專利名稱：人附睪表達的防御素基因及克隆表達與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種人附睪特異表達的防御素 基因HEL-75的核甘酸序列和該基因表達蛋白的氨基酸序列，以及該蛋白的制備方法及其在 抗感染、抗腫瘤，開發(fā)新的避孕藥以及輔助診斷和治療不育癥中的生物學應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動物防御素是機體的先天免疫因子，它是一類小分子陽離子抗菌肽。根據(jù)氨基酸序 列、六個半胱氨酸對以及外顯子的數(shù)目不同分為兩大類a-防御素和e-防御素。a-防御素 富含精氨酸，由29-35個氨基酸組成，擁有三對以C1-C6， C2-C4， C3-C5排列的二硫鍵。它們 主要表達于中性白細胞以及潘氏細胞中。到目前為止，總共報道了五種不同的人a-防御素基 因和六種a-防御素蛋白。哺乳動物e-防御素也含有大約35個氨基酸的殘基，六個半胱氨酸 以C1-C5， C2-C4， C3-C6的的方式形成三對與a-防御素不同的二硫鍵。更有趣的是，與a-防御素在多個組織和細胞類型中表達不同，哺乳動物P-防御素傾向于表達在男性生殖道，特 別是附睪和睪丸中的上皮細胞中，它們在組織跟環(huán)境之間為機體提供了第一道保護屏障。
最近，通過運用系統(tǒng)的基因組生物信息學方法，從大鼠和人的基因組中分別發(fā)現(xiàn)了42和 39個e-防御素基因和假基因。它們都在染色體中形成四到五個基因簇。更奇怪的是，RT-PCR 分析表明大鼠中除了Defb4 (人BD2同源基因)主要表達在呼吸道和上消化道之外，其它全部
e-防御素基因都傾向于表達在男性生殖道，特別是附睪跟睪丸中。而且，大多數(shù)表達在生殖 道中的e -防御素受發(fā)育跟雄激素的調(diào)控，它們在性成熟過程中表達得到加強。這些特性表明， (3-防御素可能在生殖和宿主防御中起雙元的作用。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的在于從人附睪cDNA文庫(申請?zhí)?00510059634.5，公開(公告)號 CN1840544)中克隆出一新HEL-75基因(注冊號EF426755)，提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA 序列，提供攜帶編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列的重組表達載體，通過生物信息學分析對 HEL-75基因進行生物學功能預測，并對其重組表達蛋白進行系統(tǒng)的生物學功能研究。
一、本發(fā)明的技術(shù)路線
1. 基因克隆與序列分析
2. 表達載體的構(gòu)建3. 重組HEL-75蛋白的純化
4. 重組HEL-75蛋白的生物學功能研究 二、具體步驟
1.基因克隆及序列分析
從本研究室構(gòu)建的青年人附睪cDNA文庫中獲得一個克隆，運用電子克隆獲得了全長基因， 命名為服L-75。經(jīng)過BLAST比對后發(fā)現(xiàn)它與NCBI數(shù)據(jù)庫中編號為NM—207469的基因具有100%的 同源性，屬于防御素家族成員。利用GENSCAN (http:〃genes. mit.edu/GENSCAN. html)分析 HEL-75基因結(jié)構(gòu)， 染色.體定位利用Genome Browser
(http:〃genome. ucsc. edu/cgi-bin/hgBlat)中的BLAT工具進行分析。HEL-75編碼蛋白的信 號肽切割位點用SignalP (http:〃麗.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測；N-糖基化和磷酸化 位點用ProfileScan預測http:〃myhits.isb-sibxh/cgi-bin/PFSCAN;系列比對用CLUATAL W分析 http:〃www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html。
2. 表達載體的構(gòu)建
根據(jù)HEL-75的基因序列，合成一對擴增成熟編碼區(qū)的特異引物上游HEL75-F: 5，-TTGGnCGACGACGACGACAAGGGTGGGTCAAAATGTGTG陽3，下游HEL1-R: 5，陽 GGCGA47TCTCATGATGTTACGGTCGTTTGTTGC -3'。上下游分別引進內(nèi)切酶位點KpnI和 EcoRI。以人附睪cDNA文庫為模板，通過PCR直接擴增目的基因，然后克隆至克隆載體pGM-T vector進行測序鑒定。經(jīng)過測序鑒定后的HEL-75基因通過Kpnl和EcoRI位點克隆至表達載體 pET32b(+)中，使其與融合標簽的閱讀框一致。重組表達載體pET32b(+)-hBD32轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，所得工程菌株經(jīng)lmMIPTG在32。C誘導4h后，所有組分用 150/。SDS-PAGE分離，考馬思亮蘭G-250染色分析工程菌的表達情況。所有的分子克隆實驗都 按照標準程序進行。
3. 重組HEL-75的純化
根據(jù)載體中的His-Tag，運用"兩步鎳親和層析法"對重組HEL-75蛋白進行分離純化。簡 單地說，"第一步親和層析"用于純化童組Trx-HEL-75融合蛋白。然后融合蛋白用重組腸激酶 裂解，釋放融合標簽。最后，運用"第二步親和層析"回收重組HEL-75蛋白。純化后的重組蛋 白用Bradford(Bradford 1976)法進行定量，然后用冷凍干燥進行保存。
4. HEL-75重組蛋白的生物學功能研究
