專利名稱：使用可逆修飾寡核苷酸擴增核酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及核酸化學領域，更具體而言，本發(fā)明涉及擴增核i^ 列或信號的方法和減少非特異性擴增的方法。
背景技術：
核酸擴增技術已被廣泛應用于臨床微生物學、血液檢測、食品安全、 遺傳病的診斷與預后、環(huán)境樣i生物學、藥物靶點發(fā)現(xiàn)和鑒定、法醫(yī)學以及 其他生物醫(yī)學方面的研究。其中核酸擴增的筒易高效性、特異性、靈敏度、 準確度、精確度，以及經濟可承受性至關重要。
核酸序列特異性擴增可以對特定序列進行靈敏的檢測。聚合酶鏈式反 應(PCR)和連接i^逸式反應(LCR)是兩種熱循環(huán)擴增技術。
相比PCR和LCR，等溫擴增技術是一種在基本不變的溫度下進行的 擴增方法。轉錄介導擴增(Transcription隱mediated amplification, TMA)、 基于核歹'J擴增(Nucleic acid sequence-based amplification ， NASBA)、 鏈置換才廣增(strand-displacement amplifeation, SDA)、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)、 單引物等溫擴增(single primer isothermal amplificatio， SPIATM)、指數(shù)單引物等溫擴增(exponential single primer isothermal amplification, X-SPIATM)、自主序列復制系統(tǒng)(self-sustained sequence replication, 3SR)和環(huán)介導等溫核酸擴增(loop mediated isothermal amplification, LAMP)均為等溫擴增的具體實例。核酸序列也 可通過信號擴增過程來檢測，比如循環(huán)探針技術(cycling probe)和侵入檢 測(InvaderAssay)。當雜交探針被核酸酶切除時，將會產生可檢測的信號。
由于所有的酶，無論其耐熱性如何，都在一定的溫度范圍內具有活性，
6這樣的性質會在其特異性、靈敏性、信噪比等方面對核酸擴增產生負面影
響。這已在PCR過程中被明確地證實。耐熱DNA聚合酶對PCR而言是 必不可少的。雖然耐熱DNA聚合酶活性最高的溫度在60-75°C ，但在低溫 下它依然具有活性。即使在室溫下它也仍然具有明顯的活性。但是其低溫 時的活性將會導致引物二聚體的形成和非特異性的擴增，從而降低檢測靈
使用熱啟動(hot-start)技術可以提高DNAPCR的效果。熱啟動技術是 指任何具有下述特征的組裝PCR反應的方法，即通過物理或化學方法使 得在低溫下^^應組分中的一種或多種成分與其他成分分離開來，而在高溫 下使得反應發(fā)生。熱啟動PCR技術分為以下幾種
1. 通過物理屏障分隔將必需組分分隔為至少兩部分，如美國專利 5，411，876、 5,565,339、 5,413,924和5,643,764所述(上述文獻均通過援引的 方式納入本文)。該屏障可通過高溫加熱來消除。
2. 使用可逆酶抑制劑來抑制酶在低溫下的活性，如美國專利 5,338,671、 5,677,152、 5,773,258、 6,183,998、 5,693,502、 5,874,557、 5,763,173、 6，020，130和6，183，967中所述(上述文獻均通過援引的方式納 入本文)。與抑制劑的結合方式是非共價的或共價的。這些方法的熱啟動 技術是在均一相中進行，這類技術也是目前最為廣泛使用的。
3. 輔助因子的相分離法，如美國專利6，403，341所述(該文獻通過援引 的方式納入本文)。Mg"在低溫下會沉淀，并會隨著溫度的上升而溶解。
一步法RT PCR(One-step RT PCR)是在一個反應容器中連續(xù)完成 RNA分子的逆轉錄過程與互補性cDNA分子的擴增過程，從而實現(xiàn)擴增 草巴點RNA的方法。革S點RNA分子包括艾滋病毒(HIV)、 丙型肝炎病毒 (HCV)、西尼羅河腦膜炎病毒(WNV)、人類流感病毒、禽5充感病毒、登革 病毒、埃博拉病毒等。在美國，檢測捐血者血液中是否存在HIV, HBV, HCV和WNV是強制性的。 一步法RT PCR在這些臨床檢驗以及血液檢 測時有重要的作用。遺憾的是，目前沒有一種熱啟動技術可以有效地應用 于一步法RTPCR,原因如下
1. 大部分的逆轉錄酶(逆轉錄過程的關鍵酶)不能作為熱啟動過程的 耙點，原因在于它們不具有耐熱性，會在高溫孵育后喪失活性。
2. 待檢的RNA分子是不穩(wěn)定的，在高溫下會降解。而二價金屬離子 如Mg^的存在會大大促進RNA分子的降解。目前沒有一種已有的熱啟動技術可以在不損害靶點RNA分子的前提下進行。
3.逆轉錄過程的長時間孵育(一般在30分鐘或更長)會極大地提高副 反應發(fā)生的幾率，因此將會導致檢測靈敏度的明顯降低。這表明基于酶抑 制劑的熱啟動技術不能改善一步法RT PCR的效果。
鑒于核酸擴增的現(xiàn)實重要性，核酸檢測領域急需一種可以改善核酸擴 增反應特別是一步法RT PCR的效果的新技術。本申請中將會詳細描述一 種新型核酸擴增反應的可控啟動。在本說明書全文中提及的所有專利，專 利申請以及出版物均以援引的方式納入本文。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，目前還沒有一種涉及寡聚核苷酸的熱啟動技 術，作為核酸擴增的必需成分，寡聚核苷酸是熱啟動或可控啟動技術的理 想耙位。
本發(fā)明提供了一種耙核酸序列或信號的擴增方法，其中所用的擴增反 應混合物含有至少一種具有非羥基3，端的可逆修飾寡核苦酸，該非羥基3， 端可在一種化學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍作用下轉化為幾基3，。
本發(fā)明還提供了一種乾核酸序列或信號的擴增方法，包括下述步驟
(a) 把一個懷疑含有靶核酸的樣本與擴增反應混合物相接觸，該反應 混合物含有至少一種具有非羥基3'端的可逆修飾寡核苷酸，該非鞋基3， 端可在一種化學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍作用下轉化為羥基3，
，
(b) 將步驟(a)中混合物與所述的化學物質相接觸和/或暴露于輻射和/ 或置于一定溫度范圍下，充分作用一段時間以再生羥基3，端；和
(c) 進4于擴增反應。
本發(fā)明還提供一種可以擴增耙核糖核酸序列的方法，所述方法包括如 下步驟
(a)將一個懷疑含有靼核糖核酸的樣本與擴增反應混合物相接觸，該 反應混合物至少含有一個具有非羥基-3，端的一種第一可逆修飾寡核苷酸， 該非羥基3，端可在一種第一化學物質和/或第一種輻射和/或一個第一溫度
8范圍作用下轉化為幾基3'端；
(b) 在核糖核酸的逆轉錄條件下，觶育步驟(a)中混合物；
(c) 將步驟(b)中混合物與所述第一化學物質相接觸和/或暴露于第一 種輻射和/或置于所述第一溫度范圍下，充分作用以使得所述第一可逆修飾 的寡核苷酸的3，端再生為幾基；
(d) 進行擴增反應，產生引物延伸產物。
在上述靶核糖核酸序列擴增方法的一個實施方案中，擴增反應混合物 還含有至少一種第二可逆修飾寡核苷酸，其中所述第二可逆修飾寡核苷酸 具有非羥基3，端，且該非羥基3，端可以在一種第二化學物質和/或輻射和/ 或一個第二溫度范圍作用下轉化為羥基3，端；其中所述方法還包括下述步 驟在步驟(b)之前，將步驟(a)中的混合物與所述第二化學物質相接觸和/ 或暴露于輻射和/或置于所述第二溫度范圍下，充分作用以^吏得所述第二可 逆修飾寡核苷酸的3，端再生為羥基。
本發(fā)明同時還提供了 一種具有非羥基3'端的可逆修飾寡核普酸，該非 羥基3'端可以在一種化學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍作用下轉化為 羥基3，端。
