專利名稱：：利用d-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的d-阿洛酮糖生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用源自根瘤土壤桿菌(^^r^a"en'鵬^/^/a"'e;7s)的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶(下文中稱為阿洛酮糖3_差向異構(gòu)酶)生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。
背景技術(shù)：
：通常，D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構(gòu)體，且在甜味強(qiáng)度和種類方面與D-果糖非常相似。然而，與D-果糖不同，D-阿洛酮糖在體內(nèi)同化作用過程中很難代謝，且具有較低程度的熱量供給。因此，D-阿洛酮糖能用作膳食的有效成分。當(dāng)廣泛用作非糖甜味劑的糖醇在多于規(guī)定劑量攝取時(shí)會引起副作用，如腹瀉，而D-阿洛酮糖沒有這樣的副作用。而且，D-阿洛酮糖具有幾乎為零的卡路里值，這是因?yàn)樗谌梭w內(nèi)幾乎不可代謝，并且D-阿洛酮糖具有通過抑制脂肪生成酶的活性而減少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖能夠用作甜味劑，該甜味劑還對有助于重量減輕(參見，例如，Matsuo，T.，Y.Baba,M.Hashiguchi,K.Takeshita，K.IzumoriandH.Suzuki,〃DietaryD-psicose，aC-3印imerofD-fructose，suppressestheactivityofhepaticlipogenicenzymesinrats,〃AsiaPac,J.Clin.Nutr.，10:233—237(2001);和Matsuo，T.andK.Izumori,〃D-psicose，araresugarthatprovidesnoenergyandadditionallybeneficialeffectsforclinicalnutrition,"AsiaPac._J.Clin.Nutr.,13:S127(2004))。就此而論，D-阿洛酮糖作為飲食的甜味劑吸引了大量的興趣，并且在食品工業(yè)中存在著的對開發(fā)高效生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法增加的需要。這是因?yàn)镈-阿洛酮糖僅作為在theriae處理或葡萄糖異構(gòu)化反應(yīng)過程中的中間體非常少量地存在于在自然界中，且不能化學(xué)合成。因此，為了解決上述的問題，進(jìn)行了對利用D-果糖作為底物來酶促生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法的研究。然而，在迄今為止開發(fā)的方法中存在著一個(gè)問題，即其生產(chǎn)成本高，這是由于D-阿洛酮糖的低產(chǎn)量所導(dǎo)致的。附圖簡述圖1A是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性對應(yīng)于反應(yīng)pH的曲線圖1B是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性對應(yīng)于反應(yīng)溫度的曲線圖2是顯示D-阿洛酮糖(■)和D-果糖(□)間平衡比例的曲線圖，其中所述D-阿洛酮糖和D-果糖是由根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶與D-果糖在溫度范圍3crc-6crc間反應(yīng)所獲得的；和圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的重組表達(dá)載體的卵裂圖。發(fā)明詳述技術(shù)問題本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了從差向異構(gòu)酶中選擇這樣的酶的嘗試，所選擇的酶能夠利用D-果糖作為底物高產(chǎn)量地生產(chǎn)D-阿洛酮糖，其中所述差向異構(gòu)酶不通過功能表征，而僅通過堿基序列或氨基酸序列表征，并且本發(fā)明的發(fā)明人證明了所述被選擇的酶的特殊作用。本發(fā)明提供一種利用所選擇的酶來高產(chǎn)量地生產(chǎn)D-阿洛酮糖的新型方法。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了具有SEQIDN0:1的氨基酸序列并具有阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼所述蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有所述基因的重組表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過上述蛋白質(zhì)與D-果糖的反應(yīng)生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。下文中，將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述?？梢岳斫獗疚闹兴褂玫募夹g(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語指的是本領(lǐng)域中普通的技術(shù)人員所常規(guī)理解的術(shù)語，除非另外指明。而且，將不對與常規(guī)已知技術(shù)構(gòu)造和機(jī)制相同的技術(shù)構(gòu)造和機(jī)制的描述進(jìn)行重復(fù)。本發(fā)明人研究了源自根瘤土壤桿菌的未表征的塔格糖3-差向異構(gòu)酶的特性，這是通過以下步驟進(jìn)行的克隆源自根瘤土壤桿菌的塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因或?qū)?yīng)于塔格糖3-差向異構(gòu)酶的基因，培養(yǎng)經(jīng)包含所述基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的微生物，并過表達(dá)塔格糖3-差向異構(gòu)酶。