專利名稱：：檢測前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)基因slc26a4的227c＞t突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測SLC26A4突變基因的試劑盒。技術(shù)背景S丄C2d^基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且發(fā)現(xiàn)該基因突變可以導(dǎo)致一種常染色體隱性遺傳性疾病Pendred綜合征，臨床表現(xiàn)為甲狀腺腫，及合并前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或Mondini畸形(前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大合并耳蝸發(fā)育不全)的感音神經(jīng)性耳聾。后來，Usami等對(duì)6例單純前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大家系的6ZC2"4基因的篩查結(jié)果表明，該基因的突變還可以導(dǎo)致單純前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，其遺傳模式也是隱性遺傳.由此可見，^SZC2^^基因突變可以導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大——單純性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或者是合并耳蝸畸形的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大是內(nèi)耳最常見的畸形，其在遺傳性耳聾中占到18%。臨床上主要表現(xiàn)為高頻聽力損失為主的感音神經(jīng)性耳聾，聽力損失程度多表現(xiàn)為重度或者是極重度聾。發(fā)病多在兒童時(shí)期，其發(fā)病前常有感冒、發(fā)燒、外傷等使顱內(nèi)壓增高的誘因。與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)的S丄C2"4基因mRNA全長4930bp，含21個(gè)外顯子，開放閱讀框架2343bp，貫穿外顯子2和外顯子21。該基因編碼的蛋白——Pendrin是一個(gè)分子量為86kD，含780個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，屬于離子轉(zhuǎn)運(yùn)子家族。Scott和Bidart等的研究發(fā)現(xiàn)，Pendrin主要表達(dá)于甲狀腺濾泡細(xì)胞的頂膜及內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊的主細(xì)胞，介導(dǎo)碘離子和氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持甲狀腺組織和內(nèi)淋巴的離子平衡上發(fā)揮作用。在甲狀腺，當(dāng)Pendrin功能障礙時(shí)，其不能把碘離子及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到濾泡膠質(zhì)，使碘離子在濾泡細(xì)胞內(nèi)積聚，從而不能有效有機(jī)化并與甲狀腺球蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致Pendred綜合征中甲狀腺腫的發(fā)生。Qvortrup等認(rèn)為，大鼠的內(nèi)淋巴囊類似甲狀腺濾泡，有平衡膠狀物質(zhì)填塞囊腔，內(nèi)淋巴囊主細(xì)胞的功能類似于甲狀腺濾泡細(xì)胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白質(zhì)。氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙使內(nèi)淋巴液的成分改變，從而損傷感覺上皮細(xì)胞，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。并且由于滲透壓改變和成分改變的毒性機(jī)制導(dǎo)致膜迷路結(jié)構(gòu)改變。由于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊到4歲時(shí)才停止發(fā)育，因此它們的擴(kuò)大可以導(dǎo)致周圍骨性結(jié)構(gòu)的改變，例如前庭導(dǎo)水管或耳蝸結(jié)構(gòu)的改變。對(duì)于前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者5ZC2d^基因突變的篩查，國外已經(jīng)廣泛開展，報(bào)道的致病突變位點(diǎn)超過100個(gè)，包括錯(cuò)義突變、框移突變、無義突變及剪接位點(diǎn)突變，分布于各個(gè)外顯子。5ZC7似4基因具有明顯的異質(zhì)性，不同種族其突變形式不完全相同。該基因突變后其編碼的蛋白不能準(zhǔn)確定位到細(xì)胞膜上，而是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者是高爾基體內(nèi)，影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者5XC2"4基因突變的發(fā)現(xiàn)，不僅會(huì)促進(jìn)該病的發(fā)病機(jī)理等基礎(chǔ)研究的發(fā)展，還將大大促進(jìn)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的基因診斷和治療的開展。通過產(chǎn)前診斷篩査及新生兒5XC2M4基因突變的普遍篩査，可以降低前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患兒的出生率，并且實(shí)現(xiàn)癥前診斷，從而指導(dǎo)攜帶致病基因的患兒的行為，預(yù)防疾病的發(fā)生，這將會(huì)大大減少耳聾患者的數(shù)量，減輕社會(huì)壓力。