本發(fā)明還提供一種核酸擴增反應混合物或試劑盒，所述混合物或試劑 盒含有本發(fā)明的可逆修飾寡核香酸。
本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸的非羥基3，端的實例可以是但不限于羧 酸酯基，含有硅烷基醚的醚基和光解基等基團。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法可用于含有兩酶體系的一步法 RT PCR過程，所述兩酶體系中至少使用一種逆轉錄酶和一種耐熱DNA 聚合酶；或者本發(fā)明可用于含有單酶體系的一步法RTPCR過程，所述單 酶體系中僅使用一種兼有逆轉錄酶和耐熱DNA聚合酶雙重功能的酶。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸的非羥基3， 端有至少25%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少75%和最優(yōu)選卯％被轉化為 鞋基3，端。
本發(fā)明的基于寡核苷酸的可控啟動核酸擴增技術，不僅可以作為熱啟 動技術的替代技術，而且還可以改善多種核酸擴增反應尤其是RT-PCR反 應的效果。


圖1.使用酸酐修飾寡核苷酸。
催化劑DMAP在TEA中催化馬來酸酐與寡核苷酸的5'和3，羥基形成酯。
圖2.寡核苷酸馬來酸酯的水解。
鞋胺是一種強的親核化學試劑，能夠有效地破壞氛基酯鍵。由此再生 5，和3，羥基并形成羥基酰胺。
圖3.使用三曱基氯烷硅修飾寡核苷酸。
寡核苷酸的5，和3'羥基在咪唑的作用下與叔丁基二曱基氯硅烷反應 生成叔丁基二曱1^:烷醚。
圖4.氟化物作用下的曱硅烷基醚切除。
甲硅烷基醚被氟化物水解，由此再生5，和3'羥基。
圖5.DNAPCR中，可逆4參飾寡核苷酸的應用導致引物二聚體形成的 減少。
圖5a是有模板(T+)和無模板(即無模板對照，NTC)的條件下，常規(guī)未 修飾寡核苷酸(R)和修飾寡核苷酸(M)的擴增曲線。PCR在常規(guī)的冷啟動 Taq聚合酶的作用下進行。用Sybr Green 染料進行擴增的監(jiān)測，這種染 料含有可對雙鏈特異性核酸著色的熒光團。Sybr GreenTM染料以一種非序 列特異性方式對雙鏈DNA進行檢測。因此擴增的引物二聚體和乾序列均 被檢測到，而引物二聚體和靶序列的擴增產物的退火曲線是不同的(圖 5b)。
圖6. —步法RT PCR反應條件下，含有常規(guī)未修飾寡核苷酸的熱啟 動Taq DNA聚合酶對二聚體的形成無抑制作用。
在一步法RT PCR條件下，常規(guī)的Taq DNA聚合酶(regT)和熱啟動 Taq DNA聚合酶(hsT)無論在有模板(T"和無模板(即無模板對照，NTC) 的條件下均產生引物二聚體。擴增曲線和退火曲線分別示于圖6a和圖6b。
圖7.使用修飾寡核苷酸時，引物二聚體形成的減少。
無模板時，所有PCR反應均在常規(guī)TaqDNA聚合酶的作用下進行， 因此觀察到的所有產物均為引物二聚體。這是一種可以檢測在不同情況下 二聚體形成程度的方式，引物二聚體形成得越多，擴增曲線上升得越早。
常規(guī)未修飾寡核苷酸(R)產生引物二聚體。有逆轉錄酶(RT,的情況下，
10將產生比無逆轉錄酶(RT-)存在時更多的引物二聚體，在~4循環(huán)中不同的Ct值中得到充分反映。相比之下，在使用修飾寡核苷酸(M)時，引物二聚體將會減少。逆轉錄酶的存在沒有導致更多引物二聚體的形成。
圖8.修飾寡核苷酸對一步法RTPCR效果的改善
使用修飾寡核苦酸(M)時與使用常規(guī)寡核苷酸(R)時相比，引物二聚體的Ct值滯后11個循環(huán)。有常規(guī)寡核苷酸時，嚴重的引物二聚體形成導致粑序列沒有擴增，即使在存在1250個靼序列拷貝時情況也是如此(圖8b)。相比之下，如擴增產物的退火曲線所示，使用修飾寡核苷酸時產生純凈的不含引物二聚體的革巴序列擴增。
表l.引物二聚體可能的種類數(shù)量與擴增系統(tǒng)中存在的寡核苷酸數(shù)量的對比
此表的建立基于以下假設
1. 每個靼序列擴增需要兩種不同的寡核苷酸；
2. 每個引物二聚體(PD)由兩種不同的寡核苷酸形成；
3. 任意兩種寡核苷酸均能且只能形成一種引物二聚體。以下公式用于計算引物二聚體可能的種類數(shù)量(弁PD):
#PD =N(2N-1)
N是待擴增的靶點數(shù)。
當N增加時，寡核苷酸數(shù)量線性增加。而幷PD呈幾何級數(shù)增加。例如，一個單重擴增系統(tǒng)中，有兩種寡核苷酸。在這樣一個單重系統(tǒng)中，只有一種靶定位的擴增和一種引物二聚體，弁PD/N的比值是1。而在一個十重擴增系統(tǒng)中，有二十種寡核苷酸和十種耙序列，此時，弁PD增加到1卯，而弁PD/N的比值是19。
引物二聚體種類數(shù)目的幾何級數(shù)增加使得多重PCR的靶序列擴增非常困難，對引物二聚體形成幾率大大提高的一步法RTPCR而言就顯得尤為困難。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種乾核酸序列或信號的擴增方法，其中所用的擴增反應混合物含有至少一種可逆修飾寡核苷酸，該寡核苷酸含有一種非羥基3，端基團，該非鞋基3，端可以在一種化學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍
ii作用下轉變?yōu)榱u基3，端。
"核酸擴增"是指核酸序列的擴增(例如PCR, RT-PCR)或者核酸信號的擴增(例如侵入檢測)。
一般情況下，用于核酸擴增的寡核苷酸都有一個3，羥基。3，羥基是使得寡核苷酸可被核酸聚合酶延伸和可纟皮核酸連接酶連接所必需的。它還可以影響i.對被稱為校對活性的3，—5，核酸酶活性的敏感性；ii.侵入檢測中可切除結構的形成。因此，對寡核苷酸引物3，鞋基的修飾可以有效地抑制其在擴增反應中的功能。
選擇合適的修飾基團的標準是
1. 產生完全修飾的或接近完全修飾的寡核苷酸的過程。
2. 被修飾的寡核苷酸在存貯條件下具有穩(wěn)定性。寡核苦酸一般存放在4。C或零下20。C的水溶液中，在此條件下不會發(fā)生可測出的自發(fā)逆轉反應。
3. 用于去修飾作用的化學物質和切割產生的產物不會千擾核酸擴增。優(yōu)選的是在一個均一系統(tǒng)中進行沒有額外操作步驟的可控啟動，因此，所述化學物質和/或切割產物既不應能明顯抑制酶(聚合酶，裂解酶，核酸酶等)的活性，也不應能夠改變反應的特異性，這一點很重要。
4. 在可以有效進行逆轉修飾反應的溫度下，反應體系中的酶仍然具有熱穩(wěn)定性。例如，在PCR體系中，逆轉反應發(fā)生的溫度最好高于60C對TMA核酸擴增而言，逆轉反應的溫度應該低于45。C。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸具有一個3'羧酸酯基。為了再生3，幾基，使用包括但不限于下列的化學物質疊氮化合物、咪唑、吡啶、羥胺、肼和四丁基氫氧化銨等。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸有一個3，甲硅烷基醚基。為了除去3，甲硅烷基并再生3，鞋基，該反應體系中使用了含有氟的化學物質。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸有一個3，醚基。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的可逆修飾寡核苷酸有一個通過光裂解而再生3，幾基的3，修飾基團。該光解基團可以在光作用下或者光與一種化學物質的組合作用下被去除。
本發(fā)明的寡核苷酸的修飾物通過以下方式結合到寡核苷酸上
1.通過合成后修飾。2. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用帶有修飾物的合成載體。
3. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用帶有被修飾的核苷的合成載體。
4. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用被修飾的核苷磷酰胺。合成方 向可以是5，到3，，也可以是3，到5，。
5. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用一種試劑。 除了改進通過PCR反應的熱啟動進行的定量PCR擴增反應夕卜，本發(fā)
明還能夠改善通過等溫擴增進行的定性與定量的核酸擴增反應。
使用各種等溫擴增技術，如SDA、 TMA、 NASBA和RCA定量檢測 核酸(Walker,1996; Spears， 1997; Nadeau， 1999; Leone, 1998; Nilsson， 2002)已見于報道，但是這些方法的準確性和精確性顯然有待改善。導致 定量測定效果不好的原因之一是缺乏擴增反應的可控啟動。
本發(fā)明中，核酸擴增使用的寡核苷酸含有不是羥基基團的3，基團。在 化學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍作用下，該3，基團可以再生成3，羥 基。3，羥基的再生可通過下列途徑來確保核酸擴增的進行
i. 核酸聚合酶作用下的草巴序列擴增。
聚合酶介導靶序列擴增的方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、滾環(huán)擴增 (rolling circle amplification, RCA)、 鏈置換擴增(strand隱displacement amplifeatkm ， SDA)、 單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification, SPIATM)、指數(shù)單引物等溫擴增(exponential single primer isothermal amplification ， X-SPIATM)、 環(huán)介導擴增(loop mediated amplification, LAMP)、基于核^^列的擴增(Nucleic acid sequence-based amplification ， NASBA)、 轉錄介導擴增 (Transcription-mediated amplification , TMA)和自主序列復制系統(tǒng) (self-sustained sequence replication, 3SR)。其中3，羥基是核酸聚合反應必需的基團。
ii. 連接介導靶序列擴增。
在這類反應中，連接作用是產生擴增耙序列的關鍵步驟，包括的技術 有連接酶鏈式反應(LCR)、允許(enabled)LCR(美國專利No.6，511，81t)中 有述)、缺口-LCR(gap-LCR，美國專利No.5，427,930)和連接介導PCR。
在連接介導PCR中，連接反應在PCR過程之前發(fā)生。連接反應是將 一個引物序列連接到靶標上。用于連接反應和PCR的寡核苷酸都是本發(fā) 明的主題。
13侵入檢測
侵入檢觀'J(美國專利No.6，348，314、 6，0卯，543、 6,001,567、 5,985,557、 5,846,717和5,837,450，上述所有文獻均通過援引的方式納入本文)是一種 信號擴增檢測。,板， 一個上游侵入寡核苷酸和一個與上游侵入寡核苷 酸有部分重疊的下游寡核苷酸形成一個侵入結構。Flap內切核酸酶切除下 游寡核苷酸，產生檢測信號。發(fā)現(xiàn)侵入寡核苷酸的3，端顯著影響酶切反應。 事實上，形成的切除結構與帶有一個非羥基3，端的侵入寡核苷酸極大地削 弱了酶切反應。
通過在低于反應溫度的溫度下抑制引物二聚體的形成/非特異性反應 以及控制反應的啟動，本發(fā)明可以改善上述核酸擴增方法的靈敏度和定量 能力。
本發(fā)明的寡核苷酸含有一段與所需的靶核酸序列特異性雜交的序列。 在一個實施方案中，寡核普酸只含有一段與耙核酸序列互補的序列。在另 一個實施方案中，寡核苷酸含有一個與耙序列非互補的區(qū)域，非互補的一 段序列位于寡核苷酸的5，區(qū)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸含有一個可以改變的二級結 構，例如，在由擴增形成的二級結構上消失或減少。
寡核苷酸可能由五部分組成
2. 糖基
3. 核苷酸之間的連接基團
4. 用于產生檢測信號的基團
5. 其它基團
1.堿基可以是任何天然堿基包括但不限于腺噤呤、N6曱基腺噤呤、 N6異戊烯基腺噤呤、鳥噤呤、7-甲基鳥噤呤、Q(核)香、丫(核)苷、次黃(噤 呤核)苷、胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、二氫尿嘧啶、 假尿嘧咬、4-硫脲嘧啶和胸腺嘧啶。也可以使用堿基類似物包括但不限 于7-去氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、2-氛基嘌呤、2， 6-二氬基嘌呤(腺嘌呤 和鳥噤呤)、2-和/或6-硫基噪呤(腺噤呤和鳥噤呤)、5-溴尿嘧啶、5-硝基吲 哚、5-丙炔基尿嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、5-苯基尿嘧啶、2-N-甲基鳥 噤呤、5-丁炔基尿嘧啶、二曱基噻唑尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-苯基胞嘧啶、5-丁炔基胞嘧啶、二曱基噻唑胞嘧啶、9-氨基乙氧基吩噁秦、5-N-氨基己基氨基曱酰尿嘧啶、6-氮(雜)胸腺嘧啶、N、咪唑丙基-2-氨基腺嘌呤、 N、咪唑丙基-2-氨基鳥嚆呤、已被修飾的堿基如美國專利No.6，001,611所 述。最常用的堿基是腺噤呤、鳥噤呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
2. 寡核苷酸的骨架包括5，—3'磷酸二酯鍵，或是其各種不同的修飾 體。修飾作用的例子包括像肽核酸(PNA)中的肽鍵、硫代磷酸酯、二硫代 磷酸酯、N3， —05，氨基磷酸酯、03，-N5，氨基磷酸酯、3'硫代磷酸酯、5， 硫代磷酸酯、反向鍵、曱基膦酸酯、嗎啉核酸、硼烷磷酸酯、磷-N-丁基 酰胺和亞甲基曱基亞胺、d-間隔分子以及碳連接分子。
3. 在本發(fā)明中所使用的寡核苷酸的糖基通常是核糖和/或2-脫氧核 糖。也可能含有其他一種或多種糖單元，例如2-0-烷基核糖、2-氨基核糖、 2-氟核糖、阿拉伯糖、2-脫氧阿拉伯糖、2-脫氧-2-氟阿拉伯糖、1, 5-己糖 醇酐、鎖核酸(LNA)中的2-0，4-C-亞甲基核糖以及環(huán)己烯骨架。
4. 在本發(fā)明中，寡核苷酸可能含有一種信號發(fā)生單元。此單元可為可 以通過物理、化學、光化學、免疫化學和生物化學方法進4于檢測的任意單 元，所述方法包括但不限于熒光、化學發(fā)光、生物發(fā)光、電發(fā)光、磷光、 時間分辨光譜、熒光偏振、酶反應、輻射、比色、質i普法、磁方法、電泳 和色諳法等方法。
在一個實施方案中，產生信號單元包括一個指示單元和一個調控單 元，兩單元之間被一段序列分割開來，該序列可以形成核酸酶和核酶切割 位點。比如Takara / Clontech的Q-酶檢測。
在另一個實施方案中，產生信號單元包括一個標記單元和一個淬滅單 元，當寡核苷酸處于單鏈狀態(tài)時，淬滅單元可以淬滅標記單元。當處于雙 鏈狀態(tài)時，信號產生。Amplifluor 和Scorpion 是兩種代表性的這類 技術。標記單元與淬滅單元的相互作用可以是任何兩個合適實體之間相互 作用，所述實體包括但不限于小分子，比如熒光團與它們的淬滅團，還可 以是大分子，比如蛋白質分子(Boute， 2002)。兩者之間相互作用的產生可 基于任何合適的機制。比如，標記單元與淬滅單元的相互作用可以基于共 振能量轉移，包括但不限于熒光共振能量轉移(FRET)、發(fā)光共振能量轉 移(LRET)、磷光共振能量轉移(PRET)和生物發(fā)光共振能量轉移(BRET)。