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)塔格糖3-差向異構(gòu)酶對阿洛酮糖比對塔格糖具有更高的特異性，并且因此，證明了該源自根瘤土壤桿菌的"已知是"塔格糖3-差向異構(gòu)酶實(shí)際上是阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。因此，本發(fā)明提供一種利用所述阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。更特殊地，在嘗試獲得對本發(fā)明有用的已知塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因中，使用了已知產(chǎn)生塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因的細(xì)菌菌株，且所述菌株包手舌海禾西豐包菌(77e77zcitc^ayag,jtj'/ze)，天藍(lán)色f連毒菌(5"trepto/zyce5"coeJj'co2or)，yJ/e5"or/^oZn'咖Jo"，根瘤土壤桿菌，7/W叩ireWi/hZ7Wt!'ca，小小梨形菌屬菌株(尸i'化BWa印.)，發(fā)光光桿狀菌亞種laumondii(尸力c^or/s6o^sJLWj'/7esce/751si/ifep.2aLffl7077o7i)禾口57，rM加6j'腿歷e^7o"。通過本發(fā)明首次證明了只有從源自根瘤土壤桿菌ATCC33970的基因所表達(dá)的酶(NP_535228;SEQ工DN0:1)具有能夠?qū)-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的活性。為了確定塔格糖3-差向異構(gòu)酶的特性，在本發(fā)明中，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從含有塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因的細(xì)菌菌株中大量獲得塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因，所述塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因是僅根據(jù)DNA堿基序列，而不根據(jù)其酶功能方面的表征結(jié)果所設(shè)計(jì)的。然后，將所獲得的塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因插入到適合的表達(dá)載體中，從而產(chǎn)生含有塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因的重組載體，并且將所述重組載體轉(zhuǎn)化到適合的微生物中。將該轉(zhuǎn)化的微生物培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在該微生物中過表達(dá)所述塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。然后分離和純化所述塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以備用。本發(fā)明的生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法包括使阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(通過已知為塔格糖3-差向異構(gòu)酶)與作為底物的果糖反應(yīng)。由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶可具有這樣的氨基酸序列，該序列不僅限于SEQIDN0:1的氨基酸序列，而且包括由SEQIDN0:1的氨基酸序列中一些氨基酸殘基的替換、插入或缺失所形成的氨基酸序列，只要這些修飾的氨基酸能夠?qū)-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。在本發(fā)明的方法中，能用于產(chǎn)生重組表達(dá)載體的表達(dá)載體可以是任何常規(guī)用于遺傳重組技術(shù)的表達(dá)載體，并且可以是，例如，pET-24a(+)。能夠通過重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物可以是大腸桿菌U:cW力BL21(DE3)。然而，所述微生物是不受限制的，只要它是任何這樣的細(xì)菌菌株，即該細(xì)菌菌株能夠在經(jīng)過包含所需要基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后過表達(dá)該基因，并且作為過表達(dá)的結(jié)果能夠產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)。更詳細(xì)地，以下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物和誘導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)過表達(dá)的過程可以根據(jù)本發(fā)明的示范的實(shí)施方案如以下描述進(jìn)行。將低溫保存的大腸桿菌BL21(DE3)的接種體接種到裝有50mlLB培養(yǎng)基的250ml的燒瓶中，并將該菌株在維持在37"C的搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到600nm處的吸光度達(dá)到2.0。將該培養(yǎng)溶液加入到裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L的發(fā)酵器(BiotronCo.,Ltd.,Korea)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由10g/L甘油，lg/L蛋白胨，30g/L酵母提取物，0.14g/L二磷酸鉀和lg/L單磷酸鈉組成，并將該混合物培養(yǎng)在所述發(fā)酵器中，直到600nm處的吸光度達(dá)到2.0。然后，加入lmM的ITPG，以誘導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的過表達(dá)。