專利名稱：：人源化抗人骨橋蛋白抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有優(yōu)異的活性和穩(wěn)定性的人源化抗人骨橋蛋白抗體、以及使用該抗體的疾病的治療和診斷方法。
背景技術(shù)：
：骨橋蛋白(以下稱為"OPN")是在骨中較多含有的酸性釣結(jié)合性糖蛋白，已知在人體中，由于mRNA剪切的不同，可以產(chǎn)生骨橋蛋白-a(以下稱為"OPN-a，，)、骨橋蛋白-b(以下稱為"OPN-b，，)、骨橋蛋白-c(以下稱為"OPN-c")的至少三種同工型(非專利文獻1)。其中，OPN-a的前體具有后述序列表的SEQIDN0.23所示的氨基酸序列，通過分泌，信號肽被切割，形成I17-N314成熟體OPN-a。另外，成熟體OPN是通過生物體內(nèi)的凝血酶，在第168號(為OPN-a時)的精氨酸殘基的C末端一側(cè)被切割，形成N末端片段和C末端片段兩段。上述OPN在多種生理學和病理學方面擔負著重要的功能，例如具有細胞粘附、細胞游走、腫瘤形成、免疫應答和抑制以補體為介質(zhì)的細胞溶解等功能。該多種功能是以多種細胞表面受體為介質(zhì)。OPN在內(nèi)部具有RGD序歹'j(例如OPN-a中的第159~161號殘基)，識別該RGD序列的aV|33、aVpl和aV|35等整聯(lián)蛋白是OPN的主要受體，其中，aV|33、aVpi和aV(35整聯(lián)蛋白在血管的平滑肌細胞中經(jīng)由細胞粘附、特別是aV(33參與巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等的游走。目前的研究也表明OPN經(jīng)由SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)與a鄧l、a鄰l和a4p7整聯(lián)蛋白結(jié)合，但發(fā)現(xiàn)了其中a鄰l與未被凝血酶切割的OPN(非切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割型OPN)兩者結(jié)合，而a鄧l只與凝血酶切割型OPN結(jié)合這樣的差異(非專利文獻2~4)。該a9和a4、以及|31和卩7的整聯(lián)亞單元相互之間的氨基酸序列間的類似性高。a4(31和a鄰7整聯(lián)蛋白主要在淋巴細胞和單核細胞中發(fā)現(xiàn)，而在嗜中性粒細胞中只有極少表達。另一方面，a9(31在嗜中性粒細胞中選擇性高表達，經(jīng)由VCAM-1或腱生蛋白-C(Tenascin-C)等在嗜中性粒細胞游走中擔負著必須的功能。另外，a鄧l在肌細胞或上皮細胞、肝細胞等中也廣泛表達。這樣，整聯(lián)蛋白亞單元a4和a9的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分別經(jīng)由有微妙不同的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，互相協(xié)同地促進白細胞向炎癥部位的游走和凝集，增強其浸潤活性，由此參與各種炎癥反應。這樣，各種種類的整聯(lián)蛋白均促進白細胞的游走，參與炎癥反應，因此抑制這些整聯(lián)蛋白活性的藥物被認為潛在性地具有作為抗炎癥藥物的可能性。例如，整聯(lián)蛋白aVp3在破骨細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等中表達，通過抑制aVp3整聯(lián)蛋白與其各種結(jié)合配體的結(jié)合，例如在關(guān)節(jié)中期待發(fā)揮抑制關(guān)節(jié)破壞的作用，因此可以實際進行抗aV(33抗體的開發(fā)。但是，屬于整聯(lián)蛋白家族的受體在廣泛的組織內(nèi)普遍表達，在維持生命活動中擔負著必須的功能，因此，在類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)炎的治療中使用整聯(lián)蛋白的抗體，則在其它部位也有發(fā)生同樣的抑制的可能性，可能產(chǎn)生副作用。由上述觀點考慮，目前為止，已經(jīng)明確了類風濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)病等的病因，嘗試提供更優(yōu)異的治療方法。例如WO02/081522(專利文獻l)中發(fā)現(xiàn)，風濕病患者和變形性關(guān)節(jié)病患者，關(guān)節(jié)腔液的OPN濃度顯示高值，并且在風濕病患者中，凝血酶切割型N末端片段占全部OPN的比例增加，確認了OPN與這些疾病的發(fā)病有很深相關(guān)性。專利文獻l中，對于用凝血酶切割OPN得到的N末端片段和C末端片段，制備將各片段分別區(qū)別識別的抗體，使用它們進行試驗，發(fā)現(xiàn)在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中，特別是由凝血酶切割的N末端片段在關(guān)節(jié)腔內(nèi)顯示高濃度。該N末端片段中均存在人型整聯(lián)蛋白可識別的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.IO)，確認同時阻斷這兩者序列的抗體可廣泛抑制OPN與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，對于類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)炎等治療有效。具體來說，專利文獻l中制備了抑制人OPN的RGD序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合、以及人OPN的SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)與整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體，通過細胞粘附和細胞游走等的試驗確認了其效果。并獲得了小鼠OPN的該內(nèi)部序列所對應的合成肽的抗體，使用小鼠的關(guān)節(jié)炎病態(tài)模型，確認了上述抗體作為治療藥的效果。即，小鼠OPN與人OPN在氨基酸序列上、在相同位置上具有可被小鼠的整聯(lián)蛋白識別的RGD序列和SLAYGLR序列(SEQIDN0.12),因此，取得了M5抗體作為同時阻斷這些序列的抗體。確認了該M5抗體與小鼠OPN及其凝血酶消化產(chǎn)物的結(jié)合被含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，該M5抗體抑制由TNF-a活化的、來自小鼠脾臟的單核細胞的游走。在小鼠的顱骨器官培養(yǎng)系統(tǒng)中研究該M5抗體，觀察到抑制骨破壞的作用。并且，在小鼠膠原關(guān)節(jié)炎模型中嘗試給予上述抗體，確認顯示明顯的治療效果(專利文獻1和非專利文獻5)。這些結(jié)果強烈顯示同時阻斷RGD序列與人型整聯(lián)蛋白的結(jié)合、SVVYGLR序歹,j(SEQIDNO.10)與人型整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抗體可抑制OPN與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，對于類風濕性關(guān)節(jié)炎等的治療有效，并且，不僅對于幼年型類風濕性關(guān)節(jié)炎或慢性風濕病等風濕病，也期待對于銀屑病性關(guān)節(jié)炎或銀屑病的治療有效。器官移植后的慢性排斥的特征在于發(fā)生血管或支氣管的阻塞性病變，從其組織學的研究來看，T細胞和巨噬細胞的活化引發(fā)細胞因子和生長因子的生成、血管內(nèi)皮細胞障礙，并且血管平滑肌增殖引發(fā)纖維化等，因此使血管阻塞進展(非專利文獻6~8)。已有報道稱，這些巨噬細胞的活化或血管平滑肌的纖維化中，OPN作為必須的蛋白而發(fā)揮功能(非專利文獻9)，OPN抑制抗體通過抑制單核細胞或嗜中性粒細胞的游走，可以抑制向上述纖維化發(fā)展的過程。因此，期待抑制器官移植后的慢性排斥反應，有助于器官的存活，也期待對于全身性自身免疫疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞氏病、多發(fā)性肌炎、系膜增殖性腎小球腎炎、結(jié)節(jié)病等自身免疫疾病的治療的效果。還確認了在各種癌癥中OPN的表達量增加，OPN促進了癌癥的進展和轉(zhuǎn)移(非專利文獻10~12)，通過抗OPN抗體癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移得到抑制(專利文獻3、非專利文獻13)。因此，還期待抗OPN抗體對于各種癌癥的治療發(fā)揮作用。WO03/027151(專利文獻2)中公開了具有專利文獻1所述的小鼠抗人骨橋蛋白抗體2K1可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)的嵌合抗人骨橋^"白抗體，以及具有2K1抗體的互補決定區(qū)和人抗體構(gòu)架區(qū)以及恒定區(qū)的人源化抗人骨橋蛋白抗體。時至今日，作為癌癥治療用抗體(例如利妥昔單抗、曲妥單抗、貝伐單抗)、風濕病治療用抗體(例如英夫利昔單抗、阿達木單抗)、用于抑制移植片排斥的治療用抗體(例如莫羅單抗、巴利昔單抗)等^f艮多治療用單克隆抗體已經(jīng)上市。今后，單克隆抗體制劑由于其特異性和安全性高等的根本性特征，特別是以低分子治療藥的開發(fā)較為困難的各種疾病作為目標的研究開發(fā)將會得到加速。另一方面，上述抗體藥物的開發(fā)中，最大的問題是抗體的生產(chǎn)性。目前市售的單克隆抗體的臨床給藥量大約為數(shù)mg/kg水平，因此需要相當大的制備成本。為此，在顯示優(yōu)異的活性的抗體、顯示相同活性的抗體中選擇表達量高、作為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性高的抗體，這在抗體藥物應用化中是極重要的因素。專利文獻1:國際公開第WO02/081522小冊子專利文獻2:國際公開第WO03/027151小冊子7專利文獻3:國際公開第WO06/043954小冊子非專利文獻1:Y.Saitoh等人.，(1995):LaboratoryInvestigation,72,55~63非專利文獻2:Y.Yokosaki等人"(1999):TheJournalofBiologicalChemistry274,36328~36334非專利文獻3:P.M.Green等人.