專利名稱：：嵌合噬菌體衍生的顆粒，它們的制造方法和用途的制作方法
背景技術(shù)：
：以往，顯示抗原表位的噬菌體是經(jīng)皮下施予(NatureBiotechnology18(2000)，873-6)。該文章揭露了絲狀噬菌體fd可在其主要?dú)さ鞍椎腘-端區(qū)顯示出多個(gè)外來(lái)肽的拷貝，因此，這樣的構(gòu)造可用于皮下免疫。NucleicAcidsResearch25(1997)，915-916也揭示了噬菌體fd的雜交病毒粒子，其顯示出兩個(gè)不同的肽。有人提出這樣的構(gòu)造在探索疫苗設(shè)計(jì)上具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)。在疫苗學(xué)中，最近的研究趨向是對(duì)治療和預(yù)防以下疾病的黏膜疫苗的研究。這些疾病包括在人和動(dòng)物中的(i)癌癥，(ii)對(duì)過(guò)敏原的過(guò)敏癥(包括對(duì)遺傳性過(guò)敏癥疾病的抑制)，和(iii)由致病微生物(包括病毒、細(xì)菌、真菌和原生生物)引起的感染。抗原刺激的主要部位包括結(jié)膜、胃腸道、呼吸道和尿道。因此，排列在這些部位的黏膜上皮細(xì)胞就構(gòu)成了內(nèi)外環(huán)境之間的有效的障礙，并起著有機(jī)體對(duì)感染的最主要的抵抗作用(Salminenetal.，1998，2001)。由于病原體在波及全身之前，通常先與黏膜上皮細(xì)胞接觸和/或集聚，因此采用黏膜傳遞疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)的注射疫苗，最明顯的優(yōu)點(diǎn)是它們的引入路線更為逼真地模仿出了這些抗原通常進(jìn)入宿主的途徑。其結(jié)果是，黏膜疫苗將引發(fā)由先天性和適應(yīng)性的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈反應(yīng)，從而可提供比用其他方法，如注射更完全的保護(hù)。傳統(tǒng)的注射疫苗的問(wèn)題之一是其模仿了正在發(fā)生的全身感染，結(jié)果通常是繞過(guò)了大部分的免疫系統(tǒng)(特別是先天性免疫系統(tǒng))，而這些免疫系統(tǒng)通常會(huì)在身體首次受到非己抗原刺激時(shí)被激發(fā)。已有一些研究表明經(jīng)黏膜施用疫苗比傳統(tǒng)疫苗提供了對(duì)抗通過(guò)黏膜組織進(jìn)入體內(nèi)的病原體的更好保護(hù)(Davis，2001)。為了產(chǎn)生減毒活疫苗，對(duì)已知病原體的衍生物進(jìn)行改造，使其在它們的宿主中表現(xiàn)出減弱的毒力。這樣的菌株常被用作減毒活疫苗的活性成分。減毒活疫苗通常給予宿主極好的免疫性，且可引起可持續(xù)終生的體液的和細(xì)胞的(cellular)免疫。這些疫苗通常在若干施予劑量甚至單次劑量后即產(chǎn)生保護(hù)性。然而，減毒活疫苗的配方也具有很大的危險(xiǎn)性，且有各種各樣的缺點(diǎn)是與其使用相關(guān)。其中，最為嚴(yán)重的是減毒菌株可能在體內(nèi)恢復(fù)其毒力，從而導(dǎo)致本來(lái)期望由該疫苗預(yù)防的疾病的發(fā)生。并且由疫苗菌株產(chǎn)生的感染可傳遞到免疫受損的或未接種的個(gè)體，其包括兒童和老人。此外，有時(shí)減毒的或去活的疫苗還會(huì)產(chǎn)生有害反應(yīng)，甚至是包括死亡在內(nèi)的嚴(yán)重的有害反應(yīng)，這部分歸因于疫苗制劑含有多種通常與給指定的微生物相關(guān)的定義不清楚的成分。出于這些和其他的原因，減毒疫苗通常不適合用于兒童、老人和免疫受損的個(gè)體，包括感染HIV的個(gè)體。除了上述這些人群外，醫(yī)生對(duì)健康成年人群的處方也越來(lái)越多地選用更安全的替代物(例如，亞單位疫苗)；甚至在這些替代物可顯示出某種程度的較低的效率的情況下也是如此(FossandMur-taugh，2000)。FDA認(rèn)識(shí)了這些危險(xiǎn)，從而對(duì)新疫苗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)不斷制定出更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹笇?dǎo)方針。新的FDA指導(dǎo)方針要求公司更為精確地定義出他們的疫苗產(chǎn)品的成分，這就使得開(kāi)發(fā)新的減毒活的和失去傳染性的疫苗更為困難。這些趨勢(shì)促使生物技術(shù)和制藥部門在很大程度上放棄新品種的減毒活疫苗的研究，而轉(zhuǎn)為開(kāi)發(fā)可具有更好定義的組分和安全性能的新的疫苗制劑(例如亞單位疫苗)。編碼抗原因子的基因與疫苗的活的或去活的微生物組分有關(guān)，這與它們的施用方法無(wú)關(guān)。這些基因通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和/或結(jié)合而水平傳播到宿主的常住微生物群中存在實(shí)際相當(dāng)大的危險(xiǎn)。這些基因包括不單限于編碼毒力因子和抗生素抗性因子的基因。這種轉(zhuǎn)移可發(fā)生的頻率不僅取決于疫苗的組成，還依賴于施用的方法。由于健康個(gè)體中的血液中幾乎沒(méi)有天然微生物群，因此即使通過(guò)靜脈(IV)施用高水平的活的微生物通常也只存在很小的水平傳播的危險(xiǎn)。結(jié)果，這種施用方法代表了更為安全(盡管更具侵入性)的傳遞保護(hù)性抗原(盡管與注射處感染相關(guān)的有害反應(yīng)等仍值得關(guān)注)的路線。與此相反，當(dāng)活的疫苗被施予到含高水平的具有異質(zhì)組分的天然常住微生物群的環(huán)境中時(shí)(例如胃腸道、陰道、呼吸道等)，轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)可能很高。結(jié)果，將黏膜(例如胃腸道內(nèi)的、陰道內(nèi)的、鼻內(nèi)的等)暴露于減毒活的、重組活的和去活的疫苗微生物就意味著毒力和抗生素抗性基因發(fā)生轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)，這可導(dǎo)致新的病原體的出現(xiàn)。就編碼抗生素抗性和/或毒力因子的基因的水平轉(zhuǎn)移而言，最令人不安的是施用質(zhì)粒編碼的疫苗菌株，因?yàn)檫@些可移動(dòng)的DNA要素具有很長(zhǎng)的甚至在不同屬間產(chǎn)生混雜傳遞性的歷史。質(zhì)粒通常是經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和/或結(jié)合而被傳遞。