在各種標記單元和淬滅單元中，F(xiàn)RET探針廣泛應用于擴增靶分子的 檢測。最常用的FRET探針有兩個相互作用的單元，其一是熒光供體基團，另一個是熒光受體基團。雖然熒光受體基團可以M熒光的基團，但是優(yōu)
選的受體是非熒光基團。供體基團可以置于5，端、中間、或者3，端，受體 基團也一樣。優(yōu)選的是將供體基團置于5，端。當探針與耙核酸雜交時，結 構特異性核酸酶將探針切割，使得供體基團與受體基團分離，并使得受體 釋放原先被淬滅的供體熒光。
本發(fā)明的探針的產生信號單元還可以有兩種以上的可以相互作用的 單元。例如，美國專利No.5，952，180中公開了一種方法，可以產生帶有特 異性熒光發(fā)射光譜的可延伸寡核苷酸。其獨特的熒光發(fā)射光鐠是由組合的 熒光能量轉移標簽產生的。在波長移動探針技術的另一個實例中，此探針 帶有三種相互作用的基團(美國專利No.6，037，130)。
在另一個實施方案中，寡核苷酸本身可以是一個與指示單元相互作用 的調控單元。例如，Nurmi報道過一種單一標記熒光鋱螯合探針的合成以 及它在PCR產物檢測中的應用(Nurmi， 2000)。
所述寡核苷酸還可以是雙重或三重信號發(fā)生器的一部分。例如，本發(fā) 明的探針可以是才艮據美國專利No. 6，432，642所述的方法制備的雙重寡核 苷酸。Li等人描述了另一種包括兩個互補的寡核苷酸的雙重探針(Li， 2002)。此外，本發(fā)明中的探針還可以是根據制備三重分子信標的方法 (Nutiu, 2002)而制備的三重分子。 一個不同點在于寡核苷酸同時參與了 擴增反應和檢測反應。
5.本發(fā)明的寡核苷酸還可以含有位于選定位點的基團。這些基團包括 但不限于DNA小溝結合物、芘、膽固醇、吖啶、生物素、毛細管電泳遷 移修飾物、胺、羧基、磷酸鹽和硫醇等，這些基團可以促進靶點結合、促 進與表面或其他分子結合或有利于毛細管電泳檢測。
對寡核苷酸上羥基的修飾是保護羥基、標記寡核苷酸、加入特異官能 團、改變諸如核酸酶抗性、結合親和力等各種特性的一種常用方法。例如 自動化寡核苷酸合成中，在N-甲基咪唑和四氫呋喃(THF)存在下，使用乙 酸酐來進行帽化作用。
本發(fā)明中，合適的修飾基團需要滿足以下要求 1.具有再生3，羥基的能力。
優(yōu)選地，10%到100%的修飾寡核苷酸可以再生其3，羥基。更優(yōu)選地， 至少50%的修飾寡核苦酸可以再生其3'羥基。再更優(yōu)選地，至少75%的
16修飾寡核苷酸可以再生其3，鞋基。最優(yōu)選地，至少卯％的修飾寡核普酸 可以再生其3'羥基。3'羥基的再生可以在核酸擴增開始之前發(fā)生或者伴隨 著擴增過程的進行而逐漸發(fā)生。
2. 可靠的修飾過程產生完全修飾或幾乎完全修飾的寡核苷酸。核酸擴 增體系中存在的未修飾寡核苷酸會削弱本發(fā)明的優(yōu)勢。對核酸檢測產生負
面影響所需的未^f多飾寡核苷酸所占比例與特定的擴增體系有關。
3. 修飾寡核苷酸在儲存條件下應具有穩(wěn)定性，不會發(fā)生可測出的自發(fā) 逆轉反應。存儲溶液必須與核酸擴增反應體系相兼容。
在所有成分均存在M應混合物中，它應該也具有足夠的穩(wěn)定性。這 一性質對化學輔助激活非常重要。優(yōu)選地，溫度的升高能夠極大地加速激 活過程。
4. 逆轉反應的條件應該與核酸擴增過程相兼容。優(yōu)選地，3'修飾寡核 苷酸的激活與核酸擴增在同一個系統(tǒng)中進行。因此，用于激活的化學物質、 激活產物、溫度、pH、離子強度、溶劑、波長、光激活過程中的光強度 和波長等均應該與核酸擴增過程相兼容。
本發(fā)明的寡核苷酸含有一個非幾基3，基團，優(yōu)選的基團為
1. 羧酸酯基團
2. 包含有曱硅烷基醚基團的g
3. 光解基團
本發(fā)明中，用于修飾寡核苷酸的修飾劑是通過以下方式連接到寡核苷 酸上
1. 通過合成后修飾。
2. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用帶有修飾物的合成載體。
3. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用帶有被修飾的核苷的合成載體。
4. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用被修飾的核苷磷酰胺。合成方 向可以是5，到3，，也可以是3，到5，。
5. 通過寡核苷酸合成儀，該合成儀使用一種試劑。
用寡核苦酸合成儀進行的合成優(yōu)于合成后修飾。
當通過合成后修飾作用將修飾物連接到3，端時，5'游離羥基很可能也 被修飾。
17在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸含有一個3，羧酸酯基。 酯可以包括但不限于曱酸酯、苯曱酰甲酸酯、卣代乙酸酯、曱氧基乙酸 酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、馬來酸酯及其衍生物、琥珀酸 酯及其衍生物、4-氧代戊酸酯、新戊酸酯、丁烯酸酯、4-曱氧基丁晞酸酯 和3-苯丙酸酯等。
用化學物質再生3，羥基。這種化學物質可以包括但不限于疊氮化物、 咪唑、吡啶、鞋胺、肼和四丁基氫氧化銨。
當寡核苷酸的?；饔迷诤铣珊筮M行時，使用酸酐的3，羥基的酰化需 要堿性溶劑，比如三乙胺(TEA)。其他堿性溶劑例如吡咬、苯胺、二乙胺、 三甲胺和吡咯烷酮。優(yōu)選地，在反應中存在催化劑，例如二曱基氨基吡啶 (DMAP)、氟化物、l-曱基咪唑、4-吡咯淋并吡啶、2-羥基吡啶。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸含有一個3'馬來酸酯 基。用羥胺來再生羥基。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸帶有一個3，甲硅烷 基醚。
該曱硅烷基醚選自三甲基曱硅烷基醚、三乙基曱硅烷基醚、三異丙 基甲硅烷基醚、二曱基異丙基曱硅烷基醚、二乙基異丙基甲硅烷基醚、二 甲基己基甲硅烷基醚、叔丁基二曱基曱硅烷基醚、叔丁基二苯基曱硅烷基 醚、三苯甲基甲硅烷基醚、三對二曱苯基甲硅烷基醚(tri-p-xylsilylether)、 三苯基曱硅烷基醚、二苯基曱基曱硅烷基醚與叔丁基曱氧基苯基曱硅烷基 醚。
在存在叔胺堿(例如咪唑、吡咬、三乙胺)的條件下，可以通過4吏用三 曱基氯硅烷處理羥基使其轉變?yōu)闀豕柰榛选?br> 曱硅烷基醚基不受大部分的氧化劑和還原劑的影響，且在大部分非水 溶性的酸和堿中保持穩(wěn)定。叔丁基二曱基曱硅烷基g在pH范圍2~12 的水溶液中具有穩(wěn)定性，因此它是最廣泛應用的羥基修飾基團。
曱硅烷基醚基的穩(wěn)定性已被廣泛研究，三甲基甲硅烷基是最容易被曱 硅烷基化的，但是它也是最容易被水解的。用叔丁基取代三甲基甲硅烷基 的一個曱基會生成叔丁基二甲基曱硅烷基，此基團的穩(wěn)定性大概是TMS 基團的104倍。
通常用氟離子處理來去除甲硅烷基醚基團，氟離子可以來自于四丁基 氟化銨、氟化鈉、氟化鉀、氟化鋰、氫氟酸。
18在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸含有3，醚基，優(yōu)選的 醚基是四氫呋喃醚基。
一種醚基是烯丙醚基，此基團可以被把或銠催化劑水解。
另 一種醚基是對甲氧苯基醚基或對曱氧千基醚基或3，4-二曱氧節(jié)基醚 基或(4-甲氧基苯氧基)甲基醚基，此醚基可用硝酸高鈰銨去除。
也可以使用對路易斯酸催化劑介導水解敏感的醚。這些醚包括甲氧基 乙氧基甲基(MEM)醚、甲氧基甲基(MOM)醚、鄰曱氧基苯酚甲基(GUM) 醚、四氫吡喃基醚、四氫噢"^基醚。
路易斯酸催化劑來自于ZnX2、 MgX2、 AgX、 CuX2、 MnX2、 SnX2、 FeX、 CoX、 PdX2、 HgX2、 FeX3、 A1X3、 LiBF4、 TiClj等。X是卣原子。
3'硅烷氧基甲醚或2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲醚能夠被氟化物移除，這 些氟化物選自四丁基氟化胺、氟化鈉、氟化鉀、氟化鋰、氬氟酸。
