專利名稱：修飾的麥草畏單加氧酶及其使用方法
修飾的麥草畏單加氧酶及其使用方法
背景技術(shù)：
本申請要求2006年6月6日提交的美國臨時專利申請序列號 60/811,152和2007年6月5日提交的美國專利申請序列號11/758,657的 優(yōu)先權(quán)，將它們的公開完整引入本文作為參考。
1. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及修飾的麥草 畏單加氧酶，其能夠在轉(zhuǎn)基因生物中賦予對除草劑麥草畏的耐受性。
2. 相關(guān)領(lǐng)域描述
由于通過使用植物遺傳工程技術(shù)引入性狀如昆蟲抗性和除草劑耐 受性，生產(chǎn)田間作物如玉米、大豆和棉花的方法在過去幾十年中已經(jīng)發(fā) 生了顯著改變。這些改變已經(jīng)導(dǎo)致每公項更大的生產(chǎn)力、降低的生產(chǎn)成 本、生產(chǎn)方案中更大的靈活性和效率、殺蟲劑使用減少，并且對于昆蟲 抗性棉花的情況，農(nóng)民健康得到改善。從而轉(zhuǎn)基因作物被大量采用并且 現(xiàn)在生長于世界上的數(shù)百萬英畝上。然而，為了使轉(zhuǎn)基因作物在市場上 有持續(xù)的竟?fàn)幜?，需要增加新價值的性狀。
盡管提高農(nóng)作物和園藝作物的數(shù)量和質(zhì)量的新的性狀已經(jīng)出現(xiàn)并 且將在以后的數(shù)年內(nèi)繼續(xù)增速出現(xiàn)，但是仍然需要改進(jìn)食物、飼料和其 他產(chǎn)品生產(chǎn)方法的性狀。例如，盡管當(dāng)前可以得到耐受除草劑草甘膦、 溴苯腈、磺脲和其他除草劑處理的轉(zhuǎn)基因植物，但是在所控制的雜草范 圍和通過開發(fā)額外的除草劑耐受性作物可以解決的處理選擇中存在空 白點。此外，耐受上述除草劑的雜草的出現(xiàn)(盡管通常是局部的和可變 的)造成了對額外或備選的雜草控制措施的需要。
盡管已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因除草劑耐受性在商業(yè)背景中是有價值的，但是 因此需要耐受其他除草劑的植物以避免過度依賴于任何單一除草劑和 增加管理難以控制的雜草種類的選項。尤其需要的是為得到環(huán)境友好的 并且在控制雜草方面高度有效的除草劑而開發(fā)除草劑耐受性。麥草畏是 有效且環(huán)境友好的除草劑的一個這樣的例子，其已經(jīng)被農(nóng)民使用40多
4年。麥草畏尤其可用于控制玉米、高粱、小米、牧草、干草、牧場、甘 蔗、,夢、草皮和草籽作物中一年生和多年生闊葉雜草和幾種窄葉雜草
(Crop Protection Reference, 1995)。不幸的是，麥草畏可以傷害許多商業(yè) 作物和雙子葉植物，如大豆、棉花、豌豆、馬鈴薯、向日葵和油菜，它 們對于甚至低水平的該除草劑也特別敏感。盡管如此，麥草畏在控制雜 草生長中給出有效并且從而是農(nóng)業(yè)中的重要工具。
最近，從嗜麥芽假單胞菌(尸wwtfomowos wa/m/ /n7/a)分離了編碼 麥草畏單加氧酶(DMO)的基因，其賦予對麥草畏的耐受性(美國專利號 7,022,896)。 DMO參與將除草劑麥草畏(3,6-二氯-鄰-茴香酸)轉(zhuǎn)化為無毒 的3,6-二氯水楊酸。該基因在美國專利號7,022,896中公開為在表達(dá) DMO基因的植物中提供對麥草畏的耐受性。然而，該基因的變體的開 發(fā)將有很大益處。此類變體可能在特定環(huán)境條件下具有改變的效率。以 這種方式，可以選擇為特定環(huán)境優(yōu)化的變體，在所述環(huán)境中，該變體將 意在^1使用并且可以顯示出尤其有益的動力學(xué)特征。該變體尤其可以在 不同的溫度或pH條件下顯示出最大效率，并且從而取決于細(xì)胞內(nèi)條件 和/或預(yù)期的作物生長條件被選擇用于特定的作物物種。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸序列，其選自a)編碼SEQ ID NO:l的多肽的核酸序列；b)包含SEQ ID N0:2的序列的核酸序列；和 c)編碼與SEQ ID NO:l的多肽有至少90 %序列同 一性的多肽的核酸序 列，其中后一多肽具有麥草畏單加氧酶活性并且在對應(yīng)于SEQIDNO:l 的氨基酸112的位置包含半胱氨酸。在其他實施方案中，提供了 DNA 載體，其包含可"f喿作性連接于啟動子的編碼本文所述核酸的DMO。該 啟動子可以在植物細(xì)胞中是有功能的。在一些實施方案中，編碼麥草畏 單加氧酶的核酸序列可以可才喿作性連接于葉綠體轉(zhuǎn)運肽。
另一方面，本發(fā)明提供了與SEQIDNO:l有至少90%同一性的多肽 序列，其中該多肽具有麥草畏單加氧酶活性并且在對應(yīng)于SEQIDNO:l 的氨基酸112的位置包含半胱氨酸。
在再一方面，本發(fā)明提供了用本文所述的編碼麥草畏單加氧酶的核 酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或組織。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞可以是植物細(xì) 胞。在其他實施方案中，植物細(xì)胞可以被定義為雙子葉植物細(xì)胞或單子葉植物細(xì)胞。在特定實施方案中，宿主細(xì)胞是大豆、棉花、玉米或油菜 植物細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，提供了包含本文所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 的纟且織i咅養(yǎng)物。