已開(kāi)始有不斷證據(jù)支持編碼毒力因子的DNA，包括抗生素抗性標(biāo)記可從外源微生物轉(zhuǎn)移到人和動(dòng)物的天然微生物群中的推測(cè)。Wilcks等(2004)表明了源自基因改性植物的質(zhì)?？稍诖笫蟮奈改c道中持續(xù)存在。重要的是，這些質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)仍完好無(wú)損，還可轉(zhuǎn)化電穿孔法勝任的大腸桿菌(Escherichiacoli)，這表明了這些質(zhì)?？杀荒c內(nèi)細(xì)菌吸收。類似的，Blake等(2003)中也揭示了抗生素抗性基因，屬于毒力因子，在大腸桿菌O157(E.coliO157)、沙門氏菌屬(Salmonellaspecies)(spp.)和與大腸桿菌相當(dāng)?shù)木曛g交換。另外，Mercer等(1999)還揭示了由口腔中的細(xì)菌或食物釋放出的DNA具有對(duì)口腔內(nèi)天然的感受態(tài)細(xì)菌(competentoralbacteria)進(jìn)行轉(zhuǎn)換的能力。盡管這些研究沒(méi)有在疫苗中進(jìn)行，但它們清楚地表明了這些類型的傳遞確實(shí)會(huì)發(fā)生，并指出必須研究出制備疫苗的替代方法以進(jìn)一步限制向宿主的天然微生物群中引入毒力因子。對(duì)在食物和農(nóng)業(yè)中使用基因改造的有機(jī)物(GMOs)所存在的普遍擔(dān)憂是一旦被引入到系統(tǒng)中，則有恐與GMOs相關(guān)的重組基因材料會(huì)散布到環(huán)境中，從而賦予內(nèi)源性物種新的(有可能是有害的)特性。盡管對(duì)大規(guī)模引入基因材料會(huì)導(dǎo)致出這些基因被導(dǎo)入天然物種中的爭(zhēng)論已經(jīng)平息，但此時(shí)與GMOs相關(guān)的危險(xiǎn)看似會(huì)被很大程度地夸大。因此，就需要發(fā)展既能夠降低這些危險(xiǎn)，還能夠保持疫苗的有益作用的安全的技術(shù)。發(fā)明概要本發(fā)明的目的之一是提供一組合物，該組合物含有嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如嵌合噬菌體(即噬菌體)顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)，這樣，除了編碼噬菌體的因子外，還展示出一或多種附加因子(例如抗原、過(guò)敏原、毒力蛋白、受體、配體、特別是異源的抗原)。特別加以考慮的是對(duì)人和/或動(dòng)物接種有安全保障的嵌合噬菌體顆粒的組合物。一種使得顆粒安全的方法是將顆粒引入到安全的宿主細(xì)胞內(nèi)。因此，本發(fā)明的第一方面是關(guān)于生產(chǎn)嵌合噬菌體衍生的顆粒的方法(以及生成含有所述顆粒的組合物的方法)，所述方法包括向安全的宿主細(xì)胞(通過(guò)轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化)引入一或多個(gè)(例如2，3，或4個(gè))遺傳要素，這些遺傳要素單獨(dú)或組合對(duì)噬菌體衍生的顆粒進(jìn)行編碼。安全的宿主細(xì)胞可選自以下細(xì)菌組成的組-已經(jīng)由美國(guó)食品和藥品管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)、獸用醫(yī)藥中心(CenterforVeterinaryMedicine)評(píng)價(jià)其使用是公認(rèn)安全(GRAS)的細(xì)菌，特別是出現(xiàn)在2005年9月16日公布于http://www.cfsan.fda.gov/～dms/opa-micr.html上的題為“PartialListOfMicroorganismsAndMicrobial-DerivedIngredientsThatAreUsedInFoods”中的細(xì)菌；以及-根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EuropeanFoodandFedCulturesAssociationandInternationalDairyFederation)(EFFCA/IDF)(Mogensen等(2002))公開(kāi)的名單中的細(xì)菌，這些細(xì)菌是具有在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄的微生物；和-被丹麥獸用和食物管理局(DanishVeterinaryandFoodAdministration)于2005年9月16日接受的作為食物用的食物培養(yǎng)物的細(xì)菌。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)只有一個(gè)遺傳要素被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，所述遺傳要素應(yīng)當(dāng)能編碼嵌合噬菌體衍生的所有的成分。當(dāng)前優(yōu)選的情況是要素未被嵌合顆粒所包含，或通過(guò)如化學(xué)處理等從顆粒中移除(或在顆粒中去活)。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)要素被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，目前優(yōu)選的情況是一個(gè)要素(例如噬菌體)編碼野生型噬菌體，而另一要素(例如質(zhì)粒)編碼野生型噬菌體蛋白和展示在噬菌體表面的多肽的雜種。根據(jù)本發(fā)明，在提供對(duì)人和/或動(dòng)物吸收安全的嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)的組合物時(shí)存在的問(wèn)題，可通過(guò)使用已知為安全的細(xì)菌和與它們相關(guān)的噬菌體而得以解決。這些細(xì)菌和與它們相關(guān)的噬菌體具有對(duì)產(chǎn)生嵌合顆粒而言通常被公認(rèn)安全的(GRAS)可查到的記錄，而且所產(chǎn)生的嵌合顆粒不會(huì)編碼所述附加表面展示因子的基因。