LiBF4和/或氟化物能夠水解3，端的2-(三甲M烷基)乙氧基甲醚，從 而再生羥基。
3，甲基醚可以被例如BBr3， SiClj， Nal，和AIX3的一種或多種化學物 質水解。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸含有一個3'修飾基 團，此基團能夠通過光解切割而再生3，羥基。這些3，修飾基團選自含有對 甲氧基苯曱基醚、硝酸酯和碳酸鄰硝基苯曱酯的化學基團。
除了光解切割外，也可以在反應體系中加入化學物質來減少對輻射強 度和/或時間的要求。例如，當對甲氧基苯曱基醚被紫外光&280nm)切割 時，可以在反應體系中加入硝酸高鈰銨來加速水解反應。
修飾基團、激活物質的性質、化學物質濃度、溫度以^^應體系中的 其它因素，比如pH、離子強度等均能夠影響修飾劑去除過程的動力學和 熱動力學特性。如果用輻射來再生3，幾基，輻射的強度和波長也會影響激 活過程的速度和完全性。
本發(fā)明在各種核酸擴增方法中的應用
為了更好的理解如何將本發(fā)明用于核酸擴增方法，下面通過一些現(xiàn)有 的核酸擴增方法和所使用的酶類來說明本發(fā)明。本發(fā)明在侵入檢測中的應用
侵入檢測是一種信號擴增技術，如美國專利No. 6,348,314; 6，0卯，543; 6,001,567; 5，985，557; 5,846,717和5,837,450中所述，上述文獻均通過 援引的方式納入本文。
在侵入檢測中，上游侵入性寡核苷酸和下游信號產生探針寡核苷酸與 靶分子進行雜交，形成切割結構。Flap內切核酸酶切割雜交的探針，產生 可探測信號。與其它耐熱酶一樣，F(xiàn)lap內切核酸酶在較寬的溫度范圍內具 有活性。它除了可以切割目標切割結構外，還可以切割4艮多結構。反應體 系中的寡核苷酸可以形成不同的分子內結構和分子間結構，它們大部分僅 在低溫下保持穩(wěn)定。對這些結構的切割會產生較高的背景信號或較低的可 檢測信號。減少甚至消除這些不想要的切割可以提高檢測實驗的質量。
使用本文所述的具有修飾3'端的寡核苷酸是一種減少非模板依賴性 切割的好方法。據報道，上游侵入性寡核普酸的3'基團對切割有重要影響 (Kaiser， 1999)。所有3，羥基的替代物，包括3，脫氧、3，磷酸、3，D-間隔物 會對其產生巨大的抑制作用。在一些例子中，這些替代物可以產生幾乎完 全的抑制作用。這些都清楚地表明3，羥基在切割時的重要性。本發(fā)明中， 使用一種帶有可逆修飾3，端的寡核苷酸來控制^檢測的啟動，目的是改 善侵入檢測的定量能力。
侵入檢測還能夠在無需進行逆轉錄的條件下檢測RNA分子。RNA分 子對熱很敏感，尤其在二價金屬離子如Mg"存在時更為敏感，而該離子 是維持核酸酶活性所必需的。當檢測RNA靶點時，優(yōu)選的熱啟動條件是 溫和的。本發(fā)明提供了可用于多種激活條件的修飾劑?？梢匀菀椎卮_定激 活反應的溫和條件。其中一個溫和激活的例子是放射激活，這種激活很溫 和，不會損害靶RNA分子。在這一點上，與基于酶熱啟動技術的化學修 飾作用相比，本發(fā)明具有明顯的優(yōu)勢。
在聚合膝漣式反應中的應用
眾所周知，熱啟動可以明顯改善PCR的擴增性能。已經開發(fā)了多種 熱啟動方法用于改善PCR擴增技術。這些方法可^皮分為以下幾種
1.形成物理屏障，可以在低溫下將發(fā)生副反應所需的成分分離開來。 美國專利No. 5,411,876、 5,565,339、 5,413,924和5，643，764描述過形 成這樣一種屏障的技術，該屏障隨著溫度的上升將會消失。但是這一系統(tǒng)并不方便。在這樣一種非均一體系中，各種成分的混合也是一件^f艮困難的 事情。
2. 鎂沉淀(美國專利No.6，403，341)
鎂是保持DNA聚合酶活性的關鍵元素。在該發(fā)明中，在低溫下鎂沉 淀，因此不能參與DNA聚合反應。當達到一個合適的溫度時，鎂的溶解 度升高。由此鎂從沉淀中釋放而激活DNA聚合酶。但是，這是一個非均 一的熱啟動體系，會面臨如l中所述的問題。同時，已沉淀的鎂的分配是 比較困難的。
3. 抑制性分子與DNA聚合酶的可逆非共價結合 這樣的抑制性分子可以是抗體(美國專利No. 5,338，671)或者是寡核
苷酸(美國專利No. 5，693，502、 5，874，557 、 5,763,173、 6,020,130和 6,183,967)。抑制劑/DNA聚合酶復合物的穩(wěn)定性具有溫度依賴性。當溫度 達到一定值時，抑制劑從DNA聚合酶上脫落下來，此時DNA聚合酶具 有活性。但是，由于是非共價抑制劑，所以4艮難實現(xiàn)完全抑制。同時，抑 制劑(特別是寡核苷酸抑制劑)還會在一定程度上干擾擴增。
4. DNA聚合酶的化學修飾(美國專利No. 5，677，152、 5,773,258和 6,183,998)
與非共價抑制劑一樣，這些是均一熱啟動體系。在這些修飾過程中佳_ 用了二元酸酐和醛。需要高溫下長時間的孵育，修飾劑才能從DNA聚合 酶上剝離出來。此時DNA聚合酶活性被恢復。酶活的抑制非常完全。但 是激活過程對酶會產生損傷。實際上，激活過程本身也會使許多酶分子變 性。
本發(fā)明也是一種化學修飾體系。但是本發(fā)明不使用經化學修飾的PCR 酶，而是使用3，可逆修飾的寡核香酸。
當用PCR擴增DNA靶點時，化學可逆修飾寡核苷酸提供了 一種與化 學修飾酶相似的高嚴格性的熱啟動。當?shù)蜏叵挛幢患せ顣r，3，修飾寡核苷 酸不能被DNA聚合酶延伸。因此在低溫下不會出現(xiàn)引物二聚體和副反應。 從化學物質輔助激活到輻射介導激活，各種不同的激活4吏溫和激活條件成 為可能。
當準備擴增RNA靶點時，RNA模板必須首先通過逆轉錄轉化為DNA 模板。如果逆轉錄在另一個分離的容器中進行并且逆轉錄的部分產物被用 來進行PCR擴增，PCR過程基本上與上述用DNA模板進行的PCR —樣。
21一步法RT PCR是一種逆轉錄和PCR在同一個容器中先后進行的過 程。正如"背景技術"部分所述，目前沒有一種熱啟動PCR能有效地用于 一步法RT PCR。本發(fā)明可以4艮大程度上改善一步法RT PCR。
對單重(single-plex)—步法RT-PCR而言，如果將本發(fā)明應用于此， 將會只有一種用于逆轉錄過程的帶有3'羥基的寡核苷酸。已經知道引物二 聚體不會由一個單一引物產生。
對三重(triplex)—步法RT PCR過程而言(例如用于檢測捐血者血液中 有無HIV、 HBV和HCV的羅氏(Roche，s)產品)，有六種引物。HIV和HCV 是RNA靶點，而HBV是DNA靶點。用傳統(tǒng)的技術可能形成15種引物 二聚體，如表1所示。根據本發(fā)明，6種寡核苷酸中的4種帶有3，修飾基 團，因此只能產生一種引物二聚體。本發(fā)明技術的優(yōu)勢顯而易見。
應用本發(fā)明，使用雙重修飾可以進一步改善一步法RTPCR。 一種修 飾是對逆轉錄中所需的寡核苷酸的修飾，另一種修飾是對參與PCR擴增 的寡核苷酸進行修飾。兩種修飾具有兩種不同的激活條件，因此逆轉錄反 應和PCR過程的啟動可以分開來控制。這種方法尤其對多重一步法RT PCR有很大的作用。當逆轉錄將要開始時，RT引物將被激活并參與RT 反應。同時，其它的引物保持非活性狀態(tài)，直到PCR過程啟動。這會避 免在RT啟動之前的引物二聚體形成/非特異性反應的發(fā)生。這種分步激活 過程可以通過不同方式實現(xiàn)。例如，通過輻射作用移除一種修^飾，通過化 學輔助激活移除另一種修飾。另一個實例是兩種修飾對于同一種化學物質 /輻射有不同的敏感性。此外，溫度是影響3，羥基產生的另一個重要因素。
本發(fā)明在連接酶鏈式反應中的應用
與PCR—樣，LCR是包括熱循環(huán)的指數(shù)靼點擴增方法。與LCR相 關的檢測低靈敏性很大程度上歸因于耐熱連接酶在傳于其反應溫度下的 殘余活性。在LCR中，非模板介導性擴增無法與^^板介導性擴增區(qū)分開 來。
由于3，羥基是連接酶反應的必需基團，因此使用本發(fā)明中公開的3， 修飾寡核苷酸的熱啟動LCR能夠減少甚至消除在低溫下的非模板介導性 連接。
