專利名稱：：纖維蛋白溶解活性多肽的制作方法纖維蛋白溶解活性多肽本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申"i青的申請(qǐng)日為2000年9月29日，申請(qǐng)?zhí)枮?0816321.9(PCT7US00/27029)，發(fā)明名稱為"纖維蛋白溶解活性多肽"。發(fā)明領(lǐng)城本發(fā)明涉及一種具有非天然存在序列的纖維蛋白溶解活性金屬蛋白酶及其生產(chǎn)的組合方法，和其在體內(nèi)治療血栓形成方面的應(yīng)用。發(fā)明背景fibrolase是一種由203個(gè)氨基酸殘基組成的酶活性多肽(具體地說，是一種金屬蛋白酶)，該酶最初是由南方銅頭蛇(SouthernCopperheadsnake)的毒液純化分離的；1986年9月9日授予的美國(guó)專利第4,610,879號(hào)(Markland等)；和Guan等，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,第289巻，第2期，第197-207頁(yè)(1991)。此酶顯示出直接的纖維蛋白溶解活性、而沖及少或沒有出血活性。它溶解或者由纖維蛋白原構(gòu)成的血凝塊或者由全血構(gòu)成的血凝塊。也已經(jīng)測(cè)定了fibrolase的氨基酸序列，也有關(guān)于其酵母重組生產(chǎn)方法的描述和其在體內(nèi)治療血栓形成性病癥的應(yīng)用；Randolph等,ProteinScience,CambridgeUniversityPress(1992)，第590-600頁(yè),和于1989年7月12日公布的歐洲專利申請(qǐng)第0323722號(hào)(Vale腿ela等)。發(fā)明概要本發(fā)明提供了一種纖維蛋白溶解性金屬蛋白酶，該蛋白酶具有SEQIDNO:l中所示的非天然存在的線性排列的氨基酸，在此也稱為"新型作用血栓溶解性劑(novelactingthrombolytic)"(或"NAT")。也提供了編碼NAT的核酸分子(諸如SEQIDNO:2之一)及其變異體。"成熟，，一詞以其通常含義使用，是指在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了原位的酶加工、從前原區(qū)切割下生物活性多肽。NAT因其具有纖維蛋白'容解活性，用作血凝塊的體內(nèi)溶解劑，來治療哺乳動(dòng)物(包括大鼠、豬和人類)的血栓形成。本發(fā)明所述NAT多肽作為治療劑，提供優(yōu)于天然存在的fibrolase(即在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白溶解性多肽)的優(yōu)勢(shì)。已知天然fibrolase含有幾種可變的N-末端QQRFP、EQRFP和ERFP(其中"E"表示環(huán)化谷氨酰胺或焦谷氨酸)。更具體地說，從由QQRFP組成的N-末端開始，所述fibrolase分子經(jīng)過降解，產(chǎn)生分別具有EQRFP和ERFP的N-末端序列的兩個(gè)同種型。由酵母產(chǎn)生的重組fibrolase—般產(chǎn)生所有這3種形式的混合物，因而是不均一的。參見Loayza等，JournalofChromatography,B662，第227-243頁(yè)(1994)。此外，所述環(huán)化谷氨酰胺殘基導(dǎo)致N-末端被封閉，這使得不可能進(jìn)行測(cè)序。相反，本發(fā)明所述重組NAT提供單一的種類一般僅產(chǎn)生一種N末端。其結(jié)果是，終產(chǎn)物與重組fibrolase相比更均一，這在醫(yī)學(xué)應(yīng)用是計(jì)劃的最終用途時(shí)是很有益的。附圖簡(jiǎn)述圖1以線性方式顯示NAT的完整氨基酸序列(SEQIDNO:3)，所述氨基酸序列由前原區(qū)(下劃線)和成熟多肽(無下劃線)組成，在前原區(qū)中包括"信號(hào)"肽。發(fā)明詳述NAT可通過在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)SEQIDNO:4的核酸分子而產(chǎn)生，該核酸分子編碼NAT的完整氨基酸序列(SEQIDNO:3)，包括來自核苷酸1-783的前原區(qū)和來自核苷酸784-1386的成熟多肽。在表達(dá)后，所述前原區(qū)在宿主細(xì)胞中被酶加工切掉，產(chǎn)生成熟活性多肽(SEQIDNO:1)。NAT最好是由重組酵母產(chǎn)生，其原因在后面將會(huì)更詳細(xì)地解釋。如此產(chǎn)生的成熟多肽(SEQIDNO:l)可能有或沒有氨基末端曱硫氨酸，這取決于其制備方式。一般來說，當(dāng)所述多肽是由非分泌型細(xì)菌(如大腸桿菌)菌抹作為宿主重組產(chǎn)生時(shí)，就會(huì)有一個(gè)氨基末端曱硫氨酸殘基。除了SEQIDNO:2的核酸分子外，編碼相同多肽的其簡(jiǎn)并序列也可采用。本發(fā)明也包含可以在所述成熟多肽編碼區(qū)5'或3，部分側(cè)翼編碼額外氨基酸殘基的核酸分子，所述額外氨基酸殘基諸如編碼取代天然前/原區(qū)(即在天然存在的fibrolase上所發(fā)現(xiàn)的)的替代前/原區(qū)的序列(即負(fù)責(zé)通過細(xì)胞膜分泌所述多肽的序列)。所述額外序列也可以是非編碼序列，包括轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子的，這取決于宿主細(xì)胞。采用眾所周知的重組DNA技術(shù)，可以制備NAT，所述重組DNA技術(shù)在以下文獻(xiàn)中有描述Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbo—rLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)和/或Ausubel等,編輯，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishersInc.andWileyandSons,NewYork(1994)?？色@得編碼所述多肽或其截短形式的DNA分子，例如，通過篩選基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，或通過PCR擴(kuò)增，來獲得編碼fibrolase的核酸分子，然后，用絲氨酸的密碼子取代編碼N-末端氨基酸殘基QQR的密碼子。另一方面，可通過用專業(yè)人士所熟知的方法化學(xué)合成，來制備編碼NAT的DNA分子，所述方法例如為Engels等，Angew.Chem.Intl.Ed.,第28巻，第716-734頁(yè)(1989)所述的方法。通常，所述DNA的長(zhǎng)度會(huì)有幾百個(gè)核苷酸。超過約一百個(gè)核苷酸的核酸可采用這些相同的技術(shù)，作為幾個(gè)片段合成，再將所述片段連接起來，形成一個(gè)所需長(zhǎng)度的核苷酸序列。將所述DNA分子插入到合適的表達(dá)載體上，在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。選擇在所用的特定宿主細(xì)胞中具有功能的載體(即該載體與所述宿主細(xì)胞機(jī)制是相容的，使得可以發(fā)生所述DNA的表達(dá))。所述多肽可以在原核、酵母、昆蟲(桿狀病毒系統(tǒng))或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，其中優(yōu)選酵母，其原因?qū)⒃诤竺娓敿?xì)地解釋。用于在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)NAT的載體，也可含有一個(gè)5'側(cè)翼序列(也稱為"啟動(dòng)子")和有效連接于待表達(dá)DNA上的其他表達(dá)調(diào)節(jié)元件、以及一個(gè)增強(qiáng)子、一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)元件、一個(gè)轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)元件、一個(gè)包含一個(gè)供體和受體剪接位點(diǎn)的完整的內(nèi)含子序列、一個(gè)信號(hào)肽序列、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)元件、一個(gè)聚腺苷酸化序列、一個(gè)用于插入編碼NAT的核酸序列的多接頭區(qū)和一個(gè)選擇性標(biāo)記元件。這些元件中的每種在下面還要討論的?？扇芜x的是，所述載體還包含一個(gè)"標(biāo)記"序列，例如，位于所述多肽編碼序列的5，或3'端、編碼多聚組氨酸(如六聚組氨酸(hexaHis))或其他小的免疫原性序列(例如c-myc或血凝素表位，其抗體包括單克隆抗體已有市售)的寡核苷酸序列。這種標(biāo)記將和NAT—起表達(dá)，可以用作從宿主細(xì)胞中純化該多肽的一種親和標(biāo)記?？扇芜x的是，該標(biāo)記在其后可以采用不同方法，例如用選擇性肽酶，從純化的多肽中除去。所述5'側(cè)翼序列可以是天然的5'側(cè)翼序列，或可以是同源的(即來源于與宿主細(xì)胞相同的物種和/或^^朱系)、異源的(即來源于與宿主細(xì)胞不同的物種或抹系)、雜種的(即來自不止一個(gè)來源的5，側(cè)翼序列的組合)、或合成的。該5'側(cè)翼序列的來源可以是任何單細(xì)胞原核生物或真核生物、任何脊推動(dòng)物或無脊推動(dòng)物、或任何植物，條件是該5，側(cè)翼序列在所述宿主細(xì)胞中是有功能的，并且可被該宿主細(xì)胞的機(jī)制所活化。所述復(fù)制起點(diǎn)元件通常是從市場(chǎng)上購(gòu)來的原核表達(dá)載體的一部分，幫助載體在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增。