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生成含有嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物的方法，當(dāng)中的嵌合噬菌體衍生的顆粒含有至少兩種不同的表面展示蛋白，而所述方法包含以下步驟(i)獲得至少兩種遺傳要素，其中至少一種所述遺傳要素(原生遺傳要素)包括相當(dāng)部分的噬菌體基因組，其中至少一種其他的所述遺傳要素(反式互補(bǔ)遺傳要素)編碼至少一種成分(附加成分)的合成，該至少一種成分在組裝和/或釋放顆粒的過(guò)程中被引導(dǎo)至所述顆粒的表面；(ii)用兩個(gè)或多個(gè)所述遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化適合的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(iii)在允許由所述原生遺傳要素編碼的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行表達(dá)的條件下，以及所述至少一種在組裝和/或釋放顆粒中被引導(dǎo)至所述顆粒的表面附加成分進(jìn)行表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主細(xì)胞；(iv)在一定條件下，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物形成嵌合噬菌體衍生的顆粒，其包含至少一種附加成分，該成分由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼，但不包含由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的所述至少一種附加成分的至少一部分的編碼序列；以及(v)獲得包含嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物。如以下給出的詳細(xì)說(shuō)明中所描述的，這樣的嵌合顆?？蓮纳鲜龅慕M合物中分離出。因此，本發(fā)明的第二方面涉及嵌合噬菌體衍生的顆粒，除了至少一種展示或包含至少一種附加成分的正常噬菌體成分外，所述至少一種正常噬菌體成分由含有絕大部分的噬菌體基因組的遺傳要素編碼，且所述至少一種附加成分被不同的遺傳要素編碼，顆粒的進(jìn)一步特征在于其不包含編碼至少一部分所述至少一種附加成分的序列。這樣的顆粒將具有安全的特性，可符合規(guī)定方面有一定優(yōu)勢(shì)，有助于快速通過(guò)管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。因此，本發(fā)明的進(jìn)一方面是關(guān)于應(yīng)用本發(fā)明的嵌合噬菌體衍生的顆粒來(lái)制備疫苗、噬菌體療法的組合物，以及用于治療過(guò)敏、用作生物防除劑和其他將進(jìn)一步描述的應(yīng)用。可能的應(yīng)用包括但不限于表面展示一種或多種因子的嵌合顆粒的繁殖，其中，這些顆粒...允許顆粒競(jìng)爭(zhēng)性地從黏膜表面(例如胃腸道)排除病原體或其他非有益微生物群(例如，那些降低飼料效率的)。...作為通用接合體(例如)(e.g.多聚組氨酸標(biāo)簽(polyhistidinetag))而特異性地和非共價(jià)地附著于一第二接合體成分(adaptorcomponent)(例如小鼠抗多聚組氨酸抗體)，該第二接合體成分為共價(jià)地結(jié)合到異源的生物活性分子或復(fù)合物(例如堿性磷酸酶)。...刺激免疫系統(tǒng)，使顆粒作為疫苗和/或免疫刺激輔藥。由于某些天然的噬菌體蛋白可能具有高度的抗原性，基于噬菌體的傳遞媒介物也被認(rèn)為有起到刺激免疫系統(tǒng)的輔藥的作用。另外，通過(guò)刺激抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的作用，抗原顆粒的大小也會(huì)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。多價(jià)疫苗制劑可通過(guò)(i)在一個(gè)顆粒上表面展示兩個(gè)或多個(gè)抗原，或(ii)組合使用兩個(gè)或多個(gè)截然不同的顆粒而設(shè)計(jì)出。替換因子可被用作特異性地以T-或B-淋巴細(xì)胞為靶，而傳遞它們的抗原物(即使顆粒成為智能疫苗)...延長(zhǎng)噬菌體顆粒在黏膜上皮細(xì)胞和/或它們?cè)隗w內(nèi)的同源生物膜的保留時(shí)間。進(jìn)而，本發(fā)明可用作提供工業(yè)化的表面或生物膜(既用在噬菌體生物防除中)。...選擇性地使顆粒傳遞細(xì)胞毒素有效載荷以殺死癌細(xì)胞、病原體或感染的宿主細(xì)胞。例如，一種表面展示的因子可對(duì)特定類型的癌細(xì)胞(或病原體)產(chǎn)生選擇性的特異性，而第二種因子可作為細(xì)胞毒素。有可能在細(xì)胞毒素結(jié)合到適合的靶后，才由宿主隔離(例如，在疏水袋子中)。另外的選擇是，這些顆?？杀挥米魈禺愋缘匾粤馨图?xì)胞為靶，而傳遞它們的細(xì)胞毒素(例如，選擇性地殺死HIV-感染的淋巴細(xì)胞)。...允許顆粒體內(nèi)特異性地結(jié)合到和包覆到病原體上(例如在腸胃道中)，從而中和病原體，允許其在不致病的情況下排泄出。...協(xié)助從非嵌合顆粒、細(xì)胞碎片和細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)殘?jiān)?例如多聚組氨酸標(biāo)簽)純化嵌合顆粒。定義在此使用的術(shù)語(yǔ)“乳酸細(xì)菌”(LAB)是指革蘭陽(yáng)性、觸酶陰性兼性厭氧菌或微需氧菌，其對(duì)糖發(fā)酵，產(chǎn)生包括以乳酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物在內(nèi)的酸。工業(yè)上用得最多的乳酸菌包括乳球菌屬(Lactococcusspp.)、鏈球菌屬(Streptococcusspp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)、明串珠菌屬(Leuconostocspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、酒球菌屬(Oenococcusspp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)和丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.)。此外，產(chǎn)乳酸菌的細(xì)菌也通常包含在乳酸細(xì)菌的組中，它們包括屬于嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌，雙歧桿菌(bifidobacteria)，即雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)，這些細(xì)菌常被用作食物起子培養(yǎng)物，可單獨(dú)使用或與乳酸細(xì)菌組合使用。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體”(phage，或bacteriophage)涉及已知的一類感染細(xì)菌的病毒。噬菌體包括被蛋白被膜或殼(“衣殼”)包裹的DNA或RNA序列。