專利名稱：超氧物歧化酶衍生物及其生產(chǎn)方法和在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超氧物歧化酶衍生物及其生產(chǎn)方法和該衍生物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用以及含有該衍生物的口服復(fù)方組合物。
眾所周知超氧物歧化酶(為簡明起見下文用“SOD”表示)普遍存在于動物、植物和微生物的生物組織中，它是一種酶，能分解對活機(jī)體有害的過氧化物。最近，有人嘗試應(yīng)用分離出來的SOD作為抗炎劑(FARUMASHIA，17，411，1981;CurrentTherapeuticResearch，16，706，1974)。
人們也知道當(dāng)靜脈注射SOD時，其血漿半壽期只有4-6分鐘，所注射的SOD迅速排泄。為延長SOD血漿半壽期，試圖用Ficoll，聚乙二醇，大鼠白蛋白或菊粉〔JapanesePublishedUnexaminedPatentapplication(KokaiTokkyoKoho)NO.32826/83〕修飾SOD。
據(jù)報導(dǎo)，經(jīng)Ficoll或聚乙二醇修飾的SOD的活性比未經(jīng)修飾的SOD大幅度降低，而大鼠白蛋白修飾的SOD是抗原性的。同時也發(fā)現(xiàn)菊粉修飾的SOD酶催活性次于SOD。
本發(fā)明目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，這種衍生物與SOD相比，血漿半壽期延長，而又保持SOD原有的酶催活性。
本發(fā)明另一目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，它有抗炎等藥理作用，而且用藥安全。
本發(fā)明又一目的是提供上述超氧物歧化酶衍生物的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明再一目的是將上述超氧物歧化酶衍生物提供醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，例如用作抗炎藥物。
本發(fā)明還有一個目的是提供適宜于口服給藥的上述超氧物歧化酶衍生物的復(fù)方組合物。
從以下詳細(xì)敘述中，這些目的和其他目的以及本發(fā)明所具優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得更明顯。
本發(fā)明提供一種具通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽。其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1、R2、R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物基團(tuán)平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)上述超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的方法，包括超氧物歧化酶和共聚物進(jìn)行反應(yīng)，其組成單元是(a)具有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，(b)選自以下類別如下通式的基團(tuán)
其中R1和R2分別如上所規(guī)定;
如下通式的基團(tuán)
其中R3和R4分別如上所規(guī)定;以及如下通式的基團(tuán)
在pH7～11的堿性水溶液存在下，該共聚物具有平均分子量500～200，000(為簡明起見，下文用“共聚物”)。
本發(fā)明另一方面提供了含上述SOD衍生物或其鹽作為活性成份的藥物復(fù)方組合物，例如抗炎劑;以及治療炎癥和其他疾病的方法，也包括所給予的上述SOD衍生物及其鹽的有效量。
再一方面，本發(fā)明提供含上述SOD衍生物或其鹽類的口服藥物復(fù)方組合物，以及中級/高級脂肪酸甘油酯，及其含上述SOD衍生物或其鹽的口服藥物復(fù)方組合物;還有中級/高級脂肪酸甘油酯以及兩親試劑和/或低級鏈烷醇。


圖1顯示SOD衍生物及SOD對流感病毒感染小鼠的效應(yīng)。
圖2為SOD衍生物(用合成例1制備)的紫外吸收光譜。
圖3為SOD衍生物(用合成例2制備)的紅外吸收光譜。
圖4(ⅰ)為光密度譜，用原料SOD(合成例2中所用)的聚丙烯酰胺凝膠電泳測定。
圖4(ⅱ)為光密度譜，用SOD衍生物(從合成例2制備)的聚丙烯酰胺凝膠電泳測定。
(a)SOD衍生物的生產(chǎn)方法。
(a-1)SOD和共聚物的反應(yīng)。