在再一方面，本發(fā)明提供了用本文所述的編碼麥草畏單加氧酶的核 酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物和其后代。在一些實施方案中，植物可以被定義為 雙子葉植物或單子葉植物。在特定實施方案中，植物是大豆、棉花、玉 米或油菜植物。
在再一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法，其包括 向植物中導(dǎo)入本文提供的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。在該方法的一個實施方案中，導(dǎo) 入轉(zhuǎn)化構(gòu)建體可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化一個或多個植物細(xì)J包并將所述一個或 多個細(xì)胞再生為麥草畏耐受性植物來進(jìn)行。在另一實施方案中，通過將 親本植物自交或與第二種植物雜交產(chǎn)生麥草畏耐受性植物，其中該親本 植物和/或第二種植物包含轉(zhuǎn)化構(gòu)建體并且麥草畏耐受性植物遺傳了來 自親本植物和/或第二種植物的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。
在再一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)食物或飼料的方法，包括:a)得到 如本文提供的本發(fā)明的植物或其部分；和b)從所述植物或其部分制備食 物或飼料。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述植物部分是種子。在某些 其他實施方案中，所述食物或飼料是油、粗粉、蛋白質(zhì)、谷粒、淀粉或 蛋白質(zhì)。在其他實施方案中，飼料包含草料或牧場植物，如干草。本發(fā) 明還提供了生產(chǎn)纖維、藥物、營養(yǎng)品(neutraceuticals)和工業(yè)化學(xué)品， 包括生物燃料以及來自本文提供的植物的任何其他產(chǎn)品的方法。
在再一方面，本發(fā)明提供了在包含如本文提供的本發(fā)明的植物或其
種子的作物生長環(huán)境中控制雜草生長的方法，包括對作物生長環(huán)境施用
有效控制雜草生長的量的麥草畏除草劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，
可以將麥草畏除草劑施用于作物生長環(huán)境的頂部。在特定實施方案中， 麥草畏除草劑的量不損害本發(fā)明的植物或其種子并且損害與缺少本發(fā)
明提供的DMO編碼核酸的植物有相同基因型的植物。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，提供了植物，其包含本發(fā)明提供的 DMO編碼核酸和至少一種其他轉(zhuǎn)基因編碼序列，包4舌例如，至少兩種、 三種、四種、五種或更多種此類編碼序列。在具體實施方案中，所述植 物包含賦予一種或多種額外的有益性狀如除草劑或害蟲/昆蟲耐受性的 轉(zhuǎn)基因。例如，如下文中描述，除了麥草畏耐受性外，還可以提供對一種或多種除草劑的耐受性，以及其他有益性狀。本發(fā)明因此特別提供了 植物，其包含與額外的轉(zhuǎn)基因性狀以任何希望的組合"疊加"的本發(fā)明 的編碼DMO的核酸。
附圖簡述
下面的附圖形成了本說明書的部分并且,皮包括用以進(jìn)一 步說明本 發(fā)明的某些方面。參考 一個或多個這些附圖以及本文給出的特定實施方 案的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明。


圖1.用于為了在高等植物中表達(dá)而遺傳改造麥草畏單加氧酶基因
(DMOc)的盒的略圖，其中使用來自花生褪綠條死病病毒的FLt36啟動 子、煙草蝕紋病毒(TEV前導(dǎo)序列)翻譯增強子序列，和來自豌豆Rubisco 小亞基基因的終止子區(qū)。所制備的另一種遺傳改造形式的DMOc基因含 有來自豌豆Rubisco小亞基基因的轉(zhuǎn)運肽編碼區(qū)，其用于TEV翻譯增 強子區(qū)和DMOc的編碼區(qū)之間DMO的葉鄉(xiāng)錄體定位。
圖2. DNA, RNA和蛋白質(zhì)印跡圖，表明遺傳改造的DMO基因在 Ti代轉(zhuǎn)基因煙草植物中的存在和表達(dá)。泳道Q到V描繪了從多種T!代 轉(zhuǎn)基因煙草植物提取的DNA、 mRNA和DMO種類。來自非轉(zhuǎn)基因煙草 植物的提取物在泳道WT中描繪，而泳道Ox顯示了克隆的DMO基因 構(gòu)建體的限制酶消化產(chǎn)物(上圖)和在大腸桿菌(￡. co/O中過量產(chǎn)生 的約37 kDa DMO酶(下圖)。通過向DMO抗血清中加入Rubisco抗 體的檢測，在蛋白質(zhì)印跡中檢測Rubisco的約55 kDa的大亞基，Rubisco 用作比較每個泳道中總的蛋白質(zhì)負(fù)荷的內(nèi)標(biāo)。如通過 一 式兩份凝膠的溴 化乙錠染色判斷的，在每個泳道加載了相等量的RNA。箭頭指出DMO DNA、 mRNA或蛋白質(zhì)帶的位置。
圖3.用麥草畏以2.2 kg/ha處理兩種Ti煙草植物的效果，其中的一 種含有缺少葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列的遺傳改造的DMOc基因(右)，一 種缺少DMOc基因(右數(shù)第二個)。右邊視圖上的轉(zhuǎn)基因植物顯示出很 小(如果有)的來自麥草畏處理的損傷。左邊的兩抹植物沒有用麥草畏 處理并且代表轉(zhuǎn)基因植物(左邊的)和含有DMOc基因的轉(zhuǎn)基因植物(左 數(shù)第二個)。