，(2001):FEBSLetters503，75~79非專利文獻4:S.T.Barry等人.，(2000):ExperimentalCellResearch258，342~351非專利文獻5:Yamamoto等人.，(2003):TheJournalofClinicalInvestigation,112,181-188非專利文獻6:P.Freese等人"(2001):Nephrology,dialysis,transplantation,16，2401~2406非專利文獻7:j.r.Waller等人.，(2001):BritishJournalofSurgery,88,1429~1441非專利文獻8:S.R.Lehtonen等人.，(2001):Transplantation,72，1138-1144非專利文獻9:A.O，Regan等人.，(2000):InternationalJournalofExperimentalPathology,81,373~390非專利文獻io:G.F.Weber,(2001):BiochimicaetBiophysicaActa,1552,61~85非專利文獻ii:h.Rangaswami等人.，(2006):TRENDSinCellBiology16，79~87非專利文獻12:S.S.Forootan等人"(2006):Int.J.Cancer:118，2255~2261非專利文獻13:Z.Hu等人.，(2005):Clin.CancerRes.114646~4652
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明針對上述狀況而設，要解決的課題在于提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性等)和/或穩(wěn)定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優(yōu)異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。本發(fā)明人等為解決上述課題進行了深入的研究，結(jié)果，成功地制備了具有上述特性的人源化抗骨橋蛋白抗體。解決課題的方法即，本發(fā)明具有以下特征。(1)人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、和由SEQIDN0.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)。(2)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)是人Igyl。(3)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)是人IgK。(4)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)為人Igyl，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人Ig/c。(5)人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.25所示氨基酸序列組成的重《連、和由SEQIDNO.27所示氨基酸序列組成的輕鏈。(6)多核苷酸，該多核苷酸含有編碼上述(l)所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的重鏈可變區(qū)的序列。(7)多核苷酸，該多核苷酸含有編碼上述(l)所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。(8)表達載體，該表達載體含有上述(6)和/或(7)所述多核苷酸。(9)宿主細胞，該宿主細胞中導入了上述(8)所述的表達載體。(10)生產(chǎn)人源化抗人骨橋蛋白抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)上述(9)所述的宿主細胞，使該細胞表達人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。(11)自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的治療藥，該藥物含有上述(l)~(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體。(12)預防或治療自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的方法，該方法包含給予治療有效量的上述(1)(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。(13)上述(1)(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體在制備用于預防或治療自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的藥物中的應用。發(fā)明效果本發(fā)明可提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性等)和/或穩(wěn)定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優(yōu)異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。具有上述特征的本發(fā)明的抗體可用于以自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)病為代表的各種炎癥性疾病的預防或治療。附圖簡述圖1表示含有插入到載體中的R2K1-VH1.7編碼區(qū)的DNA石咸基序列(上一行SEQIDN0.15)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.16)(下劃線部分是用于分泌表達的前導序列)。圖2表示含有插入到載體中的R2K1-VH1.8編碼區(qū)的DNA的堿基序列(上一行SEQIDN0.17)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.18)(下劃線部分是用于分泌表達的前導序列)。圖3表示含有插入到載體中的R2K1-VL1.7編碼區(qū)的DNA的堿基序列(上一行SEQIDNO,19)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.20)(下劃線部分是用于分泌表達的前導序列)。圖4表示含有插入到載體中的R2K1-VL1.8編碼區(qū)的DNA的堿基序列(上一行SEQIDN0.21)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.22)(下劃線部分是用于分泌表達的前導序列)。圖5表示通過ELISA法研究嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與10hOPN5肽的結(jié)合性的結(jié)果。圖6表示通過ELISA法研究在70。C下加熱處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與hOPN5肽的結(jié)合性的結(jié)果。以未加熱處理時的結(jié)合性為100%,表示其比例。圖7表示通過ELISA法研究用pH5緩沖液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與hOPN5肽的結(jié)合性的結(jié)果。以未經(jīng)pH5緩沖液處理時的結(jié)合性為100，表示其比例。圖8表示對用含各種濃度的鹽酸胍緩沖液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體的焚光光譜中峰波長制圖的結(jié)果。圖9表示通過CD測定用各pH緩沖液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體中隨機結(jié)構(gòu)的含量的結(jié)果。圖10是表示使用超高靈敏度差示掃描量熱儀研究嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體的熱穩(wěn)定性的結(jié)果圖。虛線箭頭和實線箭頭分別表示嵌合2K1抗體和R2Klvl.7抗體的Tm。圖11表示R2Klvl.7和R2KlvO對人OPN的細胞粘附抑制效果。圖12表示R2K1vl.7對于猴膠原誘導關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹的效果。數(shù)據(jù)分為對照組、25mg/kg組和50mg/kg組，分別表示8個動物、7個動物和5個動物的平均士SE。*p<0.05,**p<0.01:通過Dunnet多重比較;j全驗確認與對照組明顯不同。圖13表示通過HPLC分析純化R2Klvl.7-scFv的結(jié)果。圖14表示通過ELISA法研究純化R2Klvl.7-scFv與hOPN5肽的結(jié)合性的結(jié)果。圖15表示完全分子型R2Klvl.7抗體、R2Klvl.7抗體的F(ab')2和純化F(ab')2-PEG的SDS-PAGE結(jié)果。圖16表示通過BIAcore研究R2Klvl.7的F(ab')-PEG與hOPN5肽的結(jié)合性的結(jié)果。實施發(fā)明的最佳方式ii以下詳述本發(fā)明。本發(fā)明人等為了克服與上述以往的抗人骨橋蛋白抗體相關(guān)的課題而進行了深入的研究，結(jié)果成功的獲得了與WO03/027151(專利文獻2)所述的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體相比、具有優(yōu)異的活性和/或穩(wěn)定性的人源化抗人骨橋蛋白抗體。抗體分子的基本結(jié)構(gòu)為所有類別(classes)所共有，由具有分子量5萬~7萬的重鏈和具有2-3萬的輕鏈構(gòu)成。重鏈通常由含有約440個氨基酸的多肽鏈組成，每類重鏈具有特征性結(jié)構(gòu)，對應于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，稱為y、〃、a、5和e鏈。