專利名稱：酶－底物反應(yīng)的監(jiān)測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及監(jiān)測酶-底物反應(yīng)的方法，鑒別酶活性調(diào)節(jié)劑或新的酶底物的篩選測定法，和在此類方法和測定法中使用的底物和電化學(xué)反應(yīng)室(electrochemical reaction chamber)。
由氧化還原酶催化的反應(yīng)可以電化學(xué)監(jiān)測。參見，例如Barker PD，Hill HA.Prog Clin Biol Res.1988；274419-33Directelectrochemical probes of redox protein and redox enzymestructure and function。Allen等人(J.Electroanal.Chem.178(1984)69-86)，和Christensen and Hamnett(Techniques andMechanisms in Electrochemistry(1994)356-373)綜述了細(xì)胞色素c的電化學(xué)。用于測定細(xì)胞色素P450活性的電化學(xué)系統(tǒng)在WO 00/22158及其中引用的參考文獻(xiàn)中得到描述。然而，由非氧化還原酶催化的反應(yīng)不能容易地進(jìn)行電化學(xué)監(jiān)測，因?yàn)闆]有明顯合適的隨著反應(yīng)進(jìn)程改變氧化還原狀態(tài)的化學(xué)基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)當(dāng)理解，如果底物已被氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記，那么非氧化還原酶反應(yīng)可以電化學(xué)監(jiān)測。還應(yīng)當(dāng)理解，標(biāo)記的底物的使用不局限于非氧化還原酶反應(yīng)。本發(fā)明還可應(yīng)用于氧化還原酶，并且因此提供監(jiān)測氧化還原酶反應(yīng)的新方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾的方法，該方法包括提供已用氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾該底物的酶；在適合于酶修飾底物的條件下孵育底物和酶；和通過氧化還原活性基團(tuán)電化學(xué)監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾。
氧化還原活性基團(tuán)使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。例如，使用方法例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的線性掃描伏安法(LSV)或循環(huán)伏安法(CV)可以產(chǎn)生伏安波形圖。產(chǎn)生的伏安波形圖可以用于例如測定酶的催化活性、酶反應(yīng)速率、底物或抑制劑與酶結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，或進(jìn)行競爭性抑制研究、測量熱力學(xué)反應(yīng)、篩選酶活性調(diào)節(jié)劑、或測量藥物交叉反應(yīng)性。
術(shù)語“氧化還原活性基團(tuán)”在此處用于指可以對(duì)底物進(jìn)行標(biāo)記，并且能夠在其中酶是催化活性的條件下改變其氧化狀態(tài)(即，獲得或失去電子或質(zhì)子)的任何基團(tuán)。當(dāng)施加電位并根據(jù)時(shí)間的線性函數(shù)變化時(shí)，當(dāng)針對(duì)施加的電極電壓繪制電流時(shí)，對(duì)底物標(biāo)記的氧化還原活性基團(tuán)的氧化狀態(tài)中的改變將產(chǎn)生伏安波形圖。
根據(jù)本發(fā)明還提供了在本發(fā)明方法中使用的已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物。
底物可以通過將氧化還原活性基團(tuán)偶聯(lián)至底物優(yōu)選共價(jià)地而用氧化還原活性基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。氧化還原活性基團(tuán)可以直接，或經(jīng)由連接體偶聯(lián)至底物。當(dāng)使用連接體時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇連接體的大小和化學(xué)性質(zhì)，以使連接體對(duì)酶修飾底物的任何干擾最小化。
應(yīng)當(dāng)選擇氧化還原活性基團(tuán)，以在其中監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程的條件下給出良好的電化學(xué)信號(hào)。氧化還原活性基團(tuán)還應(yīng)適合將其與底物偶聯(lián)所需的化學(xué)操作。
氧化還原活性基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。合適的基團(tuán)的例子包括二茂鐵、富勒烯和醌。