未來的研究將致力于基因治療方面，能夠預(yù)見，基因治療將會(huì)給包括耳聾在內(nèi)的各種遺傳性疾病的治療帶來質(zhì)的飛躍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供診斷前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的方法，其通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在具有本發(fā)明所述突變形式的SZT2^^突變基因而判斷患者前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大癥的發(fā)生和類型，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于檢測來自待測個(gè)體的樣本是否存在基因突變的試劑盒。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供6XC26y^突變基因在診斷和/或治療前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)疾病中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病相關(guān)基因的檢測方法。該檢測方法通過檢測來自待測個(gè)體的樣本中是否存在S丄C2M4基因突變，而診斷該待測個(gè)體中前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病的發(fā)生和類型，其中所述的MCm^基因突變位于MC76^基因外顯子2的109G>T雜合突變、位于S丄C2M4基因外顯子4的3340T雜合突變、位于S丄C7d44基因外顯子5的589G>A雜合突變、位于5ZC2似4基因外顯子4的387delC雜合突變、位于見C26W基因外顯子6的611G>T雜合突變、位于^C26W基因外顯子7的812A>G雜合突變、位于見C26^/基因外顯子10的1175A>G雜合突變、位于見C2似4基因外顯子13的1540OT雜合突變、位于SLC2^^基因外顯子16的1746delG雜合突變、位于5ZCM^基因外顯子18的2054G>T突變、位于5ZC2"4基因外顯子3的2810T雜合突變、位于aCM^基因外顯子14的1586T>G突變或位于5XC26^基因外顯子3的2270T雜合突變。所述檢測方法可包括下述步驟1)采集待測個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA;2)以該DNA為模板，以針對(duì)MC2"4基因所述各突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序分析，將所得到的序列與MC2^44正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在5ZC2M4基因的所述突變位點(diǎn)；4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測個(gè)體是否為6ZC26^基因突變導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。所述檢測方法可進(jìn)一步包括下述步驟5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在下述氨基酸突變位點(diǎn)E37X、P112S、G197R、X144、G204V、D271G、N392S、Q514X、X585、R685I、T94I、I529S或P76L。以下，具體說明MC76^基因2270T雜合突變的檢測方法通過對(duì)89例前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的家系成員及80名正常聽力的對(duì)照組成員的5XC26^/基因進(jìn)行篩査，發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的患兒及其父親具有5ZC26^/基因新的突變位點(diǎn)(227C>T，P76L)。這一突變位點(diǎn)位于Pendrin的氨基末端，使76位的脯氨酸變成了亮氨酸。其氨基酸序列與大鼠小鼠同源序列的進(jìn)化研究結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)具有高度保守性(圖11)。80名正常人的篩査中未檢測到該突變，說明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)。圖6為SiX2^^編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照?qǐng)D，突變位于第227位堿基，對(duì)應(yīng)于第76位的氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼帷endrin的結(jié)構(gòu)示意圖見圖7，第76位氮基酸位于Pendrin的氨基末端。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，檢測待測個(gè)體的樣本中是否存在S丄C2644基因2270T雜合突變的方法，包括下述步驟1)采集待測個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA;2)以該DNA為模板，以下列PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；PDS3-F:5,-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，PDS3-R:5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3'3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將測序結(jié)果與MC2"4正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在5XC2似4基因的2270T突變位點(diǎn)；4)根據(jù)以上結(jié)果判斷該待測個(gè)體是否存在6XC26v^基因2270T突變。