在某些情況下，所述載體擴(kuò)增到一定的拷貝數(shù)，對(duì)于NAT的最佳表達(dá)是很重要的。如果所選用的載體不含復(fù)制起點(diǎn)，則可以按照已知的序列化學(xué)合成復(fù)制起點(diǎn)，然后將其連接到該載體上。所述轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)元件通常位于所述多肽編碼序列的3'端，其作用是終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。通常，在原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止元件是一個(gè)富含G-C的片段，接著是一個(gè)多聚T序列。雖然該元件容易從文庫(kù)中克隆得到，或者甚至作為載體的一部分從市場(chǎng)上購(gòu)買到，但它也可以用已知的核酸合成方法容易地合成。選擇性標(biāo)記基因元件編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。通常，選擇性標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)(a)使宿主細(xì)胞對(duì)抗生素或其他毒素具有抗性，所述抗生素或毒素例如對(duì)于原核宿主細(xì)胞為氨節(jié)青霉素、四環(huán)素或卡那霉素，對(duì)于酵母宿主細(xì)胞為zeocin,對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞為新霉素；(b)對(duì)該細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)；或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能提供的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。用于原核表達(dá)的優(yōu)選選擇性標(biāo)記是卡那霉素抗性基因、氨千青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。所述核糖體結(jié)合元件通常叫估支Shine-Dalgamo序列(對(duì)于原核生物而言)或Kozak序列(對(duì)于真核生物而言)，對(duì)mRNA的翻譯起始是必需的。該元件通常位于啟動(dòng)子的3'端和待合成多肽編碼序列的5，端。Shine-Dalgamo序列是各不相同的，但通常是多聚噤呤(即A-G含量高)。許多Shine-Dalgamo序列已被鑒別，每種序列均可采用上面提到的方法容易地合成并用于原核載體中。Kozak序列通常包括緊接在起始密碼子之前和之后的序列。優(yōu)選的Kozak序列是與在AUG起始密碼子高效翻譯起始有關(guān)的序列。在希望NAT多肽從宿主細(xì)胞內(nèi)分泌出來的情況下，可采用一個(gè)信號(hào)序列，來指導(dǎo)該多肽從合成所述多肽的宿主細(xì)胞中分泌出來。通常，所述信號(hào)序列位于核酸序列的編碼區(qū)中，或直接位于編碼區(qū)的5，端。許多信號(hào)序列已被鑒定，可以使用它們中的在所選宿主細(xì)胞中有功能的任一種。因此，該信號(hào)序列可以與所述多肽是同源的或異源的。此外，該信號(hào)序列可以采用上面提到的方法來化學(xué)合成。當(dāng)所述載體構(gòu)建好后，將一種核酸插入該載體的合適位點(diǎn)，制備好的載體可插入到合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。如上所述，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或脊推動(dòng)物細(xì)胞)。該宿主細(xì)胞，無論是酵母還是某一其他宿主，當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)時(shí)都可以合成NAT，隨后從培養(yǎng)基中收集NAT(如果該宿主細(xì)胞將其分泌至培養(yǎng)基中的話)，或直接從生產(chǎn)NAT的宿主細(xì)胞中收集(如果它不被分泌)。收集后，可以采用分子篩色譜、親和色譜和類似方法純化NAT多肽。對(duì)宿主細(xì)胞的選擇，在很大程度上取決于宿主細(xì)胞是否能將NAT"折疊"成它天然的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，二硫橋合適的定向等)，從而使這些細(xì)胞制備出生物活性材料。但是，即使在宿主細(xì)胞不合成生物活性材料時(shí)，也可以在合成后，采用合適的化學(xué)條件，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適化學(xué)條件，對(duì)它進(jìn)行"折疊"。在以上兩種情況下，根據(jù)獲得生物活性材料的事實(shí)，可以推斷出進(jìn)行了正確折疊。合適的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)或3T3細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)、純化的方法，是本領(lǐng)域人員已知的。其它合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系有猴COS-l和COS-7細(xì)胞系和CV-1細(xì)胞系。其它示范性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括靈長(zhǎng)類細(xì)胞系和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系，包括已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。正常的二倍體細(xì)胞、來源于原代組織體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株以及原代外植體也適用。候選細(xì)胞可以在選定的基因上是基因型缺陷的，或是包含一個(gè)顯性作用選擇基因。其它合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括但不限于HeLa細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、來源于Swiss的3T3細(xì)胞系、Balb-c或MH小鼠、BHK或HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系。細(xì)菌細(xì)胞也可用作宿主細(xì)胞。例如，大腸桿菌的不同菌4朱(如，HB101、DH5a、DH10和MC1061)在生物4支術(shù)領(lǐng)域是為人熟知的宿主細(xì)胞。也可采用枯草芽孢桿菌(及wto'fc)、假單胞菌(尸w^fomo"osspp.)、其4也芽孑包4干菌(iac/〃wjspp.)、鏈霉菌(5^e/tomyceyspp.)等的不同菌抹。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酵母菌的許多菌抹，也可作為宿主細(xì)胞，用來表達(dá)本發(fā)明所述多肽。此外，如有需要，昆蟲細(xì)胞也可用作宿主細(xì)胞。例如，參見Miller等，GeneticEngineering,第8巻，第277-298頁(yè)(1986)。將所述載體插入(也稱為"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)染")到選定的宿主細(xì)胞中，可以采用諸如磷酸鈣、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)或DEAE-葡聚糖方法之類的方法來完成。所選方法將部分隨所用宿主的，例如在Sambrook等的上述文獻(xiàn)中有4又述?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)含所述載體的宿主細(xì)胞。所述培養(yǎng)基通常含有所述細(xì)胞生長(zhǎng)和存活所必需的全部營(yíng)養(yǎng)。例如，培養(yǎng)大腸桿菌的合適培養(yǎng)基是Luria肉湯(LB)和/或Terrific肉湯(TB)。培養(yǎng)真核細(xì)胞的合適培養(yǎng)基是RPMI16恥、MEM、DMEM,所有這些培養(yǎng)基都可以根據(jù)培養(yǎng)的特定細(xì)胞系的需要，補(bǔ)充血清和/或生長(zhǎng)因子。用于昆蟲培養(yǎng)物的一種合適培養(yǎng)基是補(bǔ)充有yeastolate、乳清蛋白水解物和/或胎牛血清(如果必要時(shí))的Grace培養(yǎng)基。通常，將對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)有用的一種抗生素或其他化合物作為補(bǔ)充物，添加到培養(yǎng)基中。所采用的化合物由轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的質(zhì)粒上所存在的選擇性標(biāo)記元件決定。例如，當(dāng)選擇性標(biāo)記元件是卡那霉素抗性時(shí)，加入到培養(yǎng)基中的化合物就是卡那霉素。在宿主細(xì)胞產(chǎn)生的NAT的量，可以用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)方法來估計(jì)。此類方法包括但不限于蛋白質(zhì)印跡分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、高效液相色譜分離、免疫沉淀和/或活性分析，諸如DNA結(jié)合凝膠阻滯分析(DNAbindinggelshiftassays)。