在操作過程中，可維持?jǐn)嚢杷俾蕿?00rpm，通風(fēng)率為1.Ovvm，及培養(yǎng)溫度為37。C，而且上述培養(yǎng)條件有利于大規(guī)模生產(chǎn)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。為了純化由過表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株的培養(yǎng)溶液在6，000Xg，4'C離心30分鐘，然后用0.85。/。的NaCl洗滌兩次。隨后，將該細(xì)胞加入到含有1mg/ml溶菌酶的細(xì)胞溶解緩沖溶液(50mMNaH2P04，300mMNaCl，pH8.0)中，并將含有所述細(xì)胞的細(xì)胞溶解緩沖溶液置于冰浴中30分鐘。利用法國壓力機(jī)(Frenchpress)在15，000lb/ii^的壓力下破壞該細(xì)胞溶解緩沖溶液中的細(xì)胞，將破壞的細(xì)胞在13，000Xg，4。C離心20分鐘，并將其除去，而使上清液通過孔徑0.45um的濾紙進(jìn)行過濾，并通過低溫條件下的快速蛋白質(zhì)色譜法對其進(jìn)行純化。將含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)的濾出液應(yīng)用于HisTrapHP柱，所述HisTrapHP柱是經(jīng)過pH8.0的50rnM磷酸鹽緩沖溶液平衡的，其中所述磷酸鹽緩沖溶液含有300rnM氯化鈉(NaCl)和10mM咪唑。隨后，用相同的磷酸鹽緩沖溶液洗滌該HisTrapHP柱，并且再用含有濃度梯度為從10mM到200mM的咪唑的相同磷酸鹽緩沖溶液洗脫附著于該柱的蛋白質(zhì)，其流速為lml/min。將含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的洗脫級分加入到HiPr印16/60去礦質(zhì)化樹脂柱中，所述HiPrep16/60去礦質(zhì)化樹脂柱是經(jīng)過pH7.5的50rnM的PIPES緩沖溶液平衡的，并且再以6ml/min的速率洗脫該蛋白質(zhì)。將由此所收集的蛋白質(zhì)溶液應(yīng)用到S印hacrylS-IOOHR柱中以洗脫該蛋白質(zhì)，所述S印hacrylS-100HR柱是經(jīng)過pH7.5的含有0.15M氯化鈉的50mM的PIPES緩沖溶液平衡的，其流速為6.6ml/分鐘。最后將洗脫的蛋白質(zhì)在50mM的PIPES緩沖溶液中進(jìn)如上述所獲得的本發(fā)明的蛋白質(zhì)是阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，所述阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶是具有分子量32,600Da的單體。該阿洛酮糖3_差向異構(gòu)酶是金屬酶，其活性由金屬離子調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖間的反應(yīng)可在金屬離子的存在下進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)提高D-阿洛酮糖生產(chǎn)產(chǎn)量的目的，所述金屬離子選自由下列各項(xiàng)組成的組錳、鎂、鐵、鈷和鋁，其濃度范圍為0.5-5mM，例如，lraM。當(dāng)所述金屬離子的濃度低于0.5mM時(shí)，提高生產(chǎn)產(chǎn)量的作用的微不足道的，而當(dāng)所述金屬離子的濃度高于5mM時(shí)，該提高相對于其超出的量效率更低。阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖間的反應(yīng)可利用濃度為55-75%(w/w)，pH7-8和溫度為55-65匸的底物(即，D-果糖)進(jìn)行。當(dāng)該底物，即D-果糖的濃度在55-75%(w/V)的范圍內(nèi)時(shí)，D-阿洛酮糖的生產(chǎn)產(chǎn)量很好，且上述范圍的pH和溫度條件是對阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性最佳的pH和溫度范圍。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖間用于產(chǎn)生D-阿洛酮糖的反應(yīng)可通過在反應(yīng)過程中將阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶固定在載體上進(jìn)行，這是因?yàn)楣潭ㄔ谳d體上的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶能夠長期地保持酶活性。用于本發(fā)明目前的實(shí)施方案中的載體可以是任意己知其在酶固定中用途的載體，并且可以是例如，海藻酸鈉。海藻酸鈉是天然膠體多糖，它在藻類細(xì)胞壁中很豐富，且含有3-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸殘基，所述e-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸殘基通過e-l，4鍵合隨機(jī)地連接。因此，海藻酸鈉容許阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶穩(wěn)定的固定，且有利于獲得高D-阿洛酮糖產(chǎn)量。為了獲得D-阿洛酮糖的最大產(chǎn)量，海藻酸鈉可用于進(jìn)行阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的固定，其濃度為1.5-4重量％，例如濃度為2.5重量％。當(dāng)海藻酸鈉用作固定阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的載體時(shí)，將所述阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的溶液加入到海藻酸鈉水性溶液中，所述海藻酸鈉水性溶液的體積是阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶溶液體積的一倍或兩倍，然后利用注射器泵和真空泵將該混合物逐滴地加入到0.2M鈣離子溶液中，從而形成阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體珠。