并且，IgG存在IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，分別稱為yl、y2、y3和y4。輕鏈通常由含有約220個氨基酸的多肽鏈組成，已知有L型和K型兩種，分別稱為x和k鏈?？贵w分子的基本結(jié)構(gòu)中的肽構(gòu)成是兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過二硫鍵(S-S鍵)和非共價鍵結(jié)合，且分子量為15萬-19萬。兩種輕鏈可以與任何重鏈形成對。各抗體總是由相同的兩條輕鏈和相同的兩條重鏈形成。鏈內(nèi)S-S鍵是在重鏈中有4個—s鏈中有5個)，輕鏈中有2個，每100~IIO個氨基酸殘基形成一個環(huán)，該立體結(jié)構(gòu)在各環(huán)之間類似，稱為結(jié)構(gòu)單元或結(jié)構(gòu)域。對于重鏈和輕鏈兩者，其位于N末端的結(jié)構(gòu)域盡管是同種動物的相同類(亞類)的指標，但其氨基酸序列不恒定，該結(jié)構(gòu)域被稱為可變區(qū)(V區(qū)，可變區(qū))(各結(jié)構(gòu)域分別表示為Vh和Vl)。由此向C末端一側(cè)的氨基酸序列是在每類或亞類中大致恒定的、被稱為恒定區(qū)(C區(qū)，恒定區(qū))(各結(jié)構(gòu)域分別表示為CH1、Ch2、Ch3和CL)。抗體的抗原決定部位由Vh和Vt構(gòu)成，結(jié)合特異性由該部位的氨基酸序列確定。另一方面，與補體或各種細胞結(jié)合的生物學活性反映了各類Ig之間C區(qū)的結(jié)構(gòu)差異。輕鏈和重鏈可變區(qū)的可變性大致限于在兩種鏈中均存在的三個小的超可變區(qū)，將這些區(qū)稱為CDR(互補決定區(qū))?？勺儏^(qū)的其余部分被稱為構(gòu)架區(qū)，該區(qū)是比較恒定的。通常，只有各可變區(qū)的互補決定區(qū)的5~IO個氨基酸形成抗原結(jié)合部位。本說明書中，將與抗原反應的可變區(qū)具有來自小鼠抗體(也稱為供體異源抗體)的可變區(qū)、恒定區(qū)具有來自人抗體的恒定區(qū)的抗體稱為嵌合抗體，將識別骨橋蛋白及其片段的嵌合抗體稱為嵌合抗骨橋蛋白抗體。將除抗原特異性的非人哺乳動物(例如小鼠)抗體分子的互補決定區(qū)(抗原結(jié)合部位)以外全部置換為人抗體的氨基酸，所得重組抗體稱為人源化抗體。人源化抗體也包含如本發(fā)明抗體的、在構(gòu)架區(qū)附加有氨基酸修飾(置換、插入、缺失、附力O)而得到的抗體。通常認為在人源化抗體的制備中，當只是將互補決定區(qū)的氨基酸序列嫁接到作為模板的人抗體構(gòu)架區(qū)時，很多情況下抗原結(jié)合活性比原始小鼠抗體降低。已經(jīng)確認上述人源化2K1抗體雖然具有與OPN肽的結(jié)合性，但是與OPN的細胞粘附抑制活性極低，因此不適合作為抗體藥物使用(后述實施例9)。本發(fā)明人等為了改善上述人源化抗體的活性降低、且為了獲得適合作為抗體藥物使用的具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性的人源化抗體，進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、和由SEQIDNO.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)的人源化抗人骨橋蛋白抗體與以往的嵌合和人源化抗人骨橋蛋白抗體比較，具有顯著改善的活性和/或各種穩(wěn)定性指標方面具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。上述本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體是在作為模板的人抗體的重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)對幾種氨基酸進行修飾而制備的。與只嫁接互補決定區(qū)而制備的以往的人源化抗人骨橋蛋白抗體相比，構(gòu)架區(qū)的序列不同(專利文獻2)。本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體可根據(jù)本說明書中所公開的其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列信息，使用該領(lǐng)域所公知的方法，由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備。具體來說，可制備具有編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸(SEQIDNO.l)的堿基序列的重鏈可變區(qū)基因片段、以及具有編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸(SEQIDN0.3)的堿基序列的輕鏈可變區(qū)基因片段。然后，將該可變區(qū)基因與人抗體的適當類別(class)的恒定區(qū)基因連接，來制備人源化抗體基因。接著，將該人源化抗體基因與適當?shù)谋磉_載體連接，導入到培養(yǎng)細胞中。最后，培養(yǎng)該培養(yǎng)細胞，由此可從培養(yǎng)上清中獲得人源化抗體。編碼上述本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)氨基酸(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)的各可變區(qū)基因片段例如可按照WO03/027151所述方法，如下制備制備分別編碼該文獻公開的人源化2K1抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的基因片段，將突變導入到編碼人源化2K1抗體構(gòu)架區(qū)的該基因片段的規(guī)定位點。為了將突變導入構(gòu)架區(qū)規(guī)定位點可以采用位點定向i秀變法(CurrentProtocolsinMolecularBiologyedit.Ausubel等人.(1987)Publish.JhonWiley&SonsSection8.1~8.5)等本領(lǐng)域所公知的各種方法。或者本發(fā)明的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因片段也可以基于根據(jù)該重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)而設計的堿基序列、或SEQIDNO.5和SEQIDN0.7所示的本發(fā)明的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的堿基序列，利用本領(lǐng)域所公知的基因合成方法進行合成。上述基因合成方法可以采用WO90/07861所述抗體基因的合成方法等本領(lǐng)域所公知的各種方法。接著，將上述可變區(qū)基因片段與人抗體的恒定區(qū)基因連接，來制備人源化抗體基因。盡管所使用的人抗體的恒定區(qū)可以選擇任何亞類的恒定區(qū)，但重鏈恒定區(qū)可優(yōu)選使用人Igyl,輕鏈恒定區(qū)可優(yōu)選使用人IgK。制備該人源化抗體基因后，對于人源化抗體基因向表達載體的導入、表達載體向培養(yǎng)細胞的導入、培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)、抗體的純化等，可采用本領(lǐng)域所公知的各種方法，或者參照WO02/081522或WO03/027151所述的嵌合抗人骨橋蛋白抗體或人源化抗人骨橋蛋白抗體的制備方法進行。與上述得到的人源化抗體基因連接的表達載體可以使用國際公開公報WO94/20632所述的AG-yl或AG-k等表達載體，但對表達載體沒有特別限定，只要可表達人源化抗體基因即可。表達載體如果利用AG-yl或AG-k等已經(jīng)具有人Ig恒定區(qū)基因的載體，則只是將人源化抗體可變區(qū)基因插入其中，即可形成具有人源化抗體基因的表達載體，因此優(yōu)選。上述表達載體例如可通過磷酸4丐法等導入到培養(yǎng)細胞中。要導入表達載體的培養(yǎng)細胞例如可使用CHO-DG44細胞等的培養(yǎng)細胞，可以按照常規(guī)方法進行培養(yǎng)。上述培養(yǎng)后，在培養(yǎng)上清中累積的抗體例如可通過使用蛋白A柱的各種色譜來純化。上述得到的人源化抗人骨橋蛋白抗體的抗原活性例如可通過后述實施例所述的使用骨橋蛋白肽等的ELISA、或BIACore(BIACore公司)等測定。人源化抗人骨橋蛋白抗體的白細胞游走抑制活性例如如后述實施例所述，可以通過在受試抗體和OPN或凝血酶切割型OPN的存在下培養(yǎng)人末梢血單核細胞來測定。本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體具有抑制由細胞因子(例如TNF-a)活化的人末梢血單核細胞向凝血酶切割型OPN游走的生物學活性。接著，針對各種穩(wěn)定性指標，對上述制備的人源化抗人骨橋蛋白抗體進行試驗。本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體顯示以下的穩(wěn)定性指標(A)D)):A)熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為與在PBS中、在70。C下加熱處理2小時后時的90%以上。嵌合抗體相比，中點轉(zhuǎn)變溫度(midpointtransitiontemperature,Tm)至少高5°C。嵌合抗體相比，具有至少可以耐受高0.5M濃度的鹽酸胍的耐性。嵌合抗體相比，具有至少可以耐受低0.3的pH的耐性。15這里，上述指標A)和B)均為熱穩(wěn)定性的指標，這些指標越好的抗體，其在長期保存穩(wěn)定性和劑型方面越具有優(yōu)勢。即，抗體制劑由于是蛋白質(zhì)，因此在保存穩(wěn)定性方面有較多問題，而凍干制劑(在使用時必須溶解，因此在醫(yī)療現(xiàn)場、在便利性方面存在問題，特別是蛋白制劑溶解大多需要30秒以上，大多成為醫(yī)療現(xiàn)場較大的負擔)，如果是具有良好的溫度穩(wěn)定性的抗體，則可以在溶液狀態(tài)下可冷藏保持2年以上的長期穩(wěn)定性。實際上，作為本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的后述實施例所述的R2Klvl.7在室溫(25。C)下可確保一年左右的穩(wěn)定性。