底物可以包括或由對(duì)應(yīng)酶的全長天然底物，或僅對(duì)應(yīng)天然底物的一部分的底物組成，條件是使用的底物在適當(dāng)條件下仍可由酶進(jìn)行修飾。例如，當(dāng)酶天然底物是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，根據(jù)本發(fā)明使用的底物可以對(duì)應(yīng)全長的蛋白質(zhì)或肽，或?qū)?yīng)蛋白質(zhì)或肽的片段。底物可以包括或由重組肽或蛋白質(zhì)組成。
底物可以由超過一個(gè)的氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。氧化還原活性基團(tuán)可以與底物的任何合適部分偶聯(lián)，只要氧化還原活性基團(tuán)不干擾酶對(duì)底物的修飾。當(dāng)?shù)孜锸请幕虻鞍踪|(zhì)時(shí)，氧化還原活性基團(tuán)一般將共價(jià)偶聯(lián)至肽或蛋白質(zhì)的氨基和/或羧基末端氨基酸殘基。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，酶是非氧化還原酶。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面，酶是激酶或磷酸酶。當(dāng)酶是激酶時(shí)，底物包括在適當(dāng)條件下通過激酶進(jìn)行磷酸化的氨基酸殘基。當(dāng)酶是磷酸酶時(shí)，底物包括在適當(dāng)條件下通過磷酸酶進(jìn)行脫磷酸的磷酸化氨基酸殘基。
在

圖1(a)中圖解顯示了激酶催化的反應(yīng)。正方形表示底物肽鏈的氨基酸殘基。激酶給特定的氨基酸殘基添加了磷酸(由圓圈表示)，所述氨基酸殘基一般在由激酶特異識(shí)別的10-20個(gè)氨基酸殘基的基序中。磷酸酶催化逆反應(yīng)。
由激酶和磷酸酶催化的反應(yīng)不能容易地進(jìn)行電化學(xué)監(jiān)視，因?yàn)闆]有明顯合適的化學(xué)基團(tuán)可以用于監(jiān)視反應(yīng)。然而，如果底物分子由合適的氧化還原活性基團(tuán)例如二茂鐵、富勒烯或醌標(biāo)記(圖1(b))，那么反應(yīng)可以被監(jiān)視。磷酸基團(tuán)攜帶雙陰性電荷，因此這種基團(tuán)的添加或去除改變底物的兩個(gè)電荷。這引起底物伏安波形圖中可檢測的改變，并且使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)伏安法技術(shù)確定未轉(zhuǎn)化的底物的量(參見下文實(shí)施例1)。
由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物可以是完整的底物蛋白質(zhì)，或?qū)?yīng)于由激酶或磷酸酶識(shí)別的底物蛋白質(zhì)的片段。例如，底物可以包括由酶特異性識(shí)別的基序的氨基酸序列。
激酶或磷酸酶底物可以由超過一個(gè)的氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物由第一氧化還原活性標(biāo)記在氨基末端標(biāo)記，和第二氧化還原活性基團(tuán)在底物的羧基末端標(biāo)記。
當(dāng)酶是激酶時(shí)，優(yōu)選地，對(duì)底物標(biāo)記的氧化還原活性基團(tuán)形成與激酶添加的磷酸基團(tuán)的電子偶聯(lián)。當(dāng)酶是磷酸酶時(shí)，優(yōu)選地，對(duì)底物標(biāo)記的氧化還原活性基團(tuán)形成與磷酸酶去除的底物的磷酸基團(tuán)的電子偶聯(lián)。磷酸基團(tuán)和氧化還原活性基團(tuán)之間的電子偶聯(lián)的形成預(yù)期增加從未轉(zhuǎn)化的底物和完全轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物獲得的伏安波形圖之間的差異。這應(yīng)當(dāng)增加根據(jù)其確定的未轉(zhuǎn)化底物的量的精確度。
在本發(fā)明的另一特別優(yōu)選的方面，酶是在適當(dāng)條件下在切割位點(diǎn)切割底物的蛋白酶。蛋白酶基本上催化在圖2(a)中圖解顯示的相同反應(yīng)。在生理?xiàng)l件下，底物和反應(yīng)產(chǎn)物采用在氨基末端帶有正電荷和在羧基末端帶有負(fù)電荷的兩性離子狀態(tài)，但總電荷保持為零(忽略任何側(cè)鏈電荷，它在反應(yīng)的左和右手側(cè)之間保持不變)。
由蛋白酶催化的反應(yīng)不能容易地進(jìn)行電化學(xué)監(jiān)測，因?yàn)樵诘孜锖彤a(chǎn)物中沒有明顯合適的隨著反應(yīng)進(jìn)程改變其氧化還原狀態(tài)的化學(xué)基團(tuán)。然而，如果底物肽在其氨基和羧基末端用氧化還原活性基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記(圖2(b))，那么反應(yīng)可以電化學(xué)監(jiān)測。未切割的標(biāo)記的底物的總電荷仍是零，但切割產(chǎn)物則不是。一種具有附加的正電荷，而另一種具有附加的負(fù)電荷。