SOD和共聚物的反應(yīng)通常是將SOD溶于一些鹽的水溶液中進(jìn)行，例如碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等，再將共聚物加到生成的溶液中去，可以粉料形式加入或?qū)⑵淙苡谟袡C(jī)溶劑(如二甲亞砜)后加入。在反應(yīng)進(jìn)行時有必要使溶液維持pH7-11。若pH值小于7，共聚物的溶解度減小，從而干擾反應(yīng)進(jìn)程。若pH值大于11，則SOD被鈍化，以致得不到有效的SOD衍生物。反應(yīng)溫度最好在3～50℃，在4-40℃范圍內(nèi)更好。然而，反應(yīng)時間得取決于反應(yīng)溫度以及共聚物加料的方法，通常在10分鐘至3小時范圍內(nèi)。共聚物的投料大約按0.5-30摩爾對1摩爾SOD的比率。通過改變這一比率，連接到SOD結(jié)構(gòu)上的共聚物分子數(shù)目能被調(diào)節(jié)。
反應(yīng)生成的混合物中不僅含SOD衍生物，而且含有未反應(yīng)的SOD和共聚物等。因此，得將反應(yīng)混合物過濾，使濾液經(jīng)過凝膠過濾。所得含有SOD衍生物的濾液，如有必要，使之進(jìn)行疏水層析并超濾。所得濃縮液經(jīng)冷凍干燥，得SOD衍生物的固態(tài)產(chǎn)物。
作為上述反應(yīng)的結(jié)果，SOD的氨基與共聚物的馬來酐部分結(jié)合，產(chǎn)生SOD衍生物。例如人型SOD每個分子含22(人紅細(xì)胞SOD或產(chǎn)自酵母經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)的人型SOD)-24個(產(chǎn)自大腸桿菌經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)的人型SOD)氨基。在上述反應(yīng)中，SOD的其中某一個氨基和共聚物的其中一個馬來酐部分反應(yīng)，最終產(chǎn)生每個SOD分子含1-22或24個共聚物分子的SOD衍生物。原料共聚物通常含馬來酐環(huán)(見后面所述)。當(dāng)這些馬來酐環(huán)中其中一個與SOD的氨基結(jié)合后，其余馬來酐環(huán)明顯地不和其他氨基反應(yīng)，但傾向與水反應(yīng)，產(chǎn)生具通式
的馬來酸衍生基團(tuán)。有可能一個分子的共聚物與為數(shù)眾多的SOD分子反應(yīng)，生成副產(chǎn)品的化合物，其中共聚物分子中的多數(shù)馬來酐環(huán)與各個SOD分子中的氨基相結(jié)合，但在本發(fā)明實(shí)踐中，使用包含少部分副產(chǎn)物的SOD衍生物并不使人感到討厭。然而，考慮到如下事實(shí)，即藥物產(chǎn)品的任何活性成分希望它是具有單一的化學(xué)結(jié)構(gòu)，最好用合適的方法，如凝膠過濾，將含副產(chǎn)物多的SOD衍生物進(jìn)行純化，以便除去副產(chǎn)物。進(jìn)一步應(yīng)搞清楚，通過上述反應(yīng)得到的SOD衍生物確實(shí)是含有不同數(shù)目共聚物分子的不同化合物的混合物，就是對各個SOD衍生物來說，與SOD結(jié)合的共聚物分子數(shù)目不是均勻的。所以，在上述代表SOD衍生物的通式中，n意味著與一個分子SOD結(jié)合的共聚物分子的平均數(shù)目。然而，當(dāng)需要獲得與之結(jié)合的共聚物分子數(shù)目是均勻的SOD衍生物時，按上述方法制得的SOD衍生物可使之進(jìn)一步作合適的分級純化處理，例如凝膠過濾，從而得到所需的SOD衍生物。
(a-2)原料SOD用作原料的SOD可用常規(guī)方法從動物(人、牛)植物和微生物的活組織中提取出來，或者通過基因工程制得。如今，SOD的化學(xué)結(jié)構(gòu)已被非常充分地闡明(配位金屬，分子量，氨基酸排列順序等)。因此，SOD已被分為三大主要類型，鐵配位SOD，錳配位SOD和銅鋅配位SOD，取決于它們所存在的生物組織，SOD的分子量范圍為30，000-80，000。SOD的氨基酸順序也或多或少隨其所存在的生物組織不同而變化，有關(guān)這一課題的詳細(xì)報道可以從下列文獻(xiàn)中獲得YoshihikoOyanagiSuperoxideandMedicine，74-90(KyoritsuShuppan，May25，1981);JournalofBiologicalChemistry，246，2875-2880(1971);and250，6107-6112(1975);ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，70，3725-3729(1973);ArchivesofBiochemistryandBiophysics，179，243-256(1977)等等。原料SOD最好是人型銅鋅配位SOD。牛型和馬型銅鋅配位SOD也適宜于本發(fā)明目的。這種類型SOD的分子量大約33，000，在其分子中含20、22或24個氨基。例如，人型SOD可以通過將人血作加熱處理，離子交換及連續(xù)性凝膠過濾或基因工程方法分離出來。
(a-3)原料共聚物共聚物作為另一種原料，能通過使二乙烯基醚-馬來酐共聚物部分水解(馬來酐環(huán)水解度30～90%)，或者使該共聚物進(jìn)行部分酯化即半酯化(馬來酐環(huán)半酯化度30～90%)而獲得。作為酯的實(shí)例，可提到的有甲酯、乙酯、丙酯、正-丁酯、正-戊酯、異-戊酯、正-己酯、正-庚酯、正-辛酯、甲氧基乙酯、乙氧基乙酯、丙氧基乙酯、2-丁氧基乙酯、1，3-二甲氧基-2-丙酯、2，3-二甲氧基-1-丙酯、1，3-二乙氧基-2-丙酯、2-乙氧基-3-甲氧基-1-丙酯、1，3-二丙氧基-2-丙酯、1，3-二丁氧基-2-丙酯、芐酯等等。