美國專利No. 6，511，810公開了一種方法，這種方法使用耐熱性flap 內切核酸酶來實現(xiàn)連接反應。當一個FRET探針加入到體系中時，能夠使
22用它進行靶分子的實時定量。雖然此專利極大地改善了 LCR檢測，但并 沒有消除非模板介導性擴增。本發(fā)明公開的方法能夠進一步降低背景信 號。本發(fā)明非常適合于在上述過程中進行熱啟動。
本發(fā)明在滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)、鏈置換擴增 (strand-displacement amplifeation, SDA)、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification, SPIA"、指數(shù)單引物等溫擴增(exponential single primer isothermal amplification, X-SPIA+)和環(huán)介導等溫核酸擴增(loop mediated isothermal amplification ， LAMP)中的應用
這些技術分別在以下美國專利No.5,854,033; 6，183，960; 6，210，884; 6,344,329; 5,270,184; 5,916,779; 6,25.1,639與6,410,278中有描述。對以 上所有等溫擴增過程而言，所使用的共同成分是具有強烈鏈置換活性的 DNA聚合酶。在這些技術中，最廣泛使用的DNA聚合酶是Bst DNA聚 合酶大片段。
盡管Bst DNA聚合酶大片段在溫度最高達65。C時仍有活性，但是它 是非耐熱性的。用酶化學修飾進行熱啟動是不可行的。實際上，適用于這 些技術的熱啟動系統(tǒng)仍有待開發(fā)。本發(fā)明所提供的各種激活條件，使得能 夠找到適合于每種具體擴增技術的條件。
將本發(fā)明應用到這些檢測中可以消除擴增開始前的所有副反應。傳統(tǒng) 的寡核苷酸被本發(fā)明的寡核普酸取代。理想的情況是當擴增反應即將開始 時，3，羥基才被再生。
將本發(fā)明應用到這些過程中不僅可以提高擴增的靈敏度，而且還可以 改進對靶點的定量，通過控制擴增的啟動可以實現(xiàn)對靶點定量性能的改 進。
本發(fā)明在NASBA、 TMA和3SR中的應用
這些方法基本上是在等溫下擴增RNA靶點。擴增過程包括以下步驟
1. 逆轉錄以產生互補DNA(cDNA)。
逆轉錄產生一個DNA/RNA異聚雙鏈。逆轉錄中使用的寡核普酸在3， 端區(qū)域有一個靶結合序列，在5，端區(qū)域有RNA聚合酶啟動子區(qū)。單鏈啟 動子序列直到變成雙鏈時才具有功能。
2. RNase H降解DNA/RNA異聚雙鏈中的RNA鏈RNase H的活性來自于逆轉錄酶或分離的RNase H
3. 雙鏈DNA的合成
另一個寡核苷酸與單鏈cDNA雜交，并在逆轉錄酶作用下延伸，產生 一個DNA/RNA雙鏈。此時，用于結合相應的RNA聚合酶的啟動子區(qū)呈 現(xiàn)雙鏈結構且具有轉錄功能。
4. 通過體外轉錄合成單鏈RNA
在有功能的啟動子與RNA聚合酶作用下，每個DNA/RNA雙鏈會產 生成百上千個RNA分子。此時完成了一個擴增循環(huán)。結果，每個RNA 模板分子都被擴增了成百上千次。
5. 重復1至4 這樣就能指數(shù)擴增耙核酸。
一般而言，這些檢測的靈敏性不如PCR。它們的定量能力也不如 PCR。如果將可控啟動應用在這些檢測中，這兩個重要方面將能得到改善。 可控啟動將能有效地減少甚至消除副反應，進而改善檢測的靈敏度。
將本發(fā)明應用在這些過程中也將會改善它們的靶定量能力。在沒有可 控啟動系統(tǒng)的情況下，擴增反應在所有成分混合之后就立即啟動。由于快 速的擴增動力學原因，樣本與標準品的不同的擴增開始時間會使得精確和 準確的定量化十分困難。而可控啟動將會4吏所有的擴增在同 一時間開始啟 動。因而定量化效果可以^皮極大地改善。
本發(fā)明的寡核苷酸可代替常規(guī)的帶有3'羥基的寡核苷酸并用于這些 核酸擴增過程。本發(fā)明的寡核苷酸序列仍然與常規(guī)使用的寡核苷酸一樣。
本領域技術人員應當理解，應用本發(fā)明所帶來的優(yōu)勢的大小依賴于核 酸擴增技術、寡核苷^列、反應體系、孵育條件等。
本領域技術人員能夠在應用本發(fā)明的寡核苷酸代替常規(guī)寡核苷酸時 做出相應調整。根據具體使用的修飾基團和用于再生3，羥基的化學物質， 有可能需要對寡核苷酸濃度、緩沖體系和孵育條件進行調整以達到最優(yōu)化 的反應條件。
本發(fā)明可以與其它能夠減少引物二聚體形成/非特異性反應的技術結 合使用。正如之前所討論的一樣，熱啟動技術正是這些技術中的一個例子。 還可以將單鏈DNA結合蛋白加入到反應體系中以進一步減少引物二聚體 的形成和提高檢測的特異性。
在前三個核苷酸中，使用 一些特殊的堿基和糖基來進一步減少引物二聚體的形成和非特異性反應，而本發(fā)明中的寡核苷酸可與這種技術結合使
用。這兩種技術分別在美國專利No.6，001，6U和6，794，142有描述，這兩 篇文獻均以援引的方式納入本文。
本發(fā)明還涉及用于核酸擴增的試劑盒。雖然每種試劑盒的構成可能不 同，但是至少有一種本發(fā)明的修飾的寡核苷酸是進行擴增反應所必需的成
實施例
觀戮儀個八貝提供如何實施本發(fā)明的完全的公 開和描述，這些實施例并不意在限制發(fā)明人所認為的本發(fā)明的范圍；同樣， 提供這些實施例并不意在表示下述實施例是所進行過的全部實驗。已經努 力確保所使用的數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等等)的準確性，但是同樣也應考慮 到會有一些實驗誤差和偏差。
實施例l:用馬來酸酐對寡核苷酸進行修飾
圖1顯示了反應流程。表2所列為用來檢測乙肝病毒的三種寡核普酸 序列。
表2.寡核苷酸序列
寡核苷酸序列
正向引物CCG TCT GTG CCT TCT CAT CTG
逆向引物1GGT TTC CAT GTA ACG TGC AG
逆向引物2GGT CTC CAT GCG ACG TGC AG
凍干的寡核苷酸溶解在lxTE (10mM TrisHCl， pH8.0， O.lmM EDTA) 中，制備成濃度為100nM。 將4-(二曱基^J+吡啶(DMAP)(Aldrich)溶 于三乙胺(TEA)(Aldrich)制備成濃度為3 mg/ml的溶液。將馬來酸酐 (Aldrich)溶于N,N，-二曱基曱酰胺(DMF， Sigma)制備成4 M溶液。
步驟1:在2.0 ml的微量離心管內將16 ^寡核苷酸和320 jil的DMAP 溶液混合
步驟2:在寡核苷自MAP混合物中加入6 pi的4M馬來酸酐溶液 步驟3:室溫下，以最快速度振蕩混勻2分鐘 步驟4:加入1026nl異丙醇并混合均勻
25步驟5:在-20。C孵育兩小時
步驟6: 4°C下，以14000 rpm離心20分鐘
步驟7:移去上清液—加入800 nl異丙醇—4。C下以14000 rpm離心 20分鐘
步驟8:將步驟7重復一次
步驟9:移去上清液—室溫下干燥微離心管—用水溶解寡核苷酸。 實施例2: TaqDNA聚合酶的制備
嗜熱水生菌(Taq)DNA聚合酶基因是由基因庫的序列(目錄編碼No. J04639)經由PCR克隆而來。Taq DNA聚合酶的純化經由Lawyer等 (Lawyer et al"1989， JBC 264(11):6427誦37; Lawyer et al. 1989， PCR Moth. Appl. 2(4):275-87)描述的過程來完成。
