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檢測(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)基因slc26a4的1673a>t突變的試劑盒的制作方法

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專利名稱::檢測(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)基因slc26a4的1673a>t突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SLC26A4突變基因的試劑盒。技術(shù)背景SLC26A4基因位于7q31,其最初是由Everett等定位,并且發(fā)現(xiàn)該基因突變可以導(dǎo)致一種常染色體隱性遺傳性疾病Pendred綜合征,臨床表現(xiàn)為甲狀腺腫,及合并前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或Mondini畸形(前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大合并耳蝸發(fā)育不全)的感音神經(jīng)性耳聾。后來(lái),Usami等對(duì)6例單純前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大家系的SLC26A4基因的篩查結(jié)果表明,該基因的突變還可以導(dǎo)致單純前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大,其遺傳模式也是隱性遺傳.由此可見,SLC26A4基因突變可以導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大——單純性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或者是合并耳蝸畸形的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大是內(nèi)耳最常見的畸形,其在遺傳性耳聾中占到18%。臨床上主要表現(xiàn)為高頻聽力損失為主的感音神經(jīng)性耳聾,聽力損失程度多表現(xiàn)為重度或者是極重度聾。發(fā)病多在兒童時(shí)期,其發(fā)病前常有感冒、發(fā)燒、外傷等使顱內(nèi)壓增高的誘因。與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)的SLC26A4基因mRNA全長(zhǎng)4930bp,含21個(gè)外顯子,開放閱讀框架2343bp,貫穿外顯子2和外顯子21。該基因編碼的蛋白——Pendrin是一個(gè)分子量為86kD,含780個(gè)氨基酸的跨膜蛋白,屬于離子轉(zhuǎn)運(yùn)子家族。Scott和Bidart等的研究發(fā)現(xiàn),Pendrin主要表達(dá)于甲狀腺濾泡細(xì)胞的頂膜及內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊的主細(xì)胞,介導(dǎo)碘離子和氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn),在維持甲狀腺組織和內(nèi)淋巴的離子平衡上發(fā)揮作用。在甲狀腺,當(dāng)Pendrin功能障礙時(shí),其不能把碘離子及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到濾泡膠質(zhì),使碘離子在濾泡細(xì)胞內(nèi)積聚,從而不能有效有機(jī)化并與甲狀腺球蛋白結(jié)合,從而導(dǎo)致Pendred綜合征中甲狀腺腫的發(fā)生。Qvortrup等認(rèn)為,大鼠的內(nèi)淋巴囊類似甲狀腺濾泡,有平衡膠狀物質(zhì)填塞囊腔,內(nèi)淋巴囊主細(xì)胞的功能類似于甲狀腺濾泡細(xì)胞,可以合成、分泌、吸收、消化蛋白質(zhì)。氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙使內(nèi)淋巴液的成分改變,從而損傷感覺(jué)上皮細(xì)胞,導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。并且由于滲透壓改變和成分改變的毒性機(jī)制導(dǎo)致膜迷路結(jié)構(gòu)改變。由于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊到4歲時(shí)才停止發(fā)育,因此它們的擴(kuò)大可以導(dǎo)致周圍骨性結(jié)構(gòu)的改變,例如前庭導(dǎo)水管或耳蝸結(jié)構(gòu)的改變。對(duì)于前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因突變的篩查,國(guó)外已經(jīng)廣泛幵展,報(bào)道的致病突變位點(diǎn)超過(guò)100個(gè),包括錯(cuò)義突變、框移突變、無(wú)義突變及剪接位點(diǎn)突變,分布于各個(gè)外顯子。SLC26A4基因具有明顯的異質(zhì)性,不同種族其突變形式不完全相同。該基因突變后其編碼的蛋白不能準(zhǔn)確定位到細(xì)胞膜上,而是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者是高爾基體內(nèi),影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)。前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因突變的發(fā)現(xiàn),不僅會(huì)促進(jìn)該病的發(fā)病機(jī)理等基礎(chǔ)研究的發(fā)展,還將大大促進(jìn)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的基因診斷和治療的開展。