圖4.DMOw引起的隨著時間DCSA的形成。
圖5.確定DMOw的最適測定pH。圖6.確定DMOw的最適測定溫度。
圖7.確定DMOc的最適pH。
圖8.確定DMOc的最適溫度。
圖9. DMOc和DMOw的溫度和pH最適條件概述。
圖10. DMOw的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)。
圖11. DMOc的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)。
圖12.在50mM TRIS pH7.5和100mM KPi pH 7.0中30。C下預(yù)溫育 DMOc 45分鐘的效果。
圖13.用靜置一周并在4°C保存的酶在TRIS緩沖液(兩個測定法 在左邊；分別為在保存前和保存后的測定法)和KPi緩沖液(兩個測定 法在右邊；分別為在保存前和保存后的測定法)中的DMOc測定法。
圖14.經(jīng)遺傳改造用于在煙草葉綠體中同源重組并表達(dá)的麥草畏 加單氧酶構(gòu)建體。
圖15.用DMO基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草系的葉綠體基因組的同質(zhì)體 狀態(tài)的闡明，所述DMO基因^f皮設(shè)計用來在煙草葉綠體中同源重組并表 達(dá)。左圖顯示了用于通過同源重組將DMO整合到葉綠體中的構(gòu)建體(如 圖14中顯示)。左邊導(dǎo)向序列上方的條形指出了為了制備洋地黃毒苷 標(biāo)記的雜交探針而被擴增的DNA片段。右圖顯示了DNA印跡泳道1 含有大小標(biāo)記。泳道2含有來自非轉(zhuǎn)基因煙草植物的DNA。泳道3-11 含有在壯觀霉素存在下的第一輪選擇和再生后不久(上圖)和幾輪選擇 和再生后得到葉綠體基因組的表觀同質(zhì)體時(下圖)從轉(zhuǎn)基因植物分離 的DNA。從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物分離用于DNA印跡分析的DNA并 進(jìn)行用BamH I的限制酶消化，然后電泳分離并用與葉綠體基因組轉(zhuǎn)化 載體的"左導(dǎo)向序列"互補的經(jīng)標(biāo)記的DNA片段(即，洋地黃毒苷標(biāo) 記的雜交探針)探測經(jīng)印跡的DNA。 5.6 kb DNA條帶對應(yīng)于含有DMO 基因的葉綠體DNA片段并且3.3 kb條帶對應(yīng)于缺少插入的DMO基因構(gòu) 建體的同源天然葉綠體條帶。
圖16.用28 kg/ha水平的麥草畏處理的含有葉綠體編碼的麥草畏單 加氧酶基因的L代同質(zhì)體轉(zhuǎn)基因煙草植物(植物1 -2和植物3 -4來自 兩抹獨立轉(zhuǎn)化的R。植物)。
圖17.在非轉(zhuǎn)基因煙草植物和在葉綠體基因組中含有DMO基因的 轉(zhuǎn)基因煙草植物中的DMO表達(dá)和對麥草畏處理的敏感性和抗性。用DMO抗體探測的蛋白質(zhì)印跡泳道1含有純化的DMO。泳道2是空白 的并且泳道3含有來自非轉(zhuǎn)基因煙草植物的蛋白質(zhì)提取物。泳道4和8 含有從"假陽性，，煙草植物分離的蛋白質(zhì)，所述煙草植物在用壯觀霉素 選擇期間顯示出抗生素抗性，^f旦是缺少完整的DMO基因。泳道5-7 含有轉(zhuǎn)基因植物的提取物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)整合到葉綠體基因組中 的DMO基因編碼的DMO。 S-對0.56 kg/ha的麥草畏敏感的植物；R= 抗5.6 kg/ha的麥草畏的植物。如通過用抗Rubisco抗體檢測的Rubisco 大亞基蛋白質(zhì)的量判斷的，幾乎等量的提取物被加載到泳道4-8中， 而明顯更多的來自非轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)被加載到泳道3中。箭頭指出 DMO蛋白質(zhì)的位置。
圖18.野生型DMO多肽序列的部分與其他鐵-硫加氧酶的保守區(qū) 的比較，表明DMO是獨特的，與已知的酶具有低同一性，但是W112 (箭頭)在其他鐵-硫加氧酶中是保守的并且被兩個保守結(jié)構(gòu)域即 Rieske和Non-Haem Fe(SEQ ID NOS: 4-23)圍繞。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了在本文中,皮稱作DMOc的麥草畏單加氧酶(DMO)變 體，其在對應(yīng)于SEQIDNO:l中所示的DMO的112位的位置包含半胱 氨酸。已表明DMOc當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時產(chǎn)生對除草劑麥草畏的高 水平耐受性。結(jié)果是令人驚奇的，因為所改變的氨基酸位置在其他鐵-硫加氧酶中是高度保守的。在所分析的來自45個物種的78種鐵-硫加氧 酶序列中，具有至少15%同一性的所有52種加氧酶序列在對應(yīng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸112的位置具有W,盡管最高的總同 一性為僅僅38%。 該位置也被兩個保守的功能結(jié)構(gòu)域圍繞(圖18)。從而所產(chǎn)生的高水平 的除草劑耐受性DMOc是出乎意料的。