正如上述，原料共聚物的平均分子量為500～200，000。鑒于最終SOD衍生物進(jìn)入生物體內(nèi)有影響部位的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)，共聚物的重均分子量最好不超過10，000。共聚物的分子量分布并無特別限制。因此，共聚物(其重均分子量與數(shù)均分子量之比大約為2或更高些)可通過二乙烯基醚和馬來酐的自由基共聚，再直接使其部分水解或部分酯解，而無需作之前或之后的分級，以使分子量分布的范圍變窄，這樣的共聚物可成功地用作原料。
(b)SOD衍生物的藥物學(xué)上可接受的鹽，及其鹽的制備方法。
作為上述藥物學(xué)上可接受的SOD衍生物鹽的實(shí)例，可提到的有SOD衍生物的堿金屬鹽，如鈉、鉀等;堿土金屬鹽，如鎂、鈣、鋇等;銨鹽及有機(jī)叔胺的鹽，如吡啶、三乙胺、三正丁胺等。
藥物學(xué)上可接受的SOD衍生物鹽能從SOD衍生物容易地制得，并且能按所需堿的種類，通過常規(guī)的成鹽反應(yīng)制備。
(c)口服復(fù)方組合物中級/高級脂肪酸甘油酯可用于制備口服復(fù)方組合物，按本發(fā)明應(yīng)用具有6～20個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯的代表性例子包括辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、亞油酸、亞麻酸或其類似酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯能單獨(dú)使用或混合使用。
脂肪酸甘油酯可以是天然存在的化合物，或是合成或半合成化合物。通常應(yīng)用天然植物油較為方便。在本發(fā)明實(shí)踐中應(yīng)用植物油具有優(yōu)點(diǎn)，尤其包括橄欖油(油酸70-80%，亞油酸4-12%，十六烷酸7-15%)，玉米油(亞油酸40～60%，十六烷酸25～45%)，芝麻油(油酸35～46%，亞油酸35～48%)，山茶油，花生油(十二烷酸45～52%，癸酸4～12%，辛酸6～10%)和棕櫚油。商業(yè)級產(chǎn)品本身就能應(yīng)用。因此，作為商品可買到的中級脂肪酸三甘油酯的例子，可提到的有Panasate 875，810和800(日本油脂有限公司;辛酸含量10～100%)，ODD (Nissin Seiyu K.K.;辛酸含量67%)等。作為商品的中級脂肪酸單甘油酯的實(shí)例，可提到的有Homoteks PT(Kao公司;癸酸含量60%)。作為中級脂肪酸單和二甘油酯混合物的實(shí)例，可提到的有Witafrol (Dinamit Novel公司)。至于高級脂肪酸三甘油酯，能用像橄欖油那樣的食用商品油(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)以及亞油酸(日本油脂有限公司)。
上面敘述過的兩親試劑是具有親水性和親油性的無毒試劑。這種兩親試劑的典型例子包括天然的兩性表面活性劑，脂肪酸聚甘油酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(吐溫(Tween)系列)，脫水山梨糖醇脂肪酸酯(山梨糖醇酯類(Span)系列)以及聚乙二醇。優(yōu)選的兩親表面活性劑是大豆磷脂，蛋黃卵磷酯及其有關(guān)物質(zhì)，例如磷脂酰膽堿，蛋黃卵磷酯，大豆磷脂，磷脂酰乙醇胺等商品，可從日本油脂有限公司購得。聚甘油脂肪酸酯可以是Unigli (日本油脂有限公司)。作為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的實(shí)例，可提到的有吐溫20(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)。山梨糖醇脂肪酸酯可以是Span 20(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)，而聚乙二醇可以是PEG 6000。除上述而外，陰離子表面活性劑，如月桂基硫酸鈉以及陽離子表面活性劑，如氯化芐烷銨，氯化芐乙氧銨，Eison (美國納爾遜研究開發(fā)(NelsonResearchanolDevelopmentCo.)公司)等也可供應(yīng)用。
上述鏈烷醇可以是乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇或其類似物。
按照本發(fā)明生產(chǎn)復(fù)方組合物的方法，將SOD衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽(在下文內(nèi)一并歸入SOD衍生物)的水溶液調(diào)節(jié)到合適的pH值，制成冷凍干燥物，均勻地分散到上述脂肪酸甘油酯中，后者含或不含上述兩親試劑和/或低級鏈烷醇;或者采用下法，將SOD衍生物的碳酸銨水溶液和上述兩親試劑的水溶液和/或低級鏈烷醇的混合物，進(jìn)行真空冷凍干燥，然后將冷凍干燥物均勻地分散到中級/高級脂肪酸甘油酯中。