通過(guò)產(chǎn)前診斷篩査及新生兒SLC26A4基因突變的普遍篩査,可以降低前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患兒的出生率,并且實(shí)現(xiàn)癥前診斷,從而指導(dǎo)攜帶致病基因的患兒的行為,預(yù)防疾病的發(fā)生,這將會(huì)大大減少耳聾患者的數(shù)量,減輕社會(huì)壓力。未來(lái)的研究將致力于基因治療方面,能夠預(yù)見,基因治療將會(huì)給包括耳聾在內(nèi)的各種遺傳性疾病的治療帶來(lái)質(zhì)的飛躍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣本是否存在SLC26A4基因突變的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的一方面,本發(fā)明提供了一種與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病相關(guān)基因的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法通過(guò)檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣本中是否存在SLC26A4基因突變,而診斷該待測(cè)個(gè)體中前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病的發(fā)生和類型,其中所述的SLC26A4基因突變?yōu)槲挥赟LC26A4基因外顯子4的349delC雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子7的916—917insG雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子3的230A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子11的13360T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子14的1594A>C雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子12的13430A雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子11的1318A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子8的946G>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子17的1975G〉C雜合突變或位于SLC26A4基因外顯子6的626G>A突變。所述檢測(cè)方法可包括下述步驟1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織樣本,提取DNA;2)以該DNA為模板,以針對(duì)SLC26A4基因所述各突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物;3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序分析,將所得到的序列與SLC26A4正?;虻男蛄羞M(jìn)行比較,確定是否存在SLC26A4基因的所述突變位點(diǎn);4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為SLC26A4基因突變導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。所述檢測(cè)方法可進(jìn)一步包括下述步驟-5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在下述氨基酸突變位點(diǎn)X125、X329、K77I、N558I、Q446X、S532R、S448X、K4概、G316X、V659L或G20犯。以下,具體關(guān)于SLC26A4基因1673A>T雜合突變的檢測(cè)方法通過(guò)對(duì)70例前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大家系成員及87名正常聽力的對(duì)照組成員的SLC26A4基因進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的患兒及其母親具有SLC26A4基因新的突變位點(diǎn)(1673A>T,N558D。這一突變位點(diǎn)位于Pendrin的氨基末端,使558位的極性中性天冬酰氨變成了非極性疏水的異亮氨酸。同源氨基酸序列的進(jìn)化研究結(jié)果表明,該突變位點(diǎn)具有高度保守性(圖7)。87名正常人的篩査中未檢測(cè)到該突變,說(shuō)明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)。圖1為SLC26A4編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照?qǐng)D,突變位于第1673位堿基,對(duì)應(yīng)于第558位的氨基酸由天冬酰氨變?yōu)楫惲涟彼帷endrin的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2,第558位氨基酸位于Pendrin的羧基端。