專利名稱：用于產(chǎn)生合成啟動子的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本申請涉及一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于為基因的有效表達設計啟動子。
背景技術(shù)：
盡管早期預期為用于治療各種疾病的有希望的新技術(shù)，但在大 多凄t至今為止進4亍的試z險中并未i正明基因治療的臨床效力。臨床基 因治療的主要4支術(shù)障礙之一是4艮難將治療性基因遞送到特定的靶 細胞并且保持足夠高水平的轉(zhuǎn)基因表達所希望的時間。雖然將治療 性基因遞送到特定的細胞類型(靶向轉(zhuǎn)導)是最期望的，但它是主
為一種可替換的方式，科學家使用了細胞類型特異性的啟動子以將 轉(zhuǎn)基因的表達僅限制在草巴細胞中(靶向轉(zhuǎn)錄)(18)。這些啟動子制 作自在相同靶細胞中特異性地表達的基因(28、 43、 51、 55)。然 而，就輩巴細胞選擇性而論，這些所謂的細胞特異性啟動子經(jīng)常是滲 漏的，引起轉(zhuǎn)基因以不同的水平在非靶細胞中表達。在大多數(shù)情況 下，這些啟動子并不強大到足以在獲得實際的治療效果所需要的水
平或在高于所述水平介導轉(zhuǎn)基因表達。這些事實表明，需要更系統(tǒng) 的方式來開發(fā)高效細胞類型特異性的啟動子系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的合成組合，其可以在特定的細 胞類型中高效驅(qū)動基因表達。
在本發(fā)明的一個方面，可以通過下述來完成上述生產(chǎn)(l)構(gòu) 建DNA序列元件(其由所希望的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別)的隨才幾組合的 文庫；(2)利用細胞分選儀如FACS (熒光激活細胞分選儀)對文 庫進行高通量篩選，以選擇少量的DNA序列元件的表現(xiàn)最好的組 合(best performing combination); 以及可選地(3)進一步試驗所 選4奪的每個組合，以最終選4奪一種或多種表現(xiàn)最好的組合。
在本發(fā)明的一種特定具體實施方式
中，可以通過爿夸s又《連DNA 寡核苷酸隨機連接在一起而構(gòu)建文庫，其中每種雙鏈DNA寡核苷
包括在寡核苷酸(用于隨才幾連4姿反應)中的DNA序列元件可 以基于不同的方法來確定，上述不同的方法包括對靶細月包中的轉(zhuǎn)錄 因子進行DNA微陣列圖譜分析(profiling,分布或作圖)或選擇性 地/人包含隨沖幾核普酸的寡核苦酸的池擴增高親和力結(jié)合序列元件。 還可以利用對在靶細胞中表達的基因的序列進行基于算法的計算 才幾分沖斤來確定DNA序列元件。
更詳細;也，可以用限制酶切割隨沖幾組合的序列元件并克隆在凈艮 道基因的上游，其可以是但不限于GFP或LacZ,并且可以產(chǎn)生質(zhì) 粒DNA或病毒載體的文庫。該文庫可以利用^旦不限于反轉(zhuǎn)錄病毒 載體或腺病毒載體來產(chǎn)生。
可以將載體DNA轉(zhuǎn)染或感染進入靶細胞，然后用FACS分選， 以選4奪表達高水平才艮道基因的細胞，其中DNA載體包含隨才幾序列 組合的文庫，而隨機序列組合被克隆在最小啟動子(后面是報道基 因)的上游。然后分選的細胞用來回收和擴增載體DNA,該載體 DNA包含所希望的高表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件組合。
可以將回收和擴增自分選的細胞的載體插入革巴細胞，然后再次 通過利用FACS來選l奪最高表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件組合?？梢灾貜腿?干次相同的步驟將回收的載體DNA插入細胞，分選最高表達的 纟田月包，以及/人分選的細月包回收載體DNA，以/人上百萬不同組合中 精選和獲得少量的最高表現(xiàn)的組合。
在完成重復分選和選4奪以后，可以在靶細胞中單獨地進一步篩 選回收的DNA載體以試-驗它們的真正啟動子活性。
作為對照，如果需要細胞型特異性啟動子，則也可以在非靶細
細胞中具有顯著的啟動子活性的載體。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)合成組合啟動 子盒的方法，其中所述盒用于基因或病毒治療載體中。與其它目前 可獲得的啟動子系統(tǒng)相比，這些合成啟動子(選自上百萬潛在的候 選物)可以以很大改善的效率和選擇性地驅(qū)動轉(zhuǎn)基因在特定靶細胞 中的表達。在一個方面，該系統(tǒng)利用高通量測定系統(tǒng)，如4旦不限于 DNA ^:陣列和焚光激活細胞分選儀(FACS ),并且可以用來產(chǎn)生在 短期內(nèi)對實際上〗壬^T類型的細胞均特異的合成啟動子。本發(fā)明顯著 地增加了目前可獲得的基因或病毒治療載體系統(tǒng)的效力，這些系統(tǒng) 依賴于靶向基因轉(zhuǎn)錄。同時，它使得可以將各種新的基因或病毒治 療藥物4'美選物快速引入市場，用于治療癌癥和其它疾病。
在本發(fā)明的 一個特別示例性說明的方面，產(chǎn)生了合成啟動子 盒，其能夠使基因轉(zhuǎn)錄特異性地靶向成神經(jīng)細胞瘤癌細胞。此外尤
其是，本發(fā)明涉及構(gòu)建順式作用(exacting )序列元件的隨機組合 的文庫，其是基于對靶成神經(jīng)細胞瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子進行DNA 分析(分布，profiling )。通過隨才幾連4妻雙嗜連寡核苦酸可以產(chǎn)生順式 作用序列元件的上百萬的不同的組合，其中雙鏈寡核普酸包含各種 順式作用序列元件，用于結(jié)合在成神經(jīng)細胞瘤細胞中特異地表達的
基于先前進行的對在靶成神經(jīng)細胞瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和相關 蛋白的DNA樣丈陣列表達"i普分坤斤(表達分布，expression profiling )。 將隨機連接的序列元件組合克隆在最小啟動子的上游，其中最小啟 動子的后面是報道基因如lacZ或GFP。
在本發(fā)明的另一個特定方面，本發(fā)明涉及利用基于FACS的定 向進化方案對文庫進行預篩選?？梢院Y選質(zhì)粒文庫以選4奪少量(大 約90個)的在耙成神經(jīng)細胞瘤細胞中表現(xiàn)最好的組合，其被選用 以經(jīng)受更廣泛的篩選步驟，從而鑒別對給定耙細胞特異的序列元件 的最高表現(xiàn)組合。這種體外進化方法部分地取決于高通量細胞分選 技術(shù)(如FACS)分選細胞的能力，其中所述細胞在用報道基因載 體的文庫轉(zhuǎn)染或感染以后表達報道基因產(chǎn)物如(3-半乳糖苷酶。
此外，本發(fā)明涉及單獨地用96孔瞬時轉(zhuǎn)染/感染測定(在靶和 非靶細胞中)對預選擇的順式作用序列組合進行篩選。對大約90 種預選擇的組合啟動子盒的性能均進行了評估，并且根據(jù)它們在靶 細胞中的啟動子活性強度以及在非靶細胞中的活性缺乏選擇了序 列元件的大約3-5種表現(xiàn)最好的組合。非耙細胞類型的集合，包括 神經(jīng)元前體細月包和神經(jīng)元細月包，用于篩選以確4呆所選4奪的包含序列 元件組合的啟動子盒對于靶成神經(jīng)細力包瘤細胞真正具有選^f奪性。
可以爿夸選擇的成一申經(jīng)細月包瘤特異的啟動子盒克隆在載體中如 但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體，以另外試驗在天然染色質(zhì)或染 色質(zhì)樣環(huán)境中它們的活性(在靶細胞和非靶細胞中)。該單獨的表 現(xiàn)最好的盒用于各種載體系統(tǒng)中，以在動物試-驗以后將其開發(fā)成成 神經(jīng)細胞瘤癌基因治療或胂瘤溶解病毒治療藥物候選物。
本發(fā)明涉及一種用于制作和選4奪組合啟動子盒的方法，該方法
包括(i)構(gòu)建隨才幾組合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的文庫，其中包括由不同