如果NAT是從非革蘭氏陰性細(xì)菌的宿主細(xì)胞中分泌的，那么其大部分都會(huì)存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。如果NAT是革蘭氏陰性菌分泌的，則NAT將在一定程度上存在于細(xì)胞周質(zhì)中。如果NAT是非分泌型的，則將存在于細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)胞內(nèi)NAT來說，通常先要對(duì)所述宿主細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械破碎。對(duì)位于細(xì)胞周質(zhì)的NAT，可用才兒械破碎或滲透壓處理，使細(xì)胞周質(zhì)的內(nèi)容物釋》丈到緩沖液中。然后，^U亥溶液中分離NAT多肽。再用各種技術(shù)，從溶液中進(jìn)行純化。如果合成NAT，使得在羧基末端或氨基末端帶有一個(gè)標(biāo)記(諸如六聚組氨酸，或其他小肽)，那么使溶液通過其中親和柱基質(zhì)對(duì)所述標(biāo)記或直接對(duì)所述多肽具有高度親和力(即單克隆抗體)的親和柱，可能基本上以一步法純化NAT。例如，多聚組氨酸以高度親和性和特異性與鎳結(jié)合，因此可用鎳親和柱(諸如Qiagen鎳柱)來進(jìn)行純化(參見例如Ausubel等，編輯，CurrentProtocolsinMolecularBiology,同上).另一方面，當(dāng)所述多肽沒有標(biāo)記并且沒有抗體可用時(shí)，可采用其它已知的純化方法。該類方法包括但不限于離子交換色譜、分子篩色i普、反向色譜、高效液相色譜、非變性凝膠電泳結(jié)合凝膠洗脫和制備性等電聚焦("Isoprime，，設(shè)備/技術(shù)，HoeferScientific),在某些情況下，可以結(jié)合兩種或更多種這些技術(shù)以達(dá)到提高純度。尤其優(yōu)選采用酵母細(xì)胞生產(chǎn)NAT，最優(yōu)選稱為畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母(尸/c/7/ap^tor/5))的酵母屬，因?yàn)楸绕鹄缂?xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)來說，畢赤酵母重折疊的效率更高。用于所述酵母菌林的合適的重組表達(dá)方法在美國(guó)專利第4,855,231(Stroman等)、4,812,405(Lair等)、4,818,700(Cregg等)、4,885,242(Cregg)和4,837,148號(hào)(Cregg)中有描述，所述專利的說明書通過引用結(jié)合到本文中。值得注意的是，畢赤酵母屬細(xì)胞也可用于表達(dá)fibrolase,其表達(dá)效果與從編碼該金屬蛋白酶的DNA分子表達(dá)的效果相近，這樣一種方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。fibrolase是已知的金屬蛋白酶，在科學(xué)文獻(xiàn)及專利文獻(xiàn)中已有描述，參見以上引用的Randolph等，和歐洲專利申請(qǐng)第0323722號(hào)。通常，待表達(dá)的fibrolase是具有SEQIDNO:5的fibrolase,它由SEQIDNO:6的cDNA分子(或編碼同樣氨基酸序列的變異體)編碼。在這種系統(tǒng)中表達(dá)fibrolase,—般涉及SEQIDNO:7的..DNA分子，該DNA分子除了編碼"成熟"多肽(核苷酸784-1392)外，還編碼"前原"序列(核苷酸1-783),。其中所述多肽連接到聚合物或其他分子上、形成衍生物以修飾其特性的NAT的化學(xué)修飾形式，也包含在本發(fā)明的范圍中。采用一定方法，將一個(gè)或多個(gè)其它化學(xué)部分連接到所述多肽部分上將NAT衍生化，尤其對(duì)于人類治療目的可能是有利的。這樣的化學(xué)部分可以從不同的水溶性聚合物中選取。該聚合物應(yīng)為水溶性的，這樣使得與之相連的所述NAT多肽在水性環(huán)境里(如在生理環(huán)境里)是可混溶的。水溶性聚合物可從以下組成的一組聚合物中選取例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊環(huán)、聚-l,3，6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來酐共聚物、聚氨基酸(或者是均聚物，或者是隨機(jī)或非隨機(jī)共聚物(進(jìn)一步參見下面關(guān)于融合分子的描述))、和葡聚糖或聚(乙烯吡咯烷酮)聚丙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚苯乙烯馬來酸酯和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛因其在水中的穩(wěn)定性，而在生產(chǎn)中有優(yōu)勢(shì)。所述聚合物可以具有任何分子量，可以是分支或不分支的。對(duì)聚乙二醇而言，優(yōu)選的分子量是在約2千道爾頓(kDa)和約100kDa之間("約"一詞指在聚乙二醇的制備中，有些分子量比聲稱的分子量要大，有的則要小)，便于處理和生產(chǎn)。其他大小也可采用，這取決于所需的治療模式(例如，所需的持續(xù)釋放的持續(xù)時(shí)間、對(duì)生物活性的影響(如果有的話)、操作的容易性、免疫原性的有無和大小以及聚乙二醇對(duì)治療蛋白的其他已知的影響)。如此連接的聚合物分子的^:目可以不同，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人士能夠確定其對(duì)功能的影響?？梢杂孟嗤虿煌幕瘜W(xué)部分(如聚合物，諸如不同重量的聚乙二醇)，進(jìn)行一衍生化、或可以提供二衍生化、三衍生化、四衍生化或某些組合衍生化。聚合物分子與NAT多肽分子的比例也是各不相同的，它們?cè)诜磻?yīng)混合物中的濃度也是不同的。一般來說，最佳比例(就反應(yīng)效率而論，在反應(yīng)中沒有過量的未反應(yīng)的多肽和聚合物)將由諸如所需衍生程度(一、二、三、四衍生化等)、所選聚合物的分子量、聚合物是否是分支結(jié)構(gòu)和反應(yīng)條件等的因素來決定。將所述化學(xué)部分連接在NAT上，應(yīng)考慮其對(duì)所述多肽的功能和抗原性結(jié)構(gòu)域的影響。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，有大量的連接方法可選用。例如，參見EP0401384(將聚乙二醇偶聯(lián)到G-CSF上)和Malik等，ExperimentalHematology,第20巻，第1028-1035頁(yè)(1992)(報(bào)道了用tresylchloride對(duì)GM-CSF進(jìn)行聚乙二醇(PEG)化)。作為說明，聚乙二醇可以通過反應(yīng)基(諸如，游離氨基或羧基)與氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合。反應(yīng)基是那些可與活化的聚乙二醇分子(或其他化學(xué)部團(tuán))結(jié)合的基團(tuán)。具有一個(gè)游離氨基的氨基酸殘基，可以包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基。具有一個(gè)游離羧基的氨基酸包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基也可用作連接所述聚乙二醇分子(或其他化學(xué)部分)的反應(yīng)基。為了生產(chǎn)的目的，最好是連在氨基上，諸如在N-末端或在賴氨酸基團(tuán)上。如果需要受體結(jié)合，則應(yīng)避免連接那些對(duì)受體結(jié)合重要的殘基?？赡芴貏e需要N末端化學(xué)修飾的衍生物。以聚乙二醇為例，可以根據(jù)各種各樣的聚乙二醇分子(根據(jù)分子量、分支等)、聚乙二醇與多肽分子在反應(yīng)混合物的比例、待進(jìn)行的聚乙二醇化的反應(yīng)類型、以及獲取所選N-末端聚乙二醇化NAT的方法進(jìn)行選擇。獲得所述N末端聚乙二醇化制備物(即從其他單聚乙二醇化部分中分離所述部分，如果有必要的話)的方法，可以是從全體聚乙二醇化NAT分子中純化N-末端聚乙二醇材料。選擇性N末端化學(xué)修飾可以通過還原烷基化來完成，該方法利用了不同類型伯氨基(賴氨酸與N末端)的差別反應(yīng)性。參見1996年4月25日公布的PCT申請(qǐng)WO96/11953。在合適反應(yīng)條件下，完成用含聚合物的羧基在N末端對(duì)NAT基本上選擇性地衍生化。例如，通過在允許人們利用賴氨酸的s氨基和所述多肽N末端殘基的a氨基之間的pKa差異的pH下進(jìn)行反應(yīng)，可以對(duì)NAT進(jìn)行選擇性的N末端PEG化。通過這樣的選擇性衍生，控制聚合物與所述多肽的連接聚合物的結(jié)合主要發(fā)生在所述多肽的N末端，而沒有其他泉應(yīng)基如賴氨酸的側(cè)鏈氨基的顯著修飾。用還原烷基化，聚合物可以是如上所述的類型，而且應(yīng)有單個(gè)反應(yīng)性的醛，用于與所述多肽偶聯(lián)?？梢圆捎煤粋€(gè)反應(yīng)性醛基的聚乙二醇丙醛。按照本發(fā)明的NAT或化學(xué)修飾衍生物，可以配制用于體內(nèi)給藥，最優(yōu)選通過血栓內(nèi)給藥(即通過直接局部傳遞至血管中的血凝塊處，例如通過導(dǎo)管)。系統(tǒng)傳遞通常不是優(yōu)選的方法，因?yàn)槿硌h(huán)中先天的(x2巨球蛋白可能與NAT復(fù)合，阻止其與纖維蛋白或纖維蛋白原相互作用，從而消弱血凝塊的溶解。然而，可能有這樣的情況可以采用大量的NAT，超過a2巨球蛋白的循環(huán)水平，從而使得能夠系統(tǒng)給藥和傳遞。