專利名稱：：用于檢測戊型肝炎病毒的lamp擴增用核酸引物組的制作方法用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組相關(guān)申請的交互參考本申請基于并要求之前于2006年12月26日申請的日本專利申請?zhí)?000-350363的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在本申請中引入作為參考。發(fā)明背景1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及迅速檢測戊型肝炎病毒的手段。2、相關(guān)技術(shù)的描述導致戊型肝炎的戊型肝炎病毒(以下也記為"HEV")是于19卯年其基因已被克隆的病毒。HEV在世界局部地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，感染途徑以發(fā)生水系污染的地區(qū)經(jīng)口感染為主。由此可認為在日本和歐美那樣的先進諸國被發(fā)現(xiàn)是很稀少的?？墒墙陙?，新的日本固有林的存在變得明朗，認為起因于所述病毒林的肝炎患者也在國內(nèi)開始被確認(TakahashiK，IwataK,WatanabeN等人，Viroligy;2001;287;9-12)。由該病毒引起的肝炎病態(tài)也存在著從幾乎沒有癥狀的輕度的肝炎、至急性肝炎、甚至重癥肝炎的癥例。因此，有必要迅速鑒定原因病毒，由它的病毒型推測預后，開始恰當?shù)闹委?。另外，?jù)最近的凈艮告確認輸血也會感染戊型肝炎病毒(MatsubayashiK，NagaokaY，SakataH等人，Transfusion2004;44(6);934-940;MitsuiT，TsukamotoY，YamazakiC等人，J.Med.Virol.2004;74(4);563-572)。由此，開發(fā)能夠適應大規(guī)^莫篩選那樣的戊型肝炎病毒的簡便且高靈敏度的檢測法的需求正在增強?，F(xiàn)在，HEV的主要檢測法是采用測定患者血清中存在的抗體，或通過PCR擴增基因的方法。然而，在抗體檢查中，不僅已治愈的患者被判定為陽性，而且盡管戊型肝炎病毒實際上為陽性時期，但由于抗體產(chǎn)生的時間延遲，往往也被判定為陰性。而通過直接測定病毒基因組的PCR法存在著要從基因組提取開始經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄反應、PCR擴增反應后電泳的步驟而最終艱難獲得結(jié)果這一煩雜問題。不僅如此，盡管確認了HEVRNA由于菌林不同存在很多變異，但是未必能說使用可一次穩(wěn)定地檢測出它們各種各樣的基因型的擴增體系。因此，由于上述原因?qū)е玛栃月实鸵彩莻€問題。現(xiàn)在，在檢測戊型肝炎病毒的檢查方法中，適用于健康保險的體系還沒有開發(fā)。但現(xiàn)實是既使在日本人中，隨著年齡增大，抗體陽性率正在上升。鑒于這樣現(xiàn)狀，感染戊型肝炎病毒的人比已掌握的醫(yī)療關(guān)系者還多的可能性大。因此，期盼開發(fā)簡便、靈敏度高、而且費用低的檢查體系。本發(fā)明的課題在于提供用于檢測戊型肝炎病毒的迅速且正確的手段。發(fā)明概述為了解決上述課題，本發(fā)明者找到了以下的手段。即(1)用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組，上述LAMP擴增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一種引物，其中上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Flc為序列Fl的互補序列)；上述F3引物為序列F3;上述BIP引物為包含序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Blc為序列Bl的互補序列)；上述B3引物為序列B3;上述序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3為包含在選自序列編號1~67或其互補序列的至少一個序列中的連續(xù)序列所示的15個堿基以上的核酸。(2)用于檢測戊型肝炎病毒的基因型的LAMP擴增用核酸引物組，上述LAMP擴增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Flc為序列Fl的互補序列)；上述F3引物為序列F3;上述BIP引物為包含序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Blc為序列Bl的互補序列)；上述B3引物為序列B3;上述引物組中包含的所有序列是為了確定戊型肝炎病毒的基因型，通過使用戊型肝炎病毒基因組的可讀框2的部分序列而設(shè)計的序列。本發(fā)明提供了用于迅速且正確地檢測戊型肝炎病毒的手段。本發(fā)明的優(yōu)點在以下說明書中示出，一部分從說明書中顯然可見，一部分可通過本發(fā)明的實踐而習得。本發(fā)明的優(yōu)點可通過尤其是下文中指出的手段和組合來實現(xiàn)和獲得。附圖簡述所附的附圖整合入說明書中并構(gòu)成說明書的一部分，其闡述了本發(fā)明的實施方案，其與上文的總體描述和下文給出的實施方案的詳細描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。圖1是表示LAMP法中使用的引物與被檢核酸的關(guān)系的模式圖。圖2是表示使用LAMP法獲得的擴增產(chǎn)物的模式圖。圖3是表示在使用環(huán)引物時的LAMP法中使用的引物與被檢核酸的關(guān)系的圖。圖4A是表示從HEVRNA中的5，非編碼區(qū)至ORF-1的序列與引物設(shè)定區(qū)的模式圖。圖4B是表示續(xù)圖4A的圖。圖4C是表示續(xù)圖4B的圖。圖5A是表示HEVRNA中的ORF-2區(qū)的一部分序列與引物設(shè)定區(qū)的才莫式圖。圖5B是表示續(xù)圖5A的圖。圖5C是表示續(xù)圖5B的圖。圖6是表示一個顯示LAMP擴增結(jié)果的電泳照片例子的圖。圖7是表示一個用濁度計測定LAMP擴增結(jié)果例子的曲線圖。圖8是表示用于顯示在LAMP擴增中反應溫度影響的結(jié)果的曲線圖。圖9是表示為了確定HEV的LAMP擴增的最適區(qū)的實驗結(jié)果的曲線圖。圖10是表示選擇在ORF-2(即區(qū)域編號4和區(qū)域編號5)的保守性高的區(qū)域中擴增上升最早的引物組的研究結(jié)果的曲線圖。圖11是對通過^f吏用區(qū)域編號004與區(qū)域編號002的引物組，以來自患者樣本的提取產(chǎn)物為模板的LAMP擴增上升的速度進行比較的曲線圖。
發(fā)明內(nèi)容1、用語說明此處使用的"核酸，，可以是來自天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或設(shè)計的人工核酸等以及它們的混合物等。此處使用的"樣本樣品"或"樣本"并不限定于所使用的，可以是例如血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、活組織、口腔內(nèi)粘膜、培養(yǎng)細胞、喀痰等，或是通過任意本來已知的手段從來自上述任一個或它們的混合物提取核酸成分的樣本。本發(fā)明提供迅速且正確測定人、家畜、寵物等動物體內(nèi)有無戊型肝炎病毒，以及有關(guān)在對于治療方針的決定有用的病毒的基因型等戊型肝炎病毒的信息的手段。因此，樣本樣品只要是可用于以上手段的樣品，可以是任意樣品。此處使用的"LAMP法，，是環(huán)介導等溫擴增(Loop-MediatedIsothermalAmplification)的簡稱，是對于靼基因的6個區(qū)域設(shè)計4種引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物，利用鏈的置換反應，在一定溫度反應的方法(即等溫基因擴增法的一種)。本發(fā)明中使用的LAMP法包括通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，或其部分改變的方法等。后面給出了LAPM法的基本說明，也可參照例如特開2002-186481等文獻。其中被引用的文獻由于參照也包含在本發(fā)明中。另外，此處使用的"RT-LAMP"法是逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增這個方法是應用LAMP法的方法，是當靼基因為RNA時，合成cDNA可與擴增同時或根據(jù)要求間隔一定時差進行的可在檢測中利用的方法。在這個
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的任意的RT-LAMP和其改變法都可在本發(fā)明中利用。下面，就有關(guān)基本的LAMP法中的引物設(shè)計和獲得的擴增產(chǎn)物，利用圖1和圖2進4亍說明。另外，在本圖、本說明書和本專利申請的范圍內(nèi)，帶有"c"的記號表示與不帶"c"的同一記號彼此互補。例如"Flc，，與"F1"就是彼此互補。參照圖l。當要檢測的被檢核酸為雙鏈時，任一條鏈都可含有耙序列，在此設(shè)定在一條鏈核酸中含有靶序列。要按照能夠?qū)Ⅶ靶蛄袏A在中間那樣設(shè)定用作引物雜交的序列的引物區(qū)域Flc、F2c、F3c、Bl、B2、B3。設(shè)計用于與這些序列雜交的引物，即FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物。然后，在使上述4種引物與作為模板核酸的被檢核酸能夠獲得適當擴增的條件下進行LAMP擴增。象圖2所示那樣，由此獲得的LAMP擴增產(chǎn)物是含有靶序列的擴增產(chǎn)物和其互補鏈(參照圖2)，靼序列位于擴增產(chǎn)物的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的中央。另外，為了提高擴增速度，也可使用象圖3所示那樣的環(huán)引物。在被檢核酸中，用于環(huán)引物雜交的位置可以處于引物區(qū)域F2與Flc之間(其中，環(huán)引物的序列也可以包含F(xiàn)2區(qū)域)、引物區(qū)域B1與B2c之間(其中，環(huán)引物的序列也可以包含B2c區(qū)域)的任一位置。如圖3所示那樣，例如，當設(shè)定在引物區(qū)域F2與Flc之間時，適合的環(huán)引物是環(huán)引物FLc。而當設(shè)定在引物區(qū)域Bl與B2c之間時，適合的引物是環(huán)引物BL。環(huán)引物可以同時使用這兩個位置，也可以使用其中的至少l個。置的區(qū)域。實施LAMP法時，通過使作為與該單鏈區(qū)的鏈互補的DNA片段的環(huán)引物存在，可保持必要的立體結(jié)構(gòu)，以便目標擴增可順利進行。因此，環(huán)引物的使用在本發(fā)明中是優(yōu)選的。2、戊型肝炎病毒基因組戊型肝炎病毒的基因組為RNA。因此，無論現(xiàn)在的哪一種擴增法，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA的合成是不可缺的。因此優(yōu)選利用RT-LAMP。在RT-LAMP法中，如果在本身已公知的LAMP反應液中添加逆轉(zhuǎn)錄酶，對含有別的步驟的不進行逆轉(zhuǎn)錄反應的被檢核酸的被檢樣品，例如從來自血液的提取產(chǎn)物等直接開始擴增目標核酸是可能的。但是，也可以在進行了cDNA合成后實施LAMP法，此方法也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。已知在LAMP法中通過DNA合成酶進行的延伸反應中，作為副產(chǎn)物生成焦磷酸，它與存在于反應溶液中的鎂離子結(jié)合。本發(fā)明中使用的LAMP法由于擴增產(chǎn)物的生成量多，焦磷酸鎂超過溶解度積，產(chǎn)生白濁。如果用儀器測定白濁(即濁度)，可更容易地實時確認有無擴增。這樣的方案也是本發(fā)明的l個優(yōu)選方案。3、LAMP擴增用核酸引物根據(jù)本發(fā)明，LAMP擴增用核酸引物(也簡稱為"引物"或"LAMP引物")是FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物，作為它們的構(gòu)成單位，F(xiàn)IP引物中可含有序列Fl與序列F2，F(xiàn)3引物中可含有序列F3，BIP引物中可含有序列Bl與序列B2，而B3引物中可含有序列B3。另外，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物除了含有FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物之外，還可以含有環(huán)引物。