進(jìn)一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在P76L氨基酸突變位點(diǎn)。在上述針對(duì)SZT2^^基因各突變位點(diǎn)的檢測方法中，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物還可以用變性高效液相色譜(DHPLC)或雜交探針等方法來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的5XC7^44核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補(bǔ)序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記，尤其是可利用等位基因特異探針，以篩査是否存在已被確定的突變。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測來自待測個(gè)體的樣本是否存在5ZC2^^基因突變的試劑盒，試劑盒中可以包含以下幾種試劑的一種或幾種的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；用于擴(kuò)增樣本DNA中S丄C2^44基因下述突變位點(diǎn)的PCR引物及相應(yīng)的PCR反應(yīng)試劑位于5ZC2M4基因外顯子2的109G>T雜合突變、位于5ZC2M4基因外顯子4的3340T雜合突變、位于見C2M4基因外顯子5的589G>A雜合突變、位于5ZC2^^基因外顯子4的387ddC雜合突變、位于5ZC2(5^基因外顯子6的611G>T雜合突變、位于S丄C26^基因外顯子7的812A>G雜合突變、位于5ZC2(1^基因外顯子10的1175A〉G雜合突變、位于SZT2"4基因外顯子13的1540OT雜合突變、位于5ZC2似4基因外顯子16的1746ddG雜合突變、位于SLC2"4基因外顯子18的2054G〉T突變、位于見C2d^基因外顯子3的2810T雜合突變、位于S丄C7M4基因外顯子14的1586T〉G突變或位于S丄C2^^基因外顯子3的2270T雜合突變。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的試劑；和/或?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的試劑。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供一個(gè)檢測S丄C2^44基因所述突變的試劑盒，容器內(nèi)裝有用以檢測&LC2d44基因所述突變的成分，與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴(kuò)增后，直接檢測樣品中5ZC2(W4基因所述突變位點(diǎn)的試劑盒，可含有擴(kuò)增引物、dNTP、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液、酶切反應(yīng)和/或測序反應(yīng)所需試劑等的一種或多種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一對(duì)PDS-F和PDS-R引物，所述的用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(1)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對(duì)PDS-F和PDS-R引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(2)酶切反應(yīng)進(jìn)行突變檢測；和/或(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較確定突變位點(diǎn)的存在；(4)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在所述氨基酸突變位點(diǎn)。該試劑盒可簡便快捷地檢測S丄C2d44基因的所述突變位點(diǎn)，從而應(yīng)用于前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大病例的突變檢測及其診斷治療。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了見C2"4突變基因在診斷和/或治療前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大中的應(yīng)用，通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在S丄C2^^基因的所述突變而判斷該患者的耳聾發(fā)生原因及類型，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考；此外，在進(jìn)一步的臨床治療方面，在檢測結(jié)果為發(fā)生了5ZC24^基因的所述突變之后，可以將正?；?qū)霐y帶突變基因的細(xì)胞并在其中表達(dá)，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進(jìn)行基因治療。本發(fā)明首次提供了在中國人群中存在S丄C2^^基因的所述十三種突變，并且說明該突變基因與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)。同時(shí)，本發(fā)明提出了通過檢測患者中是否存在5XC2^44基因突變而判斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測方法，這將有利于在臨床上開展耳聾患者的5XC2^^突變篩查工作，為耳聾患者提供診斷和治療服務(wù)。下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的說明，詳細(xì)描述但不限制本發(fā)明。