根據(jù)HEL-75基因的結(jié)構(gòu)和功能預測，對重組HEL-75蛋白進行了以下功能篩選與鑒定(1) rhHEL-75抗菌活性檢測；(2) HEL-75基因在人重要組織中的表達分析，以及HEL-75蛋白間接 免疫熒光檢測；(3) HEL-75在精子運動、受精及胚胎發(fā)育方面的功能研究本發(fā)明通過以上實驗步驟初步預測Human印ididymis Li-l基因結(jié)構(gòu)和功能，通過在體外 重組表達，篩選與鑒定HEL-75蛋白生物學功能。人HEL-75基因由兩個外顯子組成，定位在人 染色體20pl3位置，全長編碼95個氨基酸，N-端22個氨基酸為信號肽。HEL-75蛋白擁有六個 半胱氨酸殘基，并存在多個潛在的翻譯后修飾位點，分析屬于Ji-防御素家族成員。該基因的 mRNA在人附睪頭、體、尾部分和肺部具有相同水平的表達，但編碼蛋白只在成人附睪頭、 體和尾部表達，而且在附睪頭部表達最強，尾部最弱，在肺部則沒有檢測到蛋白的表達。另 外，HEL-75蛋白可以特異結(jié)合在精子中，但在睪丸和睪丸內(nèi)的精子中沒有檢測到該蛋白，表 明HEL-75是在附睪中與精子結(jié)合的。重組HEL-75蛋白對大腸桿菌具有抑制作用，這種作用具 有濃度和時間依賴性。體外受精實驗表明，HEL-75不介導精卵融合過程。
本發(fā)明的積極效果具體描述如下
利用生物信息學方法，從本研究室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫中獲得一個克隆，運用電子克 隆獲得了全長基因，命名為HEL-75,屬附睪特異表達基因。新發(fā)現(xiàn)的人HEL-75基因cDNA全 長2121bp,編碼95個氨基酸，蛋白分子量為10.6 kDa。其中，N-端22個氨基酸為信號肽，成 熟肽包含73個氨基酸，理論等電點為9.62。人HEL-75基因擁有六個保守的半胱氨酸殘基。 HEL-75蛋白存在一個N-十四垸酰基化位點(G23GSKCV)和一個N-糖基化位點(N50 ASR)。 另外，還可能存在四個磷酸化位點，包括一個cAMP-和cGMP-依賴型蛋白激酶磷酸化位點(R79 RNT)以及三個蛋白激酶C磷酸化位點(S52RK,S77RRandT82QR)。而且，在分子中還找 到了一個潛在的凝固因子V LSPD重復序列(L62PKPDLPQL)。采用半定量RT-PCR分析HEL-75 基因在人附睪頭、體、尾，睪丸，心，肝，脾，肺，腎，胃等組織中的表達差異，該基因的mRNA 在人附睪頭、體、尾部分和肺部具有相同水平的表達，在其它組織中基本不表達。但編碼蛋 白只在成人附睪頭、體和尾部表達，而且在附睪頭部表達最強，尾部最弱，在肺部則沒有檢 測到蛋白的表達。
建立了HEL-75基因的克隆及重組表達與純化的方法。
發(fā)現(xiàn)HEL-75蛋白有助于先天性宿主防御。HEL-75蛋白屬于fi-防御素家族成員，并具有抗 菌活性。實驗發(fā)現(xiàn)重組HEL-75蛋白對大腸桿菌具有抑制作用，這種作用具有濃度和時間依賴 性，說明HEL-75蛋白在機體中可能作為一種天然免疫的介質(zhì)，具有免疫活性，在提高了宿主 防御功能中發(fā)揮重要的作用。為HEL-75蛋白在體內(nèi)的抗菌活性研究奠定了基礎(chǔ)。這種具有抗 菌活性的防御素為研究開發(fā)新型抗生素提供了新的來源。
HEL-75蛋白作為特異性表達在生殖道內(nèi)的防御素不僅對精子具有保護作用，還具有參與 其他生理過程的復雜功能。實驗發(fā)現(xiàn)，HEL-75能與精子結(jié)合。人和鼠的雄性生殖道內(nèi)大部分 p-防御素的表達是受雄激素調(diào)節(jié)的，即在性成熟期表達量增加；雄激素的調(diào)節(jié)水平的變化也可能調(diào)控HEL-75蛋白。本發(fā)明以成年男性附睪作為實驗材料，從HEL-75基因mRNA和HEL-75 蛋白在組織中的表達分析可見，性成熟階段HEL-75蛋白存在明顯表達。精子附睪中成熟的過 程可能依賴HEL-75蛋白的表達，并通過結(jié)合HEL-75蛋白，進一步調(diào)控精子成熟。本發(fā)明的實 驗結(jié)果表明，經(jīng)過HEL-75蛋白抗體封閉后的精子組未能明顯地影響正常受精和早期胚胎發(fā) 育。進一步說明了HEL-75蛋白對附睪成熟階段的精子發(fā)揮作用。
圖l: (A)人HEL-75基因cDNA以及對應(yīng)的氨基酸序列。HEL-75基因0RF (open reading frame)含288bp，編碼95個氨基酸，其中N-端22個氨基酸為信號肽(斜體)。十四垸?；?位點(G23GSKCV) 、 N-糖基化位點(N50 ASR)以及凝固因子V LSPD重復序列(L62PKPDLPQL) 分別用圓、正方形和雙括號表示。cAMP-和cGMP-依賴型蛋白激酶磷酸化位點(R79RNT)以及 蛋白激酶C磷酸化位點(S52RK， S77RR and T82QR)分別用"一，，,和"-"表示。(B) HEL-75 基因結(jié)構(gòu)。HEL-75基因由兩個外顯子(方框)組成，中間有一個長1240bp的內(nèi)含子(直線)。 黑色部分為蛋白編碼區(qū)外顯子，白色部分為非編碼區(qū)外顯子。
圖2:通過融合表達的策略制備重組蛋白(圖2A)。 SDS-PAGE分析表明，融合蛋白Trx-HEL-75主要以可溶形式存在(圖2B)。天然的HEL-75分子比重組的要略大(圖2C)。圖示(A) HEL-75大腸桿菌融合表達蛋白結(jié)構(gòu)圖.(B)融合蛋白表達分析1， 3， 5:三個 BL21(DE3)/pET32b(+)-HEL-75克隆的不溶組分；2， 4, 6:這些克隆對應(yīng)的可溶組分.(C)多 克隆抗體特異性分析1,純化的Trx-HEL-75融合蛋白；2，純化的rHEL-75蛋白；3，成人 附睪液提取物。
圖3:半定量RT-PCR分析HEL-75基因在1，附睪頭；2，附睪體；3，附睪尾；4，心臟；5， 肺；6，肝臟；7,脾臟；8，腎臟；9,胃；10，睪丸等組織中的表達差異，該基因的mRNA 在人附睪頭、體、尾部分和肺部具有相同水平的表達，在其它組織中基本不表達。管家基因 P-actin為內(nèi)參。