如果可以形成溶液制劑，則可以制成預灌封注射器等便利性更高的制劑。滿足上述指標的、溫度穩(wěn)定性高的抗體其制劑化變化形式廣，為實現(xiàn)醫(yī)療需求更高的制劑增添了更多的選擇可能性。上述指標C)是關(guān)于鹽耐性的指標，具有所述鹽耐性的抗體可以在形成藥物制劑時進行更為有利的處方研究。特別是在預灌封注射器中，在設計為100~200^g/mL的高濃度的蛋白制劑方面大多使用高的鹽濃度，因此是有用的。上述指標D)是關(guān)于pH耐性的指標，具有上述pH耐性的抗體在抗體在抗體的制備純化過程的病毒滅活步驟中，可以以更低的pH進行處理，因此是有用的。為此，與通常的抗體比較，即使具有低0.3左右的低pH耐性，也會成為很大的優(yōu)勢。指標A)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體在PBS中稀釋(優(yōu)選50〃g/mL),并在70。C下加熱處理2小時。然后將該稀釋液恢復至室溫，例如通過Kon等人的ELISA方法(JoumalofCellularBiology,88:420~432(2002))測定該抗體與含有SWYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的結(jié)合活性。該熱處理的抗體的結(jié)合活性與對未熱處理的相同抗體測定的結(jié)合活性進行比較。本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，在上述加熱處理時，顯示與含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的結(jié)合活性為未進行加熱處理時的90%以上的結(jié)合活性。優(yōu)選本指標試驗中使用的含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的16肽是具有CVDTYDGRGDSVVYGLRS序列(SEQIDN0.13)的骨橋蛋白肽。指標B)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體mM檸檬酸緩沖液+120mMNaCl(pH6.0))進行調(diào)節(jié)，通過差示掃描量熱儀(優(yōu)選MicroCal公司的VPcapillaryDSCplatform)可評價對加熱的穩(wěn)定性。表示本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體變性溫度的中點轉(zhuǎn)變溫度(Tm)與C2K1比較，至少高5。C。指標C)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體和上述嵌合2K1抗體(C2K1)溶解于含有0~5M各濃度鹽酸胍的緩沖液(優(yōu)選20mM磷酸鈉+120mMNaCl溶液(pH7.0)),將溶液調(diào)整為適當?shù)臐舛?優(yōu)選50,g/mL)。接著，將各溶液樣品在l(TC下靜置過夜，然后測定各樣品的熒光光語。具體來說，在波長320nm370m的范圍內(nèi)對通過280nm的激發(fā)光使色氨酸產(chǎn)生的熒光進行掃描。峰波長由于鹽酸胍導致的抗體蛋白立體結(jié)構(gòu)的松散而發(fā)生位移。對受試抗體和嵌合抗體分別測定使峰波長發(fā)生位移的鹽酸胍濃度。對于本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，上述使峰波長發(fā)生位移的鹽酸胍濃度與C2K1比較，至少約高0.5M濃度。指標D)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體和上述嵌合2K1抗體(C2K1)用適當?shù)木彌_液(優(yōu)選20mM檸檬酸鈉緩沖液+120mMNaCl(pH6.0))調(diào)節(jié)(優(yōu)選2mg/mL)，向其中加入酸性溶液(優(yōu)選0.1NHC1)和水，制備規(guī)定濃度(lmg/mL)的各低pH的樣品。將該樣品在室溫下處理1小時，然后測定圓二色性(CD)光譜。在波長205nm~260nm的范圍內(nèi)測定CD光譜，根據(jù)Yang等人的CD光譜分析法(MethodsinEnzymology，130,208~269(1986)),對各抗體的各pH處理樣品測定隨機結(jié)構(gòu)的含有率。對于本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，隨機結(jié)構(gòu)的含有率開始升高的pH比C2K1至少低約0.3。本發(fā)明人等以WO03/027151所述人源化抗體為基礎(chǔ)，將位點定向誘變等產(chǎn)生的構(gòu)架區(qū)基因的修飾、與使用上述A)~D)的穩(wěn)定性指標的穩(wěn)定性試驗組合，進行了深入的研究，結(jié)果，通過使人抗體支架部分(FRl-4)為SEQIDNO.l所示的氨基酸序歹'J(氨基酸編號分別為1~30、36~49、67~98和106~116)以及SEQIDN0.3所示的氨基斷列(氨基酸編號分別為1~23、40~54、62-93和103-113),首次成功地獲得了比以往的抗人骨橋蛋白抗體具有優(yōu)異的活性(抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性等)和/或穩(wěn)定性(對熱、低pH條件、變性劑的耐性等)的人源化抗人骨橋蛋白抗體。對本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的上述抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性和各種穩(wěn)定性指標進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有該活性，且顯示該指標A)D)的所有的特性。含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、以及由SEQIDN0.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)的本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體可如下容易地獲得使用本領(lǐng)域中公知的方法，合成編碼SEQIDNO.l所示氨基酸序列的DNA、和編碼SEQIDNO.3所示氨基酸序列的DNA，將它們與適當類別的人抗體恒定區(qū)基因、優(yōu)選重鏈為人Ig丫l恒定區(qū)基因、輕鏈為人IgK恒定區(qū)基因連接，構(gòu)建人源化抗體基因，采用本領(lǐng)域中公知的各種方法或WO02/081522或WO03/027151所述方法等，將該人源化抗體基因?qū)氲奖磉_載體中，將該表達載體導入培養(yǎng)細胞中，培養(yǎng)該培養(yǎng)細胞，由所得培養(yǎng)物中純化抗體。將SEQIDNO.l所示重鏈可變區(qū)基因和人Igyl重鏈恒定區(qū)基因連接得到的本發(fā)明的優(yōu)選的人源化抗體重鏈基因例如有含有編碼SEQIDN0.25所示氨基斷列的堿基序列的基因，更優(yōu)選含有SEQIDNO.24所示的堿基序列的基因。將SEQIDNO.3所示的輕鏈可變區(qū)基因與人IgK輕鏈恒定區(qū)基因連接得到的本發(fā)明的優(yōu)選的人源化抗體輕鏈基因例如有含有編碼SEQIDNO.27所示氨基酸序列的石咸基序列的基因，更優(yōu)選含有SEQIDNO.26所示石威基序列的基因。由含有SEQIDNO.24所示堿基序列的重鏈基因、和含有SEQIDNO.26所示18堿基序列的輕鏈基因所編碼的本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體例如有后述實施例所示的R2Klvl.7?；蛘?，含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、和由SEQIDN0.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)的本發(fā)明的人源化抗骨橋蛋白抗體還可以以編碼上述SEQIDNO.1所示氨基酸序列的DNA和人抗體重鏈恒定區(qū)基因、以及編碼SEQIDNO.3所示氨基酸序列的DNA和人抗體輕鏈恒定區(qū)基因為模板，使用無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯體系進行合成。無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯體系可以使用市售商品，也可以按照本身已知的方法，具體來說，大腸桿菌提取液可按照PrattJ.M.等人.，"TranscriptionandTranslation",HamesB.D.和HigginsS丄編輯.,IRLPress,Oxford179~209(1984)中所述的方法等制備。作為市售的細胞裂解物，來自大腸桿菌的例如有大腸桿菌S30提取系統(tǒng)(Promega公司制備)或RTS500Rapid翻譯系統(tǒng)(Roche公司制備)等，來自兔網(wǎng)織紅細胞的例如有兔網(wǎng)織紅細胞裂解系統(tǒng)(Promega公司制備)等，來自小麥胚芽的例如有PROTEIOS頂(TOYOBO公司制備)等。其中，優(yōu)選使用小麥胚芽裂解物。小麥胚芽裂解物的制備方法例如可采用JohnstonF.B.等人"Nature,179，160~161(1957)、或者EricksonA.H.等人.，Meth.Enzymol.,96，38~50(1996)等所述的方法。本發(fā)明也包含含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、由SEQIDNO.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)的、保有活性的單鏈可變區(qū)片段(scFv)、Fab、Fab'和F(ab')2等人源化抗人骨橋蛋白抗體片段。可在scFv的制備中使用的用于將重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)連接的接頭只要可使本發(fā)明的抗體片段具有上述特性即可，沒有特別限定，例如有含有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO,14)所示氨基酸序列的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明制備該人源化抗人骨橋蛋白抗體或抗體片段與其它肽和蛋白質(zhì)的融合抗體，和制備結(jié)合有修飾劑的修飾抗體。