一般來說，本發(fā)明包括藥用組合物，所述藥用組合物包含有效量的NAT以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑和/或載體。"有效量"是指足以產(chǎn)生可測(cè)量生物學(xué)效應(yīng)的量(即實(shí)現(xiàn)溶解所治療的一個(gè)或多個(gè)血凝塊的血栓溶解有效量)。通常，NAT將是高度純化的形式，而且，用作傳遞溶媒的任何藥用組合物通常都將預(yù)先滅菌待用，如通過無菌濾膜過濾。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過給藥和觀察所需的治療效果，確定有效劑量。在此范圍內(nèi)的具體有效劑量，將取決于所治療的具體疾病或病癥，以及接受者的年齡和一^:健康狀況，并且可以用標(biāo)準(zhǔn)臨床程序來決定。如可能的話，最好是先在生物測(cè)定系統(tǒng)中體外測(cè)定該藥用組合物的劑量-反應(yīng)曲線，然后在有用的動(dòng)物模型系統(tǒng)體內(nèi)測(cè)定該藥用組合物的劑量-反應(yīng)曲線，繼而在人體中進(jìn)行試驗(yàn)。有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師考慮到治療背景、治療中的疾病類型和其他合適的因素，無需過多的努力，就能夠確定合適的劑量。通常，醫(yī)師將給予所述NAT組合物，直到達(dá)到獲得預(yù)期效果(即血凝塊溶解)的劑量。所述組合物可以作為一劑給予，或在規(guī)定時(shí)間內(nèi)作為兩劑或更多劑(它們可以含有等量或不等量的多肽)給予，或在連續(xù)的基礎(chǔ)上給予。也可^"標(biāo)準(zhǔn)方法用NAT來產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和/或雙特異性抗體等等。.為了提高產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性，可以分析NAT的氨基酸序列，以鑒定可能與免疫原性增加有關(guān)的分子部分。例如，可以對(duì)所述氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以鑒定表面表位，諸如按照Hope和Woods,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA,第78巻,第3824-3828頁(yè)(1981)所述方法來進(jìn)行?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的各種程序，產(chǎn)生識(shí)別NAT表位的多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，可通過注射所述多肽，免疫各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可以用各種佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，這取決于宿主種類，所述佐劑包括^f旦不限于弗氏佐劑、礦物凝膠例如氬氧化鋁(明礬)、表面活性物質(zhì)如〉容血卵磷脂、多聚醇(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔蜮血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、和潛在有用的人用佐齊',如卡介苗和小才奉4干菌(Co^ywe^3cfen'ww/arraw)。關(guān)于針對(duì)NAT的單克隆抗體的制備，任何利用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)來生產(chǎn)抗原分子的4支術(shù)均可采用。例如，最初由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(其描述見Nature,第256巻，第495-497頁(yè)(1975》以及人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)-trioma技術(shù)(描述見Kozbor等，ImmunologyToday,第4巻，第72頁(yè)(1983))和用來生產(chǎn)單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(描述見Cole等，"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy",AlanR.Liss,Inc.,第77-96頁(yè)(1985)),均可用于按照本發(fā)明制備單克隆抗體。可以在治療上應(yīng)用本發(fā)明的抗體，諸如以便在給藥后在體內(nèi)與NAT結(jié)合，并因此中和或抑制過量的NAT。所述抗體還可用于診斷目的，諸如按已知的"^斷方法，以標(biāo)記的形式用來檢測(cè)體液、組織樣品或其他提取物中NAT的存在。具體實(shí)施方案的描述本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步說明。實(shí)施例1NAT序列的來源產(chǎn)生fibrolase的一個(gè)有效方法是，一開始將其作為preprofibrolase表達(dá)，在前fibrolase中蛋白酶kex-2在"前原"區(qū)和"成熟，，區(qū)之間的接點(diǎn)進(jìn)行切割，產(chǎn)生生物活性材料("成熟"fibrolase)。按此設(shè)計(jì)，preprofibrolase的合成和力卩工導(dǎo)致成熟fibrolase分泌到培養(yǎng)基中。在所述切割接點(diǎn)的實(shí)際序列是(...TKR;QQRF...)kex-2是一種內(nèi)切蛋白酶，它在相鄰的兩個(gè)^5咸性氨基酸的后面進(jìn)行切割，在本例中是賴氨酸(K)-精氨酸(R)。從具有上述序列的DNA序列表達(dá)的成熟fibrolase表明，所預(yù)期的N末端谷氨酰胺(Q)事實(shí)上經(jīng)歷了脫酰胺和環(huán)化，產(chǎn)生焦谷氨酸(E)。這種化學(xué)修飾被認(rèn)為是不希望有的，因?yàn)榫哂蠳末端環(huán)化谷氨酰胺(焦谷氨酸)殘基的多肽在用于氨基酸測(cè)序的Edman降解程序中不能進(jìn)行反應(yīng)。因此，使在成熟fibrolase序列中的N末端的這兩種谷氨酰胺(Q)殘基缺失，產(chǎn)生一個(gè)N末端精氨酸(R)殘基。既然kex-2如上所述在兩個(gè)相鄰堿性氨基酸之后進(jìn)行切割，那么可以預(yù)料，序列(...KREF...)存在一個(gè)不確定的kex-2切割位點(diǎn)。因此，所述N末端精氨酸(R)殘基(上面的下劃線部分)用一個(gè)絲氨酸(S)殘基取代，產(chǎn)生序列(...KRSF...)。之所以選擇絲氨酸，是因?yàn)樾枰胍粋€(gè)當(dāng)存在于水解位點(diǎn)的C末端一側(cè)時(shí)便于kex-2切割的氨基酸。Rholam等,EuropeanJournalofBiochemistry,第227巻，第707-714頁(yè)(1995)。因此，采用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，通過在成熟fibrolase的N末端編碼區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，用一個(gè)"S"的密碼子取代"QQR"的密碼子，對(duì)preprofibrolase的DNA序列進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生具有SEQINNO:3的氨基酸序列的前原NAT。用作PCR反應(yīng)引物的寡核香酸列在下面，也顯示了它們與目標(biāo)序列的同源性。最初，進(jìn)行兩種PCR反應(yīng)，采用Oligo1和4作為一個(gè)引物對(duì)，而用Oligo2和3作為另一個(gè)引物對(duì)，都以親代基因作為模板。用瓊脂糖凝膠電泳純化這兩種反應(yīng)的DNA產(chǎn)物(核苷酸長(zhǎng)度為601和815)，將其混合作為第二輪PCR的模板，用寡核苷酸1和2作為引物對(duì)。這種最終的PCR產(chǎn)物(長(zhǎng)度為1372個(gè)核苷酸)用限制性核酸內(nèi)切酶A7zo/和Mf/切割。用苯酚/氯仿除去消化液的蛋白，沉淀DNA。將一部分回收的DNA連接到質(zhì)粒pPICZoc(Invitrogen，Carlsbad,CA,CatalogNo.VI95-20)上，該質(zhì)粒也已相似地用限制性核酸內(nèi)切酶屈o/和MV進(jìn)行了切割、酶促去磷酸化和苯酚/氯仿去蛋白。所有的后續(xù)步驟都按Invitrogen畢赤酵母表達(dá)試劑盒手冊(cè)(InvitrogenCorp.,CatalogNo.K1710-01)來進(jìn)行。用電穿孔方法將所述連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，根據(jù)在含zeocin的固體培養(yǎng)基上的存活進(jìn)行選擇。分離該質(zhì)粒，通過DNA測(cè)序證實(shí)所述profibrolase區(qū)。通過用限制性核酸內(nèi)切酶尸me/切割使該質(zhì)粒線性化，再將其轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115/2/s+中。該GS115菌抹正常情況下是/^—,所以通過用攜帶野生型/z&4基因的DNA轉(zhuǎn)化，恢復(fù)了/^+基因型?；蛘?，也可從InvitrogenCorp.購(gòu)買一個(gè)/^+菌抹(X-33細(xì)胞系，CatalogNo.C180-00)。