這些阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體珠可直接用于與D-果糖的反應(yīng)中。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法是對環(huán)境友好的，這是因?yàn)槭褂昧嗽醋晕⑸锏拿?，并且該方法要求簡單的酶固定過程，以及顯著地增加了D-阿洛酮糖的生產(chǎn)產(chǎn)量，因此是降低了生產(chǎn)成本，而最大化了生產(chǎn)的效果。由此生產(chǎn)的D-阿洛酮糖能夠有效地用作飲食或藥物的添加劑。有利作用如上所述，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法是對環(huán)境友好的，這是因?yàn)槭褂昧嗽醋晕⑸锏拿福⑶以摲椒ㄒ蠛唵蔚拿腹潭ǖ倪^程，使用比常規(guī)方法中所使用的更便宜的底物，以及顯著地增加了D-阿洛酮糖的生產(chǎn)產(chǎn)量，因此是降低了生產(chǎn)成本，而最大化了生產(chǎn)的效果。由此生產(chǎn)的D-阿洛酮糖能夠有效地用作飲食或藥物的添加劑。最佳模式下文中，將參考具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。這些實(shí)施例僅僅是為了例證的目的，而不意欲限制本發(fā)明的范圍。試驗(yàn)實(shí)施例在目前的試驗(yàn)實(shí)施例中，使用MALDI-TOF-MS測量阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分子量，并使用肉桂酸作為基質(zhì)。利用D-果糖作為底物測量了其酶活性。為了測量其酶活性，容許阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶與D-果糖在含有1.0%D-果糖的50mMPIPES緩沖溶液中，在pH7.5和5(TC反應(yīng)20分鐘，再在IO(TC加熱該反應(yīng)溶液5分鐘，以終止該反應(yīng)。所述含有D-果糖的PIPES緩沖溶液是通過將D-果糖溶解于pH7-8的PIPES緩沖溶液中，以達(dá)到60-70重量％濃度配制而成的，并且將該含有D-果糖的PIPES緩沖溶液持續(xù)地加入到維持在40-6(TC的生物反應(yīng)器中。為了實(shí)現(xiàn)方便比較其酶活性的目的，將一單位的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶定義為在pH7.5和5(TC時(shí)每分鐘生產(chǎn)1摩爾D-阿洛酮糖所需要的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的量。D-果糖、D-阿洛酮糖、D-山梨糖、D-塔格糖、D-木酮糖和D-核酮糖的濃度是利用高效液相色譜法(HPLC)系統(tǒng)測量的，該高效液相色譜法(HPLC)系統(tǒng)具有BP-100鈣離子碳?xì)浠衔镏蚏I探測器。對該柱進(jìn)行了調(diào)節(jié)，從而容許了8(TC的速率為0.5ml/min的蒸餾水流。實(shí)施例阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的物理性質(zhì)實(shí)施例l:阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因是通過利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增根瘤土壤桿菌ATCC33970的DNA大量獲得的，該P(yáng)CR使用了基于基因的DNA堿基序列而設(shè)計(jì)的引物，該基因被認(rèn)為是根瘤土壤桿菌C58的塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因，但尚未對其迸行功能性表征。通過利用限制性內(nèi)切酶Xho工和Ndel，將獲得的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因插入到表達(dá)載體pET-24a(+)(Novagen，Inc.)中，從而產(chǎn)生重組表達(dá)載體pET-24a(+)/阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(見圖3)。通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。在為了大規(guī)模生產(chǎn)而進(jìn)行培養(yǎng)前，將轉(zhuǎn)化的菌株大腸桿菌BL21(DE3)低溫儲存在液氮中。此后，將該低溫儲存的大腸桿菌BL21(DE3)菌株的接種體接種在裝有50mlLB培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并在37°C的搖動培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，直到該預(yù)培養(yǎng)溶液在600nm處的吸光度達(dá)到2.0。將該預(yù)培養(yǎng)溶液加入到裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基(10g/L甘油，lg/L蛋白胨，30g/L酵母提取物，0.14g/L磷酸二鉀和lg/L磷酸單鈉)的7L的發(fā)酵器(BiotronCo,，Ltd.，KR)中，并使其進(jìn)行主培養(yǎng)(mainculture)。當(dāng)主培養(yǎng)溶液在600nm處的光吸收度達(dá)到2.0時(shí)，加入lmM的ITPG到該主培養(yǎng)溶液中，以誘導(dǎo)大規(guī)模生產(chǎn)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。在培養(yǎng)過程中，維持?jǐn)嚢杷俾蕿?00rpm，通風(fēng)率為1.0vvm(體積/體積/分鐘)，及培養(yǎng)溫度為37'C。實(shí)施例2:阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的純化為了對阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行表征，利用親合色譜法(HisTmpHP柱)，去礦質(zhì)化(HiPr印16/60柱)和凝膠過濾(S印hacrylS-100HR柱)純化阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。