附圖簡要說明圖15為關(guān)于S丄C^W基因109G〉T雜合突變的附圖圖1為MC2"4編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照突變位于第109個(gè)堿基，對(duì)應(yīng)于第37位的氨基酸變?yōu)榉g終止信號(hào)(灰色標(biāo)記的是突變的堿基和氨基酸)，其后的氨基酸序列用下劃線標(biāo)記，此段氨基酸序列缺失；圖2為Pendrin的結(jié)構(gòu)示意圖，星號(hào)示出第37位氨基酸所在位置，發(fā)生E37X突變后，其后氨基酸序列缺失；圖3為本發(fā)明見C2M4基因109G〉T雜合突變檢測方法中PCR反應(yīng)過程示意圖，示出了反應(yīng)溫度和時(shí)間；圖4為本發(fā)明6ZC2"4基因109G〉T雜合突變檢測方法中，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置；圖5為本發(fā)明方法5ZC26^基因外顯子2的部分測序結(jié)果，上方為正常對(duì)照序列，下方為突變序列，箭頭所指為突變位點(diǎn)(109G〉T,E37X);圖611為關(guān)于見C2^^基因2270T雜合突變的附圖圖6為S丄C2^^編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照突變位于第227位堿基，對(duì)應(yīng)于第76位的氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?灰色標(biāo)記的是突變的堿基和氨基酸)；圖7為Pendrin的結(jié)構(gòu)示意圖，星號(hào)示出第76位氨基酸所在位置，其位于Pendrin的羧基末端；圖8為本發(fā)明MC2^^基因2270T雜合突變檢測方法中PCR反應(yīng)過程示意圖，示出了反應(yīng)溫度和時(shí)間；圖9為本發(fā)明5ZC2^^基因2270T雜合突變檢測方法中，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置；圖10為本發(fā)明方法S丄C2^44基因外顯子3的部分測序結(jié)果，上方為正常對(duì)照序列，下方為突變序列，箭頭所指為突變位點(diǎn)(227C〉T，P76L);圖11為不同物種Pendrin氨基酸序列進(jìn)化研究，通過對(duì)不同物種氨基酸序列比對(duì)(箭頭所指為P76L位點(diǎn))，可見不同物種的Pendrin在該位點(diǎn)均為脯氨酸(P)，說明P76L突變位于保守區(qū)域。發(fā)明的具體實(shí)施方式本發(fā)明所用試驗(yàn)材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。本發(fā)明研究過程通過聾病門診收集前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者，在患者及其家屬自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，建立門診病歷資料庫，詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后，應(yīng)用酚氯仿抽提方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20°(3保存，每份DNA樣品均準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)于登記的患者臨床資料。然后，根據(jù)Coyle等的文獻(xiàn)所描述設(shè)計(jì)引物，部分利用PrimerPremier5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，包含MC2^^基因編碼區(qū)及其側(cè)翼序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序測序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，應(yīng)用ABI公司3730DNA測序儀進(jìn)行正反向測序。將得到的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，確定S丄C2(1^突變位點(diǎn)。針對(duì)S丄C2^^基因的某些突變位點(diǎn)，對(duì)PCR產(chǎn)物還可選擇性的進(jìn)行酶切反應(yīng)應(yīng)用特定的限制性內(nèi)切酶可將正常人PCR產(chǎn)物切成兩個(gè)片段，而出現(xiàn)突變后，酶切位點(diǎn)消失，不能切開。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定5XC2d^基因的突變位點(diǎn)。SJLC2fe44基因109G>T雜合突變的檢測以前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的病人作為研究對(duì)象，通過對(duì)89例該病家系成員及80例正常對(duì)照的S丄C2d^基因的編碼區(qū)各外顯子的篩查，發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者在外顯子2上具有S丄C26^基因新的突變(109G>T，E37X)。該患者為一復(fù)合雜合子，符合常染色體隱性遺傳的模式，其SZC2d^的等位基因存在另一個(gè)突變。這一突變位點(diǎn)在80名對(duì)照組中均沒被發(fā)現(xiàn)，說明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大共分離。實(shí)施例1S丄C2"4基因109G>T雜合突變的檢測方法一、待測對(duì)象血樣DNA的制備1、研究對(duì)象聾病門診收集的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的患者89例，正常對(duì)照80例。