選4奪作為zeocin抗性菌落的整合體。在含甲醇培養(yǎng)基中誘導(dǎo)候選菌落，在4-20%PAGE上用考馬斯染色，來分析肉湯中NAT的產(chǎn)生。用于定點(diǎn)PCR誘變的寡核苷酸如下Oligo15'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'(SEQIDNO:8)Oligo25'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'(SEQ工DNO:9)Oligo3(SBQIDNO:10)5'_TCCAATTAAACTTGACTAAGAGATCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3'Oligo4(SEQIDNO:11)5,-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3,下面顯示了這些寡核苷酸相對(duì)于待修飾以產(chǎn)生NAT的fibrolase(包括前原區(qū))的雙鏈DNA序列(SEQINNO:12編碼鏈或有義鏈，SEQINNO:13互補(bǔ)鏈或反義鏈)和相應(yīng)氨基酸序列(SEQIDNO:14)的位置。成熟fibrolase的N-末端和C-末端區(qū)域通過用下劃線標(biāo)注末端氨基酸序列(QQRF和LNKP)來指示。N末端區(qū)域(QQRF)是一個(gè)待修飾的區(qū)域(用S取代QQR)。對(duì)于01igo3和4，在下面，插入短橫線來表明所省略的編碼fibrolaseN末端區(qū)中殘基QQ的密碼子的位置。ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGACAAAATAAGCGTCGTAGGAdGCGTAATCGACGAMRFPSIFTAVLFAASSALAACCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT---—--——+-----——_+-—————+-————+-------—-----—---+GGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCAPVNTTTEDETA(J工PAEAVIGTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATATGAGTCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGTCGTGTTTAYSDLEGDFDVAVIiPFSUSTNOligo15'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATTGCCCAATAACAAATATTTATGATGATAACGGTCGTAACGACGATTTCTTCTTCCCCATNGLLFINTTIASIAAKEEGVXholTCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCTTCTATTATCTTGGAATCTGGTAACGTTAACAGAGAGCTCTTTTCTCTCCGACTTCGAAGAAGATAATAGAACCTTAGACCATTGCAATTGSLEKREAEASSIILESGNVNGATTACGAAGTTGTTTATCCAAGAAAG^TCACTCCAGTTCCTAGGGGTGCTGTTCAACCACTAATGCTTCAACAAATAGGTTCTTTCCAGTGAGGTCAAGGATCCCCACGACAAGTTGGTAAGTACGAAGATGCCATGCAATACGAATTCAAGGTTAACAGTGAACCAGTTGTCTTGCACTTCATGCrTCTACGGTACGTTATGCTTAAGTTCCAATTGTCACTTGGTCAACAGAACGTGKYEDAMOYEFKVNSEPVVLHTTGGAAAAAAACAAAGGTTTGTTCTCTGAAGATTACTCTGAAACTCATTACTCCCCAGATAACCmTTTTGTTTCCAAACAAGAGACTTCTAATGAGACTTTGACTAATGAGGGGTCTALEKNKGLFSEDYSETHYSPDGGTAGAGAAATTACTACTTACCCATTGGGTGAAGATCACTGTTACTACCATGGTAGAATCCCATCTCTTTAATGATGAATGGGTAACCCACTTCTAGTCACA^TGATGGTACCATCTTAGGREITTYPLGEDHCYYHGRIGAAAACGATGCTGACTCCACTGCTTCTATCrCTGCTTGTAACGGTTTGAAGGGTCATTTCCTTTTGCTACGACTGAGGTGACGAA0ATAGAGACGAACATTGCCAAAC7TCCCAGTAAAGENDADSTASISACMGLKGHFAAjGTTGCAAGGTGAAATGTACTTGATTCAACCATTGGAATTGTCCGACTCTGAAGCCCATTTCAACGTTCCACTTTACATGAACTAACTTGGTAACCTTAACAGGCTGAGACTTCGGGTAKLOGEMYL工EPLELSDSEAH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>GGTAACTGGCGTGAAACCGACCTGCTGCGTCGCCAACOTCATGATAACGCTCAACTGCTC3CCATTGACCGCACTTTGGCTGGACGACGCAGCGGTTGCAGTACTATTGCGAGTTGACGACGNWRETDIiLRRQRHDNAQIi乙ACCGCTATCGACTTCGACGGTGATACTGTTGGTCTGGCTTACGTTGGTGGCATGTGTCAATGGCGATAGCTGAAGCTGCCACTATGACAACCAGACCGAATGCAACCACCGTACACAGTTTA工DFDGDTVGLAYVGGMCQCTGAAACATTCTACTGGTGTTATCCAGGACCACTCCGCTATTAACCTGCTGGTTGCTCTGGACTTTGTAAGATGACCACAATAGGTCCTGGTGAGGCGATAATTGGACGACCAACGAGACACCXTGGCACACGAACTGGGTCATAACCTGGGTATGAACCACGA^GGCAACCAGTGTCACTGGTACCGTOTGCTTGACCCAGTATTGGACCCATACTTGGTGCTACCGTTGGTCXCAGTGTMAHELGHNLGMNHDGNQCHTGCGGTGCAAACTCCTGTGTTATGGCTGCTATGCTGTCCGATCAACCATCCAAACTGTTCACGCCACGTTTGAGGACACAATACCGACGATACGACAGGCTAGTTGGTAGGTTTGACAAGCGANSCVMAAMLSDQPSKLFTCCGACTGCTCTAAGAAAGACTACCAGACCTTCCTGACCGTTAACAACCCGCAGTGTATCAGGCTGACGAGATTCTTTCTGATGGTCTGGAAGGACTGGCAATTGTTGGGCGTCACATAGNotlCTGAACAAACCGTAAGCGGCCGCCAGCTTTCTAQAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATGACTTGTTTGGCATTCGCCGGCGGTCGAAAGATCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTANKP*AAASFLEQKl*ISEEDctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgacgacttatcgcggcagctggtagtagtagtagtagtaactcaaacatcggaatctgtactglnsavdhhhhhh*vcslrhdtgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagiacaaggagtcaagttcaacccgtgaatgctcttctggccagAacgatctaagattagttccssvqvghlredrsc*工likaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttcctacagtcttacggtaaacggactctctacgtccgaagtaaaaactatgaaaaaataaCCTACAGTCTTACGGTAAACG-5'Oligo2RMSECHIiPERCRI<HF*YPFI實(shí)施例2在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)NAT當(dāng)嘗試在大腸桿菌中表達(dá)NAT的DNA時(shí)，非常差的重折疊和對(duì)稀釋條件的要求，降低了純化效率。這些考慮和其他的考慮，導(dǎo)致使用巴斯德畢赤酵母(一種酵母菌)作為宿主菌。將已經(jīng)用前原NAT的cDNA(SEQIDNO:4)轉(zhuǎn)染的經(jīng)選擇的巴斯德畢赤酵母克隆，接種入500ml的下列接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中每升分批培養(yǎng)基酵母浸出物30.0g磷酸二氫鉀！7.2g葡萄糖20.0g生物素0.004g水磷酸，85%調(diào)節(jié)pH到6.00至1L將轉(zhuǎn)染后的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞接種，于3(TC搖床培養(yǎng)約30-32小時(shí)。用約1。/。(w/v)的所得培養(yǎng)物接種IOL發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐含已滅菌的基礎(chǔ)鹽和葡萄糖(如下)。發(fā)酵罐滅菌后，在每升分批培養(yǎng)基中加入12ml/L的PTM4鹽(PTM4是一種微量金屬溶液，包含五水硫酸銅、碘化鈉、一水硫酸錳、二水鉬酸鈉、硼酸、六水氯化鈷、氯化鋅、七水硫酸亞鐵、d-生物素、硫酸和純水)。