的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的多序列元件；(ii)將組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入載
體中的最小啟動子(后面是報道基因)的上游；以及(iii)篩選在 特定細胞中報道基因的最高水平的表達，在報道基因的上游其序列 包括所選一奪的啟動子盒。
可以在連接反應條件下，通過將包含不同DNA序列元件的雙 4連寡核普酸混合在一起來制作隨才幾組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的文庫，其中 包括由不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的多DNA序列元件。另外，寡核苦 酸的末端可以包含側(cè)翼核苦酸，借助于限制性內(nèi)切核酸酶，上述側(cè) 翼核苷酸可以— 皮平整或切割，以在經(jīng)受連4妻反應以前產(chǎn)生突出的末 端。在一個方面，報道基因可以是/acZ并且報道基因表達可以通過 熒光激活細胞分選4義(FACS)力卩以篩選。
另外，在上述方法中，通過對在特定革巴細胞中表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子進行DNA孩i陣列圖i普分析可以獲得由細月包類型特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子識別的DNA序列元件。
在以上描述的方法中，特定的細胞類型可以是癌細胞癌纟田月包、 肉瘤細胞、黑素瘤細胞、以及尤其是成神經(jīng)細月包瘤細胞。
在另 一個方面，本發(fā)明涉及一種包括上述組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的 載體。該載體可以是質(zhì)粒、病毒、瞬時表達的、或能夠一皮整合宿主 細胞基因組中。
本發(fā)明還包4舌原核生物或真核生物起源的宿主細胞，如大腸桿 菌、才直物、昆蟲、哺乳動物、以及人。
根據(jù)本發(fā)明的以下描述、附圖以及所附斥又利要求，本發(fā)明的這 些和其它目的爿奪更充分:kM皮理解。
才艮椐下文主會出的詳細描述和附圖可以更充分;也理解本發(fā)明，其
中附圖4又通過舉例i兌明方式《合出而不是限制本發(fā)明，并且其中
圖1示出了一載體系統(tǒng)，在該載體系統(tǒng)中4爭錄調(diào)節(jié)元件一皮4皮此 隨機連接并克隆在最小啟動子(D96)(后面是報道基因(LacZ))的上游。
具體實施例方式
在本申請中，"一"、"一個，，以及"一種"用來指單數(shù)和復數(shù) 對象。
如在本文中所使用的，"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件"是指由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識 別的核普酸序列，并且與"順式作用序列"或"順式作用序列元件" 或"順式作用區(qū)"同義，而且有時表示為"序列元件"。
如在本文中所使用的，"組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件"是指包括多于一 個的4t錄調(diào)節(jié)元1"牛的x又《連DNA分子?？梢酝ㄟ^以隨沖幾方式連4妻各
種雙《連轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來產(chǎn)生組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件?？蛇x地，組合序列
元4?？梢园g隔區(qū)并且間隔沖亥苷酸(間隔區(qū)核香&復，spacer nucleotide )的長度可以通過在隨才幾連4妻反應中4吏用雙《連DNA分子 以前使它們經(jīng)受 一段時間的外切核酸酶消化來加以控制。
如在本文中所使用的，"寡核苷酸"是指一種序列，該序列功 能上包括順式作用區(qū)以及也許多達約25個或較少的體外核苦酸。 因此，由術(shù)語"寡核苷酸"包含的核苦酸的數(shù)目不可能是固定的， 因而不限于任何特定數(shù)目的核普酸。
如在本文中所使用的，"啟動子盒"或"合成啟動子盒"是指 DNA片段，其包含用于基因有效轉(zhuǎn)錄的成分，并且可以包括一種 或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件、最小啟動子區(qū)、來自5，-非翻譯區(qū)的序列或 內(nèi)含子。
如在本文中所使用的，"最小啟動子區(qū)"或"最小啟動子"是 指短DNA片^:,其本身是無活性的，但當和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié) 合時可以介導強轉(zhuǎn)錄。最小啟動子序列可以衍生自各種不同的來 源，包括原核基因和真核基因，其實例是多巴胺P-羥化酶基因最小 啟動子和巨細胞病毒(CMV)即刻早期基因最小啟動子。
如在本文中所4吏用的，"組合啟動子盒"或"合成組合啟動子 盒"是指包含組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的啟動子盒。
如在本文中所使用的，"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子"是指包括蛋白質(zhì)的任何 因子，其結(jié)合于順式作用區(qū)并正或負調(diào)節(jié)基因的表達。轉(zhuǎn)錄因子或 阻遏4勿(阻4中^7, repressor)或豐甫;敫;舌沖勿(co-activator )或壽肅阻遏 物都包括在其中。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達i普分析(表達分布)
可以通過各種方法進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達譜分析。可以利用各種 方法來確定哪些轉(zhuǎn)錄因子存在于感興趣的細胞類型中以及哪些順 式區(qū)是轉(zhuǎn)錄因子或阻遏物的結(jié)合部位。在本發(fā)明的一個方面，基于 DNA微陣列的轉(zhuǎn)錄因子表達譜分析可以用來設計合成啟動子盒。 真核基因轉(zhuǎn)錄是一種復雜的生化過程，該過程涉及來自多蛋白調(diào)節(jié) 子的組合效應，其中多蛋白調(diào)節(jié)子包括轉(zhuǎn)錄激活物、阻遏物、輔激 活物以及輔阻遏物(7、 15、 29、 35)。因此，知道在不同細胞類型 中這些蛋白可獲得的準確外形可大大有助于理解在這些細胞中這 些蛋白的不同組合如何介導基因轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明中，利用商業(yè)上可獲得的DNA樣i陣列芯片對3種成 神經(jīng)細胞瘤細胞類型進行表達譜分析，其中DNA微陣列芯片點樣 有寡核苦酸，用于1500種不同的基因編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子以及直接或 間接與基因轉(zhuǎn)錄有關的其它蛋白。這些結(jié)果顯示出各種細胞類型特 異性表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。若干發(fā)育調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的表達模式精 密地與在文獻中報道的先前的觀測結(jié)果一致。這表明，微陣列測定 是敏感的，足以檢測在相對低水平表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。基于來自這些 微陣列測定的數(shù)據(jù)，確定了特異地表達在成神經(jīng)細胞瘤細胞中的轉(zhuǎn) 錄因子。
然后利用出版的報道和其它來源(其列出用于鑒別的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子的順式作用序列)確定了這些成神經(jīng)細胞瘤特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的 順式作用序列元件，并且它們用于構(gòu)建能夠在這些靶細胞中選擇性 地耙向基因轉(zhuǎn)錄的合成啟動子盒。