融合中使用的其它肽或蛋白質(zhì)只要不使抗體19結(jié)合活性降低即可，沒有特別限定，例如有人血清白蛋白，各種tag肽、人工螺旋基序肽、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、各種毒素、可促進多聚體化的其它肽或蛋白質(zhì)等。修飾中使用的修飾劑只要不使抗體結(jié)合活性降低即可，沒有特別限定，例如有聚乙二醇、糖鏈、磷脂、脂質(zhì)體、低分子化合物等。上述得到的本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體或保有起因于該抗體的活性的抗體片段、將該抗體或該抗體片段與肽或其它蛋白質(zhì)融合而成的融合抗體、或者使該抗體或抗體片段與修飾劑結(jié)合而成的修飾抗體還可以根據(jù)需要進一步純化，然后按照常規(guī)方法制成藥物制劑，可用于類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風濕性關(guān)節(jié)炎和慢性類風濕等風濕病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、銀屑病等的治療；抑制癌癥和器官移植后的慢性排斥反應；以及變形性關(guān)節(jié)病、全身性自身免疫疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞氏病、多發(fā)性肌炎、系膜增殖性腎小球腎炎和結(jié)節(jié)病等自身免疫疾病的治療。本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體優(yōu)選作為風濕病治療藥、自身免疫疾病治療藥、變形性關(guān)節(jié)病治療藥或類風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥，更優(yōu)選作為類風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥使用。這些風濕病治療藥等的劑型的例子可以是注射劑、點滴劑等非腸道給藥制劑，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥等進行給藥(為自身免疫疾病治療藥時也可以按照該方法)。制成藥物制劑時，在藥學上可接受的范圍內(nèi)可以使用與這些劑型匹配的載體或添加劑。在上述制劑制備中，人源化抗人骨橋蛋白抗體的添加量根據(jù)患者的癥狀程度、年齡或所使用的制劑的劑型或重組OPN抑制抗體的結(jié)合效價等而不同，例如可以使用0.1mg/kg~100mg/kg左右。上述得到的本發(fā)明的治療藥是作為有效成分的人源化抗人骨橋蛋白抗體與OPN的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)牢固地結(jié)合，抑制OPN的該部分與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，結(jié)果可以抑制風濕20本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體不是與整聯(lián)蛋白一側(cè)、而是與OPN—側(cè)特異性結(jié)合，因此，抑制整聯(lián)蛋白的其它重要功能的可能性小，期待避免副作用的問題。此外，本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體還可用作類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷藥。如前所述，在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)中，特別發(fā)現(xiàn)了高濃度的凝血酶切割的OPN的N末端片段。因此，使用該人源化抗人骨橋蛋白抗體測定檢體中的OPN或其N末端片段的量，可對于類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷發(fā)揮作用。該方法可以利用放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等人.，(1980):MethodsinEnzymol.,70,419~439)、熒光抗體法、噬菌斑法、點樣法、凝集法、Ouchterlonymethod(烏赫特朗尼氏法)等常規(guī)免疫化學測定法中使用的各種方法("雜交瘤法和單克隆抗體"，抹式會社R&DPlanning發(fā)行，30—53頁，1982年3月5曰)。盡管上述方法可根據(jù)各種角度適當選擇，但從靈敏度、簡便性等角度考慮優(yōu)選ELISA法。更優(yōu)選方法的例子是例如將本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體固定在載體上，對與本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體識別不同的OPN上的部位的抗體進行標記，由此可以檢測OPN或其N末端片段，可以將其用作類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷藥。在標記上述抗體時所使用的標記物可以是用于形成融合蛋白/肽的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等蛋白質(zhì)/肽，辣根過氧化物酶(以下稱為"HRP")、堿性磷酸酶(以下稱為"AP")等酶，異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光物質(zhì)，32P、1251等放射性物質(zhì)，和化學發(fā)光物質(zhì)等修飾劑。關(guān)于OPN同工型的檢測方法，例如可使用夾層法等本領(lǐng)域中公知的方法，更具體來說，可以通過使用與WO02/081522(專利文獻2)本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗體或其片段的基因、以及含有該基因的表達載體。本發(fā)明的表達載體只要是在原核細胞和/或真核細胞的各種宿主細胞中表達編碼本發(fā)明的抗體或其片段的基因、可生成這些21多肽即可，沒有特別限定。例如有質(zhì)粒載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒)等。以及可與該基因功能性連接的啟動子。作為使本發(fā)明的多肽在細菌中表達的啟動子，當宿主為埃希氏桿菌屬細菌時，例如有Trp啟動子、lac啟動子、rec啟動子、XPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為使本發(fā)明的抗體或其片段在酵母中表達的啟動子，例如有PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子，宿主為芽孢桿菌屬細菌時，例如有SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。宿主為哺乳動物細胞等的真核細胞時，例如有來自SV40的啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、熱激啟動子等。宿主細胞使用細菌、特別是大腸桿菌時，本發(fā)明的載體可以進一步含有起始密碼子、終止密碼子、終止子區(qū)和可復制單元。宿主使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞時，本發(fā)明的表達載體可以含有起始密碼子和終止密碼子。此時，可以含有增強子序列、編碼本發(fā)明的多肽的基因的5'—側(cè)和3'—側(cè)的非翻譯區(qū)、剪接界、聚腺苷酸化位點、或可復制單元等。還可根據(jù)需要含有通常使用的選擇標記(例如四環(huán)素、氨千青霉素、卡那霉素)。本發(fā)明還提供導入了本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化體。上述轉(zhuǎn)化體例如可通過用本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞來制備。轉(zhuǎn)化體的制備所使用的宿主細胞只要適合上述表達載體、并可轉(zhuǎn)化即可，沒有特別限定，可例舉本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
中通常使用的天然細胞或人工建立的細胞系等各種細胞(例如細菌(埃希氏桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌)、酵母(酵母屬、畢赤氏酵母屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如Sf9)等)。轉(zhuǎn)化可按照本身公知的方法進行。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體或其片段的生成方法，該方法包含使本發(fā)明的基因在宿主細胞中表達，即，使用上述轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的抗體或其片段的生成中，轉(zhuǎn)化體可在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。營養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有轉(zhuǎn)化體生長發(fā)育所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。碳源例如有葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源例如有銨鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粕、馬鈴薯提取液等。還可根據(jù)需要含有其它營養(yǎng)素(例如無^L鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如四環(huán)素、新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等)等)。