發(fā)酵生長(zhǎng)溫度為3(TC。該發(fā)酵罐的pH用氫氧化銨和磷酸控制在pH6.00。得自添加到該培養(yǎng)基中的鋅鹽的鋅，摻入到NAT中作為該金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)的一部分。每升分批培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)鹽磷酸，85%26.7ml硫酸4丐0.93g硫酸鉀18.2g7水硫酸錳14.9g氫氧化鉀4.13g葡萄糖30.0g水到1L讓分批培養(yǎng)物生長(zhǎng)到葡萄糖完全耗盡(17到20小時(shí))，然后開始補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段。補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基含葡萄糖和12mlPTM4鹽/升。誘導(dǎo)補(bǔ)料含葡萄糖、25%甲醇和12mlPTM4鹽/升。在誘導(dǎo)時(shí)，該反應(yīng)器溫度改到2(TC。該誘導(dǎo)階段持續(xù)60-75小時(shí)。收獲所述條件培養(yǎng)基，去掉細(xì)胞碎片。實(shí)施例3從巴斯德畢赤酵母純化NAT將得自實(shí)施例2的酵母肉湯(細(xì)胞碎片較少的條件培養(yǎng)基)澄清，將其pH和電導(dǎo)率分別調(diào)到6.5和10-20mS/cm。將該肉湯上樣到固定化金屬親和樹脂上，該樹脂已加有銅(Cu)，并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)平衡。用PBS洗該樹脂，用PBS中的咪唑梯度(0-100Mm)洗脫。合并含"成熟"NAT(SEQINNO:l)的流分，稀釋至電導(dǎo)率小于1.5mS/cm，pH6.4。將所述稀釋合并液上樣到已經(jīng)用10mM的2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)平衡的SP葡聚糖樹月旨(AmershamPharmaciaBiotech,Inc.,Piscataway,NJ)上。用MES清洗柱子，用MES中的NaCl梯度(0-500mM)洗脫。收集并貯存含NAT的流分。實(shí)施例4大鼠頸動(dòng)脈急性血栓形成的血栓溶解NAT和尿激酶的比較為了證明"成熟"NAT(SEQIDNO:l)具有生物活性，并有獨(dú)特功能，用通過施加陽(yáng)極電流對(duì)一條頸動(dòng)脈產(chǎn)生病灶性損傷的大鼠，進(jìn)行了急性藥理學(xué)研究。這一損傷一般會(huì)在15分鐘內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)閉塞性血栓。一旦血栓形成，則觀察所述動(dòng)脈30分鐘，以確保所述頸動(dòng)脈閉塞是穩(wěn)定的。然后靜脈給予肝素和阿司匹林，以防血栓進(jìn)一步形成。所述動(dòng)物經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)灌注受試材料進(jìn)行處理。在受試材料的傳遞過程中，監(jiān)測(cè)該頸動(dòng)脈的血流量，以便可以4全測(cè)到成功的血塊^1解，并記錄血塊溶解發(fā)生的時(shí)間。記錄發(fā)生溶解的實(shí)驗(yàn)的百分率，并僅對(duì)于血塊溶解成功的實(shí)驗(yàn)計(jì)算組的平均值。作為受試材料出血潛力的度量手段，用紗布拭子收集從手術(shù)部位流出的血。將拭子放在去垢劑溶液中，以溶解紅細(xì)胞，釋放血紅素，再用分光光度計(jì)定量測(cè)定血紅素。流出的血紅素用于計(jì)算出血量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>血塊溶解的發(fā)生率、血塊溶解時(shí)間、手術(shù)出血量(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)這些研究確定了，NAT在體內(nèi)血塊溶解動(dòng)物模型中具有生物活性。而且，與尿激酶相比，其血塊溶解時(shí)間明顯減少、手術(shù)部位出血更少。因此，NAT的活性分布型可以區(qū)別于纖維蛋白溶酶原激活劑類的血栓溶解劑(以尿激酶為代表)，因?yàn)镹AT對(duì)血塊溶解更快并且出血性并發(fā)癥減少。NAT的纖維蛋白溶解活性和fibrolase的是類似的。此外，如上所述，NAT的N末端的穩(wěn)定性，導(dǎo)致重組表達(dá)時(shí)終產(chǎn)物更為均一，這是明顯的優(yōu)點(diǎn)(即所述N末端在一定時(shí)間內(nèi)將不會(huì)改變而產(chǎn)生不同形式的混合物，因而使得所述多肽更加穩(wěn)定)。序列表<110>Boone,ThomasC.Li，HuiminM肌n，MichaelB.<120〉纖維蛋白溶解活性多肽<130〉A(chǔ)-596<140>09/411,329<141>1999-10-01<160>20<170>PatentlnVer.2.1<210〉1<211>201〈212〉PRT〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述NAT(AgkistrodonContourtrix的fibrolase的類似物)〈400〉1SerPheProGin1MetAsnThrLys20HisGinlieVal35GinPheThrLeu50ThrValThrSer65ArgGluThrAspLeuThrAlalie100GlyGlyMetCysArgTyrValGinLeuVallieValAlaAspHisArg51015TyrAsnGlyAspSerAspLyslieArgGinTrpVal2530AsnThrlieAsnGlulieTyrArgProLeuAsnlie4045ValGlyLeuGlulieTrpSerAsnGinAspLeulie5560ValSerHisAspThrLeuAlaSerPheGlyAsnTrp707580LeuLeuArgArgGinArgHisAspAsnAlaGinLeu859095AspPheA印GlyAspThrValGlyLeuAlaTyrVal105110GinLeuLysHisSerThrGlyVallieGinAspHis115120125SerAlalieAsnLeuLeuValAlaLeuThrMetAlaHisGluLeuGly130135140HisAsnLeuGlyMetAsnHisAspGlyAsnGinCysHisCysGlyAla145150155160AsnSerCysValMetAlaAlaMetLeuSerAspGinProSerLysLeu165170175PheSerAspCysSerLysLysAspTyrGinThrPheLeuThrValAsn180185190AsnProGinCyslieLeuAsnLysPro195200〈210〉2〈211〉603〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述:編碼NAT(fibrolase的類似物)〈400〉2tctttcccactsc犯cggtggaaatctacacaagatttgacgtgaaaccggacttcgacgtctactggtgcacgaactggaactcctgtgtctaagaaagccgactctgac犯gaccactgaatcaccgttacacctgctgcggtgatactgtgtcataacctttettggctgcactaccagacacagctggtt犯tccgtc犯catccaattcttctgtatcctcgccaacgttggtctggctccactccgctgggtatg犯ctatgctgtcccttcctgaccatcgttgctgtgggtgcaccactttggttgcacgacactccatgataacgtacgttggtgattaacctgccacgatggcagatcaaccatgttaacaaccaccaccgtattggcatccttctcaactgctgcatgtgtcatggttgctctaccagtgtcaccaaactgttcgcagtgtatgaacactaaa60caccattaac120ctggtccaac180cggtaactgg240geiccgctatc300actgaaacat360gaccatggca420ctgcggtgca480ctccgactgc540cctgaacaaa600603〈210〉3<211>462<212〉PRT〈213〉人工序列<220><223〉人工序列的描述天然pro-NAT(fibrolase的類似物)<400>3MetArgPheProSerliePheThrAlaValLeu1510PheAlaAlaSerSer15AlaLeuAlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThrAlaGin202530lieProAlaGluAlaVallieGlyTyrSerAspLeuGluGlyAspPhe354045AspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeu505560PhelieAsnThrThrlieAlaSerlieAlaAlaLysGluGluGlyVal65707580SerLeuGluLysArgGluAlaGluAlaSerSerlielieLeuGluSer859095GlyAsnValAsnAspTyrGluValValTyrProArgLysValThrPro100105110ValProArgGlyAlaValGinProLysTyrGluAspAlaMetGinTyr115120125GluPheLysValAsnSerGluProValValLeuHisLeuGluLysAsn130135140LysGlyLeuPheSerGluAspTyrSerGluThrHisTyrSerProAsp145150155160GlyArgGlulieThrThrTyrProLeuGlyGluAspHisCysTyrTyr165170175HisGlyArglieGluAsnAspAlaAspSerThrAlaSerlieSerAla180185190CysAsnGlyLeuLysGlyHisPheLysLeuGinGlyGluMetTyrLeu195200205lieGluProLeuGluLeuSerAspSerGluAlaHis,AlaValTyrLys210215220TyrGluAsnValGluLysGluAspGluAlaProLysMetCysGlyVal225230235240AsnLeuThrLysArgSerPheProGinArgTyrValGinLeuVallie260265270ValAlaAspHisArgMetAsnThrLysTyrAsnGlyAspSerAspLys275280285lieArgGinTrpValHisGinlieValAsnThrlieAsnGlulieTyr290295300ArgProLeuAsnlieGinPheThrLeuValGlyLeuGlulieTrpSer305310315320AsnGinAspLeulieThrValThrSerValSerHisAspThrLeuAla325330335SerPheGlyAsnTrpArgGluThrAspLeuLeuArgArgGinArgHis340345350AspAsnAlaGinLeuLeuThrAlalieAspPheAspGlyAspThrVal355360365GlyLeuAlaTyrValGlyGlyMetCysGinLeuLysHisSerThrGly370375380VallieGinAspHisSerAlalieAsnLeuLeuValAlaLeuThrMet385390395400AlaHisGluLeuGlyHisAsnLeuGlyMetAsnHisAspGlyAsnGin405410415CysHisCysGlyAlaAsnSerCysValMetAlaAlaMetLeuSerAsp420425430GinProSerLysLeuPheSerAspCysSerLysLysAspTyrGinThr435440445PheLeuThrValAsnAsnProGinCyslieLeuAsnLysPro450455460<210〉4<211〉1386<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述編碼pro-NAT(fibrolase的類似物)〈400〉4atgagatttcccagtcaacatactcagattaacgggttattctctcg3gagattacgaag肌gtacg犯gttggaaaaaaaagttgcaaggctgtctacaacccaaaactagatctttccaeiccaagatttggcgt,aatcgacttcgcattctactggcacacgaacgcaaactccttgctctaaga3犯CCgcttc肌ttttctacaacagaaa卿gaggcttgtttatccatgccatgcaacaaaggtttttactacttactgactccacgtga犯tgtaagtacga犯agtgactctgaacagaccacttgatcaccgtccgacctgctscggtgatacgtgttatcca"tgggtcataagtgttatggcaagactaccatactgctgttagatg肌acgtttcgatgtttactactatttgaagcttctgttctctgaacccattgggttgcttctatccttgattgaacgtcgaaaagtgaaccaatccgtacagctgcaaaatccgtgaacatccaatacttctgtagcgtcgccaatgttggtctgggaccactcccctgggtatgtgctatgctggaccttcctgttattxgcaggcacaaattcgctgttttgcgccagcattgtctattatctactccagttcaaggttaacagattactctggaagatcacttctgcttgtaccattggaatga卿tgaagaagaaggcctgttatcgttgcaatgggtgcttcactttggtcccacgacagcttacgttggctattaaccaaccacgatgtccgatc犯caccgttaacacatccixcgccggctgasLgccattttccaactgctaaagatgg犯tctggctaggggtgcgtgaaccagtgttsctacc3acggtttgaatgtccgactcccccaaagattccaattaaactgaccaccgttggtttggactctggcatcacgctcaactgtggcatgtgtgctggttgcgca^ccagtgcatccaaactacccgcagtgattagctgcttgtcatcggtcagcaca犯ttaacgttaactgttcaaccatgtcttgcacctccccagattggtagaatcgggtcatttxtgaagcccatgtgtggtgttcttgact犯gtatgaacactcaacaccatt犯tctggtcccttcggtaacgctgaccgcttcaactgaaatctgaccatgtcactgcggtgttctccgactatcctgaac60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140畫1260132013801386<210〉5<211〉203〈212〉PR丁<213〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix〈220〉<223〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix的天然fibrolase<400〉5GinGinArgPheProGinArgTyrValGinLeuVallieValAlaAsp151015HisArgMetAsnThrLysTyrAsnGlyAspSerAspLyslieArgGin202530TrpValHisGinlieValAsnThrlieAsnGlulieTyrArgProLeu354045AsnlieGinPheThrLeuValGlyLeuGlulieTrpSerAsnGinAsp505560LeulieThrValThrSerValSerHisAspThrLeuAlaSerPheGly65707580AsnTrpArgGluThrAspLeuLeuArgArgGinArgHisAspAsnAla859095GinLeuLeuThrAlalieAspPheAspGlyAspThrValGlyLeuAla100105110TyrValGlyGlyMetCysGinLeuLysHisSerThrGlyVallieGin115120125AspHisSerAlalieAsnLeuLeuValAlaLeuThrMetAlaHisGlu130135140LeuGlyHisAsnLeuGlyMetAsnHisAspGlyAsnGinCysHisCys145150155160GlyAlaAsnSerCysValMetAlaAlaMetLeuSerAspGinProSer165170175LysLeuPheSerAspCysSerLysLysAspTyrGinThrPheLeuThr180185190ValAsnAsnProGinCyslieLeuAsnLysPro195200<210>6〈211〉609<212>腿〈213〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix<220><223>編碼Agkistrodoncontortrix的天然fibrolase<400>6caacaaagatattaacgaaatccaaccaag咖tggcgtggctatcgactaaacattcta&tggc3ca_cgggtgcsaactgsctgctcta犯ca犯ccgtcccacaaagscggtgactctctacagaccatttgatcacaaaccgaccttcgacggtg3ctggtgttat犯CtgggtC3cctgtgttatatacgtacagtgaca犯atcactgaacatccgttacttctgctgcgtcgctactgttggtccaggaccactaacctgggtggctgctstgccagaccttcctggttatcgcgtc犯tgggcaattcacttgtatcccacgcaacgtcatgCtggCttfiCgtccgctattactgtccgatcctgaccgttattgctgaccatgcaccaaattggttggtttacactctggcataacgctcattggtggcstacctgctggtatggcaacca3C^CCCgCELccgtatgaac60cgtcaacacc120ggaaatctgg180atccttcggt240actgctgacc300gtgtcaactg360tgctctgacc420gtgtcactgc480actgttctcc540gtgtatcctg600609<210>7〈211〉1392〈212〉DNA<213〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix<220〉〈223〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix的天然pro-fibrolase的編碼序列〈400〉7atgagatttcccagtcaacatactcagatt犯cgggttattctctcgagagattacgaagttggaaaaaa印犯acgatg肌gttgcaaggctgtctacaaacactaaataccattaacgtggtccaaccggt雄tggcaccgctatcgctgaaacaXtaccatggcactgcggtgc肌tccgactgctctgaacaaaccttcaattttctacaacagaaaagagaggcttgtttatccatgccatgcaa^caaaggtttttactacttactgactccacgtgaaatgtaagtacga犯agattcccacaa_caacggtga_aaatctacagaagatttgatacttcgax;ggctactggtgt3Cg33Ctgggactcctgtgtegtactgctgtttttcgatgtttactactatttgaagcttctaagaaaggtcatacgaattcgttctctgaacccattgggttgettctatectt印ttga^cgtcg幼犯gtgaaccaatcaagatacgtactctgaca^accactgaaccaccgttactcctgctgcgttgatactgtttatccaggactcataacctgtatggctgetctaccagaccttattcgcaggcacaaattcgctgttttgcgcc恥cattgtctattatctactccagttcaaggttaacagattactctggaagatcacttctgcttgtaccattggaatga卿tgaagaagaaggectcagctggtta8tccgtc犯tatccaattcatctgtatcccCgCC33CgtCggtctggcttcactxcgctaggtatgaaccatgctgtccgttcctgacpgcatcctccgccggctgaagccattttccaactgeta^agstgg^tctggctaggggtgcgtgaaccagtaaactcattagttactaccatgtccgactcccccaaagattccaattaaatcgttgctgagggtgcaccactttggttggacgacEictctatgstsacgcacgttggtggttaacctgetacgatggcaaatcaaccatcttaacaacccattagctgcttgtcatcggtcagcacaaatagaaggggtataacgttaactgttcaaccatgtcttgeaectccccagattggtagaatcgggtcatttctgaageccatgtgtggtgttcttgactaagccaccgtatgaategtcaactttggaaatcggcatccttcteaactgetgcatgtgtcaaggttgctctgccagtgtcaccaaactgttcgcagtgtatc6012018024030036042048054060066072078084090096010201080114012001260132013801392〈210〉8<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸〈400〉8tactattgeeageattgetgc21<210〉9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400〉9cctacagtcttacggtaaacg21<210>10<211>45〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223〉人工序列的描述寡核苷酸<400>10tccaattaaacttgactaagagatctttcccacaaagatacgtac45<210>11<211>44<212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400〉11ggttaatttgaactgattctctagaaagggtgtttctatgcatg44<210〉12<211〉1620<212〉腿<213〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix<220〉<221〉misc—feature<222〉互補(bǔ)((l).(1620))〈223〉反義鏈(參見SEQIDN0:13)的互補(bǔ)(有義)鏈〈220〉<223〉A(chǔ)gkistrodoncontortrix的天然pro-fibrolase的編碼序列<400>12atgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgct60ccagtcaacaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggt120tactcagatttttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaat180aacgggttattgttt3ta^tactactattgccagcattgctgctaaaga卿aggggta240tctctcgaga認(rèn)g卿ggctgaagcttcttctattatcttgg組ctggtaacgttaac300gattacgaagttgtttatccactccagttcct郷ggtg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actgttcttcctgaccgttaac犯cccgcagtgtattctagaacaaaaactcatctcagaagaggatcatcattgagtttgtagccttagacatgaagaagax;cggtcttgctagattctaatcaaaggggtatctctcgag犯犯眺鄉(xiāng)ctga60cgttaacgattttatccaag120tcaaccaaagtacgaagatgccatgcaata180cttgcacttg犯ggtttgtt240cccagatggtagagaaattactacttaccc300tag犯tcg犯aacgatgctgactccactgc360tcstttc犯gttgc卿gtga犯tgtactt420agcccatgctacgaaaacgt480tggtgttaccc犯a^ctggg540gactaagagatctttcccaca犯gatacgt600gaacactaaatacaacggtgactctgacaa660caccattaacg2LCcactgaa720ctggtcc犯ccaagatttgatcaccgttac780Cggt83CtggCgtg犯3CCgacctgctgcg840gaccgctatcgacttcgacggtgatactgt900actgaaacattctactggtgttatccagga960gaccaitggca^cacgaactgggtcgtta^cct1020CtgCggtgCELaactcctgtgttatggctgc1080ctccgactgctctaag3aaga_ct3cc3gac1140cctg犯c犯accgtaagcggccgccagctt薩tctgaatagcgccgtcgacc1260ctgttcctcagttcaagttgggcacttacg1320ga卿tgtcatgc137權(quán)利要求1.含有修飾的纖維蛋白溶解活性修飾型fibrolase，其中SEQIDNO5的1-3位的Gln-Gln-Arg被當(dāng)存在于kex-2水解位點(diǎn)的C末端一側(cè)時(shí)促進(jìn)kex-2切割的氨基酸所取代。2.權(quán)利要求1的修飾型fibrolase,其在N末端或C末端包含異源多肽。3.權(quán)利要求1或2的修飾型fibrolase,其包含水溶性聚合物。4.權(quán)利要求3的修飾型fibrolase,其中所述水溶性聚合物為聚乙二醇。5.權(quán)利要求1或2的修飾型fibrolase,其通過在酵母中重組表達(dá)而制備。6.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1或2的修飾型fibrolase。7.表達(dá)載體，其包含與權(quán)利要求6的核酸分子有效連接的表達(dá)調(diào)節(jié)元件。8.宿主細(xì)胞，其已用權(quán)利要求6的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵11.宿主細(xì)胞，其已用權(quán)利要求7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。14.生產(chǎn)修飾型fibrolase的方法，其包括將權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞在使得所述核酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)，并且分離所表達(dá)的修飾型fibrolase。15.藥用組合物，其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的修飾型fibrolase和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑或載體。16.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的修飾型fibrolase在制備用于治療哺乳動(dòng)物血栓形成的藥物中的用途，其中所述纖維蛋白溶解活性修飾型fibrolase溶解血塊。17.權(quán)利要求15的修飾型fibrolase在制備用于實(shí)施溶解血塊的藥物中的用途，其中所述藥物溶解血塊。18.權(quán)利要求15的藥用組合物在制備用于治療哺乳動(dòng)物血栓形成的藥物中的用途，其中所述組合物溶解血塊。全文摘要描述了一種可用于體內(nèi)血凝塊溶解的纖維蛋白溶解活性金屬蛋白酶多肽(稱為“新型作用血栓溶解性劑”)，及通過重組表達(dá)生產(chǎn)所述多肽的方法和材料。文檔編號(hào)C12N9/64GK101230340SQ20081000532公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2000年9月29日優(yōu)先權(quán)日1999年10月1日發(fā)明者M(jìn)·B·曼,T·C·波尼,黎慧民申請(qǐng)人:安姆根有限公司