根據(jù)本發(fā)明，通過檢測患者體內(nèi)有無HEV時，可以判定病毒的基因型。因此，一方面當判定有無病毒時，需要在所有的林間選擇保守性高的區(qū)域。另一方面，當判定病毒的基因型時，優(yōu)選是選擇在基因型中的保守性高、基因型間差異較大的序列。作為滿足這些要求的區(qū)域，本發(fā)明者選擇了上述的2個區(qū)域。圖4A、圖4B和圖4C的區(qū)域主要在提供用于檢測病毒有無的通用引物時有用。另外，圖5A、圖5B和圖5C的區(qū)域在提供用于判定病毒類型的型判定用引物時有用。其中，有關(guān)圖4A、圖4B和圖4C表示的序列是連續(xù)的序列，并比較了各種林間從HEV基因組的5，末端到可讀框1(也記為"ORF-l")的g序列。同樣有關(guān)圖5A、圖5B和圖5C表示的序列是連續(xù)的序列，并比較了各種林間可讀框2(也記為"ORF-2")的一部分堿基序列。現(xiàn)在已知根據(jù)HEV基因的特征，HEV被分為4種基因型。將各個區(qū)域中可作為與擴增有關(guān)的單位序列使用的序列設(shè)定在區(qū)域編號OOl、002、004、005這4個部位，按照對應于序列F3、序列F2、序列Fl、序列Bl、序列B2、序列B3那樣用實線或虛線框架表示。以這些序列為基礎(chǔ)，i殳計必需的4種引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物。雖然任一個在圖4中均沒有顯示，但作為區(qū)域編號003使用圖4A所示序列的1位~193位的區(qū)域設(shè)計了引物。另外，在設(shè)計上述引物時，由于菌林不同，或區(qū)域不同，有時在序列中會看到細微的變異。因此，根據(jù)需要有時使用混合堿基，有時需要將選擇的序列的一部分序列組合后設(shè)計引物。這里所謂"使用混合堿基"指的是將用對應變異或可能對應變異的堿基置換的多個序列混合使用、或不混合使用。作為這樣的研究結(jié)果，設(shè)計了對構(gòu)成用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組有效的序列。其結(jié)果如表1-1~表1-2所示。表1-2是續(xù)表1一1。這里將表1-1和表1-2合起來稱為表1。HEV用LAMP引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>;<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表l中的區(qū)域編號相當于圖4A~圖5C表示的區(qū)域001005。例如，表l的區(qū)域編號1的序列編號14對應于圖4A的區(qū)域編號001-F3，作為F3引物的F3序列使用。同樣表1的001-F3-1表示區(qū)域編號001的序列，也可以作為F3引物的F3序列4吏用，或?qū)⑿蛄芯幪?4的連續(xù)序列與序列編號15連續(xù)的序列組合為包含合計15個堿基以上的核酸的F3引物使用。在這種情況下，來自于序列編號14的序列和來自于序列編號15的序列中的任一個序列處于5，端都可以?？蓪⑼瑯拥氖褂梅绞竭\用到表l中"HEV用LAMP引物序列，，欄記載的末尾編號~"-13"。就是"i兌，可以將這些末尾編號~"-13"中每一個序列單獨含有的連續(xù)的15個堿基以上的序列作為構(gòu)成單位，也可以將它們中的至少2個序列中分別含有的連續(xù)的序列(無論那一個為5，側(cè))結(jié)合，做成15個威基以上的序列，作為構(gòu)成單位。另外，也可以將末尾編號的任一個序列、或其中的連續(xù)的15個#以上的序列作為目的引物使用。因此，根據(jù)本發(fā)明的一種方案可提供用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物，上述LAMP擴增用核酸引物包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，從由序列編號14~67或它們的互補序列組成的序列組中至少選擇一個，使用所選擇序列中的15個威基以上的連續(xù)序列作為包含序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3的任一個LAMP引物的構(gòu)成單位。另外，當以表1記載的序列編號14~67或它們的互補序列作為構(gòu)成單位時，由此設(shè)計的核酸引物只要是不妨礙作為引物的功能，至少存在l個變異、缺失、添加也可以。含有那樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴增用核酸引物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，為了鑒定作為戊型肝炎病毒的基因型存在的亞種(即亞型)，也有必要在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計引物。這樣的引物可作為分型用引物使用。詳細的如下面所述，表2給出了可在這樣的引物中利用的序列的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>(1)通用引物表1給出的序列中的任一個作為通用引物用于檢測有無HEV都是有效的區(qū)域。這里所謂的通用引物是不管HEV的基因型如何都可檢測HEV的引物。由于提供這樣的通用引物，有可能做到對對象中的HEV無遺漏地進行檢測。這樣的通用引物中使用的區(qū)域優(yōu)選表l給出的序列。本發(fā)明者獲得與任何引物、特別是保守性高的HEV基因組的其它區(qū)域相比，這些區(qū)域擴增效率顯著高的實驗結(jié)果。然而，能夠說明有關(guān)為什么本發(fā)明的引物非常優(yōu)越的任何機制還完全不清楚。關(guān)于機制的這樣的見識，不限于HEV，在LAMP法中使用的任一個引物也是同樣的，現(xiàn)狀是任一個引物是否顯著有效，只有通過實驗研究才能知道。如上所述，已確認表1中給出的各引物區(qū)域用于檢測HEV的有無是有效的區(qū)域。其中，擴增速度最快，效率好的引物區(qū)域是區(qū)域002(這里也記為"區(qū)域編號002")。區(qū)域002是從HEV基因組的5，末端開始的可讀框1的2位延伸至l卯位的區(qū)域。這個區(qū)域不僅在上述的區(qū)域OOl、002、003、004、005這5個區(qū)域中是效率最好的區(qū)域，而且即使與對應于HEV基因組整體設(shè)計的任一個引物比較，也是最好的LAMP用引物區(qū)域(實施例3中詳細敘述)。因此，避開該區(qū)域中的變異部位，對根據(jù)本發(fā)明的引物的各構(gòu)成單位進行設(shè)計，結(jié)果可得到以下的序列。序列編號l:GGCAGACCACNTATGTGG序列編號2:TCGANGCCATGGAGGCCCA序列編號3:CAGTTNATNAAGGCTCCTG序列編號4:GCATTACTACTGCCATTGAG序列編號5:GCGTCACNACTGCTATTGAG序列編號6:AGGCTGCTCTGGCTGCGGC序列編號7:AGGCAGCTCTAGCAGCGGC序列編號8:GCCTTGGCGAATGCTGTGG序列編號9:CTGTGGTGGTTCGGCCNTT序列編號10:CAAACCGAGATCCTTATTAAT序列編號ll:CAGACAGAGATACTTATTAAC序列編號12:TTGATGCAACCCCGGCAGTTG序列編號13:NTGATGCAGCCCCGGCAGCTT其中，序列編號1的11位的"N"表示"A"或"G"中的任一個堿基。序列編號2的5位的"N"表示"C"或"T"中的任一個堿基。序列編號3的6位的"N"表示"C"或"T"中的任一個堿基，序列編號3的9位的"N"表示"A"或"T"中的任一個堿基。序列編號5的8位的"N"表示A或T中的任一個堿基。序列編號9的17位的"N"表示G或T中的任一個堿基。序列編號13的1位的"N"表示"C"或"T"中的任一個堿基。其中，序列編號4與序列編號5、序列編號6與序列編號7、序列編號10與序列編號11、以及序列編號12與序列編號13分別是在同樣部位設(shè)定的引物，優(yōu)選這2種混在以便于能夠?qū)诖嬖谟谀莻€區(qū)域的種種變異。序列編號1~序列編號13中的這些序列按照能夠即使在保守性高的區(qū)域中也能避開散布的變異那樣設(shè)定，或按照不能避開的變異位于對擴增的影響小的部位那樣分區(qū)域設(shè)定。另外，在使混合堿基的使用控制在最小需要水平等方面也想了些辦法。在本發(fā)明中，通過反復進行各種各樣的引物設(shè)定的研究，將這些區(qū)域分開是可能的。根據(jù)本發(fā)明的1個方案的用于檢測HEV的LAMP擴增用核酸引物可以從由序列編號1~13或它們的互補序列組成的序列組中至少選擇1個序列，使用選擇序列中的15個威基以上的連續(xù)序列作為包含序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3的任一個LAMP引物的構(gòu)成單位的核酸引物。另外，根據(jù)本發(fā)明的引物在不妨礙作為目的引物發(fā)揮功能的P艮度內(nèi)，在序列編號1~13中任一個序列中至少再進行一次變異、缺失、添加也可以。含有這樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴增用核酸引物也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。組的使用方式可以是例如以下那樣的方式。首先當用于檢測HEV的LAMP擴增用核酸引物組按照包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物設(shè)計時，上述FIP引物是含有序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2。其中x為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，優(yōu)選0~3個堿基的任意威基，例如優(yōu)選的例子"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列，更優(yōu)選x為0個堿基。即，不存在x的引物由于可防止自身分子內(nèi)高級結(jié)構(gòu)的形成，是最優(yōu)選的。另外，上述F3引物;Uf列F3。上述BIP引物是含有序列Bl和序列B2c的序歹'JBl-y-B2c。其中，y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，優(yōu)選0~3個>^的4壬意堿基，例如，優(yōu)選的例子"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列，更優(yōu)選y為0個威基。根據(jù)與x同樣的理由，優(yōu)選不存在y。另外，上述B3引物M列B3。序列Flc、序歹'JF2、序列F3、序列Bl、序列B2c和序列B3是用從由序列編號1~序列編號13和它們的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，而且按照序列F3、序列F2、序列Flc、序列Blc、序列B2和序列B3的順序選擇以上位的序列編號表示序列或它們的互補序列。例如，當序列F3為序列編號1時，序列F2可以M列編號2、序列Flc可以是序列編號3、序列Blc可以是序列編號4、序列B2可以是序列編號5、序列B3可以是序列編號6等。例如，其中當序列F3是用從由序列編號1~5組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸時，序列F2是用從由序列編號2~7組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號38的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列Bl是用從由序列4~9組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，序列B2c是用從由序列6~11的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。或者，在同上的情況下，當序列F3是用從由序列編號18的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸時，序列F2是用從由序列編號29的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號310組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列Blc是用從由序列4~11的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，序列B2是用從由序列5~12組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列6~13組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。