體外刺激外周血淋巴細胞或腫瘤浸潤性淋巴細胞時，可誘導出腫瘤反應性的活化T細胞，這些活化T細胞可有效地用于過繼免疫治療(adoptiveimmunotherapy)?；蛘?，作為強力的抗原呈遞細胞，樹突細胞也可以用本發(fā)明肽進行沖激或經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化以表達所述肽，并可通過使用這些樹突細胞在體內(nèi)或體外刺激T細胞來誘導抗腫瘤免疫應答。優(yōu)選地，可通過使用本發(fā)明的肽和佐劑進行體外刺激，來誘導輔助T細胞、殺傷T細胞或包含它們的免疫細胞群。本申請使用的佐劑包括細胞生長因子或細胞因子。可通過輸注由此獲得的輔助T細胞、殺傷T細胞或包含它們的免疫細胞群，包括將它們向癌癥患者血管內(nèi)、向腫瘤局部輸注等，來抑制腫瘤并且預防和/或治療癌癥。如上所述可抑制腫瘤的殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群，可使用本發(fā)明的肽來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供含有本發(fā)明肽的細胞培養(yǎng)基?？墒褂眉毎囵B(yǎng)基制備能抑制腫瘤的殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群。此外，本發(fā)明提供用于生成殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群的細胞培養(yǎng)試劑盒，包括上述細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)容器。(5)抗原呈遞外來體本發(fā)明進一步提供一種稱為“外來體”(exosome)的細胞內(nèi)小泡，該外來體將在本發(fā)明肽和HLA抗原之間形成的復合物呈遞到其表面。外來體可以使用例如在第平11-510507號(對應于非日語國際公布的未審查的日本國家階段公布)和第2000-512161號中公開的日語譯文中詳細描述的方法進行制備。優(yōu)選地，可使用從治療和/或預防的受試者獲得的抗原呈遞細胞來制備外來體?？蓪⒈景l(fā)明的外來體以與本發(fā)明肽相似的方式作為癌癥疫苗進行注射。在本發(fā)明中使用的HLA抗原類型應該與需要治療和/或預防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如HLA抗原類型是HLA-A02，并優(yōu)選為HLA-A2(HLA-A*0201)?！癏LA-A2”表示蛋白，“HLA-A*0201”表示與該蛋白的區(qū)段相對應的基因(因為目前沒有表示該蛋白區(qū)段的術(shù)語)。(6)誘導抗原呈遞細胞和殺傷T細胞的方法本發(fā)明提供使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導抗原呈遞細胞的方法。可以使一種或多種本發(fā)明的肽接觸從外周血單核細胞誘導的樹突細胞，以刺激該樹突細胞，從而誘導出抗原呈遞細胞。當對受試者施用本發(fā)明的肽時，可以在受試者體內(nèi)誘導出在其表面呈遞本發(fā)明的肽的抗原呈遞細胞?；蛘?，可使用回體方法，其中用本發(fā)明的肽沖激抗原呈遞細胞，然后將這樣的細胞作為疫苗施用于受試者。例如，回體施用方法可包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細胞；和(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細胞接觸本發(fā)明的肽(用本發(fā)明肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細胞)。步驟(2)中獲得的抗原呈遞細胞可作為疫苗施用于受試者。本發(fā)明還提供誘導具有高水平的殺傷T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法。這種方法包括用包含編碼一種或多種本發(fā)明肽的多核苷酸的基因體外轉(zhuǎn)染抗原呈遞細胞的步驟。要轉(zhuǎn)染的基因可以是DNA或RNA。