噬菌體通過(guò)各種方法傳播到宿主細(xì)胞中，包括感染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和/或結(jié)合。在此使用的術(shù)語(yǔ)“病毒”是為本領(lǐng)域所理解的含義，也包括其他為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的可能衍生自噬菌體或病毒的種類。在此使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”、“宿主”或“宿主有機(jī)體”可互換著用于描述適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞，在其中引入原生遺傳要素和反式互補(bǔ)遺傳要素，以及噬菌體可在產(chǎn)生原生遺傳要素的細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。在此使用的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”涉及在任何介質(zhì)中細(xì)菌生長(zhǎng)而得到的細(xì)菌細(xì)胞種群，這些介質(zhì)包括發(fā)酵的飼料和食物制品，例如發(fā)酵的乳制品、肉、魚、水果和/或蔬菜制品。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體基片”涉及將噬菌體尾絲和/或刺突連接到噬菌體上的結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體頸部”涉及將頭部和頸須連接到尾部結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體尾絲”涉及在噬菌體顆粒的底部上發(fā)現(xiàn)的絲狀結(jié)構(gòu)。噬菌體尾絲通常負(fù)責(zé)識(shí)別適合的宿主細(xì)胞。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體前頭部”涉及在噬菌體基因組殼體化和連接尾和/或頸部成分之前的噬菌體頭部結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體頭部”涉及容納噬菌體基因組的二十面的結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體尾部”涉及將噬菌體基因組從噬菌體頭部導(dǎo)出并進(jìn)入到宿主細(xì)胞質(zhì)中的管狀結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體頸須”涉及可以或不可以用作感覺(jué)噬菌體的物理化學(xué)環(huán)境的絲狀結(jié)構(gòu)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“原生菌類組合物”涉及含有原生菌類微生物的組合物，其中，原生菌類微生物被定義為當(dāng)施用足夠量后能給宿主健康帶來(lái)益處的活的微生物(FAO/WHOreport，October2001http://www.mesanders.com/probio_report.pdf.)。與慣例相同，在本文中，該定義也包括以下陳述“...益處不僅僅是簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)?！?即它們不僅僅是被消化而提供所含的卡路里)。在本文中所指的噬菌體顆粒，不是指噬菌體樣或噬菌體菌影顆粒，而是可感染宿主細(xì)胞的活的微生物。在本文中，術(shù)語(yǔ)“噬菌體基因組的絕大部分”應(yīng)理解為含有至少70％的用于形成功能性噬菌體基因組的遺傳位點(diǎn)的噬菌體基因組的部分，優(yōu)選的該部分為至少80％，更優(yōu)選的為至少90％，進(jìn)一步優(yōu)選的是形成功能性噬菌體基因組所需要的所有的基因和其他基因序列。在此使用的術(shù)語(yǔ)“功能性噬菌體基因組”涉及DNA或RNA分子或一組DNA或RNA分子，當(dāng)它們被引入到合適的細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)，在某些條件下，與一種或多種噬菌體編碼的因子一同可控制完整的感染周期，以形成噬菌體顆粒。在優(yōu)選的形式中，這個(gè)或這些DNA或RNA分子將含有從親代噬菌體中衍生出的復(fù)制DNA的起點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“成分”被理解為構(gòu)成噬菌體(或噬菌體樣或噬菌體菌影顆粒)的部分。該術(shù)語(yǔ)包括由噬菌體基因組編碼的蛋白。在此使用的術(shù)語(yǔ)“附加成分”是指由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的成分，其在組裝和/或釋放顆粒的過(guò)程中被引導(dǎo)至所述嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)的表面。在此使用的與嵌合噬菌體衍生的顆粒相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“分離”是指將顆粒從它們的原始環(huán)境(例如產(chǎn)生顆粒的細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物)中除去的過(guò)程。在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”在廣義上并特異地包含了完好的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完好的抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、以及能顯示出理想的生物活性的抗體片段。在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗原或抗原決定簇”涉及抗原分子的一部分，該部分決定了抗原—抗體反應(yīng)的特異性。在此使用的術(shù)語(yǔ)“附加體”涉及一類能夠可逆地整合入細(xì)胞染色體中的質(zhì)粒。在此使用的“動(dòng)物”涉及脊椎動(dòng)物，例如人和動(dòng)物，這里，動(dòng)物包括魚、鳥類，例如雞、火雞、鴕鳥，哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、兔、牛、豬、水牛、駱駝、鹿、羚羊、長(zhǎng)頸鹿、綿羊、山羊、馬、驢、象、猴和黑猩猩。在此使用的“穴蛋白(Holin)”涉及在噬菌體感染后期，由噬菌體基因組典型地表達(dá)的蛋白。