另外，有關(guān)含有變異位點"N"的序列，可以使用上述的含有任一堿基的序列，也可以將用分別含有作為混合堿基(即，也稱為mix威基)的兩方g那樣的序列制作的多個引物同時加入到1個反應體系中。另外，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組可以包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，在這些引物中還可組合環(huán)引物，也可稱為LAMP擴增用核酸引物組。環(huán)引物的合成可以使用上述那樣的已公知的任方法和HEV檢測方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下就使用表l的各區(qū)域時的引物組進行說明。另外，對于表l的各區(qū)域使用中有利的環(huán)引物的例子如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>(a)當使用表l的區(qū)域編號l時當使用表l的區(qū)域編號1的序列時的引物組如下所示。如上所述，當用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時，上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序歹'JFlc-x-F2，(其中x為0以上的整數(shù)個4^的核酸、優(yōu)選03個堿基的任意堿基，例如，"TTT"、"AAA"、"CCC，，和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x為O堿基。即，不存在x的引物由于防止自身分子內(nèi)高級結(jié)構(gòu)的形成而最優(yōu)選)；另外上述F3引物M列F3，而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中，y為O以上的整數(shù)個堿基的核酸、優(yōu)選0~3個堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y為O個堿基。根據(jù)與x同樣的理由，不存在y的更好)；另外當在上述B3引物為序列B3，使用表l的區(qū)域編號l時，引物組如下所示。即，上述F3引物是用從由序列編號14和序列編號15組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個^以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號16和序列編號17組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號18~20組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號21和序列編號22組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘?，同上的情況下，上述F3引物是用從由序列編號14和序列編號15的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號16和序列編號17的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號1820的互補序列組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號21和序列編號22的互補序列組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。另夕卜當利用表1的區(qū)域編號1時，在LAMP擴增用核酸引物組中還可具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含序列編號102和/或103的序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組的核酸擴增方法和HEV檢測方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(b)使用表1的區(qū)域編號2時在4象上迷那樣的情況下，使用表1的區(qū)域編號2時，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用序列編號23中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號24~26組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號2730組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號31和序列編號32組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號23的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號2426的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號27~30的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號31和序列編號32的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。另外，當利用表l的區(qū)域編號2時，作為LAMP擴增用核酸引物組，還可具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含序列編號104和/或105的序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組的核酸擴增方法和HEV檢測方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(c)使用表1的區(qū)域編號3時另外，在同上的情況下，當使用表l的區(qū)域編號3時，才艮據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用序列編號23中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號33中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號34中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號35中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物是用序列編號23的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號33的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號34的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號35的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(d)使用表l的區(qū)域編號4時另外，在同上那樣的情況下，當使用表1的區(qū)域編號4時，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用從由序列編號36~38組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號3951組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號5254組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號55和序列編號56組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個減基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用從由序列編號3638的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號39~51的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號52~54的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號55和序列編號56的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。另外，當利用表l的區(qū)域編號4時，LAMP擴增用核酸引物組中還可以具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含由序列編號106~114的序列組成的序列組中選擇的至少一個序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(e)當使用表1的區(qū)域編號5時另外，在同上那樣的情況下，當使用表1的區(qū)域編號5時，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用從由序列編號5759組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號60~63組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號64和序列編號65組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號66和序列編號67組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物是用從由序列編號57~59的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號60~63的互補序列組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號64和65的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號66和序列編號67的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。另外，當利用表1的區(qū)域編號5時，在LAMP擴增用核酸引物組中還可具備利用了表3所示序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含從序列編號116~117的序列組成的序列組中選擇的至少一個序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，根據(jù)本發(fā)明的擴增反應可以按照每l管l種引物組進行，或者也可以使多種引物組混在1管中進行。也可將后述的分型用引物組同時混在1管中進行，也可以象后述那樣只將多種分型用引物組混在1管中進行。另外，也可在l管中只存在單獨的一種分型用引物組進行反應。在需要一次鑒定戊型肝炎病毒的多種亞型時，通過使多個分型用引物組同時存在于1管中的方法進4t更有效。利用這樣的擴增反應的HEV檢測方法和擴增方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(2)分型用引物作為本發(fā)明的另一方案，為了對作為HEV的基因型存在的亞種、即亞型進行鑒定，在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計引物、即設(shè)計分型用引物。如上所述那樣，為了對作為HEV的基因型存在的亞種、即亞型進行鑒定，有必要在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計引物。用于該目的的分型用引物使用圖5A~C所述的可讀框2的一部分序列制作。在制作的引物中含有的優(yōu)選的各序列如表2所示。利用這些序列制備的引物可以準備各型用的反應管，在各個管中使用各自分型用引物，進行各自的反應。依靠添加到可獲得擴增產(chǎn)物的管中的引物的類型，即依靠對引物組的類型的特異性，判定供試驗的樣4^羊品的HEV基因型成為可能。