對于轉(zhuǎn)染，可合適地使用本領域常規(guī)進行的多種方法，如脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和磷酸鈣方法，但所述方法不限于此。更具體地，轉(zhuǎn)染可如ReevesME等，(1996)CancerRes.,565672-7；ButterfieldLH等，(1998)J.Immunol.，1615607-13；BoczkowskiD等，(1996)JExp.Med.，184:465_72；和W099/08521中所述進行。當基因轉(zhuǎn)染入抗原呈遞細胞時，它們在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。隨后所得的蛋白質(zhì)經(jīng)由MHCI型或II型途徑進行加工，并經(jīng)過抗原呈遞途徑作為部分肽呈遞在抗原呈遞細胞的表面。本發(fā)明還提供使用一種或多種本發(fā)明肽誘導殺傷T細胞的方法。通過將一種或多種本發(fā)明肽施用于受試者，可在受試者體內(nèi)誘導出殺傷T細胞，從而加強靶向腫瘤組織中呈遞CDCAl的癌細胞的免疫系統(tǒng)?；蛘?，可通過在體外使來自受試者的抗原呈遞細胞和CD8陽性細胞與一種或多種本發(fā)明肽接觸，并通過在體外使外周血單核白細胞與抗原呈遞細胞接觸來刺激細胞，從而誘導活化的殺傷T細胞。在回體治療方法中，可通過將活化的殺傷T細胞回輸(return)入受試者體內(nèi)來增強靶向受試者癌組織中呈遞CDCAl的癌細胞的免疫系統(tǒng)。例如，此方法包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細胞；(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細胞接觸本發(fā)明的肽(用本發(fā)明的肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細胞)；(3)將步驟(2)中的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合并共培養(yǎng)來誘導細胞毒性T細胞；和(4)從步驟(3)的共培養(yǎng)物中收集⑶8+T細胞。從步驟(4)中獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗施用于受試者。本發(fā)明還提供用一種或多種本發(fā)明的肽誘導的分離的殺傷T細胞。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法誘導的殺傷T細胞源自接受治療和/或預防的受試者?？蓪⑺黾毎c其他包含呈遞本發(fā)明一種或多種肽的抗原呈遞細胞或外來體的試劑組合施用。獲得的殺傷T細胞對于呈遞與誘導所用的肽相同的肽的靶細胞是特異性的。靶細胞是內(nèi)源性表達CDCAl的細胞或者是用CDCAl基因轉(zhuǎn)染的細胞。通過用本發(fā)明的肽進行刺激，在其表面呈遞本發(fā)明的肽的細胞，如來自肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤、結(jié)腸癌等的癌細胞，可成為攻擊的目標。(7)T細胞受體(TCR)本發(fā)明還提供編碼多肽的核酸，所述多肽形成識別⑶CAl-I和⑶CA1-4的T細胞受體(TCRs)的亞基，和使用所述核酸的方法。TCR包含至少七個跨膜蛋白。一個二硫鍵連接的(α，β)異源二聚體形成克隆型抗原識別單元，而由ε、Y、δ和ζ，和η鏈組成的不變的CD3鏈偶聯(lián)與信號傳導途徑結(jié)合的配體，由此引起T細胞活化和細胞免疫反應。如上所述，負責抗原識別的α和β亞基對于T細胞獲取識別特定靶物的特異性是必需的。因此，為了合成特異性地識別本發(fā)明肽的TCR，可通過本領域的技術(shù)人員已知的方法鑒定源自使用本發(fā)明肽誘導的CTL的TCR亞基α和β的核酸序列(W02007/032255；和Morgan等，J.Immunol.，171，3288(2003))。由鑒定的TCR亞基所形成的TCR可結(jié)合于呈遞⑶CAl肽的靶細胞，所以將該TCR引入具有細胞殺傷作用的細胞時可顯示出其用處?？