對(duì)所有參加者詳細(xì)調(diào)查其病史以及家族史，并對(duì)其進(jìn)行體格檢査，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學(xué)評(píng)估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5誦10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天1)抗凝血用PBS作1倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18°C-28°C)，上面鋪一層1倍體積己稀釋的血液，室溫1000xg，離心20分鐘。3)吸棄上清，小心吸出中間有核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入5mlEp管中，5000xg，離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000xg，離心10分鐘。4)將細(xì)胞懸于2mlTE緩沖液中，力卩10%的SDS至終濃度0.5%(lOOjil)，蛋白激酶k100-200|ig/ml(10mg/ml)，50。C水浴3-5小時(shí)。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000xg,離心IO分鐘。6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000xg，離心IO分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2.5倍體積的無水乙醇。10)-20。C沉淀DNA過夜。第二天11)高速離心，10000xg，IO分鐘，4°C。12)棄上清，加入75。/。乙醇2ml，高速離心10000xg，5分鐘。13)棄上清，吹干。14)用TE緩沖液溶解(200^1TE/5ml全血，400(ilTE/10ml全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)定量。二、5ZC2(1^基因外顯子4的PCR擴(kuò)增1、引物序列上游引物PDS2-F:5，-CAGGACGCGGACCAGACT畫3'(nt864-nt881)下游引物PDS2-R:5，-CGAGACTGATGGAGCCACCCTC畫3'(ntl350-nt1371)注見C2^^基因序列檢索號(hào)GenelD:51722、PCR反應(yīng)體系的建立見C2^(4基因的PCR反應(yīng)體系的組成見表1。表15ZC2^^基因的PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中緩沖液、dNTP、Taq酶從寶生物公司購得。引物由上海生工公司合成。反應(yīng)條件PCR反應(yīng)在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)過程(包括溫度和時(shí)間)如圖3所示。三、PCR產(chǎn)物的純化1、向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50pl無菌水，混勻。2、將其轉(zhuǎn)移到Millipore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒有水即可。3、純化板中再次加入50pl的去離子水，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。4、將純化板從真空泵上取下，向板中加入2(Hil的去離子水，靜止15分鐘，再震蕩15分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。5、保存在-2(TC冰箱中。四、電泳定量1、樣品準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物(2pl)+上樣緩沖液(6^1)共8^1x96取一96孔點(diǎn)樣板，每孔先加上樣緩沖液6^1，在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中，每孔用排槍移出PCR產(chǎn)物(2|iO，轉(zhuǎn)移到點(diǎn)樣板上、混勻、離心(腔板孔號(hào)要與96孔點(diǎn)樣板一一對(duì)應(yīng))。2、流程1)配膠(1.0%瓊脂糖)稱取3.0g瓊脂糖，懸浮于300ml0.5xTBE中(500ml錐形瓶)。2)溶膠微波爐中高火加熱至沸，持續(xù)沸騰數(shù)分鐘，注意不要沸出，其間取出混勻。3)涼膠待膠完全溶解，從微波爐中取出，涼至60。C左右，加入l滴EB(約lOpUOmg/ml)，搖勻。4)鋪膠平板兩端用膠布封嚴(yán)，把250ml膠液全部倒入平板，插入梳尺。5)上膠將平板放入已盛有電泳液(0.5xTBE，液面距膠面l至2mm)的電泳槽中，拔下梳尺。6)加樣用排槍按規(guī)定格式加樣，最后用單槍加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品。7)走膠蓋上電泳槽蓋，檢査正負(fù)級(jí)，開啟電泳儀，調(diào)節(jié)電泳電壓。8)定量當(dāng)溴酚藍(lán)走離加樣孔1.5至2cm處，關(guān)閉電泳儀，小心取膠，放入攝相儀照相，進(jìn)行定量。定量marker為DL2000，如圖4所示，經(jīng)過電泳后，有6條帶可見，片段長度分別是2000bp，1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，DL2000的總濃度是300ng/5ixl。電泳時(shí)取5ulDL2000，因此每條帶的含量為50ng。PCR產(chǎn)物電泳時(shí)取3)al(PCR產(chǎn)物)+5)^1(上樣緩沖液)進(jìn)行電泳。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳后的灰度值與DL2000的灰度值的比較判斷PCR產(chǎn)物的含量。五、5XC2M4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序1、PCR產(chǎn)物DNA模板的純度與用量要求DNA純度OD260/OD280=1.62.0。DNA濃度PCR產(chǎn)物10ng/fiL。