另外，利用帶有可檢測每一類型的標記物也可以檢測每一類型。這樣的方法可利用本身已公知的任一現(xiàn)有技術(shù)的手段。另外，由于才艮據(jù)HEV的亞型還可以更細地分組。對于需要更嚴密的分型時，認為圖5AC的可讀框2的區(qū)域也是有效的。這種場合下，可以選捧對各個型特異的序列設(shè)計各自的引物。這樣的詳細的分型用的引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的詳細的分型用的引物組用于檢測混有較少量的型也有效，在反應特異性高的LAMP法中可有效使用。另外，如上所述，作為分型用引物組，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，還可以再組合環(huán)引物使用。具備這樣的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另夕卜，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組的核酸擴增方法和HEV檢測方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下就使用表2的各區(qū)時的引物組進行說明。(a)使用表2的區(qū)域編號4時(i)I型用的引物組使用表2的區(qū)域編號4的序列可提供的HEVI型用的引物組如下。當用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時，上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序歹'jFlc-x-F2，(其中，x為0以上的整數(shù)個4^Jl的核酸、優(yōu)選0~3個堿基的任意堿基，例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x不存在)，另外上述F3引物是序列F3，而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸、優(yōu)選0~3個堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y不存在)，另外當上述B3引物為序列B3時，使用表2的區(qū)域編號2，用于檢測I型HEV的LAMP擴增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物可以是用序列編號68中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號72中含有的連續(xù)序列表示的15個減基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號76中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號81中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。或者，上迷F3引物可以是用序列編號68的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號72的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號76的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號81的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(ii)II型用引物組在與I型用引物組同樣的場合下，使用表2的區(qū)域編號4，用于檢測II型HEV的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。即，上述F3引物可以是用序列編號69中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號73中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號77中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號82中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物可以是用序列編號69的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號73的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號77的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號82的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(iii)III型用的引物組在與I型用引物組同樣的場合下，使用表2的區(qū)域編號4，用于檢測III型HEV的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物可以是用序列編號87中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用從由序列編號91和序列編號92組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號96中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號100中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物可以是用序列編號87的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號91的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號96的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號100的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(iV)IV型的引物組在與I型用引物組同樣的場合下，使用表2的區(qū)域編號4，用于檢測IV型HEV的LAMP擴增用核酸引物組可以是如下那樣。即，上述F3引物可以是用序列編號71中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號75中含有的連續(xù)序列表示的15個4^&以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號80中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號84中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物可以是用序列編號71的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號75的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號80的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號84的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。(b)當使用表2的區(qū)域編號5時(i)I型用的引物組使用表2的區(qū)域編號5的序列可提供的HEVI型用的引物組如下。當用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時，上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2，(其中，x為O以上的整數(shù)個堿基的核酸、優(yōu)選0~3個堿基的任意堿基，例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x不存在)，另外上述F3引物是序列F3,而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中，y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，優(yōu)選0~3個堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y不存在)，另外在上述B3引物為序列B3時，使用表2的區(qū)域編號2，用于檢測I型HEV的LAMP擴增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號85中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號89中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號94中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號98中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號85的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號89的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號94的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號98的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(ii)II型用引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號5，用于檢測II型HEV的LAMP擴增用核酸引物組如下。例如，上迷F3引物是用序列編號86中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號卯中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號95中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號99中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號85的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號89的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個減基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號94的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號98的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(iii)III型用引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號5，用于檢測III型HEV的LAMP擴增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號87中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號91和序列編號92組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號96中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號100中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號87的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號91的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號96的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號100的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。