DMOc相對于未改變序列(DMOw;美國專利號7,022,896)的米 - 曼 參數(shù)分析揭示所述酶在催化效率方面不同DMOc比DMOw的效率高5 倍并且DMOc似乎具有更高的更新次數(shù)和更嚴(yán)4各的底物結(jié)合。此外， DMOc相對于天然酶在更低pH條件和更高溫度下更好地發(fā)揮功能。這 些結(jié)果表明基于期望的使用條件，如作物生長條件選擇用于特定轉(zhuǎn)基因 植物的DMO變體的可能性。本發(fā)明的一方面因此涉及為至少一個作物 物種鑒定候選作物生長環(huán)境，并基于例如DMOc和DMOw的動力學(xué)鑒定適于該環(huán)境的DMO酶。例如，本領(lǐng)域才支術(shù)人員可以在具體實施方案
中，選擇DMOc編碼序列，用于相對于其他植物物種或生長環(huán)境具有更
低的植物內(nèi)(,"/7/朋to)pH條件和/或在生長環(huán)境的情況下具有更高溫度
的植物中。通過摻入土壤(種植前摻入)；噴霧土壤(出苗前)；和噴 霧在植物頂部(出苗后處理)來施用麥草畏，而對麥草畏的耐受性水平 可以在才直物生長期間不同的時間而不同。
如上面指出的，在表達(dá)DMOc的轉(zhuǎn)基因植物中得到了對極高水平的 除草劑麥草畏的耐受性。在例如通常對甚至極低水平麥草畏敏感的煙草
中，產(chǎn)生了表達(dá)DMOc的轉(zhuǎn)基因植物，其耐受5.6 kg/ha或以上的麥草 畏處理，例如，比為控制闊葉雜草通常推薦的田間施用率高10-20倍。 當(dāng)將DMOc基因插入到煙草植物的葉綠體基因組中時，得到對至少28 kg/ha的麥草畏耐受性。也產(chǎn)生了帶有細(xì)胞核編碼的DMOc基因的轉(zhuǎn)基 因大豆、番茄和擬南芥(爿ra&tfo;^^ //2a"a"a )植物并且發(fā)現(xiàn)它們耐受 高水平的麥草畏。例如，DMOc向大豆植物的核基因組中的插入產(chǎn)生了 對2.8 kg/ha處理的耐受性，從而允許使用麥草畏控制表達(dá)DMOc的植 物田中的雜草。
從而表明DMOc在賦予麥草畏耐受性中是有效的，不需額外的編碼 序列，如嗜麥芽假單胞菌DI-6菌抹，鐵氧還蛋白或還原酶。經(jīng)修飾的 DMO基因作為孟德爾基因在遺傳上是穩(wěn)定的并且沒有明顯喪失外顯率 或表達(dá)。盡管用葉綠體轉(zhuǎn)運肽得到某種程度更強的表達(dá)，但是缺少轉(zhuǎn)運 肽編碼序列的具有DMO轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物也顯示出高水平的出苗后 麥草畏耐受性。
A. 核酸和重組構(gòu)建7本 1.麥草畏單加氧酶(DMO)
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了 DNA構(gòu)建體，其包含編碼麥 草畏單加氧酶多肽的核酸，所述麥草畏單加氧酶多肽在對應(yīng)于SEQ ID NO:l的112位的位置包含半胱氨酸。示例性DMO編碼序列在本文中以 SEQIDNO:2提供。該序列除了包含SEQ ID NO:l的112位的半胱氨酸 外，還包括相對于天然編碼序列在ATG起始密碼子后加入GCC密碼子 (丙氨酸)以加入Nco I限制酶位點和方便克隆。因此，SEQ ID NO:l 中的多肽也包括起始密碼子編碼的Met后緊鄰的額外的Ala殘基。將轉(zhuǎn)
10運肽序列用Bgl II和EcoR I ,人質(zhì)粒切除，然后克隆到pBluescript II KS+ 載體的BamH I和EcoR I位點中。該構(gòu)建體用作PCR反應(yīng)中的沖莫板， 所述PCR反應(yīng)使用在轉(zhuǎn)運肽編碼序列任一端加入Nco I限制性位點的引 物。用Nco I消化PCR產(chǎn)物允許在經(jīng)修飾的DMO基因的ATG起始密碼 子位點中插入轉(zhuǎn)運肽編碼序列。
從而，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了編碼SEQIDNO:l的多 肽的序列，包括但不限于SEQIDNO:2。如本領(lǐng)域公知的，這些序列的 同源序列和衍生物可以容易地制備和使用。例如，可以使用編碼與SEQ ID NO:l的DMOc多肽有至少90%序列同一性，包括與此序列至少約 92%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更高同 一性的DMO多肽 的核酸。也可以4吏用與SEQ ID NO:2提供的核酸有至少90%序列同一 性，包括與此序列至少約92%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 更高同一性并且編碼在112位包含半胱氨酸的DMO的核酸。在一個實 施方案中，使用GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715)的序列 分析軟件包用默認(rèn)參數(shù)確定序列同一性。該軟件通過分配相似性或同一 性程度而匹配相似的序列。