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可按照本身公知的方法進行。培養(yǎng)條件例如溫度、培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)時間可適當選擇。例如，宿主為動物細胞時，培養(yǎng)基可以使用含有約5~20%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(Science,122巻，501頁，1952)、DMEM培養(yǎng)基(Virology，8巻，396頁，1959)、RPMI1640培養(yǎng)基(J.Am.Med.Assoc.,199巻，519頁，1967)、199培養(yǎng)基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73巻，1頁，1950)等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約為6~8,培養(yǎng)通常在約3040。C下進行約15-72小時，可以根據(jù)需要進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，例如有含胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82巻，8404頁，1985)等，其pH優(yōu)選約5~8。培養(yǎng)通常在約2040。C下進行15~100小時，可以根據(jù)需要進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌時，例如含有上述營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基較為適當。優(yōu)選pH為58的培養(yǎng)基。宿主為大腸桿菌時，優(yōu)選的培養(yǎng)基可例舉LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基(Miller等人.，Exp.Mol.Genet,ColdSpringHarborLaboratory,431頁，1972)等。這種情況下，培養(yǎng)通?？梢栽?443。C下進行約3-24小時，根據(jù)需要可同時進行通氣或攪拌。宿主為芽孢桿菌屬細菌時，培養(yǎng)通?？梢栽?0~40。C下進行約16~96小時，根據(jù)需要可同時進行通氣或攪拌。宿主為酵母時，培養(yǎng)基例如有Burkholder，s極限培養(yǎng)基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77巻，4505頁，1980),pH優(yōu)選為5~8。培養(yǎng)通常在約20~35。C下進行約14~144小時，并且可以根據(jù)需要進行通氣或攪拌。分離和純化。分離和純化的方法例如有鹽析和溶劑沉淀法等利用溶解度差的方法；透析、超濾、凝膠過濾和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳等利用分子量差的方法；離子交換色傳和羥基磷灰石色語等利用電荷差的方法；親和層析等利用特異性親和性的方法；反相高效液相色譜等利用疏水性差異的方法；等電點聚焦電泳等利用等電點差的方法等。以上對于本發(fā)明的整體情況進行了描述，這里給出為了深化理解而參照的特定實施例，它們的目的只是例舉，并不限定本發(fā)明的范圍。實施例以下給出實施例。如無特別說明，涉及使用試劑盒等的部分是4安照所附說明書進行。(1.人源化2K1抗體的制備)本發(fā)明中，制備兩種將國際公開公報WO2003/027151所述的來自小鼠的抗人骨橋蛋白抗體一2K1抗體進行人源化的人源化抗人骨橋蛋白抗體(以下稱為人源化2K1抗體或R2K1抗體)。各人源化2K1抗體的制備大致按上述公報所述方法制備，因此以下才既略描述。首先，通過使用合成寡DNA的PCR，制備具有圖1和圖2所示堿基序列的、兩種編碼人源化抗OPN抗體的重鏈可變區(qū)(VHs)的DNA,和具有圖3和圖4所示石咸基序列的、兩種編碼人源化抗OPN抗體的輕鏈可變區(qū)(VLs)的DNA。在以下的記述中，為了將它們區(qū)另ij,將圖1和圖2所示人源化抗人OPN抗體VHs分別稱為R2K1-VH1.7和R2K1-VH1.8。同樣，將圖3和圖4所示的人源化抗人OPN抗體VLs分別稱為R2K1-VL1.7和R2K1-VL1.8。接著，利用限制酶HindIII識別位點和Bamffl識別位點，將各編碼上述人源化抗人OPN抗體VHs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恒定區(qū)鏈的基因的表達載體AG-y1中，制備具有R2K1-VH1.7的重鏈的表達質(zhì)粒、和具有R2K1-VH1.8的重鏈的表達質(zhì)粒。同樣，將24各編碼上述人源化抗人OPN抗體VLs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恒定區(qū)k鏈的基因的表達載體AG-k中，制備具有R2K1-VL1.8的輕鏈的表達質(zhì)粒、和具有R2K1-VL1.7的輕鏈的表達質(zhì)粒。這些表達質(zhì)粒導入到大腸桿菌中，使其增殖，使用市售的質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)進行純化。最后，將上述純化表達質(zhì)粒的各種組合，通過磷酸釣法轉(zhuǎn)染CHO-DG44細胞，在含有Geneticin(Invitrogen公司)和透析型FCS(Invitrogen公司)的MEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中選擇細胞，由此得到表達兩種人源化2K1抗體的細胞。即，可使由具有R2K1-VH1.8的重鏈和具有R2K1-VL1.8的輕鏈組成的人源化2K1抗體一R2Klv1.8抗體；由具有R2K1-VH1.7的重鏈和具有R2K1-VL1.7的輕鏈組成的人源化2K1抗體一R2Klvl.7抗體表達。將按照上述順序得到的各R2K1抗體生成細胞在添加有進行了10%透析型FCS的MEM培養(yǎng)基中充分增殖，接種于細胞培養(yǎng)滾瓶(BDBiosciences公司)中，在37。C、1rpm轉(zhuǎn)速的條件下進行培養(yǎng)。數(shù)曰后，確認細胞貼附于器壁并增殖，舍去培養(yǎng)液，更換為500mL不含有血清的MEM培養(yǎng)基，并在上述條件下培養(yǎng)細胞。約2周后，在由器壁剝離并懸浮的細胞增多時結(jié)束培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清用0.22/mi的濾器過濾并回收，由此得到含有各R2K1抗體的培養(yǎng)上清。以這些培養(yǎng)上清為起始材料，使用蛋白A柱(MILLIPORE公司)和陽離子交換柱(Amersham公司)，得到了各數(shù)mg的兩種純化人源化抗體，即R2Klvl.8抗體和R2Klvl.7抗體。在以下所述各種試驗中，使用上述得到的純化抗體。嵌合2K1抗體(以下也稱為C2K1抗體)使用按照上述國際公開公報WO2003/027151所述方法獲得的抗體。(2.通過ELISA確認與人骨橋蛋白肽的結(jié)合性)參考Kon等人的ELISA法(JournalofCellularBiology,88:420~25432(2002)),對各R2K1抗體和CZK1抗體與人骨橋蛋白肽(CVDTYDGRGDSVVYGLRS:SEQIDN0.13)的結(jié)合活性進行比較。以下概略描述。學社)與導入了馬來酰亞氨基的BSA反應，制備hOPN5-BSA螯合物。將hOPN5-BSA螯合物以200ng/100/^L/孔在4°C下、在ELISA板(Nunc公司)中固定一夜，洗板，然后用添加了1。/。BSA的PBS在4。C下封閉過夜。將用添加1%BSA的PBS稀釋的抗體樣品以100//L/孔添加到上述板中，在37。C下反應1小時。檢測是使用過氧化物酶(HRP)標記抗人IgG(H+L)抗體(和光純藥林式會社制備)進行。使用酶標儀(MolecularDevices<^司)測定波長450nm的p及光度。結(jié)果證實，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體與hOPN5肽的結(jié)合性與C2K1抗體同等(圖5)。(3.R2K1抗體對人末梢血單核細胞游走的抑制活性)進行研究。首先，將對健康人肝素采血得到的血液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋2倍。將稀釋的血液鋪于Ficoll-Paque(Pharmacia公司)中，以400xg下在室溫下離心30分鐘。回收在血漿和Ficoll-Paque交界所見到的白色層，作為單核細胞使用。將這樣得到的單核細胞用人TNF-a(20ng/mL)進行過夜培養(yǎng)和活化，將活化后的細胞用于游走試驗。游走試驗是使用48孔微型化學趨化室裝置(microchemotaxischamber,NeuroProbeInc公司)進行。將人OPN與牛凝血酶(Sigma)一起在37。C下反應2小時，進行切割。將以各種濃度添加R2K1抗體和C2K1抗體而得到的混合液預先在37。C下;^置15分鐘，然后加入到下側(cè)房室中(人OPN終濃度為10^g/mL)。在其上放置聚碳酸酯濾器(孔徑5/mi),再向上側(cè)房室中加入50〃L細胞懸浮液(2x106個細胞26/mL)。在37。C、5%(302存在下培養(yǎng)2小時，然后取下聚碳酸酯濾器，除去上側(cè)濾器表面的細胞，然后將細胞用Diff-Quick(Baxter公司)染色。以40倍的放大倍率下計測上側(cè)濾器表面的細胞數(shù)，結(jié)果以6孔的平均細胞數(shù)(細胞/mm"士SEM表示(表1)。這些結(jié)果顯示，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體兩者與C2K1抗體同樣，抑制了由TNF-a活化的人末梢血單核細胞向凝血酶切割型人骨橋蛋白的游走。R2Klvl.7和R2Klvl.8<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(4.通過ELISA評價熱穩(wěn)定性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體用PBS稀釋為50〃g/mL，在70°C的水浴下進行2小時處理，然后恢復至室溫，通過上述ELISA,將所得的吸光度與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性制成圖表表示。