(iV)IV型用的引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號5，用于檢測IV型HEV的LAMP擴增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號88中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號92中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號97中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號101中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物是用序列編號88的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號92的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號97的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號101的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。另外，如上所述，作為分型用引物組，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，還可以再組合環(huán)引物使用。具備這樣的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另夕卜，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴增用核酸引物組的核酸擴增方法和HEV檢測方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過以上這樣的根據(jù)本發(fā)明的引物組，可提供迅速且正確地檢測HEV和/或確定感染的HEV的基因型的可能的手段。其中可在任一引物組中使用的構(gòu)成單位的序列中，在只要不妨礙作為目的的引物的功能，也可以進行至少一次的變異、缺失、添加。含有這樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴增用核酸引物和/或引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外利用這樣的引物或引物組的核酸擴增方法和HEV檢測方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。4、HEV檢測方法通過使用從由上述那樣的根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少一個引物組，可以提供用于檢測戊型肝炎病毒的方法。另外，通過^f吏用分型引物組可在檢測HEV的同時或與檢測分開地進行HEV的分型。引物組通過LAMP反應進行樣本樣品的核酸擴增反應，以及在上述擴增反應后或反應過程中對擴增產(chǎn)物進行檢測。樣本樣品如果需要，也可以在進行核酸擴增反應前通過本身公知的提取手段j故成核酸成分。例如，這樣的提取手段的例子可以使用酚-氯仿法等液-液提取法、使用了單一物體的固-液提取法等，但并不限定于這些。另外，也可以利用市售的核酸提取試劑盒QIAamp(QIAGEN社制)、SmitestEX-R&D(醫(yī)學生物學研究所社制)等。而當樣本樣品是核酸成分時，不需要提取過程。當對核酸成分的樣本樣品進行LAMP擴增時，優(yōu)選在例如下面那樣的條件下進行。LAMP擴增的溫度優(yōu)選開發(fā)LAMP法的榮研化學社推薦的約60°C~約65。C之間的溫度，優(yōu)選例如58°C~59。C的反應溫度。進行HEV的分型時，在可獲得恰當擴增的條件下通過LAMP反應進行樣本樣品的核酸擴增反應，可在上述擴增反應后或反應過程中對引物組特異的擴增產(chǎn)物進行檢測，以及根據(jù)上述引物組特異性確定戊型肝炎病毒的基因型。例如，用于對引物組特異的擴增產(chǎn)物進行檢測的手段可以在用于鑒定l管l種基因型的引物組存在下進行反應，確認有無擴增。由此可以進行引物組特異性、即取決于引物組的型特異性的檢測。另外，擴增產(chǎn)物的檢測可以在例如擴增反應時或擴增反應后檢測反應液的濁度，或者利用可見光、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、化學熒光、熒光能量轉(zhuǎn)移法、ESR等各種光學的手段。這些手段對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。另外，也可以通過測定濁度判斷有無擴增。例如，當測定濁度時，并不限定于可以4吏用例如TERAMECS林式會社制的Loopamp實時濁度測定儀器LA-200或MORITEX公司制的Realoop-30等。另外，也可以使用整合到雙鏈DNA后發(fā)熒光那樣的溴化乙錠、CyberGreenI等進行監(jiān)測。通過這些方法可以實時對擴增產(chǎn)物的合成量進行監(jiān)測。確定感染的HEV的基因型。5、測定試劑盒根據(jù)本發(fā)明，提供了用于實行本發(fā)明的方法的測定試劑盒。這樣的測定試劑盒的例子至少具備上述那樣的根據(jù)本發(fā)明的引物組，此外還可以具備核酸擴增酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、擴增酶的底物、逆轉(zhuǎn)錄酶的底物、反應用緩沖液、反應用緩沖劑和/或反應容器等。通過提供這樣的測定試劑盒，可以進行更簡便地迅速且正確的HEV的檢測和/或確定感染的HEV的基因型。[例]例1對應于引物區(qū)域的序列使用了表l和表2給出的序列表示的核酸組。另外，作為環(huán)引物使用表3給出的序列表示的核酸。以下通過實施例對本發(fā)明的核酸檢測方法進行更具體的說明。(1)合成寡核苷酸使用表l、表2給出的序列，制備用于HEV的檢測和基因型分類的核酸引物。這樣的引物的合成也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法。(2)LAMP反應液本例中，作為LAMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反應液的組成如下。RT-LAMP法的反應液組成20mMTris-HCL(pH8.8)10mMKCL8mMMgS04lOmM(NH4)2S040.1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。當用這樣組成的總量為25iL的反應液進行反應時，按照下述濃度加入各個引物。引物添加量FIP引物40pmoLBIP引物40pmoLF3引物5pmoLB3引物5pmoL。實施例中使用的引物使用區(qū)域編號002的序列。FIP引物使用序列編號24、BIP引物使用序列編號27、F3引物使用序列編號23、B3引物使用序列編號31。另外，在總量25fiL進行反應時，向各反應體系添加lfiL作為酶混合物的將BstDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs社制)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TakaraBio公司制)按照同比或任何比率混合的酶液、或添加在榮研化學社制的RNA擴增試劑盒中帶有的酶混合物。被檢樣品使用從感染HEV的患者l、患者2和患者3分別釆集的血清中用SmitestEX-R&D(醫(yī)學生物學研究所社制)提取得到的HEVRNA。(3)利用LAMP法進行核酸擴增溫度設(shè)定為63°C、時間設(shè)定為1.5小時進行核酸擴增。此時取代來自血清的提取產(chǎn)物，將添加滅菌水的樣品作為陰性對照。通過瓊脂糖凝膠電泳確認擴增的LAMP產(chǎn)物。其結(jié)果，從含有來自患者的被檢樣品的反應體系得到的樣品在LAMP產(chǎn)物中出現(xiàn)典型的梯狀的圖形(圖6)。而不含有才莫板DNA的陰性對照，則完全看不到擴增(圖6中的n泳道)。以上結(jié)果表明使用選擇的引物組，可以序列特異地進行HEV基因組的擴增。(4)利用LAMP法進行濁度測定通過濁度測定檢測利用LAMP法進行的擴增。濁度測定使用TERAMECS公司制的濁度測定儀器LA-200，對使用作為構(gòu)成單位使用了區(qū)域編號002序列的引物組實施了LAMP法的擴增進行檢測。其結(jié)果如圖7所示。在圖中的解釋性記號中，對于區(qū)域編號002中標記"L"的例子中，在該反應體系中添加表3的序列編號104的環(huán)引物。另外，解釋性記號中的末尾的編號分別表示如下的模板濃度。1:103個拷貝/反應體系2:102個拷貝/反應體系3:1(^個拷貝/反應體系4:1()C個拷貝/反應體系。根據(jù)這些結(jié)果可確認添加了環(huán)引物的反應體系要比沒有添加的更早開始擴增，模板濃度高的反應體系比低的更早開始擴增。例2進行了用于求在通過LAMP法進行HEV檢測時指出反應溫度的研究。使用的引物如下。實施例中使用的引物使用了區(qū)域編號002的序列。FIP引物4吏用了序列編號24，BIP引物使用了序列編號27,F3引物使用了序列編號23，B3引物使用了序列編號31，環(huán)引物使用了序列編號104。FIP引物、BIP引物、F3引物和B3引物在與例l相同的濃度下使用，環(huán)引物按照20pmoL/25nL加到反應體系中。反應溫度設(shè)定為63'C和59。C，測定了擴增開始的時間。其結(jié)果如圖8所示。在圖中的解釋性記號中，標記為63的是在63'C下進行反應的情況，標記為59的是在59。C下進行反應時的結(jié)果。另外，解釋性記號中的末尾的編號分別為以下這樣的才莫板濃度。2:102個拷貝/反應體系1:1(^個拷貝/反應體系0:1()Q個拷貝/反應體系n:作為陰性對照添加水。從這些結(jié)果可看出當存在充分的模板濃度的情況下，于63。C進行反應的場合下擴增開始得早。但如果模板濃度低下，會看到不擴增的現(xiàn)象。另外，對于在59。C進行反應的場合下，模板濃度即使差100倍，擴增開始的時間也不會差別IO分鐘。因此，在使用區(qū)域編號002的上述引物組合的體系中，認為與63。C相比，59。C反應更適合。例3在利用LAMP法進行的戊型肝炎病毒的檢測法中，進行了用于表示使面更優(yōu)越的實驗。以下，在表4-1~表4-3中表示的第4序列組中給出了本研究使用的引物區(qū)域和在各區(qū)域設(shè)定的引物序列。表4-2和表4-3是依次續(xù)在表4一1后的表，其中表4_1~表4一3合起來記為表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>另外，作為使用從序列編號1至13的區(qū)域編號002的引物，使用了下面的序列編號。F3:序列編號lFIP:序列編號2和序列編號4BIP:序列編號6和序列編號9B3:序列編號12沒有環(huán)引物。(1)LAMP反應溶液在本實驗中，作為LAMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反應溶液組成如下。RT-LAMP法的反應溶液組成20mMTris-HC1(pH8.8)10mMKC18mMMgS04lOmM(NH4)2S040，1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。當用該組成的總量為25jiL的反應液進行反應時，按照以下濃度加入表4中的各個引物。引物添加量FIP引物40pmolBIP引物40pmolF3引物5pmo1B3引物5pmo1沒有添加環(huán)引物。另外，當在總量25jiL中進行反應時，作為酶混合液，添加ljiL的BstDNA聚合酶與AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合的酶液，即添加lpL榮研化學社制的RNA擴增試劑盒附帶的酶混合物。模板使用HEVRNA，該RNA是使用SmitestEX-R&D(醫(yī)學生物學研究所社制)從感染了戊型肝炎病毒的患者l(III型，JRA-1)、患者2(111型，JKN-1)的血清提取的。(2)使用LAMP法進行核酸擴增將溫度設(shè)定為60。C、時間為100分鐘，進行核酸擴增。此時，取代來自血清的提取產(chǎn)物，將添加滅菌水的反應作為陰性對照。(3)使用LAMP法進行濁度測定作為濁度測定結(jié)果的例子，使用TERAMECS公司制的濁度測定儀器LA-200，對使用了用從區(qū)域編號101至115的序列設(shè)計的引物和設(shè)定在區(qū)域002內(nèi)的引物(組成與上述的例3(1)所述的同樣)時的擴增開始進行實時測定。其結(jié)果如圖9所示。在圖中的解釋性記號中，JRA表示來自患者1的結(jié)果，JKN是來自患者2的結(jié)果。附在解釋性記號的末尾的101至115和002的編號表示使用的引物的區(qū)域編號。