專利名稱：生成物為H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的氧化酶類活性檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物酶活性檢測領域，具體涉及以生成物為HA的氧化酶類活性 的檢測，包括植物體內HA含量的檢測。
背景技術：
氧化酶類是生物體氧化代謝過程中的重要物質，決定了生物體內的氧化代 謝進程和次生代謝物質的產生與消除。使植物在不同的生長環(huán)境下具有不同的 適應狀態(tài)。如多胺(Polyamines， PAs )是生物體氮代謝過程中產生的一類次生 代謝物質，植物體在受到生物的和非生物的脅迫時，體內的多胺濃度急劇地變 化。多胺氧化酶(Polyamine oxidase, PA0)是催化生物體內PAs氧化的關鍵 酶，通過調節(jié)細胞的PAs水平和生成物的濃度，參與各種植物體對逆境脅迫的 反應和生長發(fā)育過程。因而PA0是PAs代謝研究的一個重要環(huán)節(jié)；而多酚氧化 酶是氧化酚類的關鍵酶，是研究酚類氧化代謝的關鍵酶。諸如此類氧化酶在植 物體內還有很多。這類氧化酶的共同特點是氧化底物時有產物HA的生成。從而 可以檢測&02含量以達到對氧化酶活性的定量檢測。傳統(tǒng)檢測方法是1972年 Smith提出并應用的PAO活性的檢測方法。但由于其靈敏性較低和檢測產物穩(wěn)定 性較差等，在很多植物中都檢測不到PAO的活性。影響了傳統(tǒng)檢測方法應用的 廣泛性。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種生成物為H202的氧化酶類活性檢測 方法，該檢 測方法能提高氧化酶活性的檢測率，H202濃度最低檢測量可從1.25jamo1 L—'提 高至ij 0. 65 (amol . L—。
其具體搡作技術如下
(1 )制作氧化酶提取液稱取0. 5 g試材加入1. 6 mL磷酸緩沖液(0. lmol -1/1，pH 6.5 )于冰浴中研磨后以10000 xg離心20 min (4°C ),上清液即為氧化酶 提取液；
(2) 制作顯色液100 mL顯色液(用0. lmol， pH 6. 5的磷酸緩沖液配)的 成分中含25juL N,N-二甲基苯胺，10 mg 4-氨基氨替吡啉；
(3) 制作反應混合液該反應混合液含2. 5 mL磷酸緩沖液(0. lmol . L—1， PH6. 5)， 0. 2mL顯色液，0. 2 mL氧化酶提取液，0. 1 mL過氧化物酶溶液(250 U m1/1);
(4) 將反應混合液加入20 mmol L—'底物0.1 mL起動反應后，混合反應液 置于25匸中反應30min。所述底物依氧化酶的種類而定，如檢測多胺氧化酶， 其底物為多胺；檢測多酚氧化酶，其底物為各種酚類；
(5 )用分光光度計測定波長550nm處光密度值，以0. 001 AOD55。 . min-'為 一個酶活單位(U)。
(6)用加入5%高氯酸的提取液為對照。
本發(fā)明的方法，&02濃度的最低檢測量可從1.25pmo1 .L-'提高到0. 65ji mol*L—、提高了氧化酶活性的檢測率。并且其顯色產物具有良好的穩(wěn)定性與重 現性，可以延長反應時間來提高檢測效果。
權利要求
1、一種生成物為H2O2的氧化酶類活性檢測方法，具體操作技術如下(1)制作氧化酶提取液稱取0.5g試材加入1.6mL磷酸緩沖液(0.1mol·L-1，pH 6.5)于冰浴中研磨后以10000×g離心20min(4℃)，上清液即為氧化酶提取液；(2)制作顯色液100mL顯色液(用0.1mol，pH 6.5的磷酸緩沖液配)的成分中含25μL N，N-二甲基苯胺，10mg 4-氨基氨替吡啉；(3)制作反應混合液該反應混合液含2.5mL磷酸緩沖液(0.1mol·L-1，pH 6.5)，0.2mL顯色液，0.2mL氧化酶提取液，0.1mL過氧化物酶溶液(250U·mL-1)；(4)將反應混合液加入20mmol·L-1底物0.1mL起動反應后，混合反應液置于25℃中反應30min，所述底物依氧化酶的種類而定，如檢測多胺氧化酶，其底物為多胺；檢測多酚氧化酶，其底物為各種酚類；(5)用分光光度計測定波長550nm處光密度值，以0.001ΔOD550·min-1為一個酶活單位(U)；(6)用加入5％高氯酸的提取液為對照。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生成物為H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的氧化酶類活性檢測方法，利用氧化酶氧化底物生成H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>，以檢測H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>含量從而達到對氧化酶活性的定量檢測，反應顯色劑選用N，N-二甲苯胺，4-氨基胺替吡啉，顯色劑與H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反應生成紫蘿藍色產物，產物在波長550nm處測定光密度值，以0.001ΔOD<sub>550</sub>·min<sup>-1</sup>底為一個酶活單位(U)，通過檢測產物濃度來間接地測出氧化酶的活性速率，于傳統(tǒng)方法相比，本方法對H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度的最低檢測量可從1.25μmol·L<sup>-1</sup>提高到0.65μmol·L<sup>-1</sup>，從而提高了氧化酶活性的檢測率，并且其顯色產物具有良好的穩(wěn)定性和重現性，可以延長反應時間來提高檢測效果。
文檔編號C12Q1/26GK101659986SQ20081010703
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權日2008年8月27日
發(fā)明者靜 周, 天 汪 申請人:靜 周