穴蛋白在細(xì)胞膜上形成穿孔，使得溶素或溶菌酶蛋白有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞壁肽聚糖，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶解，釋放出后代噬菌體顆粒。在此使用的“衣殼”被定義為病毒顆粒的外殼。“噬菌體菌影”和“與嵌合的噬菌體樣顆?！钡臍ひ脖环Q為衣殼。在此使用的“溶素”涉及鼠科的水解酶，其能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁，使噬菌體得以釋放(綜述見(jiàn)Young等，2000)。在此使用的“生物毒素的中和”涉及通過(guò)一種或多種嵌合噬菌體顆粒與感興趣的試劑間的反應(yīng)，而降低或消除特定毒素的毒性的做法。并不受特定解釋或理論的限制，生物毒素的中和可解釋為將生物試劑從它的預(yù)期宿主受體中隔離開(kāi)，從而消除了導(dǎo)致對(duì)所述試劑不利的一連串的事件。在此使用的“病原體的中和”涉及通過(guò)一種或多種嵌合噬菌體顆粒與感興趣的試劑間的反應(yīng)，而降低或消除特定生物試劑的毒性的做法。并不受特定解釋或理論的限制，病原體的中和可解釋為將生物試劑從它的預(yù)期宿主受體或生態(tài)位隔離開(kāi)，從而消除了導(dǎo)致對(duì)所述試劑不利的一連串的事件。中和也可防止?fàn)I養(yǎng)物吸收這次使用的“不期望的微生物”涉及微生物或一組微生物，當(dāng)存在于人或動(dòng)物的特定的生態(tài)位時(shí)，在不導(dǎo)致特定疾病狀態(tài)下，降低了其居住的人或動(dòng)物的整體健康和/或生化效能。例如，細(xì)菌的某些種屬導(dǎo)致反芻動(dòng)物體內(nèi)過(guò)量的氣體(腸胃氣脹)。這些牛雖然沒(méi)有生病，但它們顯示出降低的消化吸收效率。在此使用的“噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白”涉及包含噬菌體的衣殼的成分和/或噬菌體的成分的蛋白和/或肽。在此使用的“噬菌體感染”涉及噬菌體基因組已成功進(jìn)入宿主細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的情形。在此使用的“感染”與“噬菌體復(fù)制”無(wú)關(guān)。在此使用的“噬菌體復(fù)制”涉及合成噬菌體成分，并對(duì)其處理和組裝進(jìn)入成熟噬菌體顆粒中。噬菌體復(fù)制需要在宿主中進(jìn)行基因表達(dá)，而這與成熟顆粒的感染性無(wú)關(guān)。在此使用的“噬菌體療法”涉及使用噬菌體消除和/或減少致病的和/或不期望的微生物在人體和/或動(dòng)物體內(nèi)存在的數(shù)目，可通過(guò)任何機(jī)制的數(shù)量達(dá)成，這些機(jī)制包括但不限于掠奪、競(jìng)爭(zhēng)排除、病原體中和或是它們的組合。噬菌體療法還可通過(guò)減少或消除不期望的微生物，包括病原體而富集期望的微生物。另外，噬菌體療法還可被用作治療急性和/或慢性疾病狀況的替代療法。在此使用的“原生顆?！鄙婕疤烊坏氖删w隔離種群衍生的原生遺傳要素。在此使用的“原生遺傳要素”涉及含有原生顆粒的噬菌體基因組的絕大部分的遺傳要素。在此使用的“病毒或噬菌體生物防除”涉及使用病毒或噬菌體消除和/或減少致病的和/或不期望的微生物在特定環(huán)境中存在的數(shù)目，可通過(guò)任何機(jī)制的數(shù)量達(dá)成，這些機(jī)制包括但不限于掠奪、競(jìng)爭(zhēng)排除、病原體中和或是它們的組合。病毒或噬菌體生物防除還可通過(guò)減少或消除不期望的微生物，包括病原體而富集期望的微生物。另外，噬菌體療法還可被用作治療急性和/或慢性疾病狀況的替代療法。在此使用的病毒或噬菌體生物防除不適用于活的人或動(dòng)物體系，而僅指非治療的應(yīng)用(例如用于包裝，噴涂在動(dòng)物屠體上等)。在此使用的“質(zhì)粒”是自主復(fù)制分子，其通常由雙鏈DNA構(gòu)成，存在于細(xì)胞中作為染色體外因子。通常，質(zhì)粒含有有限數(shù)目的基因，且通常編碼一個(gè)或多個(gè)用于它們自己復(fù)制用的蛋白。在大多情況下，質(zhì)粒都是非必需的，它們編碼非必要的功能以提高某些細(xì)胞代謝的能力。在此使用的“原噬菌體”涉及噬菌體復(fù)制的相對(duì)被動(dòng)的形式，因此噬菌體基因組被整合進(jìn)細(xì)菌染色體中，而不會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡。在此使用的“適合的宿主細(xì)胞”涉及可用原生遺傳要素和反式互補(bǔ)遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化，且支持所述遺傳要素的表達(dá)和嵌合噬菌體顆粒、噬菌體樣顆?；蚴删w菌影顆粒的組裝?！胺词交パa(bǔ)遺傳要素”是編碼至少一個(gè)不為原生遺傳要素編碼的成分的遺傳要素，優(yōu)選不含有噬菌體基因組的絕大部分。通常，反式互補(bǔ)遺傳要素”是質(zhì)粒。重要的是，這里定義的輔助噬菌體作為一種普通野生型噬菌體，其與特異性噬菌體(例如原生遺傳要素)一同生長(zhǎng)，并提供產(chǎn)生噬菌體顆粒任何必須的功能而不被認(rèn)為是反式互補(bǔ)遺傳要素。“病毒樣顆?！?VLPs)被定義為自組裝的、非復(fù)制的、非致病的和去基因組的顆粒，其大小與完好的病毒粒子可比，但組成的成分遠(yuǎn)少于病毒粒子。實(shí)際上，VLPs通常由單個(gè)噬菌體或病毒衣殼蛋白(衣殼粒)構(gòu)成，其融合進(jìn)感興趣的抗原/抗原表位中。該融合蛋白通常在沒(méi)有噬菌體基因組存在下由質(zhì)粒表達(dá)，其中，基因由所述基因組分離。因此，VLPs是一種改造的且由質(zhì)粒帶動(dòng)的技術(shù)。盡管VLPs和噬菌體菌影具有某些重要的共同特點(diǎn)(例如，都不含遺傳材料)，但根據(jù)定義，它們?cè)诠δ苌虾蜕飳W(xué)上截然不同，且在制備方式上也不同。“噬菌體樣顆?！北欢x為由噬菌體顆粒衍生出的顆粒，其大小與完好的病毒粒子可比，但由若干(通常為幾個(gè))組分構(gòu)成，這些衍生自完好的病毒粒子的組分與完好的病毒粒子類似，但不一定完全相同，甚至可含有部分原生遺傳要素。“噬菌體菌影”被定義為由噬菌體衍生的空的蛋白殼。噬菌體菌影可通過(guò)介入由一個(gè)或多個(gè)因子的表達(dá)導(dǎo)致的裂解性感染而誘發(fā)缺陷的原噬菌體而制得，或在某些情況下，通過(guò)化學(xué)處理(例如滲透壓休克)完好的噬菌體顆粒(即含基因組)得到。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基因”指DNA或RNA序列，其涉及產(chǎn)生多肽鏈，且包括在編碼區(qū)前后的區(qū)域(5′-上游和3′-下游序列)。5′-上游區(qū)包含調(diào)節(jié)序列，其控制基因的表達(dá)，通常為一啟動(dòng)子。