上述脂肪酸甘油酯的比例大約為每mgSOD衍生物0.1-100ml，最好約為0.5-5ml(在同一基礎(chǔ)上)。添加上述兩親試劑和/或低級鏈烷醇是隨意的，但這些試劑有助于提高與油的可濕性以及增加分散度或溶解度。以便得到一個穩(wěn)定的，具有額外效果的復(fù)方組合物，在口服之后能提高機(jī)體對藥物的吸收。添加上述兩親試劑恰當(dāng)?shù)牧?，隨其品種不同而變化。在通常情況下，相對于1mgSOD衍生物，取0.01-0.1ml液態(tài)兩親試劑或0.05-5mg固態(tài)兩親試劑為宜。上述低級鏈烷醇的添加量約為1-15%(重量百分?jǐn)?shù))，以復(fù)方組合物的總重量為基礎(chǔ)。添加這種低級鏈烷醇導(dǎo)致改善溶液的均勻性。
按本發(fā)明的復(fù)方組合物是一種物理和化學(xué)穩(wěn)定的澄清液。因此，將此復(fù)方組合物在室溫下以5000rpm的速度離心15分鐘，或者在37℃下放置一個月，無沉淀出現(xiàn)。而且，在4℃或室溫下于暗處貯存，至少在3個月內(nèi)，不出現(xiàn)肉眼可見的變化。此外，即使將復(fù)方組合物置于4℃至室溫下，以24小時為間隔，作10個循環(huán)的溫度變化實(shí)驗(yàn)之后，其效價仍維持不變。
(d)SOD衍生物的藥理學(xué)簡介按本發(fā)明的SOD衍生物表現(xiàn)出的特色為與SOD相比，顯著地延長血漿半壽期，仍保留SOD的酶催活性，實(shí)質(zhì)上原封不動，并且毒性低。所以，本發(fā)明的SOD衍生物具有抗炎劑和缺血疾病的治療劑的價值。
以下動物試驗(yàn)具體說明了本發(fā)明的SOD衍生物及其復(fù)方組合物的效果。
(Ⅰ)抗炎癥和抗病毒試驗(yàn)(1)對流感病毒感染小鼠肺實(shí)變(炎癥性硬化)的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g。使小鼠吸入100倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染，然后按預(yù)定劑量口服被測藥劑，每天一次，連續(xù)6天(從感染那天起)，所用小鼠分為30組。感染后3、4和5天間小鼠連續(xù)死亡，肺實(shí)變評分通過Horsfall方法(Journal of Experimental Medicine 95，135-145，1952)。
結(jié)果如表1所示，表內(nèi)實(shí)變評分的方法如下。將生理鹽水直接注射入小鼠心臟內(nèi)，徹底洗滌肺，然后進(jìn)行觀察，用下列評分等級評價損傷程度。
(2)對病毒感染小鼠的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g，使小鼠吸入2倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染。然后將合成實(shí)例1的SOD衍生物(2000單位/mg)或牛紅細(xì)胞SOD(2000單位/mg)在感染后第5天靜脈注射給藥，劑量為200單位/每一只鼠，每天1次，連續(xù)4天。
圖1顯示存活百分?jǐn)?shù)對感染后的天數(shù)作圖，在SOD衍生物組存活百分?jǐn)?shù)為95%，在SOD組及對照組(感染后未經(jīng)治療的小鼠)為0%。進(jìn)一步試驗(yàn)時，在上述同一方式下，給SOD劑量為2000單位/每一只鼠，僅僅觀察到輕微的效應(yīng)。
從結(jié)果看來很明顯，SOD衍生物對流感病毒感染的小鼠有卓越的效果。
(3)對燒傷部分白蛋白漏出的效果方法將伊文思藍(lán)溶于生理鹽水，終濃度為0.2%(重量百分?jǐn)?shù))，取出0.18ml(10mg/kg)該溶液，經(jīng)靜脈注射給予ddY小鼠(年齡8-10周，體重約30g)。小鼠分為10組。給上述溶液以后，用在70℃水浴上預(yù)熱過的鐵釘頭端(直徑12mm)緊壓小鼠腹部，造成燒傷，立即口服被測藥劑。服藥后2小時殺死小鼠，切割燒傷部位的皮膚，在60℃甲酰胺中浸泡48小時，經(jīng)提取的伊文思藍(lán)濃液，在波長620nm下測定吸光度。從數(shù)據(jù)估算出伊文思藍(lán)-白蛋白絡(luò)合物的濃度，計(jì)算被測藥劑對燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分?jǐn)?shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2所示
表2
＊水溶液＊＊油狀復(fù)方組合物重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，只是在給藥以后6小時殺死小鼠。在上述同一方式下，測定伊文思藍(lán)-白蛋白絡(luò)合物濃度。在ODO 組內(nèi)，燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分?jǐn)?shù)為0%;SOD衍生物(由合成實(shí)例1)組為50%;SOD復(fù)方組合物(由配方實(shí)例6)組為56.5%。