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中,檢測(cè)待測(cè)個(gè)體的樣本中是否存在SLC26A4基因1673A〉T雜合突變的方法,包括下述步驟7.1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織樣本,提取DNA;7.2)以該DNA為模板,以下列PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物;5PDS15-F:5'-GCTCCTCTGAGCAACTGTGA國(guó)3,PDS15-R:5,-GGGTCTAGGGCCTATTCCTG-3'7.3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與SLC26A4正?;虻男蛄羞M(jìn)行比較,確定是否存在SLC26A4基因的1673A〉T突變位點(diǎn);或7.4)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用BseMI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng),瓊脂糖電泳檢測(cè),確定是否具有1673A〉T突變位點(diǎn);7.5)根據(jù)以上結(jié)果判斷該待測(cè)個(gè)體是否存在SLC26A4基因1673A>T突變。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,采用BseMl限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)來(lái)檢測(cè)突變基因,將上述步驟7.2所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用BseMI進(jìn)行酶切反應(yīng)后,瓊脂糖電泳檢測(cè),正?;蚰鼙籅seMl切開,而突變基因不能被BseMl酶切開,由此確定是否存在突變位點(diǎn);根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為SLC26A4基因1673A〉T突變導(dǎo)致的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。在上述針對(duì)SLC26A4基因各突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法中,所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物還可以用雜交探針來(lái)檢測(cè),所用的雜交探針可以是與正常的SLC26A4核苷酸序列雜交,或與突變的核苷酸序列雜交,或與它們的互補(bǔ)序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記,尤其是可利用等位基因特異探針,以篩查是否存在已被確定的突變。根據(jù)本發(fā)明的另一方面,本發(fā)明提供了用于檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣本是否存在SLC26A4基因突變的試劑盒,試劑盒中可以包含以下幾種試劑的一種或幾種的組合從待測(cè)樣品中提取DNA的試劑;用于擴(kuò)增樣本DNA中SLC26A4基因下述突變位點(diǎn)的PCR引物及相應(yīng)的PCR反應(yīng)試劑位于SLC26A4基因外顯子4的349ddC雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子7的916—917insG雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子3的230A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子11的13360T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子14的1594A>C雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子12的13430A雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子11的1318A>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子8的946G>T雜合突變、位于SLC26A4基因外顯子17的1975G>C雜合突變或位于SLC26A4基因外顯子6的626G〉A(chǔ)突變;對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的試劑;和成對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的試劑。例如,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供一個(gè)檢測(cè)SLC26A4基因所述突變的試劑盒,容器內(nèi)裝有用以檢測(cè)SLC26A4基因所述突變的成分,與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如,采用PCR擴(kuò)增后,直接檢測(cè)樣品中SLC26A4基因所述突變位點(diǎn)的試劑盒,可含有擴(kuò)增引物、dNTP、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液、酶切反應(yīng)和/或測(cè)序反應(yīng)所需試劑等的一種或多種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知,以上組分僅是示意性的,例如,所述引物可以采用上述的一對(duì)PDS-F和PDS-R引物,所述的用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(1)提取待測(cè)血樣的DNA,利用上述的一對(duì)PDS-F和PDS-R引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng);(2)酶切反應(yīng)進(jìn)行突變檢測(cè);和/或(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測(cè)序,將所得的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較確定突變位點(diǎn)的存在;(4)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在所述氨基酸突變位點(diǎn)。