3′-下游區(qū)包含涉及終止基因轉(zhuǎn)錄的序列。在本文中，“輔助噬菌體”用于描述正常的野生型噬菌體，其與特異性噬菌體(例如原生遺傳要素)一同生長(zhǎng)，提供產(chǎn)生噬菌體顆粒任何必須的功能?！安幌嚓P(guān)的肽序列”描述了與引導(dǎo)融合蛋白到達(dá)噬菌體表面的肽序列不同的肽序列。本文中，術(shù)語(yǔ)“嵌合顆?！庇糜诿枋銮逗鲜删w顆粒、嵌合噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒，它們包含由至少兩種不同的要素編碼的蛋白和/或其他成分，在此，是由原生遺傳要素以及反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的成分?！扒逗鲜删w衍生的顆?！北徽J(rèn)為是衍生自噬菌體的顆粒是因?yàn)槠湔故境鲋辽僖环N附加的(異源的)成分在其表面，(優(yōu)選為除了至少一種正常的噬菌體編碼的成分外)。這種顆?？蛇x自由嵌合噬菌體顆粒、嵌合噬菌體樣顆粒和嵌合噬菌體菌影顆粒組成的組，或選自可由本發(fā)明的方法獲得的顆粒。“安全的微生物”被定義為那些通常被認(rèn)為在食品或飼料中是公認(rèn)安全的微生物，和/或那些據(jù)有關(guān)管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可的在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄的微生物。術(shù)語(yǔ)“安全的微生物”與術(shù)語(yǔ)“安全的宿主細(xì)胞”可互換使用。本文中使用的描述本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“一”和“該”以及類似的用法(特別是在后面的權(quán)利要求中)，除了有特別指出或有與文中有明顯抵觸外，應(yīng)理解為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)的形式。術(shù)語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”和“含有”，除有特別指出外，應(yīng)理解為開(kāi)放的術(shù)語(yǔ)(即意思是“包括但不限于”)。除有特別指出外，這里對(duì)數(shù)值范圍的引用是對(duì)每個(gè)落入該范圍內(nèi)的單獨(dú)的值進(jìn)行單獨(dú)引用的簡(jiǎn)化方法，其效果與在說(shuō)明書中單獨(dú)引用各個(gè)值相同。除有特別指出或有與文中有明顯抵觸外，這里描述的所有方法可以適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行。除有特別指出外，所有例子或示例性語(yǔ)言(如，“例如”)的使用，其目的只是更好地描述本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍加以限制。說(shuō)明書中的語(yǔ)言不應(yīng)理解為具有以任何非要求的元素作為實(shí)施本發(fā)明的必要元素的含義。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明據(jù)發(fā)明者所知，所有的以嵌合病毒或噬菌體作為載體而展示一種或多種成分的嘗試均是基于病毒/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，而這樣的系統(tǒng)具有潛在的致病性。此外，關(guān)于嵌合噬菌體的現(xiàn)有技術(shù)不能將在嵌合噬菌體表面發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)附加因子從編碼所述一個(gè)或多個(gè)因子的基因隔離開(kāi)，特別是在這些因子中的一個(gè)是融合蛋白的情況下。為了提供最安全的嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物，本發(fā)明描述了一產(chǎn)生大量這種嵌合顆粒的方法，該方法主要是基于通常被認(rèn)為是安全的病毒/宿主細(xì)胞系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)例如是那些通常被認(rèn)為在食品或飼料中有公認(rèn)安全的狀態(tài)的宿主有機(jī)體，和/或那些據(jù)有關(guān)管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可的在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄的微生物(此后簡(jiǎn)稱“安全的微生物”)。盡管噬菌體與宿主之間存在著天然的關(guān)系，但他們不被明確認(rèn)為是“GRAS”的，或是被相關(guān)管理機(jī)構(gòu)描述為“安全的微生物”的狀態(tài)。有相當(dāng)數(shù)量的報(bào)道證明了雖然不是全部，但有很多“安全的微生物”通常會(huì)被噬菌體感染。這樣的噬菌體與他們的特定的宿主細(xì)胞和使用這些細(xì)菌制造的食品之間有著天然的和不可避免的聯(lián)系。因此，處于“安全的微生物”的狀態(tài)必須是基于在用于食品時(shí)無(wú)副作用的歷史記錄，且有必要含有宿主細(xì)胞和與它們相關(guān)的噬菌體。作為一個(gè)額外的重要安全預(yù)防措施，本發(fā)明的方法目前優(yōu)選的一實(shí)施方式還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了在顆粒中不含有編碼至少一個(gè)附加成分的至少一個(gè)基因，所述附加成分是由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼，并展示在嵌合噬菌體衍生的顆粒的表面。通過(guò)確保所述宿主細(xì)胞的基因組和/或所述原生顆粒和/或所述反式互補(bǔ)遺傳要素具有內(nèi)在的性質(zhì)以保證來(lái)自反式互補(bǔ)遺傳要素的遺傳材料不與所述嵌合顆粒發(fā)生聯(lián)系，所述這種從嵌合噬菌體中分離基因的做法可以方便地實(shí)現(xiàn)。這樣的內(nèi)在性質(zhì)的一個(gè)例子被大多數(shù)細(xì)菌質(zhì)粒所表達(dá)。如果反式互補(bǔ)遺傳要素是質(zhì)粒，除非質(zhì)粒中存在特別的包裝信號(hào)，在質(zhì)粒中的基因?qū)⒉粫?huì)轉(zhuǎn)移到嵌合顆粒中。類似的，如果反式互補(bǔ)遺傳要素通過(guò)重組轉(zhuǎn)位子等而被整合入細(xì)菌基因組，則在反式互補(bǔ)遺傳要素中的基因轉(zhuǎn)移到嵌合噬菌體顆粒的可能性很小。但是，可以預(yù)想出有其他的的方法能降低所述基因被轉(zhuǎn)移到嵌合顆粒上的可能。