用按合成實(shí)例2所得SOD衍生物作實(shí)驗(yàn)，得到同樣結(jié)果。
從上述結(jié)果看來很明顯，SOD衍生物和本發(fā)明的復(fù)方組合物與對照組相比，抑制燒傷部位白蛋白漏出是有效的。
(Ⅱ)口服SOD衍生物復(fù)方組合物之后血液轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)血藥(SOD衍生物)濃度通過放射性測試來測定，實(shí)驗(yàn)方法步驟和結(jié)果如下(1)14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物的制備將17.7mgSOD衍生物(按合成實(shí)例1)溶于1.5ml蒸餾水，接著加入18.2mg水溶性碳化二亞胺。5分鐘后加入0.13mg(0.5ml水溶液)14C甘氨酸(New England Nuclear，U.S.A.產(chǎn)品;113.0mci/mmol)。用1M碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)混合物的pH值至大約為6。在暗處室溫下，緩慢攪拌1小時，促使反應(yīng)進(jìn)行。然后加入1.0ml 1M醋酸鹽緩沖液(pH 6.0)，以便終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用Sephaex C25柱(2.3×10cm;Pharmacia F.C.)脫鹽，并進(jìn)行冷凍干燥，得15.5mg14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物，比放射性10.7μci/mg。該產(chǎn)品基本上是均勻的，每個SOD衍生物分子主要含一個甘氨酸單位。該產(chǎn)物是穩(wěn)定的化合物，其中的甘氨酸通過酰胺鍵已被結(jié)合到SOD衍生物的羧基上。
(2)動物口服實(shí)驗(yàn)應(yīng)用14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物，按照下文所描述的配方實(shí)例2的方法制備復(fù)方組合物，并應(yīng)用胃管給予雄性ddY小鼠(年齡8周)口服0.2ml(4.26μci)復(fù)方組合物。依次在服藥后3，7和24小時殺死小鼠，測定血漿及主要器官中放射性水平。放射性以每1.0g組織含dpm單位表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3口服后不同時間過程中組織內(nèi)14C甘氨酸標(biāo)記SOD組織衍生物的濃度3小時后7小時后24小時后血漿930479129908肝320485022490027腎120542846562873脾59121039222644肌肉2490345212200
表3內(nèi)數(shù)據(jù)顯示含SOD衍生物(從合成實(shí)例1制得)的復(fù)方組合物有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到血和不同器官和組織中去。含有得自合成實(shí)例2的SOD衍生物相似復(fù)方組合物，也可得到同一結(jié)果。
因此，當(dāng)將本發(fā)明的SOD衍生物配入本發(fā)明的復(fù)方組合物中并口服時，產(chǎn)生特別顯著的抗炎效果。
為使上述復(fù)方組合物供人臨床應(yīng)用，可將該復(fù)方組合物進(jìn)一步加工成為合適的劑型供病人服用，例如軟膠囊劑，膠囊劑，片劑，顆粒劑，液劑和栓劑等。
這些制劑的服用劑量通常為0.1-100mg(按SOD衍生物計(jì))，每天1-5次，每天或隔天服用。劑量可按病人的狀況和其他因素加以調(diào)節(jié)。
(e)實(shí)例以下合成實(shí)例和配方實(shí)例是本發(fā)明進(jìn)一步具體說明。然而不言而喻，本發(fā)明決非限于這些特殊的實(shí)例。
合成實(shí)例1將95mg牛紅細(xì)胞SOD(Sigma)在4℃攪拌下，加入10ml 0.1M碳酸氫鈉水溶液中(pH8.0)。向此溶液中逐漸加入17mg固態(tài)粉末狀的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物(水解度大約等于50%;二乙烯基醚對馬來酐的摩爾比率＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5，Mw＝重均分子量，Mn＝數(shù)均分子量)。反應(yīng)進(jìn)行約1.0小時。將反應(yīng)混合物倒入Sephadex
G50柱子(4.2×80cm;Pharmacia F.C.)，進(jìn)行凝膠過濾，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫液用測定吸光度方法(波長280和220nm)加以監(jiān)視，將含有未反應(yīng)的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物的級分棄去，剩下級分進(jìn)行冷凍干燥，生成色粉末狀SOD衍生物。