殘留活性使用具有直線性的0.2~2.0范圍內(nèi)的吸光度的值計算(以下相同)。結(jié)果表明，上述處理后的殘留活性中，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體比C2K1抗體高(圖6)。特別是R2Klv1.7抗體顯示超過卯％的殘留活性。由此可以判斷，R2Klvl.7抗體和R2Klvl,8抗體與27C2K1抗體相比，熱穩(wěn)定性提高。(5.通過ELISA評價低pH耐性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體的純化品用PBS稀釋為50^g/mL。使用1NHC1和pH計(HORIBA公司)將各稀釋劑調(diào)節(jié)至pH5，在25。C下處理2小時。然后用1MTris-HCl(pH9.5)將各稀釋劑調(diào)節(jié)至pH7，進行上述ELISA,將所得吸光度與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性制成圖表表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述處理后的殘留活性中，R2Klvl.7抗體比C2K1抗體和R2Klvl.8抗體顯著高(圖7)。由此表明，R2Klvl.7抗體與R2Klvl.8抗體和C2K1抗體相比，對低pH的耐性提高。(6.通過熒光光譜測定來評價鹽酸胍耐性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體用含有各濃度的鹽酸胍的20mM磷酸鈉緩沖液+120mMNaCl(pH7)調(diào)節(jié)至50〃g/mL(對照未添加鹽酸胍)，在10。C下靜置過夜，然后測定各樣品的熒光光譜。熒光光譜的測定使用FP-6500熒光分光計(JASCO公司)進行。使用光路長3mm的比色皿(cell),在波長320nm~370nm的范圍內(nèi)對由280nm的激發(fā)光產(chǎn)生色氨酸發(fā)出的熒光進行掃描。在抗體間比較鹽酸胍濃度和峰波長之間的關(guān)系。結(jié)果，對于C2K1，從鹽酸胍濃度超過1M的時間點，對于R2Klv1.8，從超過2M的時間點，可觀察到由于蛋白立體結(jié)構(gòu)松散而產(chǎn)生的峰波長的位移，而對于R2Klv1.7，直至3.8M也未有峰波長位移(圖8)。由此表明，R2Klvl.7抗體與R2Klvl.8抗體和C2Kl抗體比較，對鹽酸胍的耐性提高。(7.通過CD評價低pH耐性)將C2K1抗體和R2Klvl.7抗體用20mM檸檬酸緩沖液+120mMNaCl(pH6)調(diào)節(jié)至2mg/mL。向其中邊加入0.1NHC1和蒸餾水邊制備具有抗體濃度為1mg/mL的各pH水準的樣品，在室溫下處理1小時后測定各樣品的CD光譜。28CD(圓二色性)的測定使用J-820分光偏振計(JASCO公司)進行。使用光路長O.lmm的比色皿，測定波長205nm~260nm范圍內(nèi)CD光譜。光譜的分析使用基于Yang等人的CD光譜分析法(MethodsinEnzymology,130,208~269(1986))制造的JWSSE-480型蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)分析程序(JASCO公司)。在抗體間比較本方法中計算的隨機結(jié)構(gòu)的含有率與處理pH之間的關(guān)系。結(jié)果表明，對于C2K1抗體，由pH3可見隨機結(jié)構(gòu)含有率的升高，而對于R2Klv1.7，直至pH2.7也未見隨機結(jié)構(gòu)的升高(圖9)。由此確認，R2Klvl.7抗體與C2K1抗體相比，具有低0.3的pH耐性。(8.通過差示掃描量熱儀評價熱穩(wěn)定性)將C2K1抗體和R2Klvl.7抗體以1mg/mL的濃度溶解于20mM檸檬酸緩沖液+120mMNaCl(pH6.0)緩沖液中，使用MicroCal公司的超高靈敏度差示掃描量熱儀(VPcapillaryDSCplatform)研究熱穩(wěn)定性。結(jié)果如圖10所示。表示高級結(jié)構(gòu)變性溫度的中點轉(zhuǎn)變溫度(Tm)在C2K1抗體中是76.0°C，而在R2Klvl.7抗體中是82.8°C，確認升高約6。C。由此表明，R2Klvl.7抗體的熱穩(wěn)定性顯著提高。(9.R2Klvl.7對OPN的細胞粘附抑制效果)為了比較本申請發(fā)明的R2Klvl.7和公知的人源化抗OPN抗體(參照WO03/027151,以下稱為R2KlvO)的藥理效果，研究了這兩種抗體對人OPN的細胞粘附抑制效果。1.細胞的培養(yǎng)和繼代JurkatE6.1細胞購自大日本制藥(抹)，使用RPMI1640(10%FCS、青霉素-鏈霉素)進行繼代和培養(yǎng)。2.試劑的制備粘附緩沖液(L-15培養(yǎng)基、1%BSA、50mMHEPES、pH7.4)PMA溶液(粘附緩沖液中含有40ng/mL12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)[SIGMA])29CV染色液(0.5。/。結(jié)晶紫、1%曱酰胺、20%曱醇)GST溶液(PBS(-)中含有5^g/mL谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)[SIGMA])人IgG,溶液(PBS(-)中含有400pg/mL)[CALBIOCHEM]3.凝血酶切割型人N末端骨橋蛋白(OPN)的制備GST融合凝血酶切割型人N末端OPN(GST-人N-OPN，1.6mg/mL)如WO02/081522中記載的方法進行制備，用PBS(-)稀釋為5^g/mL后，用于試驗。4.受試藥物的制備將R2Klvl.7(18.6mg/mL)和R2KlvO(4.39mg/mL)用PBS(-)稀釋為4、12、40、120和400(wg/mL)，各稀釋液均添加人IgGP使總蛋白質(zhì)濃度為400:g/mL。5.組構(gòu)成空白組(GST)對照組受試藥物組R2Klvl.7(1、3、10、30、lOO^wg/mL)R2Klv0(1、3、10、30、濯^g/mL)6.細胞粘附試驗將25pLGST-人N-OPN溶液添加到96孔微孔板的除外空白的所有的孔中，空白組是添加25;wLGST溶液，將該微孔板在37。C下溫育1小時，然后用PBS(-)清洗2次。添加50〃LPMA溶液，將該微孔板在37。C下溫育30分鐘，然后添加25pL受試藥物溶液(受試藥物組)或人IgG,溶液(空白組和對照組)。JurkatE6.1細胞懸浮于粘附緩沖液中，使?jié)舛葹?xl(^個細胞/mL，所有孔中均添加25^L。將懸浮液以15xg離心1分鐘，使細胞沉淀于板的底部，然后在37。C下培養(yǎng)1小時。反應結(jié)束后，將板倒轉(zhuǎn)，以47xg離心2分鐘，除去上清(非粘附細胞)。粘附細胞數(shù)的定量是添加25;uLCV染色液，將該微孔板在室溫下放置10分鐘，對細胞染色并固定，然后將該微孔板用純水洗330次。在所有的孔中加入251。/。Triton-X100溶液，確認細胞溶解，然后用酶標儀(SPECTRAmax250，MolecularDevices)測定吸光度(測定波長595nm)。7.分析試驗是每組使用5個孔。計算各組吸光度的平均值和抑制率，計算IC50值(抑制率為50%時的受試藥物濃度)。抑制率是以空白組為100%，對照組為0%。IC50值如下計算繪制X軸以對數(shù)表示受試藥物濃度，Y軸表示抑制率的圖表，通過最小二乘法代入直線回歸方程式進行計算。IC50值的計算使用在用量反應中顯示直線性的受試藥物濃度的數(shù)據(jù)。由圖11所示的結(jié)果可以理解公知的人源化抗人OPN抗體的細胞粘附抑制效果極低，而R2Klvl.7具有優(yōu)異的細胞粘附抑制效果(IC50值6.4)。(10.R2Klvl.7在食蟹猴中對于膠原誘導關(guān)節(jié)炎的效果)將用弗氏完全佐劑(BectonDickinsonandCompany)乳液化的牛II型膠原(膠原技術(shù)研修會)在給藥36日前免疫雌性食蟹猴的背部和尾部，在給藥15天前加強免疫。根據(jù)與免疫前進行比較的體重和近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積的變化率，將動物隨機分成三組給藥治療組(『10)。將25mg/kg或50mg/kg用量的R2Klvl.7或溶劑對照組按每周1次、共8次通過靜脈內(nèi)注入給藥。以最初給藥日規(guī)定為第0天。給藥期間的第0、6、13、20、27、34、41、48和55天，監(jiān)控近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積作為關(guān)節(jié)腫脹的體征。用游標卡尺測定前后肢近側(cè)指間關(guān)節(jié)的短軸和長軸，計算橢圓面積，用16個指的橢圓面積的平均值作為近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積。以給藥前的值為100，計算近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積的變化率。第0天以及第6、13、20、27、34、41、48和55天(給藥6天后)采集血漿，測定R2Klvl.7和抗R2Klvl.7抗體。該測定的R2Klvl.7的血漿濃度與波谷水平對應。數(shù)據(jù)分析是在刪除抗R2Klvl.7抗體陽性動物和試驗期間死亡的動物的數(shù)據(jù)后進行。在25mg/kg用量R2Klvl.7組的1只動物、以及50mg/kg用量R2Klvl.7組的4只動物中產(chǎn)生了抗R2Klvl.7抗體。溶劑對照組的2只動物、25mg/kg用量R2Klvl.7組的2只動物以及50mg/kg用量R2Klvl.7組的1只動物在給藥后死亡。死亡例可能是由于劇烈炎癥導致的衰竭而死亡。50mg/kgR2Klvl.7的治療中，與對照溶劑組比壽交，在第27天~第55天期間，通過近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積的變化率測定的足腫脹顯著減少(圖l2)。25mg/kg用量R2Klvl.7對于近側(cè)指間關(guān)節(jié)橢圓面積的變化未顯示顯著效果。25mg/kg用量和50mg/kg用量的血漿中R2Klvl.7波谷濃度分別為38.41~76.13Ag/mL和73.91~125.3^g/mL。