可以預(yù)期，宿主細(xì)胞的基因組和/或所述原生顆粒和/或所述反式互補(bǔ)遺傳要素經(jīng)基因工程改造而表達(dá)一些因子(例如，反義RNA或反式顯性蛋白表達(dá)、條件突變等)，從而保證了基因從所述嵌合顆粒的分離。因此，盡管嵌合顆?？烧故静糠值亩玖σ蜃踊蚨舅?，但編碼不利成分的“不利”遺傳要素的水平傳播的危險(xiǎn)幾乎為零。圖1示出了由本方法得到的主要類型的顆粒。應(yīng)當(dāng)注意的是，由在此揭示的方法制造的顆粒將得到的嵌合顆粒除了由原生遺傳要素編碼的成分之外，還含有一個(gè)或多個(gè)由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的附加因子，其中，原生遺傳要素包括相當(dāng)部分的噬菌體基因組。一個(gè)或多個(gè)這些附加因子可展示在單個(gè)顆粒上，就如同相同因子的多個(gè)單元。如圖所示，表面展示的因子可被整合入尾纖維、頭、尾或任何其他與噬菌體顆粒相關(guān)的結(jié)構(gòu)中。在大多數(shù)應(yīng)用中，顆粒并不需要是完好的才能有效地作為展示因子的載體。顆粒不含有某些編碼附加因子的反式互補(bǔ)遺傳要素的遺傳材料。因此，盡管顆粒是嵌合的，他們卻不是基因重組的。因此，關(guān)于重組GMO技術(shù)的立法限制不適用于這些產(chǎn)品。本發(fā)明重要的一方面是原生遺傳要素包含絕大部分的噬菌體基因組。這與如WO04003143中形成對(duì)比，在WO04003143中，病毒樣顆粒不含有天然產(chǎn)的噬菌體衣殼成分，但是由平移融合進(jìn)外源肽序列的病毒殼蛋白構(gòu)成。原生遺傳要素和反式互補(bǔ)遺傳要素可在一步中同時(shí)引入到宿主細(xì)胞中，但出于技術(shù)上的原因，通常優(yōu)選采用順序的方法將兩種遺傳要素引入到宿主細(xì)胞中，該順序的方法包括以下步驟(i)用所述至少一種反式互補(bǔ)遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞；和(ii)用所述原生遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。這種實(shí)施方式在原生遺傳要素是完整的編碼天然的傳染性噬菌體的完整的噬菌體基因組時(shí)，優(yōu)點(diǎn)是很顯著的。在該方法的本實(shí)施例的第一步中，反式互補(bǔ)遺傳要素被引入到宿主細(xì)胞中，該反式互補(bǔ)遺傳要素通常選自由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)位子、原噬菌體、原噬菌體殘?bào)w、假噬菌體、附加體和噬粒組成的組。接下來(lái)，含有反式互補(bǔ)遺傳要素的宿主細(xì)胞被選擇、表征和擴(kuò)展。該方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是如此轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞可在低溫下保存很長(zhǎng)一段時(shí)間，并由含不同原生遺傳要素的噬菌體感染。盡管原生遺傳要素是由噬菌體隔離種群，特別是從自然分離出的噬菌體隔離種群構(gòu)成，它可僅編碼幾個(gè)功能性的噬菌體成分。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，原生遺傳要素編碼若干正常的噬菌體成分而得到嵌合噬菌體衍生的顆粒，其包含了若干正常的噬菌體成分。在此描述的方法是否得到嵌合噬菌體衍生的顆粒將取決于宿主細(xì)胞基因組的遺傳成分，除了確切的實(shí)驗(yàn)條件外，還有原生遺傳要素和反式互補(bǔ)遺傳要素。如果原生遺傳要素能夠在至少一個(gè)由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的附加因子存在下完成感染周期，則該方法將產(chǎn)生嵌合噬菌體。通常，原生遺傳要素會(huì)在期間進(jìn)行復(fù)制。如果引入的原生遺傳要素并不編碼由原生顆粒編碼的所有因子，而這些因子是組裝天然的原生顆粒所必須的，且能夠進(jìn)行完整的感染周期，則會(huì)導(dǎo)致嵌合噬菌體樣顆粒的產(chǎn)生。最后，嵌合噬菌體菌影的產(chǎn)生通常需要額外的處理步驟。該額外的處理步驟通常是采用兩種可能的操作中的一種的結(jié)果。第一中選擇可以是使用未將其基因組加以整合的母噬菌體。這種缺陷可以是有條件的，也可以是無(wú)條件的。如果是有條件的，則噬菌體將能夠在一種條件下(如溫度1)用殼體包裹它們的基因組，但在第二種條件下(如溫度2)不能用殼體包裹它們的基因組。如果它們不是條件突變體，則必須提供一反式的因子來(lái)復(fù)制突變的噬菌體。不管用什么方法，一旦經(jīng)復(fù)制，這些突變的噬菌體顆粒就可被用于感染已含有如上所述的反式互補(bǔ)遺傳要素的宿主細(xì)胞。一旦被感染，宿主細(xì)胞將合成缺乏DNA的標(biāo)記的菌影顆粒。第二種選擇是感染已含有如上所述的反式互補(bǔ)遺傳要素的宿主細(xì)胞，該反式互補(bǔ)遺傳要素表達(dá)第二遺傳構(gòu)建，以用于特異性地防止對(duì)噬菌體基因組的殼體包裹。這可通過(guò)若干方法加以實(shí)行，這些方法包括(但不限于)表達(dá)(i)天然噬菌體抵抗機(jī)制(包括但不限于無(wú)效性抵御機(jī)制；(ii)反義RNA特異性地對(duì)編碼一個(gè)或多個(gè)基因組殼體包裹因子的噬菌體轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)；(iii)噬菌體編碼的基因組殼體包裹因子的反式顯性負(fù)性突變體衍生物(例如蛋白)；或(iv)抑制基因組殼體包裹因子的表達(dá)或使它們編碼的蛋白去活的因子。不管用什么方法，一旦復(fù)制，這些突變的噬菌體顆粒即可被用于感染已含有如上所述的反式互補(bǔ)遺傳要素的宿主細(xì)胞。一旦被感染，宿主將合成缺乏DNA的標(biāo)記的菌影顆粒。一旦成熟的顆粒被組裝，宿主細(xì)胞將經(jīng)過(guò)合適的噬菌體編碼體系而裂解，將細(xì)胞內(nèi)成分(包括顆粒)釋放入生長(zhǎng)介質(zhì)中，或者在原生和互補(bǔ)遺傳要素不提供所有必要因子時(shí)，通過(guò)非噬菌體誘導(dǎo)的裂解，包括物理分裂過(guò)程(例如聲波降解法)和/或加入化學(xué)物質(zhì)(例如噬菌體溶素，溶解酵素等)而裂解。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，顆粒通過(guò)天然裂解過(guò)程而從宿主細(xì)胞中釋放。這就意味著轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)了組裝和釋放顆粒所需要的適合的機(jī)制，即它們表達(dá)了所有指導(dǎo)顆粒組裝和釋放所需要的噬菌體編碼的基因。