圖4:人HEL-75在成人附睪的頭、體和尾部都有表達在肺及其它組織中沒有檢測但HEL-75 蛋白的表達。圖示:A排，附睪頭陰性對照;B排，附睪頭;C排，附睪體;D排，尾;E排，睪丸.1 列，樣品的相差圖；2列，細胞核染色(PI); 3列，HEL-75染色(FITC標記)；4列，第2列和第3列 重疊圖。(100x).
圖5:間接免疫熒光染色分析證實，HEL-75蛋白結(jié)合到整個精子中(100x),A排，HEL-75蛋 白；B排，陽性對照蛋白BD118; C排，陰性對照.l列,樣品的相差圖；2列,細胞核染色(PI ); 3 列，HEL-75染色(FITC標記)；4列，第2列和第3列重疊圖。圖6: 轉(zhuǎn)化細菌生長分析(A)空宿主菌.(B)轉(zhuǎn)化空載體宿主菌.(C)轉(zhuǎn)化HEL-75基因. 從f = 0開始每隔lh取樣品領(lǐng)!lOD(600nm).當細菌到達指數(shù)期時，每個樣品取一半培養(yǎng)物， 加入終濃度為0.4mMIPTG 。然后每隔lh取樣測OD值，每個值測三次，然后取平均值。實四 角形，不含IPTG;空三角形,IPTG誘導后。
圖7:重組HEL-75蛋白對革蘭氏陰性大腸桿菌具有抑制作用，而且這種作用具有濃度和 時間依賴性(圖7)。細菌在37 。C時分別跟12.5g/ml (■); 25g/ml (參)；50g/ml (A)和100g/ml (▼) rHEL-75共培養(yǎng)15 120min。不同時間取樣稀釋后涂平板，計算形成的克隆。
圖8:體外受精實驗表明，經(jīng)過抗體封閉后的精子仍然可以正常受精，而且受精效率與對 照組相比基本不變，受精卵發(fā)育正常。A-B:抗體封閉人精子免疫熒光驗證圖，A為實驗組；B 為對照組。C-D:體外受精(IVF)后胚胎發(fā)育情況。C為實驗組；D為對照組。1、 3、 5表示該胚
胎發(fā)育的時間。放大倍數(shù)200;標尺50pm。具體實施方法
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明 進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù) 上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
實施例l HEL-75基因克隆及其原核表達 1實驗材料 1. 1菌株與質(zhì)粒
菌株或質(zhì)粒 E. coli DH5a E. coli BL21(DE3) pMD-18 T Vector pET-32b(+)
說明
常規(guī)克隆宿主菌
常規(guī)表達宿主菌 克隆載體，帶有Ampr基因 表達載體，帶有Ampr基因
來源 本實驗室保存 購自Novagen公司 購于TaKaRa公司 購自Novagen公司
1.2主要生化試劑
所有限制性內(nèi)切酶、聚合酶以及T4 DNA ligase購自大連Takara公司。酵母浸出膏和蛋 白胨為0xoid公司原裝，三羥甲基氨基甲烷(Tris)為Canada生產(chǎn)北京華美公司分裝，十二烷 基磺酸鈉(SDS)、溴化乙錠(EB)、氨芐青霉素(Amp)和卡那青霉素(Kan)均為Sigma公司 生產(chǎn)，其他常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純。
2實驗方法
2.1引物設(shè)計與合成
根據(jù)編碼HEL-75基因成熟蛋白編碼序列設(shè)計了一對特異引物
上游HEL75-F: 5，- TTGGTACCGACGACGACGACAAGGGTGGGTCAAAATGTGTG-3，
下游HEL75-R: 5，- GGCGAATTCTCATGATGTTACGGTCGTTTGTTGC -3，，上下游分別引進內(nèi)切酶
位點KpnI和EcoRI。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
2.2 HEL-75基因的克隆
2. 2. 1 PCR擴增HEL-75基因加樣在0.5ml PCR管中按照以下擴增體系加樣-ddH2037.5 1
10 PCR buffer5 1
Taq酶(10U/1)0.5 1
衡Ps (2.5mM)4 1
HEL-75F (25M)11
HEL-75R(25M)11
cDNA模板1 1
總體積50.0 1
擴增將PCR管置于PE公司出產(chǎn)的2400PCR儀中進行擴增,擴增程序為94'C預變性5min;(94。C，30s; 60。C，40s; 72。C,90s) 30個循環(huán)；72。C保溫7 min; 4'C保存
檢測反應(yīng)結(jié)束后取2pl產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 2. 2. 2 PCR擴增產(chǎn)物回收
利用Promega公司的WizardDNAclean-Up System,從瓊脂糖凝膠上回收PCR產(chǎn)物。取l pl 進行瓊脂糖凝膠電泳估計回收產(chǎn)物濃度，其余置-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
2.3克隆載體的構(gòu)建及鑒定
2.3.1 PCR回收產(chǎn)物與克隆載體的連接
按以下劑量依次加入O. 5ml離心管，充分混勻，用離心機離心片刻，將管壁液滴收到管底。 置于4'C冰箱中連接16-18h。
Solution I 5(jl T-載體 1^1 HEL-75基因 4^1
總體積 iow
2.3.2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
取O. 1 mo1/1 CaC12 33. 6nl和lx SSC 16. 8(al溶液于l. 5ml離心管，混勻，加入連接產(chǎn) 物1(V1，充分混勻后冰浴l. 5min;
加入感受態(tài)細胞100nl，輕輕混勻，冰浴5-10min;
42。C靜止水浴熱激2 rain，然后立刻置冰上冷卻l min;