在許多不同細胞類型中進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和相關蛋白的表達i普 分析，并且產(chǎn)生了數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫(稱作TREP lt據(jù)庫，來自轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)子表達i普(表達分布，expression profile))包含關于細月包類型
達水平差異方面的詳細信息。對于不同組的細胞可以推出表達鐠的 一4殳才莫式。因而上述凄t據(jù)庫^更于我們理解在發(fā)育的正常過程中以 及在致瘤性轉(zhuǎn)化中，這些蛋白的不同組合如何用于細胞類型特異性
基因表達。同時，TREP數(shù)據(jù)庫變成一種用于啟動子盒的設計和合 成的工具，其中啟動子盒用于轉(zhuǎn)基因的靶細胞特異性和/或藥理上誘 導性表達。
在用于鑒別的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的順式作用序列不可獲得的情況下， 則可以用實-驗方法獲得這樣的DNA序列元件。例如， 一組包含隨 才幾核香酸序列的寡核苷酸可以在結(jié)合反應條件下與經(jīng)純化的轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)子進行混合，然后利用常規(guī)方法測定與任何寡核苷酸的結(jié)合。 可以對結(jié)合的寡核普酸進行測序，以確定順式作用區(qū)的核苷酸序 列。
構(gòu)建隨才幾序列元件組合的文庫
對于《合定細月包類型，在知道轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和相關蛋白的表達i普以 后，則通過結(jié)合用于特異性地表達在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的順式
強度，在構(gòu)建中還可以包括用于多種遍在(ubiquitously)表達的轉(zhuǎn) 錄因子的順式作用序列。最大轉(zhuǎn)錄效率可獲自順式作用序列，其包 括在組合啟動子盒中，用于在靶細胞中遍在表達的轉(zhuǎn)錄因子。另一 方面，才艮據(jù)順式作用序列可確定耙細胞特異性，其中順式作用序列 包括在盒中，用于結(jié)合在靶細胞中特異性地表達的轉(zhuǎn)錄因子。當選 才奪順式作用序列時，還考慮到在把細胞中這些轉(zhuǎn)錄因子的輔激活物 的可用性。
當適當裝配時，這些組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié)合在特定靶細胞中表 達的多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，并且有效地驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達。在非耙細胞中相
同的組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是無活性的，這是由于缺少為結(jié)合于序列元 件所需要的特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。
組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件還可以包括這樣的序列元件，其用于結(jié)合^義 在非耙細胞中表達的轉(zhuǎn)錄阻遏物，從而進一步增強轉(zhuǎn)基因表達的靶 細胞特異性。在啟動子盒中順式作用序列元件(用于結(jié)合阻抑蛋白) 的存在將在表達高水平阻抑蛋白的非靶細胞中有效地抑制轉(zhuǎn)錄。另 一方面，它在耙細胞中將沒有任何效應，因為它們并不表達相同的 阻抑蛋白。因此，通過知道在靶細胞與非靶細胞中表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子和輔調(diào)節(jié)子的準確的外形，則可以最有效地利用基因轉(zhuǎn)錄的組合特性。
基因的有效轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子和輔因子(裝配在特定基因的啟
動子/增強子區(qū)上)的組合相互作用(15、 16、 29)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 于在基因的啟動子/增強子區(qū)的順式作用序列元件，其以特定順序排 列并具有特定的空間收縮(space constriction )。 4又當不同轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合序列元件以特定順序排列并在它們之間具有適當間距時，才可 以實現(xiàn)來自合成基因啟動子盒的最有效的轉(zhuǎn)錄。在理i侖上，對于10 種不同的順式作用序列元件，々ii殳對于長度為10個序列元件的組 合每個元件^f又使用一次，則存在3百萬以上的不同的可能排列。因 此，如果利用常^見方法進行，則需要驚人的時間來裝配和試驗所有 這些可能的組合以確定對于多轉(zhuǎn)錄因子的最好的序列元件排列。
通過采用本發(fā)明的方法可以克力良這種限制，該方法包4舌(1)
進化方法并利用流式細胞儀(FACS)在靶細胞中對文庫進行預篩 選以選擇大約90個表現(xiàn)最好的組合；以及在靶細胞和非靶細胞中 利用瞬時轉(zhuǎn)染測定(如在96孔平板中)來篩選預選擇的或預篩選 的序列元件組合，乂人而選4奪約3-5個最纟冬的+美選物。
在隨才幾連4妄反應過程中，會產(chǎn)生序列元件的上百萬的不同組 合，其中很可能包含具有序列元件的最佳排列(就在靶細胞中具有 強和選纟奪性的轉(zhuǎn)錄活性而言)的組合。
利用基于FACS的定向進:化對文庫進^i^篩選
本發(fā)明的 一 個方面涉及 一 種預篩選方法，該方法采用如在 Huang等人(20)中所描述的基于FACS的定向進化方案，將其全 部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文，尤其是關于利用FACS的方案。
Huang等人(20)才艮道了基于FACS的方法，該方法用來/人隨 機DNA序列選4奪用于肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD的功能增強子/ 啟動子部位。具有埋入肌肉特異性最小啟動子中的隨才幾核普酸的寡 核苷酸被克隆在(3-半乳糖苦酶基因的上游。借助于MyoD表達載體， 得到的質(zhì)粒文庫—皮共轉(zhuǎn)染進入NIH 3T3細胞。通過FACS選4奪表達 高水平(3-半乳糖苷酶的細胞并消除大多數(shù)表達低到中等水平的報道 基因的細胞。由此分選的細胞(最初群體的約5%)包含具有高水 平轉(zhuǎn)錄活性的質(zhì)粒，其中轉(zhuǎn)錄活性是由MyoD結(jié)合于高親和力序列 元件所介導。通過Hirt方案(19)自這些選^奪的細胞提取質(zhì)粒，對 質(zhì)粒進行擴增，并再次用于轉(zhuǎn)染細胞和通過FACS進行分選，然后 重復DNA提取和擴增、轉(zhuǎn)染、以及分選的相同步驟。在上述分選 和擴增的3個循環(huán)以后，細胞群高度富集用能夠介導最高水平報道 基因表達的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞。在此定向進化方案中的選4奪壓力是 MyoD結(jié)合于隨機序列的效率(用于激活(3-半乳糖普酶報道基因)。 此方式是有歲丈和快速的，因為FACS可以4全測少至5個P-半乳4唐苷 酶/細胞(44)并且它可以每小時分選約1百萬個細胞。在用大腸桿 菌丄acZ報道基因轉(zhuǎn)染以后，基于P-半乳糖苷酶活性，對活哺乳動 物細胞的熒光激活細胞分析和分選的步驟已很好地建立起來(12、 44)。