測量了該純化的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分子量，并發(fā)現(xiàn)該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶是具有分子量32，600Da的單體。證實(shí)了該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列與NCB工登記號NP一535228的氨基酸序列相同。實(shí)施例3:阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的金屬特異性為了研究添加金屬離子的作用，測量了該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的酶活性，該測量是在用EDTA處理該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶后或向阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶加入lmM下表1中所示的各種金屬離子后進(jìn)行的。該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶反應(yīng)在50mM的PIPES緩沖溶液中，pH7.5和5(TC進(jìn)行20分鐘，其中所述PIPES緩沖溶液含有0.04單位/ml的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和1.0重量。/。的D-果糖，再將該反應(yīng)溶液在IO(TC加熱5分鐘，以終止該反應(yīng)。然后，測量了該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的酶活性。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶具有金屬酶，這是因?yàn)槿缦卤韑所示，錳和鈷離子增強(qiáng)其酶活性，而銅和鋅離子抑制其酶活性。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例4:阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的底物特異性該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶反應(yīng)在50mM的PIPES緩沖溶液中，pH7.5和5(TC進(jìn)行20分鐘，其中所述PIPES緩沖溶液含有0.04單位/ml的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和10mM下表2中所示的各種單獨(dú)的單糖，再將每個(gè)反應(yīng)溶液在IO(TC加熱5分鐘，以終止該反應(yīng)。然后，測量了每種反應(yīng)溶液中該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的酶活性。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶具有比對D-塔格糖更高的對D-阿洛酮糖的親合性。因此，新近公認(rèn)了阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，而非塔格糖3-差向異構(gòu)酶，是能夠進(jìn)行阿洛酮糖差向異構(gòu)作用的酶。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>施例5:根據(jù)pH和溫度的變化的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性在實(shí)施例5中，該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在不同的pH和溫度下與D-果糖反應(yīng)，且比較了在不同pH值和溫度下獲得的酶活性。為了研究pH的作用，該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在50fflM的PIPES緩沖溶液中，pH值范圍6.5-7.5中進(jìn)行，其中所述PIPES緩沖溶液含有0.04單位/ml的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和1.0%的D-果糖，且相同的反應(yīng)在50mM的EPPS緩沖溶液中，PH值范圍7.5-8.5中進(jìn)行，其中所述EPPS緩沖溶液含有0.04單位/ml的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和1.0%的D-果糖。在此，各自的反應(yīng)在當(dāng)無金屬離子加入時(shí)在5(TC進(jìn)行，在當(dāng)加入錳離子時(shí)，在6(TC進(jìn)行，并分別進(jìn)行了20分鐘。然后，通過在100。C加熱5分鐘來終止該反應(yīng)，并測量了其酶活性。其結(jié)果在圖1A中所說明。為了研究溫度的作用，該反應(yīng)在50raM的PIPES緩沖溶液中，溫度范圍30°C-7CTC中進(jìn)行了20分鐘，其中所述PIPES緩沖溶液含有0.04單位/ml的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和1.0%的D-果糖，且當(dāng)無金屬離子加入時(shí)在pH7.5進(jìn)行該反應(yīng)，在當(dāng)加入錳離子時(shí)，在pH7.0進(jìn)行該反應(yīng)。通過在100'C加熱5分鐘來終止該反應(yīng)，并測量了其酶活性。其結(jié)果在圖1B中所說明。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)無金屬離子加入時(shí)，該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的最佳pH和溫度分別為7.5和50°C。在當(dāng)加入Mn2+離子時(shí)，該阿洛酮糖3_差向異構(gòu)酶的最佳pH和溫度分別為7.0和60°C。