力口850jal LB液體培養(yǎng)基，37°C， 200r/min搖床培養(yǎng)lh;
5000 r/min，常溫離心2min，收集菌體，加入200pl新鮮LB培養(yǎng)基重懸；
取100(il轉(zhuǎn)化液涂布于含100mg/ml Amp的LB培養(yǎng)基平板上(預先30min涂布16nl lOmg/mlX-Gal和化l 200mg/ml IPTG混合液)，進行藍白斑篩選
37'C恒溫培養(yǎng)12-16h; 2.3.3重組質(zhì)粒的提取
從轉(zhuǎn)化平板中挑白色單菌落接種到含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C， 300r/min 搖床培養(yǎng)16-18h;
取l. 5ml菌液到2ml離心管中，8000r/min， 4'C離心2min;
完全倒去上清，加入150 nl預冷的Solution I，渦旋振蕩懸浮菌體；
加入300 nl新配制Solution II，輕輕倒置混勻，室溫靜置5min;
加入200 (al預冷的Solution III，輕輕混勻后置冰上5-10min;
10000 r/min， 4'C離心10 min。取上清于一新離心管，加入等體積的異丙醇，混勻后室 溫放置IO min以上；
10000 r/min，室溫離心IO min，除去上清。用lml預冷的70%乙醇洗沉淀2-3次，最后于 超凈臺中風干沉淀；
用20pl TE (pH8.0)溶解沉淀，再加入RNase A至終濃度為20ng/ml，于37。C溫育60min 左右，以除去RNA;
質(zhì)粒于4'C冰箱保存?zhèn)溆茫?2.3.4重組質(zhì)粒的酶切鑒定
加樣&0 1 /^7 1雙酶切反應(yīng)體系
10xbuffer M 2. 5pl
Kpn I (10U/V1) 0.5nl EcoR I (lOUAil) 0.5^1 重組質(zhì)粒 4^1 ddH20 17.25^1
總體積 25pl
酶切充分混勻后離心片刻，再置于37。C水浴鍋中酶切3h以上
檢測用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物，篩選陽性克隆。 2.3.5重組質(zhì)粒的序列分析挑取陽性克隆，由寶生物公司測序分析； 2.4表達載體的構(gòu)建及鑒定 2.4.1 HEL-75基因的制備
pMD18 T- HEL-75質(zhì)粒的提取按2. 3. 3節(jié)的方法提取質(zhì)粒；
pMD18 T - HEL-75質(zhì)粒的酶切按2. 3. 4節(jié)的方法做酶切；HEL-75基因的回收按2.2.2節(jié)的方法回收酶切產(chǎn)物。
2.4.2表達載體pET32b (+)的制備
pET32b(+)質(zhì)粒的提取按2. 3. 3節(jié)的方法提取質(zhì)粒；
pET32b(+)質(zhì)粒的酶切按2. 3. 4節(jié)的方法做酶切
pET32b (+)載體大片段的回收按2. 2. 2節(jié)的方法回收酶切產(chǎn)物。
2.4.3 HEL-75基因與表達載體的連接 加樣在O. 5ml離心管依次加入
ddH20 4|il 10x連接酶buffer
pET32b(+)載體 11
HEL-75基因 3^1
T4-DNA連接酶(3U/V1) 1^1
總體積 10^1
充分混勻，用離心機離心片刻，將管壁液滴收回管底。 連接置于16'C水浴鍋中連接20h以上。 2.4.4連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定
轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物按照2. 3. 2節(jié)提供的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 鑒定按照2.3.3節(jié)的方法提取質(zhì)粒、1.2.3.4節(jié)的方法做酶切鑒定 2.5工程菌BL21 (DE3) / pET-32b(+)_ HEL-75的構(gòu)建與篩選 2. 5. 1pET-32b (+) - HEL-75質(zhì)粒的制備
pET-32b(+)- HEL-75質(zhì)粒的提取按照第一章2. 4. 4節(jié)的方法提取質(zhì)粒； 質(zhì)粒純化在上述質(zhì)粒中加入等體積含1.6M NaCl的13WPEG8000溶液，混勻，室溫放置 5min，然后于12000r/min，室溫離心5min ;除去上清，沉淀先溶于500^ilTE(pH8. 0)中，然后 加等體積酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，充分混勻；12000r/min，室溫離心5min，然后取上 清于一新離心管中，加等體積氯仿異戊醇(24: 1)，充分混勻；12000r/min，室溫離心5min, 然后取上清于一新離心管中，加入l/10體積3M的NaAc (pH5. 2)溶液和2倍體積預冷的無水乙 醇，充分混勻后置-20。C冰箱中15 min左右；12,000 r/m， 4"C離心10min，棄上清。用lml預 冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，然后于超凈臺中風干純化后的DNA溶于20plTE(pH8.0)中，取 2^1電泳檢測純度及估計濃度，其余的置-20'C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2.5.2E. coli BL21 (DE3)的轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化pET-32b(+)-HEL-75質(zhì)粒按照1. 2. 4. 3節(jié)提供的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。2. 5. 3 菌落PCR篩選陽性克隆