在本發(fā)明中，對Huang等人(20 )的基于FACS的選擇方案的 基本概念已進行了改進，使得報道基因表達由多序列元件的隨機組 合來介導。在這種情況下，來自多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于隨機組合序列元 件、而不是單因子結(jié)合于隨機核苦酸的組合輸入決定了報道基因表 達的效率。這種方式的一個顯著特點是，在所有相關調(diào)節(jié)子和輔調(diào) 節(jié)子存在的情況下，在靶細胞中實時選擇序列組合。這種方案用于 預篩選順式作用序列元件組合的文庫，以^更快速消除大多凄t在輩巴細 胞中具有低到中等轉(zhuǎn)錄能力的組合。選擇了大約90種表現(xiàn)最好的 序列組合，使它們?nèi)菀子糜诟浞值暮Y選，其中篩選是在耙細胞和 非靶細胞中進行并借助于96孔格式的轉(zhuǎn)染/感染。將每種細胞類型 平皿接種于96孔平?jīng)_反，然后用90種選擇的克隆加上陽性和陰性對 照載體進行轉(zhuǎn)染/感染。在靶細胞中的瞬時轉(zhuǎn)染/感染篩選使大約90 種選4奪的克隆可以」接照它們在啟動子活性中的強度進行排列。此 外，如果需要細胞類型特異性啟動子盒，則可以在非靶細胞中對這 些克隆進行篩選，以消除在這些非靶細胞中具有可檢測活性的所有 滲漏克隆。在篩選中試驗了許多不同的非靶細胞類型(原代細胞和
可以選一奪約3至5種表現(xiàn)最好的組合啟動子盒并在克隆在病毒載體 中以后進一步i式-驗。
本發(fā)明的制作合成組合啟動子盒的方法實際上可以用于任<可 類型的細胞，優(yōu)選癌細胞。才艮據(jù)/>眾可獲得的并由基因醫(yī)學雜志 (2004年1月31日更新)提供的基于萬維網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫(用于世界 范圍的基因治療臨床試驗)，全世界有918項基因治療臨床試驗正 在進行中。在臨床基因治療試驗中最經(jīng)常治療的疾病是癌癥，構(gòu)成 66% ( 608項試-驗)。這些試-瞼的大約190項4吏用自殺基因或肺瘤才中 制基因。這些試-瞼依賴于治療性基因產(chǎn)物有效地和選4奪性地殺死癌 細胞而不影響患者的正常細胞的能力。本發(fā)明的方法可以用于合成
啟動子的生產(chǎn)，其中合成啟動子特別為這些癌基因治療試驗的每一 項的要求而設計，從而導致改善的效力。
成神經(jīng)細胞瘤細胞-特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子
雖然任何細胞類型可以用來實施本發(fā)明，^旦本文以成神經(jīng)細月包 瘤作為靶細胞舉例說明。因此，在本發(fā)明的一個方面，制備了成神 經(jīng)細胞瘤癌細胞-特異性合成組合啟動子盒。成神經(jīng)細胞瘤是兒童早 期的最常見的實體瘤之一，其發(fā)生于腎上腺髓質(zhì)或交感神經(jīng)組織的
其它部位。每年有大約650例成神經(jīng)細胞瘤新病例。其特4正在于多 種多樣的臨床行為從自發(fā)消退到快速腫瘤進展以及死亡(54)。 雖然通過外科切除術(shù)可以經(jīng)常成功地治療初期腫瘤，^旦后期惡性成 神經(jīng)細胞瘤極具攻擊性并且在較大兒童中是致命的，甚至在加強的 多沖莫式療法(多重才莫式療法，multimodal therapy )以后(42 )。因此， 迫切需要先進的治療策略如基因治療或溶瘤細胞病毒治療，以用于 后期成神經(jīng)細^^瘤患者。
在胚胎發(fā)育和胚后期發(fā)育的正常過程中，多能神經(jīng)嵴細胞分化 成各種神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞類型。因此，產(chǎn)生自多能神經(jīng)峰細胞 的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤包含多細胞表型。乂人成神經(jīng)細胞瘤原發(fā)性腫瘤 或/人骨髓轉(zhuǎn)移灶已建立了許多細胞系，并廣泛用于分子和細胞研究 的不同領域。長期研究表明，在成神經(jīng)細胞瘤細胞系中存在3種不 同的細胞類型I型干細胞、N型成神經(jīng)細月包-神經(jīng)內(nèi)分泌前體、以 及S型施旺-成黑、素纟田月包前體(Schwannian—melanoblastic precursor ) (49)。 I型干細胞比N型細胞或S型細胞明顯地更為惡性。全面的 遺傳和組織病理學研究揭示了在人成神經(jīng)細J包瘤月中瘤中的3種相似、 類型的細胞(33)。推測的I型干細胞存在于所有階^:的肺瘤中。在 各種不同的分化階—歐，腫瘤包含N型成神經(jīng)細胞。基質(zhì)細胞包含起 源于肺瘤的S型細胞和正常細胞。3種上述不同類型的成神經(jīng)細月包 瘤細胞系用作草巴纟田月包，以i^更設計成神經(jīng)細胞瘤細胞特異性合成組合
啟動子盒I型SK-N-BE(2)-C細胞；N型SH-SY5Y細胞；S型 SH-EP1纟田月包。
進行了能夠在上述3種細胞類型中有效地介導基因表達的組合 啟動子盒的合成?；谠谶@些細胞系中的選擇所制備的組合啟動子 盒具有高度的可能性在動物試驗中和在臨床試-險中，以相同方式 在體內(nèi)發(fā)揮作用。
在將選自瞬時轉(zhuǎn)染測定的3-5種成神經(jīng)細l包瘤特異性組合啟動 子盒放入病毒表達載體以后，進一步對它們進行試驗。真核基因組 被包裝進入復合染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且已有報道，為了便于轉(zhuǎn)錄，需要 通過蛋白質(zhì)，如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和依賴ATP的染色質(zhì)重建因子， 來重建染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(13、 53)。至少在感染的早期，借助于在核小 體樣結(jié)構(gòu)中的病毒基礎蛋白將反轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定地整合到宿主 基因組和腺病毒基因組復合物中(45)。因此，在動物研究中再次 對裝備有合成組合啟動子盒(在體外研究中所選用的)的重組反轉(zhuǎn) 錄病毒和腺病毒LacZ表達載體進行試-瞼，以了解它們在靶細胞和 非靶細胞中表達的特異性和效率。選沖奪一種表現(xiàn)最好的合成組合啟 動子盒并進一步開發(fā)成基因或病毒治療藥物候選物，用于在適當載 體中的臨床試驗。因此，例如，它可以在癌基因治療試驗中用于自 殺或細胞毒基因的成神經(jīng)細月包瘤癌細月包特異性表達，或用于載體 中，這些載體用于成神經(jīng)細胞瘤特異性腫瘤溶解病毒治療試驗。
在本發(fā)明的另 一個方面，可以優(yōu)化靶向不同癌類型的合成組合 啟動子盒的生產(chǎn)。對方案進行優(yōu)化以便可以利用原代細胞進行基于 FACS的預篩選步務聚。這4吏4尋該l支術(shù)可以應用于多種癌類型而無需 為進行篩選步驟而建立任何適當?shù)募毎怠Ｔ┘毎梢灾苽渥?新鮮組織才羊品，其可以通過全國癌癥研究所的人組織妨、作網(wǎng)全各 (Cooperative Human Tissue Network of the National Cancer Institute)獲得?；贔ACS的步驟在預篩選序列組合文庫方面的成 功應用很大程度上依賴于轉(zhuǎn)染靶細胞的效率。
一般說來，基于脂質(zhì) 或基于磷酸鈣的轉(zhuǎn)染方法在原代細胞中達到小于25%的轉(zhuǎn)染效率。 為了克服這種限制，試驗了基于慢病毒和/或基于電穿孔的基因轉(zhuǎn)移 方法，以獲得更高水平的轉(zhuǎn)染效率。使用慢病毒系統(tǒng)的優(yōu)點是它能 夠轉(zhuǎn)導靜止期或生長停滯期的細胞。無啟動子的慢病毒載體系統(tǒng)可
商業(yè)上獲4尋(Invitrogen, Carlsbad, CA )。利用這種系統(tǒng)，可以制備 和包裝包含序列元件的不同組合(驅(qū)動P-半乳糖苷酶基因表達)的 慢病毒載體文庫，用于在相對較短時間內(nèi)轉(zhuǎn)導原代細胞。電穿孔是 另 一種相對高效轉(zhuǎn)染原代細胞的方法。