所得SOD衍生物的紫外吸收光譜，在磷酸鹽緩沖液中測定，于濃度為1mg/ml，pH7.4時進(jìn)行。該產(chǎn)物紫外吸收光譜如圖2所示。
上面所用的牛紅細(xì)胞SOD的每個分子含有20個氨基基團(tuán)。為確證這些氨基已經(jīng)和二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)，可應(yīng)用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)測定殘留氨基。在上述反應(yīng)條件下，發(fā)現(xiàn)大約有22%(摩爾)的牛紅細(xì)胞SOD的氨基已經(jīng)起反應(yīng)，使平均有4-5個二乙烯基-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物結(jié)合到每一個SOD分子上。
當(dāng)應(yīng)用焦棓酚自動氧化法(見EuropeanJournalofBiochemistry47，469-474，1974敘述)測定SOD衍生物酶催活性時，發(fā)現(xiàn)SOD衍生物保留了原SOD的45%酶催活性。
合成實(shí)例2(a)部分半酯化二乙烯基醚-馬來酐共聚物的合成在體積約為100ml的安瓿(用作封管)內(nèi)配以磁性攪拌，加進(jìn)2.0g二乙烯基醚-馬來酐共聚物(二乙烯基醚對馬來酐的摩爾比＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5)，0.88g正丁醇，40mg無水醋酸鋰和60ml四氫呋喃，然后封住。將此安瓿內(nèi)容物在55℃加熱攪拌20小時。取反應(yīng)混合物等分試樣一份，通過氣相層析(以乙基溶纖劑作為內(nèi)標(biāo))估計(jì)反應(yīng)混合物中未作用的正丁醇。根據(jù)所加正丁醇的反應(yīng)比率，計(jì)算出共聚物的馬來酐環(huán)轉(zhuǎn)變到正丁基半酯的轉(zhuǎn)化率為43.3%(摩爾)。反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，將濃縮液滴加到500ml正己烷中，達(dá)到重沉淀目的。生成的沉淀經(jīng)回收濾集后在室溫干燥過夜，得1.13g所需的正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物。
(b)通過正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物與SOD反應(yīng)，合成SOD衍生物將200μl人紅細(xì)胞SOD水溶液(62.8mg/ml)和170mg碳酸氫鈉溶于1.8ml等滲磷酸鹽緩沖液(pH7.04)。在室溫攪拌下，向此溶液逐漸加入64mg正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物〔制法見上述(a)〕，使反應(yīng)再進(jìn)行2小時，然后在4℃放置過夜。過濾反應(yīng)混合物，將濾液置于Sephadex
G75(Pharmacia F.C.)柱上作凝膠過濾，用10mM碳酸氫銨水溶液作為洗脫液。將含SOD衍生物的級分進(jìn)行冷凍干燥，得8.52mg白色粉末狀SOD衍生物。圖3顯示該產(chǎn)物的紅外吸收光譜(KBr片)。圖4(ⅰ)顯示原料SOD的光密度譜，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(慣常的PAGE方法)測定。圖4(ⅱ)顯示SOD衍生物的光密度譜，圖內(nèi)a代表SOD，b代表SOD衍生物。
用于以下配方實(shí)例的SOD衍生物，按合成實(shí)例1制得。按照本發(fā)明，類似的復(fù)方組合物也可以通過其他SOD衍生物制得。
配方方法1將從合成實(shí)例1制得的SOD衍生物，在冰冷下溶于蒸餾水(10mg/ml)。通過滴加0.5M醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到大約3.0，然后進(jìn)行冷凍干燥。將一種中級/高級脂肪酸甘油酯(增補(bǔ)一種兩親試劑和/或低級鏈烷醇)加到經(jīng)冰凍干燥的SOD衍生物粉末中。振搖此混合物，直到獲得宏觀的均勻分散體。應(yīng)用TOMYUR-150P集成電路塊型超聲波發(fā)生器(TomySeiki)作振動處理。這一處理的持續(xù)時間不超過30秒鐘。
配方方法2將預(yù)定量的兩親試劑加到一定量的蒸餾水中，加進(jìn)所要求的低級鏈烷醇之后，進(jìn)行超聲處理，以制成一個溶液。然后，將SOD衍生物粉末(合成實(shí)例1)于0.02%碳酸銨水溶液中的溶液(4mg/ml，在冰冷下制備)，以等體積加到上述溶液中去，將此混合液進(jìn)行冷凍干燥。然后向生成的冷凍干燥粉末中，加進(jìn)中級/高級脂肪酸甘油酯，接著加進(jìn)所要求的低級鏈烷醇?；旌衔镌诒≈凶鞒曁幚?0秒鐘。
表4給出用上述方法步驟制得本發(fā)明的復(fù)方組合物。