人OPN的SVVYGLR序列與猴OPN的相應序列(SVAYGLR)(SEQIDNO.ll)不同，R2Klvl.7與該人OPN肽的結(jié)合親和性比對應的對猴OPN肽的結(jié)合親和性高100倍以上?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，推定在關(guān)節(jié)炎治療中，R2Klvl.7的有效血漿濃度為100〃g/mL以下。(11.R2Klvl.7的scFv的制備)以上述具有R2K1-VH1.7的重鏈表達質(zhì)粒和具有R2K1-VL1.7的輕鏈表達質(zhì)粒作為模板，通過PCR制備編碼具有VH1.7-接頭-VL1.7(接頭是編碼GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0.14)所示氨基酸序列的堿基序列)結(jié)構(gòu)的單鏈可變區(qū)片段(scFv)的DNA片段。該DNA片段的末端附加有限制酶Sfil和Notl的識別序列。將該DNA片段用限制酶Sfil和Notl消化，插入到同樣用Sfil和Notl消化的pCANTAB5E載體(Marks,J.D等人，J.Mol.Biol.,222巻，581~97頁,1991)的Sfil位點和Notl位點，由此制備R2K1-VH1.7的scFv表達質(zhì)粒。該表達質(zhì)粒中，scFv的編碼區(qū)的下游附加有編碼E-Tag的堿基序列。按照常規(guī)方法，將該質(zhì)粒導入大腸桿菌HB2151抹，接種于SOBAG瓊脂板(含2%葡萄糖和100〃g/mL氨芐青霉素的SOB板)，得到轉(zhuǎn)化克隆。由所得克隆提取質(zhì)粒DNA，通過以該質(zhì)粒DNA為模板的DNA,咸基序列分析確認scFv的編碼區(qū)的序列。DNA堿基序列分析是使用32DTCS-QuickStart試劑盒和CEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)(兩者均為BeckmanCoulter公司)。所得堿基序列如SEQIDN0.9所示。確認了堿基序列的大腸桿菌克隆在含有2%葡萄糖和100^g/mL氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，將其一部分懸浮于加入了1mMIPTG和100〃g/mL氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)過夜，進行scFv的表達誘導。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心回收細胞，懸浮于含有1mMEDTA的PBS中，在冰上放置30分鐘。接著將懸浮液以10,000rpm離心15分鐘，回收上清，用0.45^m的濾器過濾，由此得到含有scFv的周質(zhì)組分。通過使用抗E-Tag抗體的親和層析，由該周質(zhì)組分中純化R2Klvl.7的scFv(以下稱為R2Klvl.7-scFv)。對于上述制備的R2Klvl.7-scFv進行凝膠過濾層析，結(jié)果由圖13所示的分離圖譜中確認，幾乎均為單體。(12.確認R2Klvl.7-scFv與人骨橋蛋白肽的結(jié)合性)通過ELISA法測定純化的R2Klvl.7-scFv與hOPN5肽的結(jié)合活性。方法大致如前所述，在本測定中，使用HRP標記抗E-Tag抗體作為標記抗體。結(jié)果如圖14所示。確認純化的R2Klvl.7-scFv未與陰性對照的BSA結(jié)合，而與hOPN5肽特異性結(jié)合。(13.聚乙二醇修飾抗體片段的制備)按照常規(guī)方法，對R2Klvl.7抗體進行胃蛋白酶處理，然后使用蛋白GHP柱(兩者均為AmershamBiosciences公司)和Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱(AmershamBiosciences公司),4尋到純化F(ab')2。接著，用0.1MDTT對純化F(ab')2進行還原處理，活化石危醇基，然后進4亍4吏用SephadexG-25才主(AmershamBiosciences公司)的凝膠過濾，除去DTT。將這樣得到的Fab，與馬來酰亞胺化聚乙二醇SUNBRIGHTME-120MA(日本油月旨)按照摩爾比1:10混合，在4。C下靜置過夜，進行偶聯(lián)反應。添加碘乙酰胺(NacalaiTesque),終止偶聯(lián)33反應，然后通過使用Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱的凝膠過濾，得到聚乙二醇修飾的F(ab')2(以下可記為F(ab')2-PEG)。該SDS-PAGE的結(jié)果如圖15所示。通過與作為比較對照的、電泳的未修飾F(ab')2進行比較，可以確認通過聚乙二醇修飾導致分子量增力口。(14.確認F(ab')2-PEG與骨橋蛋白肽的結(jié)合活性)使用表面等離子共振測定法確認純化R2Klv1.7的F(ab')2-PEG與hOPN5肽的結(jié)合活性。將生物素化hOPN5肽固定在SensorChipSA(BIAcore公司)上，使用用HBS-EP緩沖液(BIAcore公司)預先稀釋為5Z^g/mL的F(ab')2-PEG確認結(jié)合活性，結(jié)果如圖16所示。由信號的升高，可確認本F(ab')2-PGE與hOPN5肽的結(jié)合活性與R2Klvl.7相同。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性等)和/或穩(wěn)定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優(yōu)異，因此在以自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)病為代表的各種炎癥性疾病的預防或治療中，比起以往的抗人骨橋蛋白抗體可作為更為有效的藥物。雖然本發(fā)明強調(diào)、說明了優(yōu)選方式，但優(yōu)選的方式也可以變更，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明可以按照本說明書詳述以外的方法實施。因此，本發(fā)明包含在所附"權(quán)利要求書"的要旨和范圍內(nèi)所包含的所有的變更。本申請是以在日本國申請的特愿2006-152892為基礎(chǔ)，其中所公開的內(nèi)容均包含在本說明書中。這里所述的包含專利或?qū)＠暾堈f明等程度地引入到本說明書中。3權(quán)利要求1.人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.1所示氨基酸序列組成的重鏈可變區(qū)、和由SEQIDNO.3所示氨基酸序列組成的輕鏈可變區(qū)。2.權(quán)利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)是人IgYl。3.權(quán)利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)是人IgK。4.權(quán)利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)為人Igyl，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人IgK。5.人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.25所示氨基酸序列組成的重鏈、和由SEQIDNO.27所示氨基酸序列組成的輕鏈。6.多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權(quán)利要求1所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的重鏈可變區(qū)的序列。7.多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權(quán)利要求1所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。8.表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求6和/或7所述多核苷酸。9.宿主細胞，該宿主細胞中導入了權(quán)利要求8所述的表達載體。10.生產(chǎn)人源化抗人骨橋蛋白抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細胞，使該細胞表達人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。11.自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的治療藥，該藥物含有權(quán)利要求1-5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體。12.用于預防或治療自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的方法，該方法包含給予治療有效量的權(quán)利要求1~5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。13.權(quán)利要求1~5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體在制備用于預防或治療自身免疫疾病、風濕病、類風濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)病的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體活性(抗原結(jié)合活性、白細胞游走抑制活性等)和/或穩(wěn)定性(對熱、低酸性條件和改性劑的耐性等)優(yōu)異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。文檔編號C12N15/09GK101495632SQ20078002856公開日2009年7月29日申請日期2007年5月30日優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日發(fā)明者中島敏博,山本宣哉,樋口浩文,酒井文彥,鳥飼正治申請人:安斯泰來制藥有限公司;財團法人化學及血清療法研究所