蓪⒕幋aTCR亞基的核酸整合入合適的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)。載體可通過本領域的技術(shù)人員已知的方法生成。整合了TCR亞基的載體可用于導入T細胞。具體地，通過轉(zhuǎn)化源自患者的T細胞，可獲得特異性識別并攻擊表達CDCAl的細胞的T細胞(CTL)?？赏ㄟ^普通方法(Kawakami等，J.Immunol.，142，3452-3461(1989))培養(yǎng)和生長由此獲得的導入了TCR的CTL。通過上述方法獲得的CTL可用于細胞免疫治療。本發(fā)明還提供呈遞由HLA抗原和一種或多種本發(fā)明肽形成的復合物的抗原呈遞細胞。與一種或多種本發(fā)明的肽或編碼這些肽的核苷酸接觸的抗原呈遞細胞優(yōu)選從接受治療和/或預防的受試者收集。本發(fā)明的肽、呈遞此肽的抗原呈遞細胞、外來體、或活化的殺傷T細胞，可以與其他藥劑組合作為疫苗施用。本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)參考文件均通過提述并入本文。將參考下面的實施例進一步說明本發(fā)明；然而，本發(fā)明不應理解為受限于這些實施例。實施例[實施例1](1)顯示與HLA-A2有結(jié)合性的CDCAl肽庫(r印ertoire)的選擇使用BIMAS系統(tǒng)搜索人CDCAl的氨基酸序列，并按估計的與HLA-A2結(jié)合親和性的降序選擇了41種肽(表1)。[表1-1]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[表1-2]28402-411KLGIQQLKDA40.0SEQIDNO:2829343-352RLMIVKKEKL38.7SEQIDNO:2930309-318KLASILKESL36.6SEQIDNO:303122-31ILTGADGKNL36.3SEQIDNO3132193-202SLNODFHOKT28.3SEQIDNO:323352-61ALQIVYGIRL21.4SEQIDNO:333444-53VLHMIYMRAL16.7SEQIDNO:343535-44DLYPNPKPEV16.7SEQIDNO:3536165-174KLERLDSVPV15.6SEQIDNO:363765-74YMMPVNSEVM12.3SEQIDNO:3738154-163QLNAAHQEAL10.5SEQIDNO:383960-69RLEHFYMMPV10.2SEQIDNO3940344-353LMIVKKEKLA6.1SEQIDNO:4041453-462AELKRKMFKM4.8SEQIDNO:41在本發(fā)明中鑒定的HLA-A2限制性殺傷T細胞表位以下劃線表示。[實施例2]首先，利用先前報道的方法(KomoriH等ClinicalCancerResearch12:2689-2697,2006)從HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細胞中誘導樹突細胞(DC)。將由此獲得的BM-DC用⑶CAl肽(ΙΟμΜ)沖激，然后以5XIO5個細胞/小鼠在腹膜內(nèi)施用于HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠。以相同的施用方法以一周為間隔免疫小鼠兩次，然后收集它們的脾細胞用于檢測殺傷T細胞。為了能夠嚴格地檢查源自CD8+T細胞的殺傷T細胞的誘導，在去除脾臟后利用MACS珠從脾細胞中去除CD4+T細胞，使用余下的細胞。圖IA顯示用于確定能夠被HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中的HLA-A2限制性殺傷T細胞識別的CDCAl肽的規(guī)程。將從免疫的小鼠中收集脾細胞的日期指定為“第O天”。第21天(1)通過向HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細胞加入GM-CSF來啟動源自骨髓的樹突細胞(下文稱為BM-DC)的誘導。第14天⑵向誘導的BM-DC中加入含有四種⑶CAl肽的混合物，并在兩小時之后將其以5XIO5個細胞/小鼠腹膜內(nèi)施用。