本發(fā)明的用于優(yōu)化和層流載體4支術(shù)的另 一 種方法是通過收集 來自多種多樣的細胞類型的數(shù)據(jù)來擴大轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達譜(TREP) 數(shù)據(jù)庫。當從足夠大量的細胞類型建造數(shù)據(jù)庫時，則可以為每個特
定組的細胞推出轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達譜的一^:才莫式，其有助于以更加可 預測的方式完成所提出方案的設計部分。其它有關信息也包括在數(shù) 據(jù)庫中，如大約90種預選擇的隨^L組合啟動子盒的核苷酸序列， 其中預選擇是根據(jù)每個基于FACS的選擇實驗以及在靶細胞和非靶 細月包中的瞬時轉(zhuǎn)染測定中它們的啟動子活性。因為該坤支術(shù)用于合成 耙向各種癌類型的組合啟動子盒，所以數(shù)據(jù)庫會積累關于轉(zhuǎn)錄因子
定之前)，該數(shù)據(jù)庫使得可以更準確和有效地完成合成啟動子盒的 設計。
才艮據(jù)先前的描述和附圖，對于本領域沖支術(shù)人員來i兌，除本文描迷之 外的本發(fā)明的各種改進將變得顯而易見。這樣的改進包括在所附權(quán) 利要求的范圍內(nèi)。以下實施例是用來說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明 的限制。
實施例
實施例l-在成神經(jīng)細胞瘤細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和相關蛋白的微: 陣列表達鐠分析(表達分布)
實施例1.1-實驗步驟
實施例1.1.1-細/^乂###?；骔iVJ為、葛在D-IO培養(yǎng)基中培養(yǎng) SH-EP1、 SH-SY5Y、以及SK-N-BE(2)-C成神經(jīng)細胞瘤細胞，D-IO 培養(yǎng)基為每升有4.5 g葡萄糖的(杜爾貝科)Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基，包含10%小牛血清(熱滅活)并補充有谷氨酰胺(0.03% )、 青霉素(100單位/ml)、以及鏈霉素(100 jig/ml)。將細胞保持在 37°C、力。濕的95%空氣、5%二氧化石友氣氛的培養(yǎng)箱中。利用RNeasy 微型試劑盒(Qiagen)并按照制造商的方案，從在T150組織培養(yǎng) 瓶中生長到80-85%匯合的細胞提取總RNA,然后以等分試樣存儲 在-80°C。
實施例1.1.2—《貨萍/{/^;/定利用Geneka Biotechnology 乂〉司生 產(chǎn)的蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)寡核苷酸微陣列(PROM)芯片，從SH-EP1、 SH-SY5Y、以及SK-N-BE(2)-C成神經(jīng)細月包瘤細胞獲得轉(zhuǎn)錄因子和 相關蛋白的表達i普。上述芯片包含35-45個石成基對寡核苷酸，其點 樣有雙份1500種基因，用于轉(zhuǎn)錄因子、輔因子、DNA-結(jié)合蛋白、 以及與基因轉(zhuǎn)錄有關的其它蛋白。在Geneka Biotechnology 司進 行cDNA合成和用焚光染料標記、微陣列雜交、微陣列掃描、以及 數(shù)據(jù)分析。筒單地說，通過用HeLa細胞cDNA (利用不同的熒光 標簽(Cy5與Cy3 )加以標記)共雜交每一種成神經(jīng)細胞瘤細月包cDNA 進行測定，其l吏得可以在三種不同成神經(jīng)細胞瘤細月包系之間比凈交 1500種基因的每一種的相對表達水平。來自成神經(jīng)細胞瘤細胞的每 種基因的相對表達水平表示為相對于在HeLa細胞中表達水平的比
率。此外，每種寡核苦酸芯片包含用于作為外部對照的無性(^i物)
基因的探針，以及用于作為內(nèi)部對照的18SrRNA、 P-肌動蛋白以及 GAPDH基因的探針，其用來對信號進行規(guī)一化。用雙份載玻片來 篩選每種成神經(jīng)細月包瘤細^^系，以4吏相對于Cy3-標i己HeLa cDNA 用Cy5-標記成神經(jīng)細月包瘤cDNA雜交第一載3皮片，以及相對于Cy5-標記HeLa cDNA用Cy3-標記成神經(jīng)細胞瘤cDNA雜交第一載玻片。
實施例1.2-結(jié)果和討論
來自PROM孩i陣列測定的結(jié)果表明，在這些三種不同的成神經(jīng) 細胞瘤細胞類型中各種基因有差別地上調(diào)節(jié)或下調(diào)節(jié)。 一些有趣的 ，見測結(jié)果包括，在SH-EP1細月包中才僉測到神經(jīng)D基因(NeuroD gene ) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞類型特異性表達，以及在SH-SY5Y和 SK-N-BE(2)-C細月包中分別才全測到Phox2b基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的纟田月包類型 特異性表達。神經(jīng)D是基礎螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員并在 神經(jīng)元前體細胞的分化中具有重要作用(1)。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的胚 胎發(fā)育期間，神經(jīng)D mRNA在有絲分裂期后的神經(jīng)元前體細胞中瞬 時表達(34)。另一方面，Phox2b是同源(異型)結(jié)構(gòu)域(homeodomain ) 轉(zhuǎn)錄因子，其控制不同神經(jīng)元類型的生成和存活(4、 10)。 Phox2b 和Phox2a共表達在所有表達去曱腎上腺素能生物合成酶多巴胺P-羥化酶(DBH )的中樞神經(jīng)元和周圍神經(jīng)元中(46 )。 Kim等人(27 ) 已表明，DBH基因具有至少2個順式作用序列用于在其5，啟動子 區(qū)的這些同源(異型)結(jié)構(gòu)i或蛋白。因為在測定中^又在SH-SY5Y和 SK-N-BE(2)-C細胞(其是去甲腎上腺素能的)中檢測到Phox2b表 達但膽石咸能SH-EP1細胞中未才全測到，所以它證實了從文獻中知道 的情況。細胞特異性地正調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子和輔因子的其它實例包 括在SH-EP1細胞中的NPAS1 (神經(jīng)元基礎螺旋-環(huán)-螺旋-PAS家 族成員)和TBX21 ( T-box蛋白)；在SH-SY5Y細月包中的ATF-3、 C/EBP-a 、 NFkB 、以及PIAS3 (;敫活STAT3的蛋白水卩制劑)；以及 在SK-N-BE(2)-C細月包中的CBP ( CREB結(jié)合蛋白)、HTLF (T細月包白血病病毒增強子因子)、N-Myc和Oct-l。 PROM《效陣列測定檢
測這些發(fā)育上或細胞類型特異性地調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的能力表 明，該測定是足夠敏感的以纟企測以相對低水平表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。然
建，則可以進行RNA印跡分析或凝膠遷移率變動分析以證實微陣
列結(jié)果。
PROM樣i陣列^U居表明，Sox、 Hox、 Pbx、 Pax、 Egr、以及一亥 激素受體家力矣的成員特異性;也表達在所有三種成一申經(jīng)細月包瘤細月包 類型中。對可獲得文獻的廣泛研究表明，這些轉(zhuǎn)錄因子以一種方式 或另一種方式與胚胎發(fā)育和細胞分化有關。這些轉(zhuǎn)錄因子、以及其 它遍在表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和輔調(diào)節(jié)子的復雜的組合相互作用會觸