該試劑盒可簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)SLC26A4基因的所述突變位點(diǎn),從而應(yīng)用于前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大病例的突變檢測(cè)及其診斷治療。根據(jù)本發(fā)明的再一方面,本發(fā)明提供了SLC26A4突變基因在診斷和/或治療前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大中的應(yīng)用,通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的待測(cè)樣本中是否存在SLC26A4基因的所述突變而判斷該患者的耳聾發(fā)生原因及類型,進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考;此外,在進(jìn)一步的臨床治療方面,在檢測(cè)結(jié)果為發(fā)生了SLC26A4基因的所述突變之后,可以將正?;?qū)霐y帶突變基因的細(xì)胞并在其中表達(dá),它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組,從而可以進(jìn)行基因治療。本發(fā)明首次提供了在中國(guó)人群中存在SLC26A4基因的所述十一種突變,并且說(shuō)明該突變基因與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)。同時(shí),本發(fā)明提出了通過(guò)檢測(cè)患者中是否存在SLC26A4基因突變而判斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測(cè)方法,這將有利于在臨床上開展耳聾患者的SLC26A4突變篩查工作,為耳聾患者提供診斷和治療服務(wù)。下面結(jié)合附圖,通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的說(shuō)明,詳細(xì)描述但不限制本發(fā)明。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖17為關(guān)于SLC26A4基因1673A〉T雜合突變的附圖圖1為SLC26A4編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照突變位于第1673位堿基,對(duì)應(yīng)于第558位的氨基酸由天冬酰氨變?yōu)楫惲涟彼?灰色標(biāo)記部分的是突變的堿基和氨基酸);圖2為Pendrin的結(jié)構(gòu)示意圖,星號(hào)示出第558位氨基酸所在位置,其位于Pendrin的羧基端;圖3為本發(fā)明SLC26A4基因1673A〉T雜合突變檢測(cè)方法中PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖,示出了反應(yīng)溫度和時(shí)間;圖4為本發(fā)明SLC26A4基因1673A〉T雜合突變檢測(cè)方法中,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜,圖中示出了定量Marker的片段位置;圖5為本發(fā)明方法SLC26A4基因外顯子15的部分測(cè)序結(jié)果,上方為正常對(duì)照序列,下方為突變序列,箭頭所指為突變位點(diǎn)(1673A>T,N558I);圖6為本發(fā)明方法中N558I雜合突變檢測(cè)方法中突變位點(diǎn)酶切電泳圖,圖中從左至右第一泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)、第二為正?;虻拿盖袌D譜、第三泳道為雜合突變基因的酶切圖譜,限制性內(nèi)切酶BseMI可以在1677和1678位堿基切開,而使得正常人PCR產(chǎn)物片段由原來(lái)的302bp被切成170bp和132bp兩個(gè)片段,而突變以后此酶切位點(diǎn)消失,不能切開,由于本組此例為雜合突變,故電泳膠圖上顯示為3條帶;圖7為同源氨基酸序列進(jìn)化研究,不同物種氨基酸序列比對(duì)(箭頭所指為N558I位點(diǎn)),可見pendrinz的不同物種的氨基酸序列在該位點(diǎn)均為天冬酰氨(N),說(shuō)明N558I突變位于保守區(qū)域。發(fā)明的具體實(shí)施方式本發(fā)明所用試驗(yàn)材料,如無(wú)特別說(shuō)明,均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。本發(fā)明研究過(guò)程通過(guò)聾病門診收集前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者,在患者及其家屬自愿的前提下,簽署知情同意書后,留取5-10ml血樣,建立門診病歷資料庫(kù),詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后,應(yīng)用酚氯仿抽提方法提取基因組DNA,定量后入庫(kù),-20。C保存,每份DNA樣品均準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)于登記的患者臨床資料。然后,根據(jù)Coyle等的文獻(xiàn)所描述設(shè)計(jì)引物,包含SLC26A4基因編碼區(qū)及其側(cè)翼序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同,應(yīng)用ABI公司3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行正反向測(cè)序。將得到的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較,確定SLC26A4突變位點(diǎn)。針對(duì)SLC26A4基因的某些突變位點(diǎn),對(duì)PCR產(chǎn)物還可選擇性的進(jìn)行酶切反應(yīng)應(yīng)用特定的限制性內(nèi)切酶可將正常人PCR產(chǎn)物切成兩個(gè)片段,而出現(xiàn)突變后,酶切位點(diǎn)消失,不能切開。