以1周的間隔將(1)和(2)再重復兩次。第O天從經(jīng)免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中收集脾細胞，并將其與已經(jīng)和⑶CAl肽溫育兩小時的BM-DC共培養(yǎng)，隨后將其培養(yǎng)六天。第6天為了檢測特異性地識別⑶CAl肽的殺傷T細胞，通過ELISP0T測定法對抗原刺激后產(chǎn)生Y干擾素的T細胞進行定量。作為靶細胞，使用以各個CDCAl肽沖激的BM-DC和未沖激的BM-DC。通過ELISP0T測定法評價⑶CAl特異性殺傷T細胞的活性通過ELISP0T測定法確定被誘導的殺傷T細胞中是否存在與⑶CAl特異地反應而產(chǎn)生IFN-γ的殺傷T細胞。使用MouseIFN-yELISPOTSet(BDBiosciences)檢測IFN-γ。當殺傷T細胞(效應物)響應于刺激細胞(靶物)并生成IFN-Y時，它們可以作為紅色斑點被檢測到。作為靶細胞，使用不表達⑶CAl的HLA-A2陽性Τ2Α2細胞和經(jīng)⑶CAl肽沖激的Τ2Α2細胞。Τ2Α2細胞是通過將HLA-A2基因引入TAP基因表達缺陷的小鼠T2細胞系而產(chǎn)生的細胞系，其購自RIKENCellBank0這些細胞中由于TAP的缺陷，僅當外源添加的肽具有結(jié)合于HLA-A2分子的性質(zhì)時，才會在細胞表面上表達肽與HLA-A2分子之間形成的復合物。首先，用抗-小鼠IFN-Y抗體包被ELISP0T板(BDBiosciences)18個小時，隨后，將板用10%FCS/RPMI封閉2小時。將效應物細胞(100微升/孔)和靶細胞(100微升/孔)混合，并在37°C培養(yǎng)22小時。該實驗以效應物/靶比例(E/T比)51進行。然后將板用無菌水洗滌并與生物素化的抗小鼠IFN-Y反應兩小時，再與鏈親合素-HRP反應一小時。使用底物溶液檢測出IFN-Y陽性斑點。利用MINERVATECH的自動化分析軟件計數(shù)斑點。肽編號1至20的結(jié)果示于圖1B。通過類似的實驗，在41種肽之中，在用⑶CA165_73(No.1)(SEQIDNO:1)或CDCAl351-S59(No.4)(SEQIDNO2)肽誘導的殺傷T細胞中觀察到了CDCAl特異性殺傷T細胞免疫應答(圖2)。用CDCA165_73(No.1)(SEQIDNO1)或CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽誘導的殺傷T細胞的分析結(jié)果分別示于圖2A和2B。[實施例3]患者、血液樣本和細胞系在日常診斷檢查的過程中經(jīng)知情同意收集源自NSCLC患者的血液樣本。⑶CAl陰性人結(jié)腸癌細胞系C0L0201由HealthScienceResearchResourcesBank提供。使用HLA-A2單克隆抗體BB7.2(0neLambdaInc.，CanogaPark,CA)通過流式細胞術(shù)確認這些樣本中的HLA-A2表達。慢病毒基因轉(zhuǎn)移使用Tahara-HanaokaS等ExpHematol2002；3011-17中描述的方法進行慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移。簡言之，使用Lipofectamine2000(InvitrogenCorporation,CA,USA)，將攜帶CDCAlcDNA的17微克CSII-CMV-RfA和CSIIEF-RfA自滅活載體(MiyoshiH等JVirol1998；728150-8157)與10微克pCMV-VSV-G-RSV-Rev和pHIVgp轉(zhuǎn)染入10厘米培養(yǎng)皿上的293T細胞。60小時后，收集培養(yǎng)基，用超速離心法(50，000xg，2小時)沉淀病毒顆粒。將沉淀懸浮于50微升RPMI1640溶液中，并將10微升病毒懸液加至每孔含有5XIO4個C0L0201細胞的U型底96孔板的每個孔中。通過Western印跡分析確認轉(zhuǎn)染的⑶CAl基因的表達。⑶CAl反應性人CTL的誘導使用源自單核細胞的DC細胞作為抗原呈遞細胞誘導響應HLA呈遞的肽的CTL。