才艮據(jù)本y^開，可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)得到表達(dá)DMO多肽的多 核苷酸分子。從而可以制備能夠降解麥草畏的本文提供的DMOs的變體 并根據(jù)本文公開的方法測定活性。此類序列也可以例如從合適的生物 (包括降解麥草畏的細(xì)菌)鑒定(美國專利號5,445,962; Kmeger " a/., 1989; Cork和Kmeger, 1991; Cork和Khalil, 1995)。分離克隆的DMO序 列的一種方法是通過例如與從來源生物構(gòu)建的文庫進(jìn)行合適雜交，或者 爿使用來自來源生物的mRNA和基于所7>開的DMO設(shè)計的引物進(jìn)行 RT-PCR。本發(fā)明因此包括使用在嚴(yán)格條件下與本文所述的DMO編碼序 列雜交的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解通過增加鹽濃度和降低溫度可以使 得條件的嚴(yán)格性降低。從而，可以容易地操作雜交條件并且其將通常是 取決于希望的結(jié)果的選擇的方法。高嚴(yán)格條件的一個實例是5X SSC, 50%甲酰胺和42° C。通過在此類條件下進(jìn)行洗滌，如10分鐘，在這些 條件下不與特定耙序列雜交的那些序列將被除去。本發(fā)明的一個實施方 案從而包括使用DMO編碼核酸，所述核酸#皮定義為在5XSSC, 50%甲 酰胺和42° C下持續(xù)10分鐘的洗滌條件下與SEQ ID NO:2的核酸雜交
ii的核酸。
才艮據(jù)本領(lǐng)域/>知的:|支術(shù)，用本文描述的DMO多核苷酸序列也可以
化學(xué)合成變體。例如，通過亞磷酰胺化學(xué)在自動化DNA合成儀中可以 合成DNA序列?；瘜W(xué)合成具有許多優(yōu)點。具體地，化學(xué)合成是所希望
達(dá)。使用擬南芥密碼子選擇從而優(yōu)化用于在雙子葉植物中表達(dá)的此類序 列的實例是SEQIDNO:3中顯示的DMO序列。經(jīng)預(yù)測分別在2， 3, 112 位具有Ala， Thr, Cys的多肽在SEQ ID NO:l中給出。由于在緊鄰ATG 起始密碼子后加入丙氨酸密碼子以簡化載體構(gòu)建(如下述)，相對于野 生型DMO在2位加入了 Ala殘基。
并不是需要所有密碼子被改變以得到改進(jìn)的表達(dá)，而是優(yōu)選至少將
在宿主中;f艮少使用的密碼子改變成宿主優(yōu)選的密碼子，例如，更經(jīng)常用 于宿主中并且通常比罕見的非優(yōu)選的密碼子更容易翻譯的密碼子。通過
將大于約50%,最優(yōu)選至少約80%的非優(yōu)選的密碼子改變成宿主優(yōu)選
的密碼子，可以得到高水平表達(dá)。許多宿主細(xì)胞的密碼子優(yōu)先性是已知
的(PCT WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494;和美國 專利號5,689,052; 5,567,862; 5,567,600; 5,552，299和5,017,692)。通過 本領(lǐng)域已知的方法可以推導(dǎo)其他宿主細(xì)胞的密碼子優(yōu)先性。而且，使用 化學(xué)合成，可以容易地改變DNA分子或其編碼的蛋白質(zhì)的序列以例如 優(yōu)化表達(dá)(例如，消除干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的mRNA二級結(jié)構(gòu))，在方便的 位點加入獨特的限制位點，以及去除蛋白酶切割位點。
可以對蛋白質(zhì)的多肽序列，如本文提供的DMO序列進(jìn)行》f飾和改 變同時保留酶活性。下面是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸以產(chǎn)生等同的或甚 至改進(jìn)的經(jīng)》務(wù)飾的多肽和對應(yīng)的編碼序列的討i侖。在本發(fā)明的具體實施
改變DNA序列的密碼子可以實現(xiàn)氨基酸改變。
已知例如，某些氨基酸可以替代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其他氨基酸而與結(jié) 構(gòu)，如底物分子上的結(jié)合位點的相互結(jié)合能力沒有明顯損失。因為是蛋 白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)限定了該蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可以 在蛋白質(zhì)序列和當(dāng)然，在作為基礎(chǔ)的DNA編碼序列中進(jìn)行某些氨基酸 序列替代，并且仍然得到具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。從而預(yù)期可以在本文 所述的DMO多肽序列和對應(yīng)的DNA編碼序列中進(jìn)4亍多種改變而它們的生物效用或活性沒有明顯損失。
在進(jìn)行此類改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)
在對蛋白質(zhì)賦予相互作用生物功能中的重要性是本領(lǐng)域公知的(Kyte " a/., 1982)。公認(rèn)氨基酸的相對親水特征對所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有貢 獻(xiàn)，所述二級結(jié)構(gòu)又確定了該蛋白質(zhì)與其他分子如酶、底物、受體、DNA、 抗體、抗原等等的相互作用。每個氨基酸已經(jīng)基于它們的疏水性和電荷 特征被分配了疏水性指數(shù)(Kyte "a/., 1982),這些為異亮氨酸(+4.5);纈 氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲 硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8); 色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5); 谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸 (-4.5)。
本領(lǐng)域已知氨基酸可以;故具有相似親水指數(shù)或得分的其他氨基酸 替代并且仍然得到具有相似的生物活性的蛋白質(zhì)，即仍然得到生物學(xué)功 能等同的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行此類改變時，親水指數(shù)在土2以內(nèi)的氨基酸替代 是優(yōu)選的，在士l以內(nèi)是尤其優(yōu)選的，在土0.5是尤其更優(yōu)選的。這里，考 慮到天然和改變的氨基酸之間不同的親水指數(shù)并且將不被本領(lǐng)域技術(shù) 人員用于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生功能變體，所以在112位的色氨酸用半胱氨 酸替代的DMO具有生物活性并且得到耐受高水平麥草畏的植物這一觀 察結(jié)果是令人驚奇的。
本領(lǐng)域也理解基于親水性可以有效進(jìn)行類似氨基酸的替代。美國專 利4，554,101公開了蛋白質(zhì)的最大的局部平均親水性(如通過其相鄰氨 基酸的親水性控制)與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。如美國專利4,554,101 中詳述，下面的親水性值被分配給氨基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸 (+3.0);天冬氨酸(+3.0 ± 1);谷氨酸(+3.0 ± 1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺 (+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5 ± 1);丙 氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(隱1.5); 亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸 (-3.4)?？梢岳斫獍被峥梢蕴娲哂邢嗨朴H水性值的另 一氨基酸并且仍 然得到生物學(xué)等同的蛋白質(zhì)。在此類改變中，親水性值在士2以內(nèi)的氨基 酸替代是優(yōu)選的，±1以內(nèi)的氨基酸替代是尤其優(yōu)選的，在±0.5以內(nèi)的氨 基酸替代是甚至更尤其優(yōu)選的。考慮這些和多種前述特征的示例性替代是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨 酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸。再次，考慮到改變的和天然氨基酸之間的非常不同的親水性值
DMOc的活性是令人驚奇的。
而進(jìn)行指導(dǎo)。例如，在下面闡明DMO酶含有功能結(jié)構(gòu)域，如Rieske鐵 -硫簇和游離鐵的結(jié)合位點(例如，見圖18)。該信息與本領(lǐng)域關(guān)于蛋 白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域和修飾的知識相組合一般因此可用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的 DMO酶同時在本發(fā)明范圍內(nèi)保留酶的活性(見例如，Mason和Cammack， 1992; Jmng Wa/" 1996)。
2.轉(zhuǎn)化構(gòu)建體
用于本發(fā)明的DMO編碼多核苷酸將通常,皮導(dǎo)入細(xì)胞中作為構(gòu)建 體，其包含有效表達(dá)必須的表達(dá)控制元件。操作性連接表達(dá)控制元件與 編石馬序歹寸的方法是本4頁》或乂^^口的(Maniatis " 1982; Sambrook " a/., 1989)。表達(dá)控制序列是以任何方式參考轉(zhuǎn)錄控制的DNA序列。合適的 表達(dá)控制序列和使用它們的方法是本領(lǐng)域公知的。尤其可使用啟動子， 使用或不使用增強子，5'非翻譯區(qū)，用于將蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物靶向植 物細(xì)胞器，尤其葉綠體的轉(zhuǎn)運肽或信號肽，和3，非翻譯區(qū)，如聚腺苷 酸化位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道多種增強子、啟動子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)運 肽、導(dǎo)向信號序列和5，和3，非翻譯區(qū)(UTRs)可用于設(shè)計有效的植物 表達(dá)載體，如美國專利申請公開2003/01403641中描述的那些。
適于當(dāng)前和其他用途的啟動子是本領(lǐng)域公知的。描述此類啟動子的 實例包括美國專利6，437,217 (玉米RS81啟動子)，美國專利5,641,876 (稻肌動蛋白啟動子)，美國專利6,426,446 (玉米RS324啟動子)，美國專 利6,429,362 (玉米PR-1啟動子)，美國專利6,232,526 (玉米A3啟動子), 美國專利6,177,611 (組成型玉米啟動子)，美國專利5,322,938, 5,352,605, 5,359,142和5,530,196 (35S啟動子)，美國專利6,433,252 (玉米L3油質(zhì) 蛋白啟動子)，美國專利6,429,357 (稻肌動蛋白2啟動子以及稻肌動蛋 白2內(nèi)含子)，美國專利5,837,848 (根特異性啟動子)，美國專利 6,294,714 (光誘導(dǎo)型啟動子)，美國專利6,140,078 (鹽誘導(dǎo)型啟動子)，美國專利6,252,138 (病原體誘導(dǎo)型啟動子)，美國專利6,175,060 (磷缺乏誘 導(dǎo)型啟動子)，美國專利6,635，806 ( Y-coixm啟動子),和美國專利申請序 號09/757,089 (玉米葉綠體i^縮酶啟動子)?？