(4)研究中使用的引物區(qū)域的保守性與擴增開始時間的比較表5中匯總了本研究中使用的引物的區(qū)域與各個患者樣本的擴增開始時間以及該區(qū)域的序列保守性。根據(jù)表5給出的結(jié)果，與本發(fā)明中效率最好的區(qū)域編號002相比，區(qū)域編號114一方擴增開始時間更早，顯示出了良好的結(jié)果。然而，這個區(qū)域編號114與區(qū)域編號002相比，是變異集積的區(qū)域，不僅在型間，即使在同一型的內(nèi)部也是出現(xiàn)不同序列多的區(qū)域。因此，當增加除了此次使用的JRA-1林和JKN-1林以外的型時，擴增效率降低的可能性大。與此相比，實驗數(shù)據(jù)表明區(qū)域編號002附近無論型間還是型內(nèi)都是變異少的區(qū)[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>域。因此區(qū)域編號002不僅型間、型內(nèi)的變異少，而且從通過"^殳計在該區(qū)域的引物進^f亍的擴增開始早這一點也可證明是最適于HEV的LAMP擴增的引物設(shè)定區(qū)域。例4通過使用HEV基因組中的其它保守性高的區(qū)域，進行了使用圖4給出的區(qū)域編號002區(qū)進行擴增顯示擴增開始的時間更早的研究。在HEV基因組中，在從圖4所示的5，末端開始至可讀框1的區(qū)域中存在保存性高的區(qū)域。然而，除此之外，在可讀框2區(qū)域的一部分也存在著同等程度的保守性高的區(qū)域(圖5)。當分別用這2個區(qū)域組成LAMP擴增體系時，研究了有關(guān)作為擴增效率的擴增開始究竟有怎樣不同。(1)可讀框2區(qū)域中的2種引物組的研究在可讀框2中，設(shè)計區(qū)域編號004和區(qū)域編號0052種引物組，比較擴增開始。LAMP反應溶液組成如下。RT-LAMP法的反應溶液組成20mMTris-HC1(pH8.8)lOmMKC18mMMgS0410mM(NH4)2S040.1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。另外，在總反應液25jiL中添加1jiL作為酶混合液的BstDNA聚合酶與AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合的酶液，即添加ljiL的榮研化學社制的RNA擴增試劑盒附帶的酶混合液。另外在用同樣總量25jiL進行反應時，按照下面濃度添加各個引物。引物添加量FIP40pmo1BIP40pmolF35pmo1B35pmo1。另外，在各個區(qū)域中，加入到反應中的引物如下。區(qū)&戈編號004:序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號41、序列編號42、序列編號52、序列編號53、序列編號55、序列編號56區(qū)域編號005:序列編號57、序列編號58、序列編號59、序列編號60、序列編號61、序列編號62、序列編號63、序列編號64、序列編號65、序列編號66、序列編號67。為了對應于在保守性高的區(qū)域中也存在少量變異，將不同型引物混合后使用。沒有使用環(huán)引物。至于模板，將使用SmitestEX-R&D(醫(yī)學生物學研究所社制)從預先已知病毒濃度的戊型肝炎病毒陽性患者20例的血清中提取的HEVRNA經(jīng)階段稀釋后使用。反應溫度定為60。C，測定擴增開始的時間。結(jié)果如圖10所示。圖IO的解釋性記號中的末尾編號分別表示下面的模板濃度。1:102個拷貝/反應體系2:101個拷貝/反應體系3:10Q個拷貝/反應體系4:作為陰性對照，添加水。根據(jù)這些結(jié)果確認當存在的模板的濃度充足時，區(qū)域編號005的引物一方雖然擴增開始稍早些，但存在著隨著模板減少，區(qū)域005引物的開始大幅度延遲的傾向。而區(qū)域編號004即使模板濃度減少，但只要存在模板，在l小時以內(nèi)擴增開始，認為與區(qū)域005的引物組相比更好。根據(jù)以上結(jié)果，獲得了在可讀框2中用區(qū)域編號004設(shè)計的引物組優(yōu)越的結(jié)果。(2)比較使用分別用區(qū)域編號004與區(qū)域編號002設(shè)計的引物組的擴增開始。LAMP反應溶液組成做成例4的(1)那樣。加入的引物對于區(qū)域編號004做成例4(1)那樣。區(qū)域編號002使用序列編號23、序列編號24、序列編號27、序列編號31。而作為環(huán)引物，對于區(qū)域編號004的反應使用序列編號107、108、109，對于區(qū)域編號002的反應使用序列編號104。使用的量做成20pmoL/25nL反應體系。作為擴增反應中的模板，使用用SmitestEX-R&D(醫(yī)學生物學研究所社制)從感染了HEV的患者21、患者22、患者24的血清提取的HEVRNA.反應溫度設(shè)定為60°C，測定擴增開始的時間。得到的結(jié)果如圖11所示。圖11中，解釋性記號中的末尾編號表示患者編號。從圖11給出的結(jié)果看到在由各3例患者樣^取的樣品的擴增中，如果使用區(qū)域編號004的引物組，即使引入環(huán)引物，擴增開始也需要48分至l個多小時的時間。明白了如果使用另外的區(qū)域編號002，在20分鐘至30分鐘的短時間內(nèi)可確認擴增開始。也就是說，即使是同樣的保守性高的這2個區(qū)域，擴增開始需要的時間有很大差異，設(shè)計在區(qū)域編號002的引物組一方在較早的時間就能夠開始擴增。因此，為了設(shè)計用于HEV檢測體系的更好的引物，在LAMP擴增中使用從5，末端到可讀框1的區(qū)域可以說是重要的一點。實際上，在這2個保守性高的區(qū)域中，在GC含量中確實看到了大的差別。GC含量越多，看到模板更容易呈現(xiàn)高級結(jié)構(gòu)，而且高級結(jié)構(gòu)難以解除的現(xiàn)象。此時與模板沒有呈現(xiàn)高級結(jié)構(gòu)時相比，用于解離成擴增需要的單鏈形狀的能量需要的更多。如果使用此次LAMP擴增那樣的等溫擴增法，由于一旦形成的高級結(jié)構(gòu)存在原本難以解除的傾向，才莫板為難以呈現(xiàn)高級結(jié)構(gòu)的序列成了在進行好的引物設(shè)計上的一個關(guān)鍵點。因此，可以說即使是同樣程度的高保守性的區(qū)域，選擇區(qū)域編號002的5，末端區(qū)是個重要的發(fā)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解有其它優(yōu)點和改進。因此，本發(fā)明在廣義的方面不限于本說明書中顯示并描述的特定的詳細說明和代表性實施方案。所以，在不偏離后附的權(quán)利要求書和它們的等同物所定義的總的發(fā)明性概念的精神和范圍下可進行多種改變。<110>株式會社東芝<120>用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組<130>〈140〉CN〈141〉〈150〉JP2006-350363<151〉2006-12-26<160>177〈210〉1<211〉18<212>纖<213>引物<220><221>misc—feature<222>(ll)..(ll)<223>n代表a或g.〈400〉1ggcagaccacntatgtgg18<210>2<211>19〈212>DNA<213>引物<220><221>misc—feature〈222>(5)..(5)<223>n代表c或t.<400>2tcgangccatggaggccca19<210>3<211>19〈212>DNA<213〉引物<220><221>misc—feature<222>(6)..(6)<223>n代表c或t.<220><221>misc—feature<222>(9)..(9)<223>n代表a或t.<400>3cagttnatnaaggctcctg19<210>4<211>20<212>DNA〈213>引物<400>4gcattactactgccattgag20〈210>5<211>20<212>腿<213〉引物<220〉<221>misc—feature<222>(8)..(8)<223>n代表a或t.<400>5gcgtcacnactgctattgag20<210〉6<211>19<212>DNA〈213>引物<400>6aggctgctctggctgcggc19<210>7<211>19<212>腿<213>引物<400>7aggcagctctagcagcggc19<210>8〈211〉19<212〉腿<213>引物<400>8gccttggcgaatgctgtgg19<210>9<211>19<212>腿<213>引物<220><221>misc—feature<222>(17)..(17)<223〉n代表g或t.<4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gcggggtca38〈210〉145〈211〉18<212>DNA<213>引物HEV107-B3<400>145tagtcgggggccactgca18〈210>146〈211〉20<212>■<213>引物HEV108-F3<400>146gggattgtgcaytatcagtt20<210>147<211>38<212>腿<213〉引物冊V108-FIP<400>147cacaacatcracatccccctactgccggggtcccgggc38〈210>148〈211>40<212>DNA<213>引物HEV108-BIP<400>148cccacccgggagcttcgcaatggggtgtaaaggccgcaaa40〈210〉149〈211〉18<212>DNA〈213〉引物HEV108-B3〈400〉149tatagtgacacgggccgc18<210>150<211〉20〈212〉腿<213>引物HEV109-F3<400>150accacaattatagcyacggc20<210>151<211>39<212>腿<213>引物HEV109-FIP<400>151gtgtggcgggtragtgcaacccaggggtctcatccagtc39<210〉152<211>41<212>DNA<213>引物HEV109-BIP<400〉152gaagtgtgttattttagatgccaatcacatcwgatatgccg41<210>153〈211〉20<212>腿<213>引物HEV109-B3<400>153ccaccagcgaggaaaaagtt20<210>154<211〉19<212〉腿<213>引物HEV110-F3<400>154ggaaggccgtcctctcaac19<210〉155<211〉39<212〉腿<213>引物HEV110-FIP<400>155cgaacatctgaatgmgctgcttgtggggaggtatggccg39<210〉156<211〉41〈212>DNA<213>引物HEV110-BIP<400>156gtccctagctaggttcatccatataactcacaygtggtggc41<210〉157<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV110-B3<400>157accatagcctcaaccagttg20<210>158<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV111-F3<400>158tgcatggtatttgaaaatga20<210>159<211>42<212>腿<213>引物HEV111-FIP<400>159cactcctccataaccacacactgaatttgacagtactcagaa42<210>160<211>42<212>DNA<213>引物HEV111-BIP<400>160gtatcayctggttcggtcagcaaaaacctttaagagactcca42<210>161〈211>20<212>DNA〈213>引物HEV111-B3161caggctcaccagaatgcttg20<210>162<211>20<212>DNA〈213>引物HEV112-F3<400>162ggttgattaccgccctattg20〈210〉163〈211〉39<212>DNA<213>引物HEV112-FIP<400〉163gcaaawcgcaccacatcagggctgtatgccggtgtggtg39<210>164<211〉39<212>DNA<213>引物HEV112-BIP<400>164gaactggggccccggccctcgaagraaatcacaaacagc39<210>165〈211〉20<212>DNA<213>引物HEV112-B3<400>165caracctgcgcaacattcgt20<210>166<