通過先前報道的體外方法(SudaT，等CancerSci.2007；NakaharaS，等CancerRes.2003；63:4112-8)獲得DC。簡言之，針對使用Ficoll-Paque溶液(GEHealthcareUK,Ltd.,Buckinghamshire,UK)從HLA_A*0201陽性健康志愿者和NSCLC患者分離的外周血單核細胞(PBMC)，使用MicroBeads(MiltenyiBiotec，BergischGladbach,Germany)篩選CD8陽性⑶14陽性群體。為了獲得DC，在含有2%自體血漿的AIM-V(Invitrogen)中，存在IOOng/mL的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和lOng/mL的白細胞介素(IL)-4(P印roTecInc.,NewJersey,USA)的條件下，培養(yǎng)CD14陽性群體。溫育4天后，皿中添加0K-432以制備成熟DC。開始培養(yǎng)細胞因子誘導的DC五天后，在37°C、AMI-V中存在4yg/mL的β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO,USA)的條件下，將細胞用20μg/mL的HLA-A2結(jié)合肽進行沖激2小時。對這些經(jīng)肽沖激的DC進行輻射照射(3，500cGy)并以150比例與自體⑶8陽性T細胞混合；所述自體⑶8陽性T細胞是使用抗-⑶8微珠(MiltenyiBiotec)從PBMC獲得的。使用48孔板進行溫育，48孔板準備為每孔包含0.5mLAIM-V，其中含2%自體血漿、IXIO4個肽沖激的DC、5XIO5個CD8陽性T細胞和10ng/mL的人IL-7(ffako,Osaka,Japan)。溫育三天后，以20IU/mL的濃度加入人IL-2(PeproTecInc.)。此外，在第12和19天，用經(jīng)肽沖激的自體DC再刺激T細胞。通過上述方法合適地制備DC。第三次肽刺激的六天后，即第25天，通過鉻(Cr)釋放測定法和IFN-yELISP0T測定法來評價抗原特異性CTL應答。對靶細胞的CTL應答以不同的效應細胞/靶細胞比例將CTL與靶細胞即多種癌細胞系及經(jīng)過或未經(jīng)過沖激的Τ2細胞共培養(yǎng)，并使用常規(guī)方法進行51Cr釋放測定和IFN-yELISP0T測定(KomoriH,等，Clin.CancerRes.2006；12:2689_2697；MakitaM,等Clin.CancerRes.2002；82626-31；YokomineK，等CancerSci.2007;981930-5)。簡言之，在37°C的CO2溫育器中使用3.7KBqNa251Cr4(PerkinElmerLifeSciences)將靶細胞標記一小時。將標記的靶細胞沖洗三次，并將細胞與20μg/mL的肽一起在37°C溫育三小時來制備肽沖激的靶細胞。將靶細胞與效應細胞混合使得平底微量滴定板上的最終體積為200μL，然后溫育。溫育六小時后，由每個孔收集50μL的上清液，并使用γ粒子計數(shù)管(gammacounter)對放射性進行定量。根據(jù)現(xiàn)有方法(SudaT，等CancerSci.2007；981803-8)計算特異性51Cr釋放率，來評價特異性細胞毒活性。另根據(jù)現(xiàn)有方法(KomoriH，等Clin.CancerRes.2006；122689-97)進行ELISP0T測定。由源自HLA-A2陽性健康供體的PBMC誘導⑶CAl反應性CTL自HLA-A2(A*0201)陽性健康供體分離PBMC。將CD8+T細胞與經(jīng)過CDCA165_73(No.1)(SEQIDNO1)或CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽沖激的源自單核細胞的DC—起共培養(yǎng)，并將CD8+T細胞每周刺激三次(圖3A)。將來自癌癥患者或健康供體的誘導的CTL與靶細胞一起共培養(yǎng)。將用CDCA165_73(No.1)(SEQIDNO:1)或CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽沖激的T2細胞用作靶物，并進行ELISP0T測定和51Cr釋放測定。