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定SLC26A4基因的突變位點(diǎn)。SLC26A4基因349delC雜合突變的檢測(cè)以前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的病人作為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)70例該病家系成員及85例正常對(duì)照的SLC26A4基因的編碼區(qū)各外顯子的篩查,發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者在外顯子4上具有SLC26A4基因新的突變位點(diǎn)(349delC,X125)。該患者為一復(fù)合雜合子,符合常染色體隱性遺傳的模式,其SLC26A4的等位基因存在另一個(gè)突變?;颊叩哪赣H為349ddC(X125)突變的攜帶者。這一突變位點(diǎn)在70名對(duì)照組中均沒(méi)被發(fā)現(xiàn),說(shuō)明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大共分離。實(shí)施例1SLC26A4基因349delC雜合突變的檢測(cè)方法一、待測(cè)對(duì)象血樣DNA的制備1、研究對(duì)象聾病門診收集的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的患者70例,正常對(duì)照85例。對(duì)所有參加者詳細(xì)調(diào)查其病史以及家族史,并對(duì)其進(jìn)行體格檢查,耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學(xué)評(píng)估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5-10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天O抗凝血用PBS作1倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18°C-28°C),上面鋪一層1倍體積已稀釋的血液,室溫1000xg,離心20分鐘。3)吸棄上清,小心吸出中間有核細(xì)胞層,轉(zhuǎn)入5mlEp管中,5000xg,離心10分鐘,然后用PBS洗一次。5000xg,離心10分鐘。4)將細(xì)胞懸于2mlTE緩沖液中,力Q10%的SDS至終濃度0.5%(100^1),蛋白激酶k100-200pg/ml(10mg/ml),50。C水浴3-5小時(shí)。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚,加入混勻,5000xg,離心IO分鐘。6)吸上清液至新離心管中,棄下層沉淀,加入等體積酚氯仿混合物,混勻,5000xg,離心IO分鐘。7)吸上清液至新離心管中,棄下層沉淀,加入等體積氯仿異戊醇混合物,混勻,5000xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中,棄下層沉淀,加入1/10體積的乙酸鈉,混勻。9)加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇。10)-20°C沉淀DNA過(guò)夜。第二天11)高速離心,10000xg,IO分鐘,4°C。12)棄上清,加入75。/。乙醇2ml,高速離心10000xg,5分鐘。13)棄上清,吹干。14)用TE緩沖液溶解(200plTE/5ml全血,400|alTE/10ml全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)定量。二、SLC26A4基因外顯子4的PCR擴(kuò)增1、引物序列上游引物PDS4-F:5'國(guó)TAATCACTTTGCATGTGCTTT-3,(ntll480-nt11500)下游引物PDS4-R:5,-GCCAAAACACTTTAAACATGA-3,(ntl1648-1lnt668)注SLC26A4基因序列檢索號(hào)GenelD:51722、PCR反應(yīng)體系的建立SLC26A4基因的PCR反應(yīng)體系的組成見表1。表1SLC26A4基因的PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>其中緩沖液、dNTP、Taq酶從寶生物公司購(gòu)得。引物由上海生工公司合成。反應(yīng)條件PCR反應(yīng)在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行。三、PCR產(chǎn)物的純化1、向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50W無(wú)菌水,混勻。2、將其轉(zhuǎn)移到MiUipore純化板中,放到真空泵上抽濾約3分鐘,看到純化板中沒(méi)有水即可。3、純化板中再次加入50pl的去離子水,繼續(xù)抽濾,直到純化板中沒(méi)有水為止。4、將純化板從真空泵上取下,向板中加入20W的去離子水,靜止15分鐘,再震蕩15分鐘,然后吸到一新96孔板內(nèi)。5、保存在-2(TC冰箱中。四、電泳定量1、樣品準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物(2pl)+上樣緩沖液(6W)共8^1x96取一96孔點(diǎn)樣板,每孔先加上樣緩沖液6^1,在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中,每孔用排槍移出PCR產(chǎn)物(2)li1),轉(zhuǎn)移到點(diǎn)樣板上、混勻、離心(腔板孔號(hào)要與96孔點(diǎn)樣板一一對(duì)應(yīng))。2、流程1)配膠(1.0%瓊脂糖)稱取3.0g瓊脂糖,懸浮于300ml0,5xTBE中(500ml錐形瓶)。2)溶膠微波爐中高火加熱至沸,持續(xù)沸騰數(shù)分鐘,注意不要沸出,其間取出混勻。