圖1A是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案相對于反應(yīng)pH的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的曲線圖。參考圖1A，O指由不含金屬離子的PIPES緩沖溶液中所獲的結(jié)果；參指由含有Mn2+離子的PIPES緩沖溶液中所獲的結(jié)果；口指由不含金屬離子的EPPS緩沖溶液中所獲的結(jié)果；和B指由含有Mn2+離子的EPPS緩沖溶液中所獲的結(jié)果。圖1B是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案相對于反應(yīng)溫度的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的曲線圖。參考圖1B,O指由缺乏金屬離子所獲的結(jié)果；參指由存在lmM的MZ離子所獲的結(jié)果。實(shí)施例6:利用阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶所獲得的D-阿洛酮糖和D-果糖間的平衡在實(shí)施例6中，該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在50mM的PIPES緩沖溶液中，pH7.0和溫度范圍3(TC-6(TC中進(jìn)行24小時(shí)，從而容許該反應(yīng)充分地進(jìn)行，其中所述PIPES緩沖溶液含有每毫升0.04單位的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，lmM的Mn2+離子，和合起來0.1%的D-阿洛酮糖和D-果糖，這是為了確定D-阿洛酮糖和D-果糖間的平衡而進(jìn)行的。然后，通過在IO(TC加熱5分鐘來終止該反應(yīng)，并測量了其酶活性。圖2是顯示D-阿洛酮糖(■)和D-果糖(□)的平衡比例的曲線圖，其是在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶與D-果糖在溫度范圍3(TC-6(TC中反應(yīng)后獲得的。作為結(jié)果，該反應(yīng)起始于5種D-阿洛酮糖對D-果糖的初始比例0:100，25:75，50:50，75:25和100:0，反應(yīng)24小時(shí)后確定D-阿洛酮糖對D-果糖的最終比例，如圖2中所示。參考圖2，D-阿洛酮糖對D-果糖的比例在3(TC時(shí)為32:68，而該比例在6(TC時(shí)為37:63。這些結(jié)果大約20%地優(yōu)于由生產(chǎn)D-阿洛酮糖的常規(guī)方法所獲得的產(chǎn)量。實(shí)施例7:利用阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)D-阿洛酮糖為了生產(chǎn)高濃度的D-阿洛酮糖，該反應(yīng)在50mM的PIPES緩沖溶液中，pH7.0和6CTC進(jìn)行了不同的反應(yīng)時(shí)間，其中所述PIPES緩沖溶液含有每毫升14單位的該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，lmM的Mn2+離子，和700g/L的D-果糖。然后，通過在10(TC加熱5分鐘終止該反應(yīng)，并測量了其酶活性。根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的D-阿洛酮糖生產(chǎn)率顯示在下表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>作為結(jié)果，當(dāng)利用120分鐘的反應(yīng)時(shí)間時(shí)，產(chǎn)生了211g/L的D-阿洛酮糖，且這個(gè)生產(chǎn)率相當(dāng)于D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)量為30.2%。實(shí)施例8:通過酶固定生產(chǎn)D-阿洛酮糖為了研究該生產(chǎn)D-阿洛酮糖方法的效率，對阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了固定。測量了固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)產(chǎn)量，將其與未固定的(自由的)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)產(chǎn)量進(jìn)行比較。對于固定在載體上的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，使用了阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體珠，該珠是通過如下方法制備的將阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶溶液加入到2.5%的海藻酸鈉溶液中，所述海藻酸鈉溶液的體積是所述阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶溶液體積的1.5倍，再利用注射器泵和真空泵將該混合物加入到0.2M鈣離子溶液中。除了使用了固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶之外，該反應(yīng)以與實(shí)施例7中相同的方式進(jìn)行。該反應(yīng)中所用的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的量為140單位/10ml，并測量了D-阿洛酮糖生產(chǎn)率。其結(jié)果顯示在下表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例7的自由的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在使用反應(yīng)時(shí)間120分鐘時(shí)引起最大轉(zhuǎn)化率211g/L。然而，在本實(shí)施例的固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的情形中，生產(chǎn)速度低于自由的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，但是固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性較高，且D-阿洛酮糖的濃度隨時(shí)間而增高。