如圖3B所示，對于癌癥患者供體1，當用⑶CA165_73(No.1)(SEQIDN0:1)肽沖激過的T2刺激細胞時，CTL的IFN-γ生成顯著大于用未經(jīng)沖激的Τ2刺激細胞時的情況。來自健康供體1的誘導的CTL響應于⑶CA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽沖激過的T2細胞產(chǎn)生大量的IFN-γ(每孔多于300個斑點)(圖3C)。此外，在51Cr釋放測定中，源自癌癥患者供體1和健康供體1的CTL針對用⑶CA165_73(No.1)(SEQIDNO1)或CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽沖激過的T2細胞顯示了細胞毒活性(圖3D)。如圖3E所示，當以用不同濃度的⑶CAl肽沖激過的T2細胞刺激CTL時，CTL以劑量依賴性方式響應于CDCAl肽沖激過的T2細胞。我們發(fā)現(xiàn)，與對未經(jīng)沖激的T2細胞或用源自HIV的HLA-A2結(jié)合性肽沖激的T2細胞的應答相比，CTL響應于以0.2μg/mL以上的肽濃度沖激的T2細胞產(chǎn)生更大量的IFN-γ。上述結(jié)果顯示這些CTL具有肽特異性的細胞毒性。將其中引入了CDCAl的C0L0201(C0L0201/CDCA1，CDCA1+，HLA_A2+；圖4A)用作靶細胞，檢查CTL的⑶CAl特異性免疫反應。如圖4B所示，用CDCA165_73(No.1)(SEQIDNO:1)肽刺激的源自健康供體的CTL針對C0L0201/⑶CAl產(chǎn)生的IFN-γ量大于轉(zhuǎn)染空載體的不表達CDCAl的C0L0201。用CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽刺激的源自健康供體2的CTL也顯示對C0L0201/⑶CAl的特異性免疫反應(圖4C)。此外，這些CTL顯示對PANCl細胞(⑶CA1+，HLA-A2+)的免疫反應，而不顯示對A549細胞(⑶CA1+，HLA-2-)的免疫反應(圖4D)。為了將源自⑶CAl的肽施用于癌癥免疫療法，最重要的是⑶CAl肽-反應性CTL能夠顯示針對內(nèi)源表達⑶CAl的腫瘤細胞的特異性細胞毒性。如圖4E所示，對于癌癥患者供體1，使用CDCA165_73(No.1)(SEQIDNO1)肽獲得的CDCAl反應性CTL顯示針對PANCl細胞(CDCA1+，HLA-A2+)的細胞毒活性，而不顯示對A549細胞(CDCA1+，HLA-2-)或C0L0201細胞(CDCA1-，HLA-A2+)的細胞毒活性。類似地，用CDCA1351_359(No.4)(SEQIDNO2)肽刺激的源自健康供體1的CTL顯示對PANCl細胞(⑶CA1+，HLA-A2+)的細胞毒活性，而不顯示對A549細胞(⑶CA1+，HLA-2-)的細胞毒活性。這些結(jié)果顯示這些肽在癌細胞中天然地被加工，且與HLA-A2—起呈遞于癌細胞的表面上，并可被CTL識別。對于HLA-A2限制性CDCAl特異性的CTL的檢測，自Medical&BiologicalLaboratoriesCo.Ltd.(Nagoya,Japan)購買結(jié)合有CDCA1351_359肽的PE-標記的HLA_A*0201四聚體。如圖4G所示，在⑶8陽性細胞中，觀察到⑶CAl351_3KJi-反應性CTL和四聚體陽性CTL之間有強的關聯(lián)。此結(jié)果證明，本研究中使用的CD8陽性T細胞之中存在HLA-A2-限制性、⑶CAl肽-特異性的CTL。討論經(jīng)天然加工并呈遞于腫瘤細胞的源自TAA的肽的鑒定，對于建立基于肽的癌癥免疫療法來說是重要的。使用NSCLC和正常組織通過cDNA微陣列分析鑒定了作為新的癌癥/睪丸抗原的⑶CA1。⑶CAl在NSCLC和正常睪丸中強表達，但其mRNA或蛋白質(zhì)在所檢查的其他正常組織中不表達。由于睪丸是與免疫系統(tǒng)隔離的組織，所以⑶CAl反應性CTL將僅攻擊NSCLC。因此，選擇⑶CAl作為TAA用于NSCLC患者的免疫治療。為了最大程度地減小由于免疫誘導治療造成TAA缺失、突變或減少表達(它們是癌細胞免疫回避的手段)的風險，期望鑒定出對于NSCLC的增殖或存活而言必不可少的TAA，用作免疫治療的靶標(YoshitakeY，等Clin.CancerRes.2004；10:6437_48)。