3)涼膠待膠完全溶解,從微波爐中取出,涼至6(TC左右,加入l滴EB(約10^il,10mg/ml),搖勻。4)鋪膠平板兩端用膠布封嚴(yán),把250ml膠液全部倒入平板,插入梳尺。5)上膠將平板放入已盛有電泳液(0.5xTBE,液面距膠面l至2mm)的電泳槽中,拔下梳尺。6)加樣用排槍按規(guī)定格式加樣,最后用單槍加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品。7)走膠蓋上電泳槽蓋,檢查正負(fù)級(jí),開啟電泳儀,調(diào)節(jié)電泳電壓。8)定量當(dāng)溴酚藍(lán)走離加樣孔1.5至2cm處,關(guān)閉電泳儀,小心取膠,放入攝相儀照相,進(jìn)行定量。定量marker為DL2000,經(jīng)過(guò)電泳后,有6條帶可見,片段長(zhǎng)度分別是2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,DL2000的總濃度是300ng/5|il。電泳時(shí)取5ulDL2000,因此每條帶的含量為50ng。PCR產(chǎn)物電泳時(shí)取3pl(PCR產(chǎn)物)+5^1(上樣緩沖液)進(jìn)行電泳。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳后的灰度值與DL2000的灰度值的比較判斷PCR產(chǎn)物的含量。五、SLC26A4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序1、PCR產(chǎn)物DNA模板的純度與用量要求DNA純度OD260/OD280=1.6~2.0。DNA濃度PCR產(chǎn)物10ng/iiL。DNA用量PCR產(chǎn)物100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng>2000bp40-幽ng2、測(cè)序反應(yīng)(1)測(cè)序反應(yīng)所需試劑應(yīng)為新鮮配制,需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測(cè)序反應(yīng)所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應(yīng)為潔凈無(wú)菌12的。(2)為了保證測(cè)序樣本及反應(yīng)試劑的新鮮,加樣時(shí)應(yīng)在冰上操作。(3)目前的反應(yīng)體系為5p1,各種試劑加入量見表2。表2SLC26A4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)體系模板純化的PCR產(chǎn)物(實(shí)施例1中制備)200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp40-100ngBigDyev3"0,25^15x緩沖液(Tris-HClpH9.0,MgCl2)0.875^1(Kit)引物3.2pmol用無(wú)菌水補(bǔ)至5pl*BigDye3.1為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的一種用于測(cè)序反應(yīng)的熒光染料。(4)樣品放于PCR儀上,所做反應(yīng)的過(guò)程見表3。表3SLC26A4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)過(guò)程步驟作用196°C,2min.重復(fù)以下過(guò)程30個(gè)循環(huán)2*96。C,10sec;參50°C,5sec;參60°C,4min.3保持在fC,直到純化(5)反應(yīng)完的樣品要及時(shí)從PCR儀上取下,短時(shí)間內(nèi)要進(jìn)行純化的樣品放置于4'C冰箱中,超過(guò)一天以上才能純化的樣品放置于-2(TC冰箱冷凍。3、測(cè)序反應(yīng)物的純化和測(cè)序(1)向每孔中加入20jil80。/。乙醇,4000rpm離心30min;將樣品板放在折好的紙巾上,在離心機(jī)中倒甩,倒甩時(shí)速率不能超過(guò)1000rpm;(2)在每孔中加入30^1170%乙醇,4,000rpm離心10min,倒甩;(3)重復(fù)第2步的操作;(4)重復(fù)第2步的操作;(5)將樣品板放于干凈的抽屜中,避光干燥30min;(6)加入5pl甲酰胺,封膜,離心后置于-2(TC冰箱中;(7)上機(jī)器前95'C變性5分鐘,放置冰上2分鐘,離心后上樣。六、突變位點(diǎn)酶切反應(yīng)檢測(cè)酶切反應(yīng)體系的組成見表4,反應(yīng)條件為37'C水浴4小時(shí)。應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),方法參見實(shí)施例1中電泳定量。酶切分析是在該突變位點(diǎn)找到了一個(gè)限制性內(nèi)切酶Eco311酶切位點(diǎn),沒(méi)有發(fā)生突變時(shí),限制性內(nèi)切酶Eco31I可以在352和353位堿基切開,而使得PCR產(chǎn)物片段由原來(lái)的189bp被切成72bp和117bp兩個(gè)片段,而突變以后此酶切位點(diǎn)消失,不能切開。由于此患者為雜合突變,故電泳膠圖上顯示為3條帶。表4酶切反應(yīng)體系試劑樣品量Eco31110XLBuffer2^1PCR產(chǎn)物6^1ddH20Upto20|ilEco31I限制性內(nèi)切酶與10XLBuffer購(gòu)于寶生物公司,PCR產(chǎn)物為實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例2突變位點(diǎn)進(jìn)化研究突變分析應(yīng)用DNAStar5.0(Lasergeneinc.)軟件包中的SeqmanTM軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。將測(cè)序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),找出突變序列,發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)(349ddC,X125)。