這樣，D-阿洛酮糖的生產(chǎn)率在反應(yīng)時(shí)間360分鐘后為245g/L，且這個(gè)生產(chǎn)率相當(dāng)于轉(zhuǎn)化產(chǎn)量為35%。實(shí)施例9:D-阿洛酮糖在生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)產(chǎn)量以下反應(yīng)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，從而檢驗(yàn)實(shí)施例8的固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)產(chǎn)量。首先，該固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖以與實(shí)施例8中相同的方式制備，將D-果糖加入到該固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶中，并將該混合物調(diào)節(jié)為體積100ml。隨后，將高100cm和直徑26cm的生物反應(yīng)器(PharmaciaBiotechnologies,Inc.，XK26，UK)中充滿所述固定的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖的混合物，且該反應(yīng)在流速10ml/h和6(TC進(jìn)行。所用的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的量為500單位，且所用的D-果糖的濃度限制為600g/L，這歸因于長時(shí)間操作過程中過量D-果糖的沉淀問題。其結(jié)果顯示在下表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>作為結(jié)果，阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-果糖間的反應(yīng)在30天的整個(gè)試驗(yàn)周期中是穩(wěn)定的，且其生產(chǎn)速率為21g/L/h，從D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為35%，而其生產(chǎn)率為210g/L。其產(chǎn)量在糖類大規(guī)模生產(chǎn)中是優(yōu)秀的產(chǎn)量值。因此，本發(fā)明能夠提供利用生物反應(yīng)器的D-阿洛酮糖生產(chǎn)系統(tǒng)，所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的大規(guī)模生產(chǎn)。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO1的氨基酸序列，并具有阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性。2.—種基因，其編碼具有SEQIDN0:1的氨基酸序列且具有阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。3.—種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求2的基因。4.一種生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，所述方法是通過將權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)與D-果糖反應(yīng)進(jìn)行的。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過如下方法獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物培養(yǎng)經(jīng)權(quán)利要求3的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，并從所述微生物的培養(yǎng)溶液中分離所述蛋白質(zhì)。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反應(yīng)是在金屬離子存在下進(jìn)行的，所述金屬離子選自由下列各項(xiàng)組成的組錳、鎂、鐵、鈷和鋁。7.權(quán)利要求4的方法，其中用于所述反應(yīng)的D-果糖的濃度為55-75%(w/w)。8.權(quán)利要求4的方法，其中所述反應(yīng)是在pH為7-8及溫度為55-65。C條件下進(jìn)行的。9.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白質(zhì)當(dāng)被固定在載體上時(shí)，與D-果糖反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明提供利用源自根瘤土壤桿菌的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。本發(fā)明提供具有SEQIDNO1的氨基酸序列并具有阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，編碼所述蛋白質(zhì)的基因，含有所述基因的重組表達(dá)載體，以及通過大規(guī)模生產(chǎn)的蛋白質(zhì)與D-果糖的反應(yīng)生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。所述生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法是利用新型酶的對環(huán)境友好的方法，其中使用了便宜的底物，且所述酶的活性能夠長期保持。因此，所述方法能夠有效地用于D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號C12N9/90GK101189332SQ200680018899公開日2008年5月28日申請日期2006年5月30日優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日發(fā)明者吳德根,宋相勛,樸承源,李容姝,金慧貞,金成俌,金政勛申請人:Cj第一制糖株式會社