實施例3:用順曱基丁烯二酸修飾Taq DNA聚合酶 順曱基丁烯二酸(Aldrich)和N，N，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (Aldrich) 以及NHS (AIdrich)均溶解在DMF中，形成濃度均為1M的溶液。200jU DCC、200nl NHS和lOO^il順曱基丁烯二酸混合于一 1.5 ml的樣史離心管中。 然后將該混合物在室溫下賻育1小時。然后，將該混合物在室溫下以12000 rpm離心20分鐘。去除沉淀物，保留上清液用來修飾Taq DNA聚合酶。 已純化的Taq DNA聚合酶在20 mM MOPS， pH8.0和100 mM KC1 中配成1 mg/ml的溶液。已活化順曱基丁烯二酸與Taq DNA聚合酶，按1: 99體積比相混合，然后置于室溫下孵育一小時，以使TaqDNA聚合酶失 活。
實施例4:使用修飾寡核苷酸的PCR擴增
Sybr Green優(yōu)先和雙鏈DNA結合，其親合力比單鏈DNA高1000倍 以上。它已被廣泛運用于實時監(jiān)控PCR的擴增。雖然這樣的結合不具有 序列特異性，但可以通過退火曲線分析來辨別不同的擴增產物，因為每種 擴增產物都有一定的退火溫度。Sybr Green在本發(fā)明中被用來監(jiān)測引物二 聚體的形成和乾序列的擴增。
PCR體系包括50mMTrisHCl、 pH8.4、 5mMKCl、 3mMMgCl2、 0.01%Tween-20、 0.005%明膠、lxSybr Green、 500nM 5-ROX、 7.5mM羥基胺氯(Aldrich), dATP、 dCTP、 dGTP和TTP各0.2mM、 1U Taq DNA
聚合酶、未修飾的或馬來酸酐修飾的HBV引物各200nM。反應體積是 25^1,在反應體系中加入零HBV模板拷貝(無^jt板對照或NTC)或加入500 份HBV模板拷貝。
反應在ABIPrizm7000上進行。熱循環(huán)條件如下95°C, 10分鐘—(95 。C, 5秒—60。C, 30秒)x40循環(huán)。
對于逆轉修飾，高溫下的預培養(yǎng)，即95。C IO分鐘，和羥基胺氯的存 在都4艮重要。
結果如圖5a所示，和一般的未經修飾的引物(NTC/R)相比，含有馬來 酸酐修飾引物的NTC反應(NTC/M)顯示超過7周期的滯后擴增。換句話 說，NTC擴增或引物二聚體的形成被推遲了超過7個周期。這點很清楚 地表明，經修飾的引物在降低引物二聚體形成方面是有效的。
實施例5: PCR產物的退火曲線分析
在圖5a中顯示，使用常規(guī)引物的含有HBV模板(T+ZR)比相應的使用 修飾引物的擴增反應(T+M)幾乎早5個周期。在沒有引物二聚體形成之類 的副作用發(fā)生時，兩者因為包含相同的HBV模板數(shù)，所有也應該有類似 的擴增動力學。這要求我們對擴增產品進行進一步的分析。
進行了退火曲線分析。退火曲線結果如圖5b所示，使用常規(guī)引物的 含有HBV模板(T+ZR)有兩個擴增產物， 一個是主要產物解鏈溫度大概 在77。C的引物二聚體，另一個是少量產物解鏈溫度大概在83。C的模板 介導擴增產物。對比之下，使用修飾引物的HBV模板擴增(T+ZM)顯示較 純凈的擴增。只產生模板介導擴增產物。
實施例6:在逆轉錄酶存在時使用常規(guī)Taq聚合酶和化學修飾Taq聚 合酶的PCR
各種基于熱啟動PCR的技術中，可逆化學修飾PCR DNA聚合酶技 術的熱啟動最嚴格，也最有效。它能有效地改善DNA模板擴增，并實現(xiàn) 多重multiplex PCR擴增。
但是，在一步法RT.PCR系統(tǒng)中，它面臨"背景技術"里所述的難題。 測試了 一種經化學修飾過的酶在逆轉錄酶存在時是否會減少引物二聚體 的形成。PCR體系包括50mMTrisHCl、 pH8.4、 5mMKCl、 3mMMgCl2、 7.5mM羥基胺氯(Aldrich)、 0.01%Tween-20、 0.005%明膠、500nM 5-ROX、 lxSybr Green， dATP、 dCTP、 dGTP和TTP各0.2mM、 4U的Superscript III (Invitrogen)、未修飾的HBV引物各200 nM、普通非熱啟動或化學修 飾的熱啟動TaqDNA聚合酶lU。反應體積是25jd，在反應體系中加入零 HBV模板拷貝(無模板對照或NTC)或加入500份HBV模板拷貝。
反應在ABIPrizm7000上進行。熱循環(huán)條件如下55。C, 15分鐘—95 。C, 10分鐘—(95°C， 5秒—60°C， 30秒)x40個循環(huán)。
擴增結果如圖6所示，雖然含有化學4奮飾Taq (NTC/hsT)的NTC擴 增比普通Taq (NTC/regT)延遲了約兩個循環(huán)，但含有化學#~飾Taq的 NTC擴增很嚴重。在含有HBV模板的反應中，普通Taq和化學修飾Taq 兩者擴增達到的閾值的時間比正常^(參見圖5a)。對退火曲線的分析顯 示該實驗中，所有四種擴增中均只有引物二聚體產生(圖6b)。it^明i.逆 轉錄酶可介導引物二聚體的形成；ii.當反應系統(tǒng)中存在逆轉錄酶時，化學 #"飾PCR酶在減少引物二聚體形成方面效果不佳。
實施例7:帶有修飾寡核苷酸的PCR
此實驗的目的是為了進一步說明逆轉錄酶有促進引物二聚體形成的 作用，以及可逆l奮飾引物有抑制引物二聚體形成的功能。
PCR體系包括50mMTrisHCl、 pH8.4、 5mMKCl、 3mMMgCl2、 7.5mM羥基胺氯(Aldrich)、 0.01%Tween-20、 0.005%明膠、500nM 5國ROX、 lxSybrGreen， dATP、 dCTP、 dGTP和TTP各0.2mM、 1U常規(guī)的未修 飾Taq DNA聚合酶、OU或4U的Superscript III (Invitrogen)、未修飾的 或修飾的HBV引物各200 nM。反應體積是25fil，該體系中無HBV模板。
反應在ABIPrizm7000上進行。熱循環(huán)條件如下55°C, 15分鐘—95 。C， 10分鐘—(95°C， 5秒—60。C， 30秒)x40個循環(huán)。
帶有常規(guī)未修飾的引物，NTC反應(RT+ZR)中存在逆轉錄酶時，比不 存在逆轉錄酶(RT7R)時產生更多的引物二聚體(圖7),并且早將近4個循 環(huán)。
修飾引物可以很大程度上減少引物二聚體的形成。和普通引物相比， 不存在或存在4U逆轉錄酶時，引物二聚體的形成分別滯后了 7個(RT7Rvs RT7M)和11個循環(huán)(RT+7R vs RT+/M)。更重要的是，它表明了當使用
28修飾引物時，逆轉錄酶的存在并沒有對引物二聚體的形成造成很大影響
(RT7M vs RT/M)。
實施例8:帶有修飾引物的乾序列的擴增
此實驗的目的是為了進一步證實可逆修飾引物在一步法RT PCR中 可以改善PCR擴增效果。
PCR體系中包含50mMTrisHCl、 pH8.4、 5mMKCl、 3mMMgCl2、 7.5mM羥基胺氯(Aldrich)、 0.01%Tween-20、 0.005%明膠、500nM 5-ROX、 lxSybrGreen， dATP、 dCTP、 dGTP和TTP各0.2mM、 1U普通未修飾 Taq DNA聚合酶、4U Superscript III (Invitrogen)、未修飾或修飾HBV 引物各200 nM。反應體積是25ji1,在反應體積中加入零HBV模板拷貝(無 模板對照或NTC)或加入500拷貝HBV模板。
反應在ABI Prizm7000上進行。熱循環(huán)條件如下55°C， 15分鐘—95 °C， 10分鐘4(95。C， 5秒—60°C， 30秒)x40個循環(huán)。
如圖8a所示，修飾引物有效地將引物二聚體的形成推遲了 ll個循環(huán) (NTC/MvsNTC/R)。如圖8b所示，使用修飾引物的模板介導擴增沒有產 生引物二聚體(T7m),而使用普通引物的擴增即使在500份HBV模板拷 貝下都只產生引物二聚體(圖8a和8b中的T+/R)。
參考文獻
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權利要求
1.一種擴增靶核酸序列或信號的方法，該方法中所用的擴增反應混合物中含有至少一種具有非羥基3’端的可逆修飾寡核苷酸；該非羥基3’端可以在一種化學物質和/或輻射和/或溫度范圍作用下轉化為羥基3’端。