進(jìn)化研究349delC突變位于Pendrin的第二跨膜區(qū),其使氨基酸序列從117位始發(fā)生框移,后提前終止于125位氨基酸。該突變必定影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能。SLC26A4基因1673A>T雜合突變的檢測(cè)以前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的病人作為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)70例該病家系成員及87例正常對(duì)照的SLC26A4基因的編碼區(qū)各外顯子的篩査,發(fā)現(xiàn)一名前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者在外顯子15上具有SLC26A4基因新的突變位點(diǎn)(1673A>T,N558I)?;颊叩哪赣H為1673A〉T(N558I)突變的攜帶者。這一突變位點(diǎn)在87名對(duì)照組中均沒(méi)被發(fā)現(xiàn),說(shuō)明這一突變位點(diǎn)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大共分離。實(shí)施例3SLC26A4基因1673A>T雜合突變的檢測(cè)方法基本方法和步驟參見實(shí)施例1。針對(duì)SLC26A4基因外顯子15的PCR擴(kuò)增引物序列為-上游引物-PDS15-F:5,-GCTCCTCTGAGCAACTGTGA-3,(nt39342-nt39351)下游引物PDS15-R:5'-GGGTCTAGGGCCTATTCCTG-3,(nt39624-nt39643)PCR反應(yīng)過(guò)程如圖3所示;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖4;測(cè)序圖見圖5。突變位點(diǎn)酶切反應(yīng)檢測(cè)酶切反應(yīng)體系的組成見表5,反應(yīng)條件為55X:水浴4小時(shí)。應(yīng)用瓊脂糖電泳檢測(cè),方法參見實(shí)施例1中電泳定量。酶切反應(yīng)電泳圖如圖6所示。酶切分析是在該突變位點(diǎn)找到了一個(gè)限制性內(nèi)切酶BseMI酶切位點(diǎn),沒(méi)有發(fā)生突變時(shí),限制性內(nèi)切酶BseMI可以在1677和1678位堿基切開,而使得PCR產(chǎn)物片段由原來(lái)的302bp被切成170bp和132bp兩個(gè)片段,而突變以后此酶切位點(diǎn)消失,不能切開。由于此例為雜合突變,故電泳膠圖上顯示為3條帶。表5酶切反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>BseMI限制性內(nèi)切酶與lOXLBuffer購(gòu)于晶美生物公司。實(shí)施例4突變位點(diǎn)進(jìn)化研究突變分析應(yīng)用DNAStar5.0(Lasergeneinc.)軟件包中的Seqman軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。將測(cè)序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),找出突變序列,發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)(1673A>T,N558I)。進(jìn)化研究1673A〉T突變位于Pendrin的羧基末端,使極性中性的天冬酰氨變成了非極性疏水的異亮氨酸,同源基因氨基酸序列進(jìn)化性研究結(jié)果表明,該突變位于高度保守區(qū)(圖7)。檢測(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)的S丄C2fe44基因突變的試劑盒及其應(yīng)用實(shí)施例5檢測(cè)S丄C2^^基因突變的試劑盒可以根據(jù)需要制備成檢測(cè)各單一突變位點(diǎn)的單獨(dú)的試劑盒,也可以制備成檢測(cè)多個(gè)或所有5ZC2"4基因突變位點(diǎn)的試劑盒,下面以檢測(cè)本發(fā)明的突變位點(diǎn)的試劑盒為例進(jìn)行說(shuō)明1、試劑盒含有.-(1)擴(kuò)增用引物前述為檢測(cè)SZT2^44基因的1673A〉T突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的1對(duì)引物,或者其他可使用的針對(duì)該突變基因設(shè)計(jì)的引物;注5XC2^44基因序列檢索號(hào)GenelD:5172其它可選地包含在試劑盒中的試劑包括下述試劑(2)PCR擴(kuò)增用Taq酶5U/pl(3)10x緩沖液(含15mlMgCl2)(4)dNTP2.5mM(5)Eco31I限制性內(nèi)切酶;BseMI限制性內(nèi)切酶;HindIII限制性內(nèi)切酶;Ndel限制性內(nèi)切酶;或EcoRl限制性內(nèi)切酶(6)10XLBuffer(7)Big-Dyemix2、使用方法主要包括如下步驟OPCR擴(kuò)增采集待測(cè)個(gè)體的樣本(血液、體液、組織等),提取DNA,用上述針對(duì)各突變基因的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增;2)PCR產(chǎn)物純化將含有PCR產(chǎn)物的MultiScreen-PCR板抽真空,加入去離子水,靜置,隨后將MultiScreen-PCR板置于混合器上震蕩,純化后的PCR產(chǎn)物重新溶解后轉(zhuǎn)移至另一潔凈的96孔板中;3)酶切反應(yīng)將針對(duì)349delC突變位點(diǎn)、針對(duì)1673A>T突變位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別按照實(shí)施例3的酶切反應(yīng)體系進(jìn)行酶切反應(yīng),參照?qǐng)D6判斷是否存在上述突變。