已報道⑶CAl作用于紡綞體微管和動粒(kinetochore)之間的連接，并在細胞周期的維持中起重要作用(DeLucaJG，等J.CellBiol.2002；159:549_55)。此外，CDCAl是核分裂周期(NDC)復合物的組分，其在有絲分裂期間正確的染色體分離中起重要作用，并且無論物種是高度保守的(DeLucaJG，等Curr.Biol.2003；13:2103_9)。CDCAl對于著絲粒蛋白質(zhì)E(CENP-E)在HeLa細胞中的動粒定位是必需的。siRNA對CDCAl表達的抑制可導致染色體由于有絲分裂阻斷(mitosisblock)而分離異常，隨后誘導細胞死亡(LiuD，等J.Biol.Chem.2007；282:21415-24)。這種異常的有絲分裂逸出具有凋亡和激變(catastrophe)兩者的特征(DeLucaJG，等J.CellBiol.2002；159:549_55)。也就是說，CDCAl對于細胞功能是必需的，并在癌細胞的增殖和存活中起重要作用。CDCAl和動粒相關的2(KNTC2)是進化上保守的著絲粒蛋白質(zhì)復合物的成員(HayamaS，等CancerRes2006；6610339-48)。免疫染色顯示它們的表達增加與NSCLC患者的預后不良相關(HayamaS，等CancerRes2006;66:10339-48)。因此，CDCAl在NSCLC組織中的表達水平是預測患者外科手術(shù)后的預后的有用標記。提示⑶CAl牽涉于NSCLC的進程中。因而，靶向⑶CAl的免疫療法對于預后不良的NSCLC患者可能是有效的。在本發(fā)明中，使用HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定了兩種HLA-A2限制性⑶CAl表位肽，它們促進HLA-A2限制性小鼠CTL的生成。此外，可由以這些肽刺激的源自健康供體的PBMC制備⑶CAl反應性人CTL。這些⑶CAl肽-特異性CTL細胞系殺死以HLA-A2限制性方式表達⑶CAl的癌細胞(圖4)。針對預計與HLA-A0201分子具有高結(jié)合親和性的源自⑶CAl的肽，使用BIMAS軟件加以選擇；然而，一些氨基酸序列在人和小鼠⑶CAl之間不是保守的。⑶CA165_73(No.1)肽的人序列和小鼠序列之間存在兩個氨基酸的差異(人YMMPYNSEV/小鼠YMMPMNIEV)，而在CDCA1351_359(No.4)肽中存在一個氨基酸差異(人KLATAQFKI/小鼠KLATASFKI)。然而，在本發(fā)明中，確認了來自健康供體的上述表位肽_反應性的CTL的誘導。使用所述CDCAl肽進行體外刺激，由源自健康供體的PBMC誘導出了CDCAl反應性CTL。通過呈遞肽的DC誘導出的CTL以HLA-A2限制性方式顯示針對表達⑶CA的癌細胞的細胞毒活性。源自健康供體的CDCAl特異性CTL的誘導對于持續(xù)進一步搜索TAA是有意義的。此外，從分離自NSCLC、小細胞癌、膽管細胞癌、膀胱癌和腎細胞癌患者的PBMC誘導CDCAl反應性CTL目前在嘗試中。有幾種細胞介導的癌癥免疫治療方法，包括肽或蛋白質(zhì)疫苗接種(RosenbergSA，等NatMed1998;4:321_7)，使用經(jīng)肽、蛋白質(zhì)或腫瘤裂解物沖激的樹突細胞進行免疫(KuglerA，等NatMed2000;6:332_6)，以及使用腫瘤特異性CTL系的回體過繼轉(zhuǎn)移(exvivoadoptivetransfer)(FalkenburgJH，等Blood1999；941201-8)。本發(fā)明中鑒定的⑶CAl肽可應用于這些免疫療法。如果醫(yī)學研究能夠證明使用本發(fā)明中鑒定的肽(其經(jīng)由HLA-A2被呈遞給殺傷T細胞)進行的癌癥免疫療法的安全性和有效性，那么對白種人的臨床應用將是可能的。此夕卜，通過鑒定經(jīng)由HLA-A2被呈遞給殺傷T細胞的肽(其不僅是日本人，而且是白種人常有的)，很可能開發(fā)可用于30%的日本和白人肺癌患者的癌癥免疫治療劑。工業(yè)實用性HLA-A2是大約30%的日本人群所具有的HLAI型等位基因。