權(quán)利要求
1.具有通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽，其中[SOD]代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即在氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶；[Z]代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子；上述共聚物的組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接[SOD])，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000；n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些一價基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述[SOR]中的氨基上除去一個氫原子。
2.權(quán)利要求1所述的超氧物歧化酶或其藥物學(xué)上可接受的鹽，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
3.一種生產(chǎn)通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物的方法，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，單價共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些一價基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子;此方法包括將超氧物歧化酶與共聚物反應(yīng)，共聚物組成單元是(a)具有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4如上所規(guī)定，以及(b)選自以下一類的基團(tuán)如下通式的基團(tuán)
其中R1和R2分別如上所規(guī)定;如下通式的基團(tuán)
其中R3和R4分別如上所規(guī)定;如下通式的基團(tuán)
在pH7-11的堿性水溶液的存在下，該共聚物具有平均分子量500-200，000。
4.按照權(quán)利要求3生產(chǎn)超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的方法，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
5.含有通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為活性成分及藥物學(xué)上可接受的載體的抗炎復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子代所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子;上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子。
6.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其在藥物學(xué)上可接受的鹽以及中級/高級脂肪酸甘油酯的口服藥物復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生物自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán);
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氫基中除去一個氫原子。
7.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其藥物學(xué)上可接受的鹽，以及中級/高級脂肪酸甘油酯，還有兩親試劑和/或低級鏈烷醇的口服藥物復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氨基中除去一個氫原子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽。其中[SOD]代表帶有1—22或24個各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團(tuán))的超氧物歧化酶；[Z]代表單價共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
文檔編號C12N9/02GK1030426SQ8810316
公開日1989年1月18日 申請日期1988年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1987年5月28日
發(fā)明者前田浩, 鈴木富士夫, 小田達(dá)也 申請人:前田浩, 可樂麗股份有限公司