加樣:在0.5ml PCR管中按照以下擴增體系加樣:
ddH20 19.5 pl
10x PCR buffer 2. 5 pl
dNTPs (2.5mM) 2 pl
HEL-75F (25-) 0. 5pl
HEL-75R(25pM) 0.5pl
總體積 25 pl
用滅菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板上挑單菌落于上述PCR管中，輕輕攪拌使菌體溶解。注意按對應(yīng)編 號在平板上作好標記。
裂解把PCR管置PCR儀上，設(shè)99。C加熱5min，以裂解細胞
取出PCR管，每管加0.25 pi Taq酶(10,)
擴增將PCR管重新置于PCR儀中按以下程序進行擴增-
94 。C預變性5 min; (94。C，30s; 60。C,40s; 72。C,90s) 30個循環(huán)；72 。C保溫7 min; 4
'C保存；
檢測反應(yīng)結(jié)束后取2|^1產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以篩選陽性克?。?br>
2.6服L-75基因的誘導表達
將一個含有重組質(zhì)粒的單菌落接種于5ml含有合適抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C搖床 培養(yǎng)過夜；
吸取0.2ml過夜培養(yǎng)液于10ml含有合適抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基中，于37'C搖床培養(yǎng)至 OD600值在0. 8-l.O之間；
把上述菌液分成兩份， 一份加入100mMIPTG至終濃度為lmmo1/1，另一份作為未誘導的對 照。于37。C繼續(xù)培養(yǎng)4h;
各取lml培養(yǎng)物于l. 5ml離心管中，5000r/min，室溫離心5min收集菌體；
將菌體重懸于100W lxSDS凝膠加樣緩沖液，然后于10(TC加熱變性3min。將變性后的樣 品!C存于4t:，以備做SDS-PAGE分析； 2. 7重組蛋白SDS-PAGE分析
按說明書安裝電泳玻璃板
制膠采用12%分離膠和5%濃縮膠，其配方如下表各組分名稱12%分離膠(誠)5%濃縮膠
ddH203.32. 1
30%Acrylamide4.00.5
1. 5M Tris-HC1(pH8. 8)2.50
1. 0M Tris-HC1(pH6. 8)00. 38
10% SDS0. 10. 03
10%過硫酸胺0. 10. 03
TEMED0. 0040. 003
按上表配制12X分離膠10ml，加完TEMED后迅速向兩玻璃板的間隙中灌注分離膠，所灌分 離膠的體積約占整塊膠體積的三分之二。用吸管在分離膠上小心地覆蓋一層ddH20，然后將凝 膠垂直放置于室溫下自然凝固。分離膠聚合完全后(約30min)，傾出覆蓋層ddH20，再濾紙 吸干殘留液體。按上表配制5W的濃縮膠5ml，加入TEMED后迅速在已聚合的分離膠上灌注濃縮 膠，立即插入干凈的梳子，小心避免帶入氣泡，然后將凝膠垂直放置于室溫下。
上樣濃縮膠聚合完全后，小心取出梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的 丙烯酰胺，把凝膠固定于電泳裝置，上下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，排除玻璃板之間 的氣泡。用微量進樣器按預定的次序加入適量的樣品。
電泳將電泳槽與電源連接，先以80V的電壓進行電泳，待溴酚藍前沿進入到分離膠后， 再把電壓提高到150V，直至溴酚藍到達分離膠底部，然后關(guān)閉電源。
考馬斯亮藍R250染色
(1) 染色液在90ml甲醇水(1:1， v/v)和10ml冰乙酸的混合液中溶解0. 25g考馬斯亮藍， 用濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)；
(2) 染色從電泳裝置上卸下玻璃板，小心取出凝膠，并在靠近左邊第一個上樣槽的下部 切去一角一標記凝膠的方位。用適量的染色液浸泡凝膠，放在搖床上于室溫染色2h左右；
(3) 脫色染色結(jié)束后，回收染色液以重復使用。將凝膠浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液
中，放在搖床上于室溫脫色4-8h，其間更換脫色液3-4次直到能夠區(qū)分蛋白條帶。
(4) 保存脫色完全后，將凝膠保存于含有20%甘油的水中，或先用50%乙醇浸泡，待凝膠 不再縮小時制成干膠保存。為保留永久性記錄，最好對已染色的凝膠進行拍照保存。
2.8重組蛋白可溶性分析'
誘導工程菌按照1.2.6的方法誘導
破碎取10ml誘導后的菌液，5000 r/min常溫離心5 min,收集菌體用lml 50 mmol/L PBS (pH7.4)重懸，然后用超聲破碎儀破碎細胞。采用功率水平4-5， 40-50%能率，15_20脈沖，在冰上旋轉(zhuǎn)、超聲破碎5 min。細胞破碎后以12000 r/min離心10 min，取上清于一新管，沉 淀則用lml 50mmol/LPBS (pH7.4)重懸。最后可溶上清和重懸后的沉淀各取50nl，加入50pl 2xSDS凝膠上樣緩沖液，10(TC加熱變性3min。取樣進行SDS-PAGE電泳，以分析表達產(chǎn)物的存 在狀態(tài)。
SDS-PAGE分析按照2. 7的方法進行 3.結(jié)果與分析 3. 1 HEL-75基因克隆
通過PCR直接從正常青年人附睪cDNA文庫中擴增HEL-75基因。結(jié)果顯示在250bp處有一條 特異條帶，與擬擴增的HEL-75成熟編碼區(qū)大小相同。 3.2重組工程菌株篩選