4)測(cè)序反應(yīng)及驗(yàn)證將上述擴(kuò)增的針對(duì)各突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物以PCR引物作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),在ABI9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,延伸產(chǎn)物上樣于ABIPRISM3730DNA序列分析儀。將所得到的測(cè)序圖譜進(jìn)行分析,與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較可以發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn);5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在相應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)。具體方法參見前面實(shí)施例中的詳細(xì)描述。以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形,只要不脫離本發(fā)明的精神,均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病相關(guān)的位于SLC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變的試劑盒,所述試劑盒包括用于檢測(cè)位于SLC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變的試劑和用于擴(kuò)增SLC26A4基因的試劑。2、如權(quán)利要求1所述試劑盒,所述試劑盒包括下述試劑的組合從待測(cè)樣品中提取DNA的試劑;用于擴(kuò)增樣本DNA中SLC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變的PCR引物及相應(yīng)的PCR反應(yīng)試劑;對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的試劑;和/或?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的試劑。3、如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其中所述的PCR引物為PDS15-F:5'-GCTCCTCTGAGCAACTGTGA-3,PDS15-R:5'-GGGTCTAGGGCCTATTCCTG畫3,。4、如權(quán)利要求1所述試劑盒,所述試劑盒用于檢測(cè)位于SLC26A4基因外顯子15的1673A〉T雜合突變的步驟包括1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織樣本,提取DNA;2)以該DNA為模板,以下列PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物;PDS15-F:5,-GCTCCTCTGAGCAACTGTGA-3'PDS15-R:5,-GGGTCTAGGGCCTATTCCTG-3'3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與SLC26A4正常基因的序列進(jìn)行比較,確定SLC26A4基因的1673A〉T突變位點(diǎn);或4)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用BseMI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng),瓊脂糖電泳檢測(cè),確定SLC26A4基因的1673A>T突變位點(diǎn)。5、如權(quán)利要求4所述試劑盒,所述步驟還進(jìn)一步包括5)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定N558I氨基酸突變位點(diǎn)。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法,通過(guò)檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣本中是否存在SLC26A4基因突變,而診斷該待測(cè)個(gè)體中前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大疾病的發(fā)生和類型,其中所述的SLC26A4基因突變?yōu)槲挥赟LC26A4基因外顯子15的1673A>T雜合突變。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣本是否存在SLC26A4基因突變的檢測(cè)試劑盒,以及SLC26A4基因突變?cè)谠\斷和/或治療與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大相關(guān)疾病中的應(yīng)用。該基因突變和檢測(cè)方法將有利于臨床上開展耳聾患者的SLC26A4基因突變篩查工作,為耳聾患者的診斷和治療提供服務(wù)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101255467SQ20071030165公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2005年8月8日優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日發(fā)明者巖沈,王秋菊,翟所強(qiáng),趙亞麗申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院;北京諾賽基因組研究中心有限公司
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