梢允褂玫念~外啟動子是胭 脂堿合酶(NOS)啟動子(Ebert " "/., 198",章魚堿合酶(OCS)啟動子 (其在根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)，花椰菜花葉病毒啟動子,如花 椰菜花葉病毒(CaMV) 19S啟動子(Lawton " 1987), CaMV 35S啟 動子(Odell ef "/" 1985)，玄參花葉病毒35S-啟動子(Walker " 1987),蔗糖合酶啟動子(Yang " a/., 1990)， R基因復(fù)合啟動子 (Chandler W a/., 1989)，和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子等等。對于用 于本發(fā)明尤其有益的可以是CaMV35S (美國專利號5,322,938; 5，352,605; 5,359,142;和5,530,196), FMV35S (美國專利6,051,753; 5,378,619), PC1SV 啟動子(辨乂p美國專利5,850,019,和SEQ ID NO:24),和AGRtu.nos (GenBank才全索號V00087; Depicker " a/, 1982; Bevan " 1983)啟動 子。
通過使用編碼轉(zhuǎn)運肽的序列表達(dá)異源基因也可以得到益處。轉(zhuǎn)運肽 通常指當(dāng)連接到目的蛋白質(zhì)時將該蛋白質(zhì)導(dǎo)向特定組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞 位置或細(xì)胞器的肽分子。實例包括，但不限于，葉綠體轉(zhuǎn)運肽、核導(dǎo)向 信號，和液泡信號。葉綠體轉(zhuǎn)運肽尤其可用于本發(fā)明中用于將DMO酶 的表達(dá)導(dǎo)向于葉綠體。預(yù)期通過植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源還原酶和鐵氧還 蛋白降解麥草畏可以促進(jìn)DMO功能。植物葉綠體尤其富含還原酶和鐵 氧還蛋白。因此，在用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的麥草畏耐受性植物的優(yōu)選實施方 案中，可以使用編碼肽的序列，其將降解麥草畏的加氧酶導(dǎo)向葉綠體中。 備選地或額外地，也可以在細(xì)胞中表達(dá)異源還原酶和/或4失氧還蛋白。
編碼葉綠體導(dǎo)向序列的DNA可以優(yōu)選纟皮置于編碼DMO的序列上 游(5，)，但是也可以被置于編碼序列的下游(3'),或者編碼序列的上游 和下游。尤其可以將葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)改造為與將被導(dǎo)向于植物葉綠 體的蛋白質(zhì)的N-末端融合。許多葉綠體定位的蛋白質(zhì)從核基因表達(dá)為前 體并且被CTP導(dǎo)向于葉綠體，CTP在輸入步驟中被去除。葉綠體蛋白質(zhì) 的實例包括核酮糖-l,5,-二磷酸羧化酶的小亞基(RbcS2)、鐵氧還蛋白、 鐵氧還蛋白氧化還原酶、捕獲光的復(fù)合蛋白I和蛋白II，和硫氧還蛋白 F。已經(jīng)在體內(nèi)和體外闡明通過使用與CTP的蛋白質(zhì)融合體可以將非葉 綠體蛋白導(dǎo)向于葉綠體并且CTP足夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)導(dǎo)向于葉綠體。例如，已
15經(jīng)表明在轉(zhuǎn)基因植物中，合適的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，如擬南芥(爿ra6Wo戸w Aa/z"憩)EPSPS CTP(Klee " a/" 1987)和P"麗za /zj;6r^2 EPSPS CTP (della-Cioppa Wa/., 1986)的摻入將異源EPSPS蛋白質(zhì)序列導(dǎo)向于葉綠體 中。其他示例性葉綠體導(dǎo)向序列包括玉米cab-m7信號序列(Becker W a/., 1992; PCT WO 97/41228)和豌豆谷胱甘肽還原酶信號序列 (Creissen " a/., 1991; PCT WO 97/41228)。在本發(fā)明中，AtRbcS4 (CTP1; 美國專利5,728,925)， AtShkG (CTP2; Klee " a/., 1987), AtShkGZm (CTP2synthetic;見WO04009761的SEQ ID NO:14),和PsRbcS (Comzzi Wa/.， 1984)例如在DMO多肽的表達(dá)方面是尤其有益的。
作為翻譯前導(dǎo)序列發(fā)揮功能的5， UTR是位于基因的啟動子序列 和編碼序列之間的DNA遺傳元件。翻i爭前導(dǎo)序列存在于翻i奪起始序列 上游的完全加工的mRNA中。翻i奪前導(dǎo)序列可以影響一級4爭錄物向 mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻i奪前導(dǎo)序列的實例包括玉 米和牽?；峒さ鞍浊皩?dǎo)序列(美國專利號5,362,865)、植物病毒包膜蛋 白前導(dǎo)序列、植物mbisco前導(dǎo)序列，等等(Turner和Foster, 1995)。在本 發(fā)明中，尤其可發(fā)現(xiàn)益處的5， UTR是GmHsp (美國專利5,659，122), PhDnaK (美國專利5,362,865), AtAntl, TEV (Carrington和Freed， 1990), 和AGRtunos (GenBank檢索號V00087; Bevan " a/., 1983)。