重組表達載體pET32b(+)-HEL-75轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，菌落PCR分析表明，所選的 克隆都為陽性。所得工程菌株用lmM IPTG在32。C誘導4h，然后用SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍 R-250染色檢測?？梢娪幸粭l明顯的誘導條帶產(chǎn)生，而且融合蛋白以包含體和可溶性兩種形式 存在。以上結(jié)果表明，在體外對HEL-75基因進行了成功的重組。
實施例2 rh服L-75蛋白的純化
1. 工程菌活化
取甘油管保存的工程菌接種于30ml含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)液中，37°C ， 200rpm 搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期(A550=0. 5-1. 0)。
2. 工程菌平板培養(yǎng)
取活化的工程菌在含氨節(jié)青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)板中劃線培養(yǎng)，將長有單菌落的 平板密封保存。
3. 工程菌大規(guī)模培養(yǎng)，大量表達靶蛋白
挑取工程菌菌落接種于50ml含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)液中，在37'C過夜培養(yǎng)。 取20ml過夜培養(yǎng)物接入500ml含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)液，37。C搖床培養(yǎng)至對數(shù)中 期(A550=0. 5-1. 0)。加入IPTG至終濃度為l咖ol/L， 37'C培養(yǎng)誘導表達4h。 誘導表達結(jié)束， 于4'C以6000g離心10min收集菌體。
4. 包涵體制備、洗滌與溶解
將濕菌體反復凍融3次，加30ml裂解緩沖液(50mmol/L Tris-Cl， pH8. 0， l咖ol/L EDTA， 100ramol/LNaCl)懸起菌體。冰浴條件下超聲破菌，2min/次，共7次。llOOOg， 4'C離心15min， 取沉淀。沉淀重懸于2mol/L尿素的0. lmol/L Tris (pH8. 0) 。 11000g, 4'C離心15min，取沉淀。8mol/L尿素，0.1 mol/L Tris (pH8.0)變性液溶解包涵體，加入DTT至5腦ol/L終濃度。 室溫變性40min。
20000g， 14。C離心20min，取上清。
5. 目的蛋白柱上復性及同時純化
8mol/L尿素，0.1mol/LTris (pH8. 0) ， 0. 5mol/L NaCl緩沖液平衡Chelating S印harose FF親和柱。離心上清上樣親和柱，緩沖液沖洗。50mmol/L咪唑變性狀態(tài)下洗滌親和柱。50mraol/L Tris(pH8.0)，0. 5mol/L NaCl緩沖液沖洗親和柱3個柱體積。目的蛋白柱上復性24h。 200mmol/L 咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫樣品。常規(guī)方法對親和柱進行再生處理。
6. 目的蛋白檢測
按還原與非還原SDS-PAGE電泳檢測顯示目的蛋白復性及純化效果，目的蛋白純度》93%， 目的蛋白單體率應(yīng)》70%。
實施例3蛋白質(zhì)提取物與Western blot
人附睪總蛋白抽提物按照文獻進行。每個樣品總蛋白2(^g用15MSDS-PAGE分離，然后濕轉(zhuǎn) 到PVDF膜上進行western blot。鼠抗人HEL-75多抗為一抗(1:5000) ， 二抗為HRP-標記羊抗 鼠IgG (1:500)。辣根過氧化酶的活性用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒分析。
實施例4抗HEL-75多克隆抗血清(多抗)的制備與組織免疫熒光定位 多抗用BALB/C小鼠制備。簡單地說，每只老鼠于第1天注射50嗎重組蛋白與等量的完全福 氏佐劑(CFA)。然后在第15， 30和45天注射25叫重組蛋白和等量的不完全福氏佐劑(IFA)加強 免疫。第60天從眼球取血，分離血清后用ELASA和western blot分析抗體的效價和特異性。
免疫熒光染色方法見文獻。其中一抗為鼠抗rHEL-75多抗(1:400) , 二抗為FITC-標記羊 抗鼠IgG (1:200)，細胞核用PI染色。染色后所有的切片用80%甘油封片，然后用共聚焦顯微 鏡(Leica TCS SP2 A0BS)觀察結(jié)果。實驗同時以小鼠免疫前血清替代一抗作為陰性對照。
實施例5 精子免疫熒光定位
收集精子用PBS洗滌后涂布于l。/。明膠包被的載玻片上，自然晾干，然后用甲醇固定10分鐘。 含有精子的載玻片用3MBSA在室溫下封閉1小時，然后添加鼠抗rhBD32多抗(1:200) ， 4。C過 夜。免疫前小鼠血清做陰性對照。用PBST (PBS containing 0. 1% TVeen-20)洗滌三次，加入 對應(yīng)的FITC-標記羊抗鼠IgG二抗(1:200)。載玻片用PBST洗滌三次，然后用80%甘油封片。 用01ympus BX-52顯微鏡觀察結(jié)果。實施例6細菌生長分析
分析在大腸桿菌中誘導重組蛋白的表達是否抑制宿主菌的生長。簡單地說，含重組載體
或者空載體的細菌過夜培養(yǎng)后，用LB培養(yǎng)基按照1:40接種。此時，取樣測OD600,以后每各 一個小時取樣觀察。當?shù)竭_指數(shù)生長期時，將細菌平均分成兩份。其中一份加入IPTG至終濃 度為0.1mM,另一份不加作為對照。以后每各一個小時測量各自的OD600，每次平行重復測 量三次。作為陰性對照，空白宿主菌BL21(DE3訴于檢領(lǐng)UIPTG的毒性。
實施例7 抗菌活性分析
