專利名稱：超氧化物歧化酶活動(dòng)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一自由基醫(yī)學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域中超氧化物歧化酶活力的測定方法。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase.簡稱SOD)是機(jī)體清除超氧陰離子自由基的一種重要的酶，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。此酶能清除超氧陰離子自由基(O2)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因而SOD活力的高低與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、血液、心血管病、腎臟病等有密切的聯(lián)系，對疾病的病因?qū)W探討、診斷、治療和觀察等有重要意義。
目前，國內(nèi)外測試SOD活力的方法很多，如電子順磁波譜法與核磁共振法，由于所需儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，一般實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院很難應(yīng)用，國內(nèi)一般采用化學(xué)比色法，但受外界因素影響大，實(shí)驗(yàn)效果不穩(wěn)定;YOSHIHIKO OYANAGVL的“Reevaluarion of Assay Methods and Establishment of Kit for Superoxide Dismutase Activity”一文，刊登于ANALYTICALBIOCHEMISTRY142，290-296(1984)，介紹了一種測定SOD活力的亞硝酸鹽法。該方法利用黃嘌呤(XO)加黃嘌呤氧化酶(XOD)反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2，在此體系中加電子受體羥胺，則O2氧化羥胺形成亞硝酸鹽，再添加顯色劑(對氨基苯磺酸+N-甲荼基二胺基乙烯)，則測試液呈紫紅色。上述反應(yīng)是在KH2PO4與Na2B4O7緩沖液體系中進(jìn)行。上述方法存在的問題是1、磷酸緩液中加10-4M/L的EDTA，濃度太高，會影響銅鋅-SOD活力，使測試結(jié)果不準(zhǔn)確;2、底物黃嘌呤XO及羥胺是溶于PH8.2的KH2PO4及Na2B4O7中，①實(shí)際上XO只能溶解一部分，有一部分沉淀下來，使結(jié)果很不準(zhǔn)確;②而且羥胺在這緩沖體系中極易氧化，使試劑的保存期縮短;③由于羥胺的自動(dòng)氧化，使得試劑在不加黃嘌呤氧化酶的情況下，反應(yīng)體系中會產(chǎn)生亞硝酸鹽，即對照管與空白對照管呈色接近則此法測定價(jià)值不大;3、該方法采用的顯色劑為300μg/ml對氨基苯磺酸與5μg/mlN-甲荼基二胺基乙烯及16.7%的冰醋酸混合而成，此混合顯色劑顯色極淺，對照管吸光度在0.080-0.090之間，一般儀器很難鑒別。
本發(fā)明的目的在于提供一種超氧化物歧化酶活力的測定方法，以提高測定的準(zhǔn)確性，且使測試方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的超氧化物歧化酶活力測定方法屬亞硝酸鹽形成法，它利用黃嘌呤(XO)加黃嘌呤氧化酶(XOD)反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2，XOD氧化羥胺形成亞硝酸鹽，再添加顯色劑(對氨基苯磺酸加N-甲荼基二胺基乙烯)，使測試液呈紫紅色，測試過程在磷酸緩沖液體系中進(jìn)行，其特征在于，測定時(shí)選用PH值為8.0的磷酸緩沖液，其中EDTA濃度為2×10-5mol/L;XO溶解于堿性溶液中，充分溶解;羥胺溶解于弱酸中;采用1.65mg/ml對氨基苯磺酸及0.75mg/mlN-甲荼基二氨基乙烯和20%冰醋酸混合液作顯色劑。
本發(fā)明的原理1、黃嘌呤XO可溶于堿性溶液中，溶解充分;即反應(yīng)物溶液均勻，則測試結(jié)果滿意;2、羥胺溶于弱酸中，使測試液穩(wěn)定，保存時(shí)間長;3、磷酸緩沖液中加2×10-5mol/l的EDTA濃度適中即可絡(luò)合金屬離子同時(shí)又不影響SOD活力;使測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定;4、本發(fā)明所采用的顯色劑配比可使顯色穩(wěn)定，過高或過低會造成吸光度過高或過低。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是1、測試液吸光度大大提高，可達(dá)0.45，一般721或722分光光度計(jì)可進(jìn)行測試;2、測試結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，變異系數(shù)CV可達(dá)1.7%，回收率χ±SD可達(dá)103%±2.63%(n＝5);3、測試靈敏度高，ID50可達(dá)0.05μg/ml;4、測試速度快，每小時(shí)可測100例樣本。本發(fā)明可廣泛適用于實(shí)驗(yàn)室及臨床檢驗(yàn)。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的SOD測定采用XO+XOD反應(yīng)體系產(chǎn)生O2再加羥胺及顯色劑的原理，測定在對照管及測定管兩支試管中進(jìn)行，測定管中加入被測樣本，對照管中不加樣本，并按照下述步驟及條件配制試劑，取少量分別加入試管中1、Na2HPO320.5克+NaH2PO3752mg+EDTA38.7mg溶于37℃，1000ml水中;
2、70mg羥胺加到100ml的0.03N/L HCl溶液中;
3、98mgXO加到0.1N/L的Na2HPO4溶液中;
4、5單位的XOD溶于182ml的磷酸緩沖液中;
5、顯色劑的配制;
①0.66克對氨基苯磺酸溶于50℃，150ml的水中;
②0.3克N-甲荼基二胺基乙烯溶于50℃，150ml的水中;
③冰醋酸100ml;
將① ② ③三種試液在測試前按3∶3∶2比例混合，每支試管取2ml顯色。
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶活力測定方法，屬于亞硝酸鹽形成法，它利用黃嘌呤(XO)加黃嘌呤氧化酶(XOD)反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2，黃嘌呤氧化酶氧化羥胺形成亞硝酸鹽，再添加顯色劑(對氧基苯磺酸加N-甲萘基二胺基乙烯)使測試液呈紫紅色，測試過程在磷酸緩沖液體系中進(jìn)行，其特征在于1.1磷酸緩沖液PH值為8.0，其中EDTA濃度為2×10-5ml/l；1.2XO溶于堿性溶液中，充分溶解；1.3羥胺溶于弱酸中；1.4采用1.65mg/ml對氨基苯磺酸及0.75mg/mlN-甲萘基二氨基乙烯和20%冰醋酸混合液作顯色劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超氧化物歧化酶活力測定方法，其特征在于XO溶解于0.1N/L Na2HPO4中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的超氧化物歧化酶活力測定方法，其特征在于羥胺溶解于0.03N/L HCl溶液中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定超氧化物歧化酶活力的方法，該方法屬亞硝酸鹽形成法，利用XO加XOD反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基O
文檔編號C12Q1/26GK1082612SQ9210763
公開日1994年2月23日 申請日期1992年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月9日
發(fā)明者季岳軍 申請人:季岳軍, 岳成斌