3，非翻譯序列、3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或聚腺苷酸化區(qū)指DNA分子，其 連接到基因的編碼區(qū)并位于基因的編碼區(qū)下游并且包括提供聚腺苷酸 化信號和能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)信號的多核 苦酸。聚腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，引起在mRNA前體的3'末 端加入聚腺苷酸核普酸。聚腺苷酸化序列可來自天然基因、來自多種植 物基因，或來自T-DNA基因。3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的一個實例是胭脂堿合酶 3，區(qū)(nos3， ；Fraley"a/.， 1983)。已經(jīng)描述了不同3，非翻i奪區(qū)的用途 (Ingelbrecht " a/., 1989)。 來自碗豆(尸w謹(jǐn)贈》臓)RbcS2基因 (Ps.RbcS2隱E9; Coruzzi " a/., 1984)和AGRtu.簡(Rojiyaa " "/., 1987,
編碼dmJ的多核苷酸i子表達(dá)單位可以連接到含有可;選/可評分
標(biāo)記或賦予所希望性狀的基因的遺傳元件的表達(dá)單位中的第二種多核 苷酸分子。用于篩選假定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的常用基因包括(3-葡糖醛酸糖苷酶 (GUS)、 p-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Jefferson, 1987;
16Teen W a/., 1989; Koncz e/1"/., 1987; De Block W 1984),纟錄色焚光蛋白 (GFP) (Chalfie " "/., 1994; Haseloff " 1995;和PCT申請WO 97/41228)。
第二種多核苷酸分子可以包括但不限于，作為選擇標(biāo)記的基因。第 二種或另一種基因可以提供與植物形態(tài)、生理、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營 養(yǎng)增強、疾病或害蟲抗性或環(huán)境或化學(xué)耐受性相關(guān)的所希望的特征并且 可以包括遺傳元件，所述遺傳元件包含除草劑抗性(美國專利6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225，114; 6,107,549; 5,866，775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175),增加的產(chǎn)量(美國專利RE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 5,716,837),昆蟲控制(美國專利6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6，093,695; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 5,763,241),真菌疾病抗性(美國專利6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 6,506,962),病毒抗性(美國專利6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304，730),線蟲抗性(美國專利6,228,992),細(xì)菌疾 病抗性(美國專利5,516,671),才直物生長和發(fā)育(美國專利6,723,897; 6，518,488),淀粉生產(chǎn)(美國專利6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295),改變的油生產(chǎn)(美國專利6,444,876; 6,426,447; 6,380,462)，高油產(chǎn)量(美國專利6,495,739; 5，608,149; 6,483,008; 6,476,295),修飾的脂肪酸含量(美國專利6,828,475; 6,822，141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537，750; 6,489,461; 6,459,018)，高蛋白質(zhì)產(chǎn)量(美國專利6,380,466),果實成熟(美國專利 5,512,466)，增強的動物和人類營養(yǎng)(美國專利6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5，985,605; 6,171，640),生物聚合物(美國專利RE37,543; 6,228,623; 5,958,745和美國專利
發(fā)明者D·P·維克斯, P·C·C·馮, R·杜米特魯, S·弗拉辛斯基, T·E·克勒門特 申請人:孟山都技術(shù)有限公司;內(nèi)布拉斯加大學(xué)評議會