運用克隆菌落形成單位(CFU)分析抗菌活性。簡單地說，過夜培養(yǎng)的E. coliXL-l blue生長 至U對數(shù)期(OD600 = 0.4 - 0.5)后用10mMPBS(pH7.4)稀釋。大約2xl06 CFU/ml細菌在與 12.5~100 |Jg/ml的rhBD118混合，37。C培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的15， 30, 60 and 120 min分別在取 樣。將樣品用IO mM PBS (pH 7.4)做系列稀釋，每個稀釋度取IOO pl涂布于LB瓊脂平板， 37°C培養(yǎng)過夜至形成單菌落。統(tǒng)計菌落個數(shù)，抗菌活性用細菌存活的百分數(shù)表示，公式為 %存活=(蛋白處理后存活克隆數(shù)/未經(jīng)蛋白處理后存活的克隆數(shù))xlOO。實驗以10mMPBS (pH7.4)代替蛋白處理細菌作為陰性對照。
實施例8 精子運動性與體外受精分析
利用HEL-75多抗封閉正常人精子，然后進行精子運動性和體外受精分析。實驗按照vitro life標準試劑盒提供的方法進行。簡單地說，精子先用SpermRinse-30于37。C、 5%0)2培養(yǎng) 1小時獲能。然后按照1:200加入鼠抗rHEL-75多抗，于37°C、 6% 0)2培養(yǎng)2小時進行封閉。 封閉后的精子分成兩部分， 一部分直接利用計算機輔助系統(tǒng)分析精子的運動性。另一部分用 G-Fert洗滌2次，并調(diào)整至終濃度為1. 0X107 cells/ml。加入lOOpl精子樣品于35咖的培 養(yǎng)皿中，然后覆蓋石蠟油放入37r、 6%0)2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)待用。經(jīng)G-MOPS處理后成熟 卵母細胞加入預先準備好的受精滴中，在37。C、02和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察受精情況， 每日記錄胚胎發(fā)育情況。以上所有實驗同時用免疫前小鼠血清作為陰性對照。序列表
1、 一般信息
(i )發(fā)明名稱人附睪表達的防御素基因及克隆表達與應(yīng)用 (ii)序列數(shù)目2
2、 SEQ ID N0:1的信息 (i)序列特征
(A) 長度2101
(B) 類型核酸
(C) 鏈性雙鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii )分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID N0:1: ctccattaaa ccaccaccag ctccccaagc caccccttca gccatgaagt tcctgctcct 1
ggtcttggcagccctcggattcctgacccaggtgatcccagccagtgcaggtgggtcaaa61
atgtgtgagt^ceiccccsggatactgcaggacatgttgcC3Ctgggggg3g3C3gC3tt121
gttcatgtgcaacgcttccag犯a^tgctgcatcagctactccttcctgccgaagcctga181
cct3ccacagctca/tcggtaaccactggcaatca^gg3ga241
caaacgaccgtaacatcata￡Lta￡lCC￡lCtgCt3tCgCCtCC3ccaactc3301
atttccacagttccaattcctcctacattgctgagtactagccaaggctc361
ctctttatggggcagettatctatagccaaccccaaaacttctgtcttctatcattctgtc421
attcatctagtaactaatttggagtttgtstctatcttacgagaacaatcatcatgcaga481
ttcgtccacaggggatctgtcagtttgggtcctccaaatg^3犯tgtC83g3C3g肪tt541
gg3C3tgc^aagattgactggg卿3C3Cacctctgatggacaaaggtgagacagagca601
gccacaggca鵬卿gccttcagactgcaacgctggcctgatacgtgtca幼ggag卿661
gggst卿ggaggattgaatagaagg卿cgctctaagaaagtctcagcc721
犯acagatgg3gC犯ggCttgcccctcagagg3gCtC3CgC3gggC3gg3781
atagccaggttctcatatcccaggggUcagacttggctgagaacagcccctggag犯ca841
tggggtgsctgctaccataggtctgg犯gt3tg郷Ctgttccccttgaa901
gcaagttctcttgaa已gg肌atctaaacagtgcacccccatggctgccacggagtataag961
a3gtct3ggtttggccagct鄉(xiāng)t卿ctg acttgtgagg1021
tatttatttattcatttgaggac3g犯t3catagccaccattggtagtac藤
3CCCC犯犯gc朋ggatggcatgatgctggtgactca犯cgtgcctactcatggtgtcaa1141
attggcat33tcctcttggg犯gctgtgtgga犯taagc3cag3gaagc3gaactctaat1201
tgcttaatccactaaacat tacttctgggaattggctcatcataaattatccaeig￡iga_aa1261
gC3C^3gttatgggcac犯3ggttttCC3"t at aat at tatttaaaatgctgagaaaatg1321
aaaaaat c "ta肌tggtga^teLtatatactaatgccatctat1381
tttatagaat33tgg犯cataataacat tattcaaaattgcatttatgctatagttgtca1441aaattgtctc cttatatgat acaaaactca tgaaaattat gacttttttg tttggttgga 1501