需要的(31、 52、 57)。 一些在成神經(jīng)細胞瘤細胞中正調(diào)節(jié)的輔調(diào) 節(jié)子包4舌SNW1、 N-CoR、 NCOA3、以及HDAC6。此夕卜，兩種緊 密相關的已知與抑制c-myc表達有關的轉(zhuǎn)錄阻遏物在所有三種成神 經(jīng)細胞瘤細胞中 一皮下調(diào)節(jié)。
在隨機連接反應中使用了用于10種不同轉(zhuǎn)錄因子的順式作用 序列元件，其選自上述成神經(jīng)細月包瘤細月包特異性轉(zhuǎn)錄因子和Oct、 CREB、 AP-1以及STAT家力矣的成員，用于組成型表達的轉(zhuǎn)錄因子。 成神經(jīng)細胞瘤細胞特異性下調(diào)節(jié)阻遏物元件也可以包括在P遺才幾盒
將在成神經(jīng)細胞瘤細胞中對由啟動子組合驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有任 何影響。另一方面，相同的阻遏物元件將在表達高水平阻遏物蛋白 的非靶細胞中作為轉(zhuǎn)錄的抑制劑。
要包括在文庫構(gòu)建中的序列元件是在考慮每種相應的轉(zhuǎn)錄因 子起作用(通過和其它參與的成員緊密合作，以^更在成神經(jīng)細胞瘤
細胞中進行有效的基因轉(zhuǎn)錄)的潛力以后加以確定。Sp-l結(jié)合序列 元件也包4舌在反應中，因為已知Sp-l和其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，并
且Sp-l結(jié)合位點對保護CpG島免受曱基化是必需的(3、 40、 41 )。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和輔調(diào)節(jié)子的表達i普獲自三種相關的靶成神經(jīng)細 胞瘤細胞類型。與表達譜獲自單一靶細胞類型的情況相比，這些數(shù) 據(jù)為癌細胞特異性啟動子盒的計和構(gòu)建4是供了更有意義和準確 的信息。然而，對要包括在計劃中的隨才幾連4妻反應中的用于轉(zhuǎn)錄因
的文獻。進行這些研究以確定最好的候選序列元件，當加以組合物， 其和其它成分進4亍協(xié)同相互作用，以在草巴細胞中獲得有效和選4奪性 的轉(zhuǎn)錄。
實施例2 -基于轉(zhuǎn)錄因子的DNA微陣列圖鐠分析構(gòu)建序列元 4牛的隨才幾纟且合的文庫。
合成并退火互補寡核苷酸，其包含用于結(jié)合每種所選4奪的轉(zhuǎn)錄 因子的保守順式作用序列。利用退火的寡核苷酸的混合物進行隨枳』 連接反應(36 )。得到的多順式作用序列的隨機伸展(extension )被 亞克隆在人多巴胺P-羥化酶(DBH)基因最小啟動子(后面是LacZ 報道基因)的上游。選擇包含TATA框(盒，box)的DBH最小啟 動子(離轉(zhuǎn)錄起始位點-45至+51 ),因為DBH特異性地表達在神經(jīng) 嵴衍生細胞(包括成神經(jīng)細胞瘤細胞系)中(27、 59)。研究表明， DBH最小啟動子本身是無活性的，但當和其它序列元件結(jié)合時則介 導強細胞特異性轉(zhuǎn)錄(21)。
小心設計要用在隨機連接反應中的包含寡核苷酸的順式作用 序列，要考慮到順式作用序列之間的間距或它們離轉(zhuǎn)錄起始位點的 距離的重要性。為了增加轉(zhuǎn)錄激活的效率，位于每個調(diào)節(jié)元件的核 心基序的側(cè)翼的序列是取自在成神經(jīng)細胞瘤細胞中特異性地表達
的4呆守基因。確定這些側(cè)翼序列(flanking sequence),以至丈當重裝 配時核心調(diào)節(jié)元件將出現(xiàn)在DNA雙螺旋的相同面上。Protein Data Bank (蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)包含250個以上的蛋白質(zhì)-DNA復合物的結(jié) 構(gòu)(2)。和分子以及生化研究相結(jié)合，這些結(jié)構(gòu)-說明了各種不同的 策略，借助于這些策略，蛋白質(zhì)選纟奪性地結(jié)合于特定的DNA序列。 來自所有可獲得來源的信息可用來確定要加入到合成啟動子盒中 的寡核苷酸的精確結(jié)構(gòu)。在某些情況下，用外切核酸酶III (ExoIII) 處理包含單獨的順式作用序列元件和側(cè)翼序列的^U連寡沖亥苷酸，其 中外切核酸酶III以固定速率從DNA分子的末端除去核香酸。設置 反應條件，以便在ExoIII消化以后，借助于在側(cè)翼序列中的累進1 個》威基對缺失來恢復DNA分子。在將單獨的順式作用序列元件
ExoIII對它們進行處理可導致在組合啟動子盒中在順式作用序列元 4牛之間間3巨的卩逸4/M生增加。
在多個發(fā)育調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的情況下，順式作用序列元件的特異 性隨家族的成員而變化。在這樣的情況下以及當用于轉(zhuǎn)錄因子的準 確的共有順式作用序列并不清楚已知時或當它們必須加以確定時， 則實驗上確定有關靶元件的細胞類型特異性序列。CASTing (靶的 循環(huán)擴增和選4奪)方案已用于4全測轉(zhuǎn)錄因子的順式作用序列，尤其 是用于多成分復合物(14)。在此方案中， -使等分部分的雙嗜連寡核 香酸(在中部包含一段簡并隨機核苷酸(15-35bp))與制備自靶細 胞的核提取物進行混合。利用對特定轉(zhuǎn)錄因子特異的抗體免疫沉淀 蛋白質(zhì)-DNA復合物，PCR擴增結(jié)合的DNA分子，然后再次用于 核蛋白結(jié)合和免疫沉淀的另一個循環(huán)。要是沒有對轉(zhuǎn)錄因子具有最 高結(jié)合親和力的寡核苷酸，則多個重復循環(huán)會富集隨才凡寡核苷酸的 群。根據(jù)得到的高親和力核苷酸序列，則可以推出共用結(jié)合序列。
地反映在有其它相互作用調(diào)節(jié)子和輔調(diào)節(jié)子存在的情況下蛋白質(zhì)
在體內(nèi)的結(jié)合優(yōu)先性。在加入隨機連接反應以前，利用這些方法小 心地確定用于順式作用元件的寡核苷酸的序列可增加生產(chǎn)最佳啟 動子盒的可能性。
實施例2.1-實驗步驟
實施例2.1.1-^f/餘式V，^淨^/確;C的C45T,7^:在其它相互 作用調(diào)節(jié)子和輔調(diào)節(jié)子的范圍內(nèi)，為需要準確結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄因子
進行CASTing?；旧弦匀缭贔unk等人(14 )和Wright等人(58 ) 中所披露的相同方式進行CASTing，并具有少量改進。將Funk等 人和Wright等人的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文，尤其是當它們 涉及確定順式作用序列的方法時。制備在中部具有約25個隨機核 普酸序列以及在每個末端具有三個不同限制4立點的寡核苷S菱(
III-I-N25-￡coRI-SawHI-ATw I )。在兩末端包含限制^立點 和間隔核普酸的大約25bp序列用于i殳計正向引物和反向引物(用 于PCR擴增)。利用反向引物作為唯一的PCR引物，并通過用 DNA聚合酶延伸30分鐘，來制備雙《連的寡核苷酸。將這種雙鏈寡 核苷酸的樣品與制備自SK-N-BE(2)-C細胞的核提取物(NaCl的最 終濃度為約100 mM，并在有10 !ig超聲處理大馬哈魚精子DNA存 在的情況下)進行混合，以降低非特異性相互作用。利用磁珠(Dynal Inc., Great Neck, NY )來免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復合物，其中》茲5朱涂 敷有相對于靶轉(zhuǎn)錄因子的抗體。利用磁體回收蛋白質(zhì)-DNA-珠復合 物，然后用包含0.5% NP-40和0.1% BSA的PBS洗;條三次。將復 合物再懸浮在30 )ul的PCR反應緩和液中，然后利用正向和反向引 物擴增9個4盾環(huán)(在IO(TC下變性5分4中，沖妻著加入rag，然后是9 個循環(huán)94°C l分鐘，65°C 1分鐘，以及72°C 1分鐘，其中延伸 10分鐘)。10 pi的擴增樣品再次用于CASTing的另一個循環(huán)。進 行6個CASTing循環(huán)并將得到的DNA樣品克隆進入質(zhì)粒，然后挑 選約30種不同的克隆并測序，乂人而4,出共有序列。