DNA用量PCR產(chǎn)物100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng>2000bp40-100ng2、測序反應(yīng)(1)測序反應(yīng)所需試劑應(yīng)為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測序反應(yīng)所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應(yīng)為潔凈無菌的。(2)為了保證測序樣本及反應(yīng)試劑的新鮮，加樣時(shí)應(yīng)在冰上操作。(3)目前的反應(yīng)體系為5W，各種試劑加入量見表2。表2S丄C76y^基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用無菌水補(bǔ)至5pl*BigDye3.1為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的一種用于測序反應(yīng)的熒光染料。(4)樣品放于PCR儀上，所做反應(yīng)的過程見表3。表3S丄C76^/基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序反應(yīng)過程<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>過一天以上才能純化的樣品放置于-2(TC冰箱冷凍。3、測序反應(yīng)物的純化和測序(1)向每孔中加入20(il80。/。乙醇，4000rpm離心30min;將樣品板放在折好的紙巾上，在離心機(jī)中倒甩，倒甩時(shí)速率不能超過1000rpm;(2)在每孔中加入30^170%乙醇，4，000rpm離心10min，倒甩;(3)重復(fù)第2步的操作；(4)重復(fù)第2步的操作；(5)將樣品板放于干凈的抽屜中，避光干燥30min;(6)加入5pl甲酰胺，封膜，離心后置于-2(TC冰箱中；(7)上機(jī)器前95。C變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后上樣。測序圖如圖5所示。實(shí)施例2突變位點(diǎn)進(jìn)化研究突變分析應(yīng)用DNAStar5.0(LasergeneInc.)軟件包中的SeqmanTM軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。將測序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，找出突變序列，發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)(109G>T，E37X)。進(jìn)化研究109G>T突變位于Pendrin的氨基末端，其使氨基酸編碼終止于37位，其后的734個(gè)氨基酸丟失。該突變必定影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能。5XC7W基因227QT雜合突變的檢測以前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的病人作為研究對(duì)象，通過對(duì)89例該病家系成員及80例正常對(duì)照的S丄C26v^基因的編碼區(qū)各外顯子的篩査，發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者在外顯子3上具有5ZC7d^基因新的突變位點(diǎn)(227C>T，P76L)。該患者為一復(fù)合雜合子，符合常染色體隱性遺傳的模式，其5ZC2"4的等位基因存在另一個(gè)突變?；颊叩母赣H為2270T(P76L)突變的攜帶者。這一突變位點(diǎn)在80名對(duì)照組中均沒被發(fā)現(xiàn)，說明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大共分離。實(shí)施例3M04^基因227OT雜合突變的檢測方法基本方法和步驟參見實(shí)施例l，其中針對(duì)5XC2"4基因外顯子3的PCR擴(kuò)增使用如下引物上游引物.-PDS3-F:5'-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，(nt2497-nt2516)下游引物PDS3-R:5，畫AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3'(nt2876-nt2896)注5XC2^^基因序列檢索號(hào)GenelD:5172PCR反應(yīng)體系如圖8所示；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖9;測序圖如圖10。實(shí)施例4突變位點(diǎn)進(jìn)化研究突變分析應(yīng)用DNAStar5.0(LasergeneInc.)軟件包中的SeqmanTM軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。將測序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，找出突變序列，發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)(227C>T，P76L)。進(jìn)化研究2270T突變位于Pendrin的羧基末端，使非極性疏水脯氨酸變成了非極性疏水的亮氨酸，人類Pendrin序列與大鼠和小鼠同源氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，該突變位于保守區(qū)(圖ll)。