切割產(chǎn)物的伏安波形圖與底物的伏安波形圖顯著不同。這使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)伏安法技術(shù)確定被切割的底物的量(參見下文實(shí)施例2)。
在本發(fā)明的這個(gè)方面的其他實(shí)施方案中，蛋白酶底物可以改由一種或更多種氧化還原活性基團(tuán)遠(yuǎn)離氨基和羧基末端進(jìn)行標(biāo)記(從而使得氨基末端的正電荷和羧基末端的負(fù)電荷得以保留)。然而，優(yōu)選氧化還原活性基團(tuán)在底物的氨基和/或羧基末端，因?yàn)檫@預(yù)期增加未切割的底物和切割產(chǎn)物之間的區(qū)別。
在本發(fā)明的這個(gè)方面的其他實(shí)施方案中，蛋白酶底物可以由單個(gè)氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。然而，優(yōu)選蛋白酶底物在切割位點(diǎn)每一側(cè)由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記，從而使得兩種切割產(chǎn)物隨后都可用電化學(xué)檢測。
可以在氧化還原活性基團(tuán)之間進(jìn)行改造的任何電或直通空間能量偶聯(lián)(electronic or through-space energetic coupling)預(yù)期進(jìn)一步增強(qiáng)由底物和切割產(chǎn)物獲得的伏安波形圖之間的差異，并且因此增強(qiáng)根據(jù)其可以確定的切割產(chǎn)物的量的精確度。
第一和第二氧化還原活性基團(tuán)可以是相同的化學(xué)基團(tuán)，但優(yōu)選是不同的化學(xué)基團(tuán)，當(dāng)?shù)孜锉磺懈顣r(shí)以使可檢測的電化學(xué)信號(hào)的改變最大化。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，酶是氧化還原酶。此類方面提供監(jiān)測氧化還原酶反應(yīng)的新方法。此類方面的優(yōu)點(diǎn)是酶反應(yīng)直接監(jiān)測(通過監(jiān)測底物的伏安波形圖)而不是根據(jù)常規(guī)方法間接監(jiān)測(通過監(jiān)測反應(yīng)物例如NAD+/NADH而不是酶或底物的伏安波形圖)。
在一些實(shí)施方案中，可能希望提供可以由超過一種酶識(shí)別的氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物。例如，可以提供具有氨基酸序列的肽底物，所述氨基酸序列包括由相同類別的不同酶例如不同的激酶識(shí)別的不同基序。這使得能夠使用相同底物對(duì)不同酶進(jìn)行電化學(xué)研究。
在其他實(shí)施方案中，提供可以由2種或更多種不同類別的酶例如激酶、磷酸酶和蛋白酶識(shí)別的氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物肽。這使得能夠使用相同底物對(duì)不同類別的酶進(jìn)行電化學(xué)研究。
本發(fā)明的方法可以用于酶的動(dòng)力學(xué)研究，或鑒別酶活性調(diào)節(jié)劑，或鑒別酶的底物。
根據(jù)本發(fā)明提供了鑒別酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選測定法，該測定法包括提供已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾該底物的酶；在適合于酶修飾底物的條件下孵育標(biāo)記的底物和酶；在酶活性的候選調(diào)節(jié)劑的存在下，通過氧化還原活性標(biāo)記電化學(xué)監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾；和確定該候選調(diào)節(jié)劑是否調(diào)節(jié)酶的活性。
一般地，通過比較在候選調(diào)節(jié)劑的存在下酶對(duì)底物的修飾和在候選調(diào)節(jié)劑的缺失下酶對(duì)底物的修飾確定候選調(diào)節(jié)劑是否調(diào)節(jié)酶的活性。
候選調(diào)節(jié)劑可以是酶活性的抑制劑、活化劑或增強(qiáng)劑。
根據(jù)本發(fā)明還提供了用于鑒別酶底物的篩選測定法，該測定法包括提供酶和已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的酶的候選底物；在允許酶修飾該酶的已知底物的條件下孵育酶和候選底物；和通過氧化還原活性標(biāo)記電化學(xué)確定該酶是否修飾候選底物。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物的方法，它包括將氧化還原活性基團(tuán)與底物偶聯(lián)。