實施例2.1.2-/銜式#^7#/{/,核芬^的經(jīng)*遽凝合成一組互 補寡核苷酸以包含特異性順式作用序列元件和側(cè)翼序列，其用于在 分析TREP圖語(分布，profiling) DNA微陣列測定結(jié)果以后選擇 的每種轉(zhuǎn)錄因子。在TEN鄉(xiāng)爰沖液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 50mMNaCl)中的一個反應中退火和石粦酸4b每組互補寡核 苷酸。在70。C下在300 )Lil的最終容積(包含20 nM的每種互補寡 核苦酸、1 mMATP、以及0.5 U/ml的T4多核苷酸激酶)中進行反 應15分鐘，然后經(jīng)30分鐘緩慢冷卻至室溫。對于隨機連接反應， 使用了相同摩爾量的用于不同順式作用序列的寡核苷酸，以在150 lil的最終反應容積中保持寡核苷酸的總量為200 pmol。在16。C下 利用20 U的T4 DNA連接酶進4亍連接作用過4復。在6%丙烯酰胺凝 膠上流動(run )連接混合物，然后切割包含75 bp至1.0 kb之間的 DNA帶的凝膠的一部分。在37。C下，在兩容積的擴散緩沖液中溫 育埃是月交塊過4復以后，利用Qiaex II Gel Extraction i式劑盒(Qiagen, Chatsworth， CA )從凝膠塊洗脫DNA片段。在16。C下，在150 |_U 的連4妾反應(包含磷酸化和退火的12 bp互補寡核苷酸，而該寡核 苦酸在中部包含8 bp的Asc I限制位點)中用10 U的T4連接酶溫 育經(jīng)純4匕的DNA片l史過4艾。利用Qiaquick Nucleotide Removal i式劑 盒(Qiagen )對反應進行才是純(凈化，clean up )，用Asc I消化，然 后連接到p-半乳糖苷酶報道質(zhì)粒(pD96L)的Asc I位點。如圖1 所示，在pD96L中，(3-半乳糖苦酶報道基因位于多巴胺P-羥化酶
(DBH)最小啟動子的下游，其中最小啟動子包含具有TATA框的 45 bp啟動子序列以及基因的5'非翻i爭區(qū)的51 bp。通過Qiaquick Nucleotide Removal試劑盒純化連4妾的克隆并轉(zhuǎn)化成電感受態(tài)
(electrocompetent)大腸桿菌DH10b菌林。在有氨芐青霉素(100 pg/ml)存在的情況下，將轉(zhuǎn)化的細菌細胞作為一批接種到5 ml LB 中8小時，然后擴增到200ml過巧X。利用Qiagen Maxi制劑分離質(zhì)并立。
實施例3-利用FACS對文庫進3亍預篩選，以i^^表現(xiàn)最好的 序列纟且合。
用質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染把SK-N-BE(2)-C成神經(jīng)細胞瘤細胞，其中質(zhì) 粒包含隨機組合的克隆在LacZ基因上游的啟動子盒。FACS用來選 擇大約3-5%的具有強(3-半乳糖苦酶表達的轉(zhuǎn)染細胞。從分選的細 胞分離質(zhì)粒，擴增并再次用于SK-N-BE(2)-C細胞的轉(zhuǎn)染。重復相 同的步驟3至4次，以使得到的細胞群體包含能夠以最高水平表達 才艮道基因的質(zhì)粒。在最后的分選以后，分離質(zhì)粒并單獨地擴增，然 后用于96孑L瞬時轉(zhuǎn)染測定。選沖奪SK-N-BE(2)-C細胞用于預篩選， 因為這些細胞具有最高的轉(zhuǎn)移潛力，因而是晚期成神經(jīng)細胞瘤的基 因治療的主要耙。這些細胞在培養(yǎng)基中也過分地生長，并在這些細 月包中可以實i見相《于高水平的壽爭染率。利用Metafectene試劑(Biontex; Munich, Germany )在SK-N-BE(2)-C細月包中可以達到高達90%的專爭 染率。
實施例3.1-實驗步驟
實施例3.1.1-/#染6^-5^Y2人C勿^^"iif過/^CS迷/f為、遽 在T75弁瓦中的D-10中生長SK-N-BE(2)-C成神經(jīng)細月包瘤細月包。4安照 制造商的方案，用20 (ag的質(zhì)粒DNA文庫和50 |ul的Metafectene 轉(zhuǎn)染大約lxl0 個SK-N-BE(2)-C細胞。在轉(zhuǎn)染48小時以后，利用 在PBS中的5 mM EDTA A人培養(yǎng)板脫離細胞并通過23規(guī)4各的針以 進一步解離二耳關體(雙jf關體)和凝塊。將細胞再懸浮在0.2 ml的PBS 中,轉(zhuǎn)移到Falcon 2085管并加熱至37°C。如在Fiering等人(12 )、 Huang等人(20)、以及Nolan等人(44)中所4苗述的，^于纟田月包的 (3-半乳糖普酶活性進行流式細胞術(shù)分析，其中將上述文獻的全部內(nèi) 容以引用方式結(jié)合于本文，尤其是當它們涉及流式細胞術(shù)技術(shù)時。 簡單地說，將在水中的200 pi的2 mM熒光素二-P-D-半乳糖苷 (FDG; Molecular Probes )力口入纟田月包，然后在37。C下溫育混合物1
分鐘。在溫育結(jié)束時，加入10容積冰冷的PBS并將細胞保持在冰 上20-60分鐘。通過加入2 mM苯乙基-P-D-石克代半乳糖芬(Molecular Probes )來纟冬止反應。在分選以前，力口入5 pg/ml的石輿4匕丙口定(Sigma )。 在4。C下用FACS儀對細胞進行分選。從分選儀收集在上部3-5%水 平的異硫氰酸熒光素(FITC)-陽性細胞。
實施例3.1.2 -乂乂為、」逸的勿i^回僅l在通過Hirt方案(19 )才是 耳又在分選細胞中的質(zhì)粒，其中Hirt方案通過在有SDS和NaCl存在 的情況下優(yōu)先沉淀細胞基因組DNA而開發(fā)用來纟是耳又^氐分子量 DNA。簡單;也i兌，將分選的細胞懸浮在45 mMTris-硼酸鹽、1 mM EDTA、 0.5% SDS以及1.6 M氯化鈉中，然后在4。C下消化過^艾。 將細胞提取物壓成丸并用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1 )從上清提取 DNA兩次，然后用氯仿4是耳又一 次。用乙醇沉淀DNA ，然后懸浮在 50 pl的水中。然后分離自分選細胞的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化高效電感 受態(tài)大腸桿菌DH10b菌抹，其在補充有氨芐青霉素的200 ml的LB 中生長為混合培養(yǎng)基過4復。利用Qiagen Maxi試劑盒對質(zhì)粒進行分 離。
實施例3.1.3-重復》v逸進行轉(zhuǎn)染、分選以及質(zhì)粒DNA分離 的相同循環(huán)三至四次，以便消除大多數(shù)具有低到中等水平報道基因 表達的克隆。驅(qū)動才艮道基因以最高水平表達的序列組合經(jīng)受住累進 選捧過程。在最后一次選^奪以后，從分選細胞分離質(zhì)粒，在大腸桿 菌中轉(zhuǎn)化然后平皿4妻種在瓊脂々反(具有100 )Lig/ml氨芐青霉素)上。 從平板挑選90-100個細菌轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)過夜然后單獨地用于質(zhì)粒制 備。在每個循環(huán)的FACS細胞分選期間選4奪(3-5% )的閾值和循環(huán) 的數(shù)目(3-4 )是根據(jù)經(jīng)驗加以優(yōu)化，以使在最后一次以后大約90-100 種表現(xiàn)最好的序列組合經(jīng)受住選4奪過程。對選4奪的質(zhì)粒進行測序并 用于另外的篩選步驟。
實施例4-在把細胞和非把細胞的96孑L瞬時轉(zhuǎn)染測定中對預選 擇的組合進行篩選，以最終選擇3-5種表現(xiàn)最好的候選物。
在此步驟中，用在SK-N-BE(2)-C細月包、在SH-SY5Y和SH-EP1