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV113-F3<400>166ccactgaacccwctcttacc20<210>167〈211>40<212>腿〈213〉引物HEV113-FIP〈400>167cccggtactgggcgtaattacttcaggatggcaccaacac40<210>168<211>43<212>腿<213>引物HEV113-BIP<400>168atccgttatcgcccgctggtggccaaaargaaatagaaatage43<210>169<211〉20<212〉腿<213>引物HEV113-B3<400>169catatcaacagargtagggg20〈210>170<211>19<212>DNA<213>引物HEV114-F3<400>170tgcatttcacyggcacgaa19<210〉171〈211>39〈212〉腿<213〉引物HEV114-FIP<400>171ccgagaagcgtatcagcaagttggtgaggtgggycgagg39<210>172<211>41〈212>DNA<213>引物HEV114-BIP<400>172ccgacagaattgatttcgtcgggctgagacgacagggcggg41<210>173〈211〉<212>〈213〉20DNA引物服V114-B3〈400>173agctttacagtcggctcgcc<210>174<211>20〈212>腿〈213>引物HEV115-F3<400>174ttgcccgytcccttgattgg20〈210〉175〈211〉39<212>腿<213>引物HEV115-FIP<400〉175gcgggaggacatagaatgtctactttggacggccgcccc39<210>176〈211>42<212>DNA<213>引物HEV115-BIP<400>176cgcggtaagctgtctttctgtataattataagggtagccagc42<210>177<211>20<212>DNA<213〉引物HEV115-B3〈400>177atttgrtcactagcagttgt20權(quán)利要求1、用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物組，其包含F(xiàn)IP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一種引物，其中上述FIP引物為包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列F1c為序列F1的互補序列)；上述F3引物為序列F3；上述BIP引物為包含序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列B1c為序列B1的互補序列)；上述B3引物為序列B3；上述序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3為包含在選自序列編號1～67或其互補序列的至少一個序列中的連續(xù)序列所示的15個堿基以上的核酸。2、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，其中序列F3是用從由序列編號1~5組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列F2是用從由序列編號27組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號38的互補序列組成的序列組中選擇的至少l個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸、序列Blc是用從由序列4~9組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列B2是用從由序列6~11的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者當序列F3是用從由序列編號1~5的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中舍有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸時，序列F2是用從由序列編號27的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸、序列Flc是用從由序列編號3~8組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，序列Blc是用從由序列4~9的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，序列B2是用從由序列6~11組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，其中按照序列F3、序列F2、序列Flc、序列Blc、序列B2和序列B3的順序選擇以上位的序列編號表示的序列或它們的互補序列。3、權(quán)利要求2的核酸引物組，其還含有環(huán)引物。4、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，上述F3引物是用從由序列編號14和序列編號15組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號16和序列編號17組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號18~20組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號21和序列編號22組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號14和序列編號15的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號16和序列編號17的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號18~20的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號21和序列編號22的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。5、LAMP擴增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求4的核酸引物組中，還包含含有由序列編號102、103的序列和它們的互補序列組成的序列組中選擇的至少l個序列的環(huán)引物。6、權(quán)利要求2的核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號23中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上迷FIP引物是用從由序列編號24~26組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號27~30組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號31和序列編號32組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號23的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號24~26的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號27~30的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號31和序列編號32的互補序列組成的酸。7、權(quán)利要求6的核酸引物組，其還包含含有由序列編號104、序列編號105和它們的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列的環(huán)引物。8、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號23中含有的連續(xù)序列表示的15個4^以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號33中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號34中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號35中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號23的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號33的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號34的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號35的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。9、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用從由序列編號36~38組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號3951組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號52~54組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號55和序列編號56組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號3638的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號39~51的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號52~54的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上迷B3引物是用從由從由序列編號55和序列編號56的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。10、LAMP擴增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求9所述的LAMP擴增用核酸引物組中，還包含含有從由序列編號106~114的序列和它們的互補序列組成的序列組選擇的至少1個序列的環(huán)引物。11、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用從由序列編號57~59組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號60~63組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號64和序列編號65組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號66和序列編號67組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號57~59的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號60~63的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號64和65的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號66和序列編號67的互補序列組成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核12、LAMP擴增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求11所述的LAMP擴增用核酸引物組中，還包含含有由從序列編號115~117的序列和它們的互補序列中選擇的至少l個序列的環(huán)引物。