與自動(dòng)化肽合成儀相容的偶聯(lián)操作是優(yōu)選的，因?yàn)槭褂么祟惒僮骺梢匀菀椎厣a(chǎn)標(biāo)記底物。Fmoc(9-芴甲基羰基)或t-Boc(叔丁氧基羰基)偶聯(lián)反應(yīng)是特別優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明還提供了包括酶的底物和任選地能夠修飾該底物的酶的電化學(xué)反應(yīng)室，該底物已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾的試劑盒，該試劑盒包括已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾該底物的酶。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)是它們可以自動(dòng)化并使用微流(microfluidic)電化學(xué)傳感器裝置執(zhí)行。這允許進(jìn)行高通量方法，例如高通量篩選酶活性的候選調(diào)節(jié)劑，或同時(shí)收集在幾種不同的條件下(例如系列稀釋的酶抑制劑)相同酶底物反應(yīng)的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的方法可能對(duì)候選藥物化合物的二次篩選特別有用，所述候選藥物化合物先前通過高通量篩選化合物文庫鑒別為具有針對(duì)酶的某些活性。二次篩選可以用于確證活性、測量潛力、并評(píng)估活性藥物化合物的選擇性。在藥物開發(fā)過程中使用的大多數(shù)二次篩選人工地進(jìn)行并且因此消耗大量資源。本發(fā)明的方法允許進(jìn)行高通量、自動(dòng)化的二次篩選。
本發(fā)明的方法還可用于候選藥物化合物的前期最優(yōu)化，以鑒別具有最佳安全與有效特征的那些化合物。此外，使用本發(fā)明的方法可以進(jìn)行高通量、自動(dòng)化的前期最優(yōu)化。
本發(fā)明的方法甚至可以用于化合物文庫的高通量、自動(dòng)化初次篩選，以鑒別針對(duì)酶有活性的候選藥物化合物。
現(xiàn)在參照附圖在下列實(shí)施例中描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1(a)顯示了激酶反應(yīng)的圖示；圖1(b)顯示了其中底物已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的激酶反應(yīng)的圖示；圖2(a)顯示了蛋白酶反應(yīng)的圖示；圖2(b)顯示了其中底物的氨基和羧基末端已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的蛋白酶反應(yīng)的圖示；圖3(a)顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的激酶反應(yīng)的伏安波形圖中的預(yù)期變化；
圖3(b)顯示了激酶抑制劑對(duì)激酶反應(yīng)速率的預(yù)期效應(yīng)；圖4(a)顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的蛋白酶反應(yīng)的伏安波形圖中的預(yù)期變化；和圖4(b)顯示了蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白酶反應(yīng)速率的預(yù)期效應(yīng)。
實(shí)施例1電化學(xué)激酶/磷酸酶測定法下文顯示了在(i)其氨基末端或(ii)其羧基末端由氧化還原活性二茂鐵標(biāo)記的酪氨酸激酶c-Src的肽底物 白色框表示通過c-Src磷酸化的酪氨酸殘基。假定標(biāo)記底物的所有側(cè)鏈在測定條件下離子化，酪氨酸殘基的磷酸化將使標(biāo)記底物的總電荷從-1變?yōu)?3。
為了電化學(xué)監(jiān)測c-Src對(duì)標(biāo)記底物的修飾，在電化學(xué)反應(yīng)室中在ATP的存在下在水性溶液(在非常類似生理?xiàng)l件的pH、溫度和離子濃度下)中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)電化學(xué)反應(yīng)室施加電位(使用工作電極和參考電極)，并測量電流應(yīng)答(使用工作電極和輔助電極)。使用線性掃描伏安法產(chǎn)生伏安圖。圖3(a)顯示了可以獲得的假定的伏安圖。
盡管在磷酸和氧化還原標(biāo)記之間可能沒有直接的電荷轉(zhuǎn)移，但當(dāng)接近電極時(shí)分子電荷的總變化將改變其經(jīng)受的吸引力或排斥力。因此，盡管波形圖的形狀可能沒有改變，但它將“平行”移動(dòng)，移動(dòng)程度與底物肽磷酸化程度成比例(參見圖3(a))。
隨著肽從完全非磷酸化變?yōu)橥耆姿峄?，伏安圖中的波形曲線在2個(gè)界限清楚的限度(由圖3(a)中的亮和暗的實(shí)線舉例說明)之間移動(dòng)。這種應(yīng)答用于監(jiān)視肽磷酸化的程度，并且因此可以用于監(jiān)測由酶催化的反應(yīng)速率。
酶通常可以具有由圖3(b)中上面的暗線顯示的反應(yīng)速率。如果候選藥物能夠抑制該反應(yīng)，那么在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的修飾的底物的量將減少，由圖3(b)中下面的淡色的線顯示。假如一直存在可獲得的大量過量的底物肽，監(jiān)視反應(yīng)的這種方法是特別有用的，因?yàn)樵谌魏谓o定時(shí)間2條線的值的比應(yīng)保持不變，并且通過將測定法運(yùn)行更長時(shí)間可以簡單地增加結(jié)果的精確度。