細胞、以及其它非l巴細胞中的瞬時轉(zhuǎn)染測定單獨地試驗了大約90 種不同的預選擇的組合啟動子盒，其中預選擇是依據(jù)它們在 SK-N-BE(2)-C細胞中的性能(通過FACS加以分析)。對每種組合 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件在耙細胞以及在非靶細胞中的性能進行打分，并且選 擇3-5種得分最高的組合用于進一步分析。打分標準(scoring criteria)是在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄效率以及在非靶細胞中轉(zhuǎn)錄活性的缺 少。在各種不同的非靶細胞中進行測定，其中非靶細胞包括但不限 于HeLa纟田胞、HCN-1A和HCN-2人皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(ATCC, Manassas, VA ) 、 HNPC人碎申纟至元前體纟田月包(Clonexpress, Inc., Gaithersburg, MD )、 ARPE-19人視網(wǎng)月莫色素上皮細月包(ATCC )、 293 人腎細胞(ATCC)、 HepG2人肝細胞癌細胞、以及其它非人細力包如 PC12和NIH 3T3。
實施例4.1-實驗步驟
為了瞬時轉(zhuǎn)染測定，在轉(zhuǎn)染前12-16小時，將10,000至30,000 個細月包雙4分平皿4妄種于在適當生長培養(yǎng)基中的96孑14反。確定平皿 才妄種密度，以^更在轉(zhuǎn)染時細月包變成70-90°/。匯合(confluent )。還利 用不同的商業(yè)上可獲纟尋的轉(zhuǎn)染試劑預試-瞼了細刀包的壽爭染率
(transcription efficiency ), 其中耷令染^式劑包4舌 Metafectene 、 Lifofectamine (Invitrogen )、 Fugene-6 ( Roche )、 以及Superfectene
(Qiagen)。按照制造商的方案，利用50_200 ng的DNA并借助于 適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑對細胞進行轉(zhuǎn)染。然后用PBS洗滌細胞并利用50 ilU 的凈艮道裂解緩沖液(Promega)在轉(zhuǎn)染后裂解48小時，然后利用(3-半乳4唐苦酶測定系統(tǒng)(Promega)在平一反上直4姿測定(3-半乳#唐苷酶 活性。除大約90種預選擇的質(zhì)粒DNA樣品之外，還分別雙份加入CMV增強子/啟動子驅(qū)動的(3-半乳糖苷酶纟艮道質(zhì)粒和由最小DBH 啟動子驅(qū)動的報道質(zhì)粒作為陽性對照和陰性對照。此外，522 bp酪 氨酸羥化酶啟動子(50 )驅(qū)動的P-半乳糖苷酶才艮道質(zhì)粒雙份用于孔 中作為細月包類型特異性的對照。因為不同的細胞類型顯示不同的轉(zhuǎn) 錄率，所以利用相同質(zhì)?？寺∮涗涀圆煌毎膒-半乳4唐苷酶活性 并不能直接用于得分的比較。因此，具有不同順式作用序列組合的 質(zhì)粒樣品的性能表示為百分比，該百分比是相對于在減去本底信號 (基線信號，background signal)(獲自陰性對照孑L)以后從CMV 增強子/啟動子驅(qū)動的陽性對照孔獲得的數(shù)值。根據(jù)在耙細胞中的表 達強度和在非靶細胞中的表達缺少選擇了得分最高的3-5種質(zhì)粒。
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本領域技術(shù)人員將明了 ，或利用常規(guī)實驗能夠確定對本文具體 描述的本發(fā)明的特定具體實施方式
的許多等同替換。這樣的等同替 換包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于制備和選擇轉(zhuǎn)錄增強組合啟動子盒的方法，包括(i)構(gòu)建隨機組合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的文庫，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件中的每一個包括由特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的雙鏈DNA序列元件以及側(cè)翼序列；(ii)將所述組合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入載體中的最小啟動子的上游，其中所述最小啟動子的后面是報道基因；(iii)將所述載體插入到宿主細胞中；以及(iv)篩選顯示出所述報道基因增強表達的細胞，并在所述細胞中鑒別所述組合啟動子盒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在連接反應條件下，通過 將由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的單個雙鏈DNA序列元件混合在 一起來
3. 才艮據(jù)^k利要求1所述的方法，其中，所述雙鏈DNA序列元件 包4舌在<壬<可一端或兩端的間隔斗亥苦酉菱。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報道基因表達是通過 熒光激活細胞分選儀(FACS)來篩選的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的 DNA序列元件是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和輔調(diào)節(jié)子的DNA孩i陣列 圖語分析而獲得的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報道基因是/"cZ或 GFP。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述宿主細胞是癌細胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述癌是成神經(jīng)細胞瘤。
9. 一種包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合啟動子盒的載體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其是質(zhì)粒。
11. 4艮據(jù)—又利要求9所述的載體，其是病毒。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其是瞬時表達的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其被整合到宿主細胞的基因組中。
14. 一種包括根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體的宿主細胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細胞，其是原核細胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細胞，其是真核細胞。
17. #4居纟又利要求16所述的宿主細力包，其是哺乳動物細月包。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其是人細胞。
19. 4艮據(jù)斗又利要求18所述的宿主細胞，其是癌細月包。
全文摘要
本申請披露了一種用于制作和選擇轉(zhuǎn)錄增強組合啟動子盒的方法，該方法包括構(gòu)建隨機組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的文庫，這些元件包括由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子識別的雙鏈DNA序列元件；將組合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入載體中的報道基因在其后面的最小啟動子的上游；將載體插入到宿主細胞中；然后篩選顯示出報道基因增強表達的細胞，并鑒別細胞中的組合啟動子盒。
文檔編號C12N15/74GK101189348SQ200680018777
公開日2008年5月28日 申請日期2006年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日
發(fā)明者咸圣鎬 申請人:普洛姆根公司