根據(jù)本發(fā)明的⑶CAl肽可誘導人細胞毒性T細胞，它們可損害表達所述肽和HLA-A2分子的復合物的癌細胞。因此，可將本發(fā)明的肽應用于HLA-A2陽性患者中的肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、骨肉瘤、乳癌、軟組織肉瘤、結(jié)腸癌的免疫治療。因此，這些肽對于開發(fā)用于抑制這些癌癥的增殖和進展的治療劑是有用的。權(quán)利要求下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性。2.權(quán)利要求1的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。3.權(quán)利要求1的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。4.一種用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。5.一種用于治療和/或預防癌癥的藥劑，其包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。6.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。7.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含編碼權(quán)利要求1的肽的一種或多種多核苷酸作為活性成分。8.一種用于誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。9.針對權(quán)利要求1的肽的抗體。10.使用權(quán)利要求1的肽誘導的輔助T細胞、細胞毒性(殺傷)T細胞或包含它們的免疫細胞群體。11.一種抗原呈遞細胞，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復合物。12.權(quán)利要求11的抗原呈遞細胞，其是通過權(quán)利要求6或7的藥劑誘導的。13.—種外來體，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復合物。14.權(quán)利要求13的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA_A2*0201)。15.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括使抗原呈遞細胞與權(quán)利要求1的肽接觸的步驟。16.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞的步驟。17.一種用于誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的方法，其包括使T細胞與權(quán)利要求1的肽接觸的步驟。18.一種用于誘導針對癌癥的免疫力的方法，其包括將權(quán)利要求1的肽施用于受試者的步驟。19.一種用于治療和/或預防癌癥的方法，其包括將權(quán)利要求1的肽施用于受試者的步驟。20.權(quán)利要求1的肽用于制備誘導針對癌癥的免疫力的試劑的用途。21.權(quán)利要求1的肽用于制備治療和/或預防癌癥的藥劑的用途。22.權(quán)利要求1的肽，其用于誘導針對癌癥的免疫力。23.權(quán)利要求1的肽，其用于治療和/或預防癌癥。全文摘要本發(fā)明提供如下(A)或(B)的肽和使用所述肽的方法(A)包括SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽，(B)包括SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸，并且其中所述肽顯示殺傷T細胞誘導活性。文檔編號C12N15/00GK101835892SQ20088011239公開日2010年9月15日申請日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日發(fā)明者中村佑輔,原尾美智子,西村泰治,角田卓也申請人:腫瘤療法科學股份有限公司