實(shí)施例2電化學(xué)蛋白酶測定法下文顯示了由二茂鐵和富勒烯標(biāo)記的肝炎NS3蛋白酶的肽底物(箭頭標(biāo)明了蛋白酶切割底物的位點(diǎn)) 通過蛋白酶切割底物產(chǎn)生了2種產(chǎn)物，一種在其氨基末端帶有正電荷，和另一種在其羧基末端帶有負(fù)電荷。
為了電化學(xué)監(jiān)測NS3蛋白酶對(duì)標(biāo)記底物的切割，在電化學(xué)反應(yīng)室中在水性溶液(在非常類似生理?xiàng)l件的pH、溫度和離子濃度下)中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)電化學(xué)反應(yīng)室施加電位(使用工作電極和參考電極)，并測量電流應(yīng)答(使用工作電極和輔助電極)。使用線性掃描伏安法產(chǎn)生伏安圖。圖4(a)顯示了可以獲得的假定的伏安圖。
盡管在2種氧化還原標(biāo)記之間可能沒有直接的電荷轉(zhuǎn)移，但當(dāng)接近電極時(shí)，切割產(chǎn)物將經(jīng)受與底物相比顯著不同的吸引力或排斥力。因此，波形圖的形狀將改變，改變的程度與底物被切割的程度成比例(參見圖4(a))。
隨著底物被切割，伏安圖中的曲線將在由底物和切割產(chǎn)物的電化學(xué)曲線限定的限度之間移動(dòng)(參見圖4(a)中的亮和暗線)。這種應(yīng)答可以用于監(jiān)視底物被切割的程度，并且因此可以用于監(jiān)測由酶催化的反應(yīng)速率。
酶通常可以具有由圖4(b)中上面的暗線顯示的反應(yīng)速率。如果候選藥物能夠抑制該反應(yīng)，那么在給定時(shí)間內(nèi)被切割的底物的量將減少，由圖4(b)中下面的淡色的線顯示。此外，假如一直存在可獲得的大量過量的底物，監(jiān)視反應(yīng)的這種方法是特別有用的，因?yàn)樵谌魏谓o定時(shí)間2條線的值的比應(yīng)保持不變，并且通過將測定法運(yùn)行更長時(shí)間可以簡單地增加結(jié)果的精確度。盡管線的實(shí)際斜度可能改變，但比率由候選藥物的性質(zhì)確定，并且不依賴于酶的濃度。這意味著進(jìn)行測定法的傳感器對(duì)制造變化(manufacturing variation)具有高耐受性。
使用實(shí)施例1和2中描述的方法通過簡單地改變候選藥物的濃度可以進(jìn)行完整的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究。這類實(shí)驗(yàn)可以例如涉及沿著一排微量滴定板孔制備系列稀釋，并使用設(shè)計(jì)為同時(shí)收集24個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的24探針芯片，從而在單次測量中產(chǎn)生完整的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)組。其他動(dòng)力學(xué)研究例如競爭性抑制、熱力學(xué)應(yīng)答和藥物交叉反應(yīng)性可以通過混合藥物候選物或改變反應(yīng)溫度、pH等容易地進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾的方法，所述方法包括提供已用氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾所述底物的酶；在適合于所述酶修飾所述底物的條件下孵育所述底物和所述酶；和通過氧化還原活性基團(tuán)電化學(xué)監(jiān)測所述酶對(duì)所述底物的修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是非氧化還原酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述酶是激酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述酶是磷酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述氧化還原活性基團(tuán)與通過所述激酶添加的所述底物的磷酸基團(tuán)形成電子偶聯(lián)，或根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述氧化還原活性基團(tuán)與所述磷酸酶去除的所述底物的磷酸基團(tuán)形成電子偶聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述酶是蛋白酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述底物包含在肽的氨基末端由第一氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記并在肽的羧基末端由第二氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述第一和第二氧化還原活性基團(tuán)是不同的化學(xué)基團(tuán)。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述或每種氧化還原活性基團(tuán)是二茂鐵、富勒烯或醌。