2. 權利要求l所述的方法，包括以下步驟(a) 將一個懷疑含有靶核苷酸的樣本與擴增反應混合物相接觸，該 反應混合物含有至少一種具有非羥基3，端的可逆修飾寡核苷 酸，該非羥基3，端可在一種化學物質和/或輻射和/或一定溫度 范圍作用下轉化為羥基3'端；(b) 將步驟(a)中混合物與所述的化學物質相接觸和/或暴露于輻射 和/或置于一定溫度范圍下，充分作用一段時間以再生羥基3， 端；和(c) 進行擴增反應。
3. 權利要求1所述的方法，其中所述核酸為核糖核酸，所述方法包括如 下步驟(a) 將一個懷疑含有靶核糖核酸的樣本與擴增反應混合物相接觸， 該反應混合物含有至少一種具有非羥基3，端的一種第一可逆修 飾寡核苷酸，該非羥基3'端可在一種第一化學物質和/或輻射和 /或一個第一溫度范圍下轉化為羥基3，端；(b) 在核糖核酸的逆轉錄條件下，孵育步驟(a)中混合物；(c) 將步驟(b)中混合物與所述第一化學物質相接觸和/或暴露于輻 射和/或置于所述第一溫度范圍下，充分作用以使得所述第一可 逆修飾的寡核苷酸的3'端再生為羥基；(d) 進行擴增反應，產生引物延伸產物。
4. 權利要求3所述的方法，其中所述擴增反應混合物含有至少一種第二 可逆修飾寡核苷酸，其中所述第二可逆性修飾寡核苷酸具有非羥基團 3，端，且該非鞋基3，端可以在一種第二化學物質和/或輻射和/或一 個第二溫度范圍作用下被轉化成羥基3，端；該方法還包括下述步驟， 在步驟(b)之前，將步驟(a)的混合物與所述第二化學物質相接觸和/ 或暴露于輻射和/或置于所述第二溫度范圍下，充分作用以使得所述第二可逆修飾寡核苷酸的3，端再生為羥基。
5. 權利要求3所述方法，所述方法為一種兩酶體系的一步法RT-PCR過 程，其中至少使用了一種逆轉錄酶和一種耐熱DNA聚合酶，或者所述 方法為一種單酶體系的一步法RT-PCR的過程，其中只使用了一種兼 有逆轉錄酶和DNA聚合酶雙重功能的酶。
6. 權利要求2-5任一項所述的方法，其中所述非羥基3，端有至少25%、 優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少75%和最優(yōu)選90%被轉化成羥基3，端。
7. 權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述可逆修飾寡核苷酸在其3， 端具有一個羧酸酯基。
8. 權利要求7所述的方法，其羧酸酯基選自曱酸酯、苯甲酰曱酸酯、 卣代乙酸酯、曱氧基乙酸酯、三苯基曱氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、 馬來酸酯及其衍生物、琥珀酸酯及其衍生物、4-氧代戊酸酯、新戊 酸酯、丁烯酸酯、4-曱氧基丁烯酸酯和3-苯丙酸酯等。
9. 權利要求7所述的方法，其中用于再生3，羥基的化學物質選自疊 氮化物、咪唑、吡啶、羥胺、肼和四丁基氫氧化銨。
10. 權利要求7所述的方法，在再生3，羥基時， 一種化學物質和在一定 溫度范圍內孵育同時作用。
11. 權利要求7所述的方法，其中所述羧酸酯是馬來酸脂，并且使用羥胺 或肼來再生3'羥基。
12. 權利要求7所述的方法，其中所述羧酸酯是馬來酸脂，并且使用羥胺 或肼來再生3，羥基，并同時在一定溫度范圍內孵育。
13. 權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述可逆修飾寡核苷酸在其3，端有一個曱硅烷基醚基。
14. 權利要求13所述的方法，其中所述曱硅烷基醚基選自于三曱基曱 硅烷基醚、三乙基曱硅烷基醚、三異丙基曱硅烷基醚、二曱基異丙 基曱硅烷基醚、二乙基異丙基甲硅烷基醚、二曱基己基曱硅烷基醚、 叔丁基二曱基曱硅烷基醚、叔丁基二苯基曱硅烷基醚、三苯甲基曱硅 烷基醚、三對二甲苯基甲硅烷基醚(tri-p-xylsilyl ether)、三苯 基甲硅烷基醚、二苯基甲基曱硅烷基醚與叔丁基曱氧基苯基甲硅烷基 醚。
15. 權利要求13所述的方法，其中使用氟化物來再生3'羥基。
16. 權利要求15所述的方法，其中所述氟化物選自四丁基氟化銨、氟化鈉、氟化鉀、氟化鋰和氫氟酸。
17. 權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述可逆修飾寡核苷酸在其3， 端有一個醚基。
18. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基是四氫呋喃醚基。
19. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基是烯丙醚基，并且使用鉈或 銠催化劑來再生3，羥基。
20. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基為對曱氧苯基醚基或對曱 氧節(jié)基醚基或3， 4-二曱氧基節(jié)基醚基或(4-曱氧基苯氧基)曱基醚 基；并且使用硝酸高鈰銨用來再生3，羥基。
21. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基選自曱氧基乙氧基曱基醚、 曱氧基甲基醚、鄰曱氧基苯酚甲基醚、四氫吡喃基醚和四氫噻吩基醚； 并且使用路易絲酸催化劑來再生3，羥基。
22. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基是硅烷氧基曱基醚或2-(三 曱基硅烷基)乙氧基曱醚；并且使用氟化物來再生3，羥基。
23. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基為2-(三曱基硅烷基)乙氧基 曱醚，并且使用LiBF4和/或氟化物來再生3，羥基。
24. 權利要求17所述的方法，其中所述醚基為曱基醚，并且使用選自 BBr3、 SiCl4、 Nal、 AIX3的一種或多種化學物質來再生3'羥基。
25. 權利要求l-5任一項所述的方法，其中所述可逆修飾寡核苷酸在其3， 端有一個修飾基團，該基團能夠通過光解切割而再生3'羥基。
26. 權利要求25所述的方法，其中所述修飾基團選自對甲氧基苯曱醚、 硝酸酯和碳酸鄰硝基苯曱酯。
27. 權利要求25所述的方法，其中使用輻射和/或化學物質和/或一定溫 度范圍作用來再生3'鞋基。
28. 權利要求1-5任一項所述的方法，應用于^V檢測、聚合酶鏈式反 應、連接酶鏈式反應、滾環(huán)擴增、鏈置換擴增、轉錄介導擴增、基 于核酸序列的擴增、自主序列復制系統(tǒng)、單引物等溫擴增、指數(shù)單 引物等溫擴增或環(huán)介導擴增的過程中。
29. —種具有非羥基3，端的可逆修飾寡核苷酸，該非羥基3，端可以在化 學物質和/或輻射和/或一定溫度范圍作用下轉化為鞋基3，端。
30. 權利要求29所述的可逆修飾寡核苷酸，在其3，端具有一個羧酸酯基。
31. 權利要求30所述的可逆修飾寡核苷酸，其中所述羧酸酯基是馬來酸酯。
32. 權利要求29所述的可逆修飾寡核苷酸，在其3，端具有一個醚基。
33. 權利要求32所述的可逆修飾寡核苷酸，其中所述醚基為曱硅烷基醚。
34. 權利要求29所述的可逆修飾寡核苷酸，在其3'端有一個修飾基團， 該修飾基團可通過光解切割而再生3'羥基。
35. —種核酸擴增反應混合物，包含權利要求29-34任一項所述的可逆寸奮 飾寡核苷酸。
36. —種核酸擴增反應試劑盒，包含權利要求29-34任一項所述的可逆修 飾寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種擴增靶核酸序列或信號的方法，其中所用的擴增反應混合物中含有至少一種具有非羥基3’端的可逆修飾寡核苷酸。此非羥基3’端可以在一種化學物質和/或輻射和/或溫度范圍作用下轉化為羥基3’端。本發(fā)明還提供了一種如上所述的可逆修飾寡核苷酸，此外還提供了含有這種寡核苷酸的核酸擴增反應混合物和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101495657SQ200780028773
公開日2009年7月29日 申請日期2007年7月30日 優(yōu)先權日2006年7月31日
發(fā)明者畢萬里 申請人:畢萬里