aagcagaatt atgcataaat ttcctcttac agttcgatgc ccattagttt tatataacat 1561
ttatttgaca cgtactgact tctatctgag aagaacaaac caaaacactc aggcctaaat 1621
aattaaaaac ggtcctaaaa actagcaaac cagataagaa aagatgttaa tgcccattcc 1681
ctaacttatg tcttagacca aaattaattc tagatggttt taaaatgaca gtgtaaaagt 1741
朋agt3ttaa aag8ttgtgt ggtcaaatat tcaatttaag agcaaggaaa ttcttataaa 1801
tataacaata gaggcagaac tcatgtaaga ataaattgat taggtggtat taaatattaa 1861
gttcttatgt atgtcaaaag atatcatttt gaaattcatc catcttattg ggtattgcag 1921
gagttcattc ctttttgttt ataaatactc ttccgtcata tgaatagtat tcatttgtat 1981
actggtttgt tgatggacat ttgggttgtt cccagtttat ggctattaca aataaagctt 2041
ctatgaacat ttatgtaca 2101
3、 SEQ ID NO:2的信息 (i )序列特征
(A) 長度95aa
(B) 類型氨基酸
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型多肽 (xi)序列描述SEQ ID NO:2:
MKFLLLVLAALGFLTQVIPASAGGSKCVSNTPGYCRTCCHWGETALFMCN 50 ASRKCCISYSFLPKPDLPQLIGNHWQSRRRNTQRKDKKQQTTVTS 9權(quán)利要求
1.一種人附睪表達的基因HEL-75，其特征在于，具有序列表SEQ ID NO1所示的核酸序列，其表達蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利l所述基因的表達蛋白，其特征在于，3.根據(jù)權(quán)利2所述，其特征是是一種附 睪防御素，HEL-75蛋白存在一個N-十四垸酰基化位點(G23GSKCV)和一個N-糖基化位點(N50 ASR)。另外，還可能存在四個磷酸化位點，包括一個cAMP-和cGMP-依賴型蛋白激酶磷酸化 位點(R79 RNT)以及三個蛋白激酶C磷酸化位點(S52RK, S77RR and T82QR)。而且，在 分子中還找到了一個潛在的凝固因子V LSPD重復序列(L62PKPDLPQL)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2， 3所述的HEL-75蛋白，其特征在于，該蛋白還包括SEQ ID N0: 2所示的氨 基酸序列中個別氨基酸的缺失、取代或修飾而得到的變異體或功能等同物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的基因表達蛋白，屬于人附睪特異表達的精子結(jié)合蛋白，與精子成 熟及防御功能有關(guān)。
5. HEL-75蛋白其特征在于，可以是天然分離純化的蛋白、化學合成蛋白、重組蛋白等。
6. HEL-75蛋白其特征在于，所述蛋白可采用基因工程方法制備，以含有SEQ ID N0:1編碼序 列的載體，轉(zhuǎn)化原核或真核細胞，進行HEL-75蛋白表達，表達蛋白經(jīng)親合層析方法純化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所獲得的蛋白，其特征在于，可作為免疫原制備相應(yīng)的單克隆或多克隆抗 體，用于HEL-75蛋白的檢測。可用于制備蛋白芯片、免疫檢測試劑盒等，輔助診斷不育癥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述，編碼HEL-75蛋白的基因，可用于開發(fā)新的基因芯片、核酸探針等 檢測方法，用于人類生殖醫(yī)學研究以及臨床不育癥的輔助診斷。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蛋白，是一種藥物組合物，以此作為有效活性成分，可混有一種 或多種醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑，用于生產(chǎn)一種治療不育癥或?qū)共≡⑸锔腥疽约?腫瘤等疾病的藥物。
10. HEL-75蛋白可作為一種開發(fā)新的避孕藥的靶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種人附睪特異表達的防御素基因HEL-75的核酸序列及表達蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了HEL-75蛋白的制備方法，可以通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)，也可以采用化學方法合成，；HEL-75蛋白屬于β-防御素家族的新成員，特異表達于人附睪，并結(jié)合在精子中，提示該蛋白與精子成熟及防御功能有關(guān)。HEL-75蛋白不僅可用于制備抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物，還為開發(fā)新的避孕藥、輔助診斷和治療不育癥提供新的分子靶標。HEL-75蛋白還有助于男性生殖功能研究。
文檔編號C12Q1/68GK101525615SQ20081000649
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者李建遠, 林育泉, 王海燕 申請人:李建遠