13、用于檢測戊型肝炎病毒的基因型的LAMP擴增用核酸引物組，其包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序列Flc-X-F2，(其中x為0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Flc是序列Fl的互補序列)，上述F3引物M列F3，上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中y是0以上的整數(shù)個堿基的核酸，序列Blc是序列Bl的互補序列)，上述B3引物M列B3，上述LAMP擴增用核酸引物組中含有的全部序列是為了確定戊型肝炎病毒的基因型，使用戊型肝炎病毒基因組的可讀框2的一部分序列設(shè)計的序列。14、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組為用于檢測戊型肝炎病毒的I型而使用的，上述F3引物是用序列編號68中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號72中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號76中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號81中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號68的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號72的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號76的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號81的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。15、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組是用于檢測戊型肝炎病毒的II型而使用的，上述F3引物是用序列編號69中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號73中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號77中含有的連續(xù)序列表示的15個#以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號82中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號69的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號73的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號77的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號82的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸。16、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組是用于檢測戊型肝炎病毒的III型而使用的，上述F3引物是用序列編號70中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸、上述FIP引物是用序列編號74中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸、上述BIP引物是用從由序列編號78和序列編號79構(gòu)成的序列組中選擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個減基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號83中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號70的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號74的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號78和序列編號79的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號83的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸。17、權(quán)利要求13所述的用于檢測戊型肝炎病毒的IV型的LAMP擴增用核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號71中含有的連續(xù)序列表示的15個g以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號75中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號80中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號84中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號71的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號75的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號80的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號84的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。18、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測戊型肝炎病毒的I型而使用的，上述F3引物是用序列編號85中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號89中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號94中含有的連續(xù)序列表示的15個戚基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號98中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號85的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號89的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號94的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號98的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。19、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測戊型肝炎病毒的II型而使用的，上述F3引物是用序列編號86中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號90中含有的連續(xù)序列表示的15個4^以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號95中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號99中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號86的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號卯的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號95的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號99的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。20、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測戊型肝炎病毒的III型而使用的，上述F3引物是用序列編號87中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號91和序列編號92組成的序列組中逸擇的至少1個序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號96中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號100中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號87的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號91和序列編號92的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號96的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號100的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸。21、權(quán)利要求13所述的用于檢測戊型肝炎病毒的IV型的LAMP擴增用核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號88中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號93中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號97中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號101中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號88的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號93的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號97的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號101的互補序列中含有的連續(xù)序列表示的15個威基以上的核酸。22、用于檢測戊型肝炎病毒的方法，其包括使用從由權(quán)利要求1所迷的LAMP擴增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少1個引物組，在可獲得適當擴增的條件下進行LAMP反應，實施樣本樣品的核酸擴增反應；以及在上述擴增反應后或反應過程中檢測擴增產(chǎn)物。23、權(quán)利要求22所述的方法，其中對所述擴增產(chǎn)物的檢測是通過測定LAMP反應溶液的法度而進行的。24、用于檢測戊型肝炎病毒的基因型的方法，其包括使用從由權(quán)利要求13所述的LAMP擴增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少1個引物組，在可獲得適當擴增的條件下進行LAMP反應，實施樣本樣品的核酸擴增反應；在上述擴增反應后或反應過程中檢測引物組特異的擴增產(chǎn)物；以及根據(jù)上述引物組特異性確定戊型肝炎病毒的基因型。25、權(quán)利要求24所述的檢測戊型肝炎病毒的方法，其中對所迷擴增產(chǎn)物的檢測是通過測定LAMP反應溶液的濁度而進行的。全文摘要用于檢測戊型肝炎病毒的LAMP擴增用核酸引物，上述LAMP擴增用核酸引物包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，從由序列編號1～67或其互補序列構(gòu)成的序列組中至少選擇一個，使用選擇序列中的15個堿基以上的連續(xù)序列，作為包含序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3的任一個LAMP引物的構(gòu)成單位的核酸引物。文檔編號C12Q1/68GK101210269SQ200710301190公開日2008年7月2日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者三代俊治,太田裕彥,安倍夏生,橋本美智惠,高橋和明申請人:株式會社東芝