10.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中在所述酶的活性調(diào)節(jié)劑的存在或缺失下監(jiān)測所述酶對(duì)所述底物的修飾。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中在所述調(diào)節(jié)劑的2種或更多種不同濃度下監(jiān)測所述酶對(duì)所述底物的修飾。
12.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法確定所述酶的催化活性、鑒別所述酶的活性調(diào)節(jié)劑、用于所述酶的動(dòng)力學(xué)研究、或用于評(píng)估所述酶的藥物交叉反應(yīng)性的用途。
13.用于鑒別酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選測定法，所述測定法包括提供已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾所述底物的酶；在適合于所述酶修飾所述底物的條件下孵育所述底物和所述酶；在所述酶活性的候選調(diào)節(jié)劑的存在下，通過所述氧化還原活性標(biāo)記電化學(xué)監(jiān)測所述酶對(duì)所述底物的修飾；和確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否調(diào)節(jié)所述酶的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的篩選測定法，其中比較在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下所述酶對(duì)所述底物的修飾與在所述候選調(diào)節(jié)劑的缺失下所述酶對(duì)所述底物的修飾。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的測定法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑是候選抑制劑。
16.用于鑒別酶底物的篩選測定法，所述測定法包括提供酶和已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的所述酶的候選底物；在允許所述酶修飾所述酶的已知底物的條件下孵育所述酶和所述候選底物；和通過所述氧化還原活性標(biāo)記電化學(xué)確定所述酶是否修飾所述候選底物。
17.已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，其用于根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法中，或用于根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的篩選測定法中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的底物在根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法或在根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的測定法中的用途。
19.制備已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物的方法，其包括將氧化還原活性基團(tuán)與底物偶聯(lián)。
20.電化學(xué)反應(yīng)室，其包含酶的底物和任選地能夠修飾所述底物的酶，所述底物已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。
21.用于監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾的試劑盒，所述試劑盒包含已由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記的底物，和修飾所述底物的酶。
全文摘要
描述了電化學(xué)監(jiān)測酶－底物反應(yīng)的方法。底物由氧化還原活性基團(tuán)標(biāo)記。隨后可以通過氧化還原活性基團(tuán)電化學(xué)監(jiān)測酶對(duì)底物的修飾。此類方法可以特別用于監(jiān)測非氧化還原酶反應(yīng)，例如激酶、磷酸酶或蛋白酶反應(yīng)，盡管氧化還原酶反應(yīng)也可通過此類方法進(jìn)行監(jiān)測。還描述了鑒別酶活性調(diào)節(jié)劑或新的酶底物的篩選測定法。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK101061233SQ200580039360
公開日2007年10月24日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
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