檢測前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)的基因突變的試劑盒及其應(yīng)用實(shí)施例5檢測SZT26^/基因突變的試劑盒可以根據(jù)需要制備成檢測各單一突變位點(diǎn)的單獨(dú)的試劑盒，也可以制備成檢測多個(gè)或所有SZT2^44基因突變位點(diǎn)的試劑盒，下面以檢測本發(fā)明的11個(gè)突變位點(diǎn)的試劑盒為例進(jìn)行說明1、試劑盒含有(O擴(kuò)增用引物前述為檢測SLC26A4基因的13個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的11對(duì)引物，或者其他可使用的針對(duì)該13個(gè)突變基因設(shè)計(jì)的引物；注SLC26A4基因序列檢索號(hào)GenelD:5172其他可選地包含在試劑盒中的試劑包括下述試劑(2)PCR擴(kuò)增用Taq酶5U/pl(3)10x緩沖液(含15mlMgCl2)(4)dNTP2.5mM(5)Scal限制性內(nèi)切酶；EcoRV限制性內(nèi)切酶；(6)10xLBuffer(7)Big-Dyemix2、使用方法主要包括如下步驟1)PCR擴(kuò)增采集待測個(gè)體的樣本(血液、體液、組織等)，提取DNA，用上述針對(duì)各突變基因的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)PCR產(chǎn)物純化將含有PCR產(chǎn)物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去離子水，靜置，隨后將MultiScreen-PCR板置于混合器上震蕩，純化后的PCR產(chǎn)物重新溶解后轉(zhuǎn)移至另一潔凈的96孔板中；3)測序反應(yīng)及驗(yàn)證將上述擴(kuò)增的針對(duì)各突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物以PCR引物作為測序引物進(jìn)行測序反應(yīng)，在ABI9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，延伸產(chǎn)物上樣于ABIPRISM3730DNA序列分析儀。將所得到的測序圖譜進(jìn)行分析，與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較可以發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)；4)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在相應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)。具體方法參見前面實(shí)施例中的詳細(xì)描述。以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。權(quán)利要求1、一種用于檢測是否存在SLC26A4基因外顯子3的227C＞T雜合突變的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增樣本DNA中SLC26A4基因外顯子3的第227位堿基的PCR引物；以及下述一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；相應(yīng)的PCR反應(yīng)試劑；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的試劑。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的PCR引物為PDS3-F:5，畫GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3'PDS3匿R:5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA國3,。3、如權(quán)利要求l所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測位于SLC26A4基因外顯子3的2270T雜合突變的步驟包括1)采集待測個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA;2)以該DNA為模板，以下列PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；PDS3-F:5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3'PDS3-R:5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3'3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將測序結(jié)果與SLC26A4正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在SLC26A4基因的227C>T突變位點(diǎn)。4、如權(quán)利要求3所述試劑盒，所述步驟還進(jìn)一步包括4)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定是否存在P76L氨基酸突變位點(diǎn)。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測方法，通過檢測來自待測個(gè)體的樣本中是否存在SLC26A4基因突變，而診斷該待測個(gè)體中前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病的發(fā)生和類型，其中所述的SLC26A4基因突變?yōu)槲挥赟LC26A4基因外顯子3的227C＞T雜合突變。本發(fā)明還涉及一種用于檢測來自待測個(gè)體的樣本是否存在SLC26A4基因突變的檢測試劑盒，以及SLC26A4基因突變?cè)谠\斷和/或治療與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)疾病中的應(yīng)用。該基因突變和檢測方法將有利于臨床上開展耳聾患者的SLC26A4基因突變篩查工作，為耳聾患者的診斷和治療提供服務(wù)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101240339SQ20081000639公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2005年12月22日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者王秋菊,趙亞麗申請(qǐng)人:中國人民解放軍總醫(yī)院