對(duì)此，本發(fā)明的嵌合噬菌體樣顆粒和嵌合噬菌體菌影顆粒與VLPs的不同就在于對(duì)VLPs的普遍理解可定義為是自組裝、非復(fù)制、非致病的和去基因組的顆粒，其大小與完好的病毒粒子可比，但組成成分遠(yuǎn)少于病毒粒子。實(shí)際上，VLPs通常由幾個(gè)，典型的是僅有單個(gè)噬菌體或病毒衣殼蛋白(衣殼粒)構(gòu)成，其融合進(jìn)感興趣的抗原/抗原表位中。該VLPs的融合蛋白通常由宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒表達(dá)，而不含有噬菌體基因組的絕大部分，其中，基因由所述基因組分離。因此，VLPs是一種改造的且由質(zhì)粒帶動(dòng)的技術(shù)。盡管VLPs和噬菌體菌影具有某些重要的共同特點(diǎn)(例如，都不含遺傳材料)，但根據(jù)定義，它們?cè)诠δ苌虾蜕飳W(xué)上截然不同，且在制備方式上也不同。據(jù)本發(fā)明者所知，所有的VLPs一般均從人類發(fā)明的的細(xì)胞工廠中釋放(例如，通過(guò)將宿主細(xì)胞進(jìn)行聲波降解、弗氏壓濾、化學(xué)溶解或類似的過(guò)程)。一旦噬菌體顆粒被釋放，將進(jìn)行發(fā)酵以除去外源核酸—包括重組融合基因。額外的處理步驟有時(shí)為必要的，有時(shí)為非必要的。這樣的處理可包括(i)顆粒純化和/或(ii)顆?；罨?。如果表面展示因子是作為一個(gè)或多個(gè)生物活性因子(例如抗體、蛋白、小分子等)的載體，則顆?；罨梢允潜匾?。這時(shí)，生物活性因子可直接加入到經(jīng)發(fā)酵或純化的顆粒中，使得它們結(jié)合到展示在嵌合顆粒表面的載體蛋白上。在大多數(shù)情況下，原生遺傳要素和反式互補(bǔ)遺傳要素是通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，例如轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化等描述于Ausubel等(ed.)″CurrentProtocolsinMolecularBiology″JohnWileyandSons，1995(并入作為參考)中的方法而引入到宿主細(xì)胞中的。然而，在某些情況下，顆粒產(chǎn)生的宿主細(xì)胞也可以是通過(guò)細(xì)胞融合而形成，其中一種情形是當(dāng)發(fā)現(xiàn)將兩個(gè)噬菌體基因組結(jié)合到一個(gè)細(xì)胞中是重要時(shí)，此時(shí)，每個(gè)噬菌體基因組均賦予感染的細(xì)胞對(duì)抗另一個(gè)噬菌體基因組的重復(fù)感染的抵抗力。盡管不被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，但Ausubel(1995)仍對(duì)細(xì)胞融合的方法給出了詳細(xì)的信息。為了確保在組裝和/或釋放顆粒中，由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的成分被引導(dǎo)至所述顆粒的表面，本發(fā)明是采取了將編碼期望的多肽的基因(基因1)融合到第二基因(基因2)中，使得在反式互補(bǔ)遺傳要素進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生融合蛋白。基因1通常是噬菌體編碼的基因，其優(yōu)選為來(lái)自感染一種或多種乳酸菌的噬菌體的衣殼蛋白，或其部分?；?(“不相關(guān)的肽序列”)通常編碼抗原、過(guò)敏原、毒力蛋白受體、配體等或其部分?；?和2的融合可通過(guò)將基因2插入到含有基因1的質(zhì)粒上的特別的位點(diǎn)而得以實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)將基因1插入到含有基因2的質(zhì)粒上的特別的位點(diǎn)而得以實(shí)現(xiàn)，所采用的方法是描述于上述Ausubel，1995supra和Sambrook，1989supra中的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)。另外，也可采用Horton，1995描述的所謂的重疊延伸基因剪接(SOEing)技術(shù)，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將基因2融合到基因1中。在本發(fā)明的大多數(shù)實(shí)施方式中，在組裝和/或釋放顆粒中，被引導(dǎo)至所述顆粒的表面的成分是一融合蛋白，其是在編碼指導(dǎo)融合蛋白到所述嵌合噬菌體衍生的顆粒表面的序列和不相關(guān)的肽或蛋白編碼序列之間的翻譯融合。在本發(fā)明一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述融合蛋白的不相關(guān)的肽序列編碼能引起人和/或動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答的抗原和/或過(guò)敏原。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，不相關(guān)的肽序列選自由含在對(duì)植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌致病的肽或蛋白序列組成的肽或蛋白序列的組。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，融合蛋白的不相關(guān)的肽或蛋白序列是選自一組肽。它們與植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌的相互作用可能會(huì)被認(rèn)為是沒(méi)有益處但不致病的，包括部分毒力因子的肽和允許至少一個(gè)分子的特異性結(jié)合的肽。如上所述，本發(fā)明的目的是提供安全的嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物，該組合物可對(duì)人和/或動(dòng)物施用(例如，通過(guò)攝食、注射或點(diǎn)滴法)，而不必?fù)p及展示各種因子的顆粒的效率。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)選擇對(duì)細(xì)菌宿主細(xì)胞特異的噬菌體，獲得了額外的安全性。其中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是選自由其使用已通過(guò)美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心和/或類似機(jī)構(gòu)評(píng)價(jià)，并認(rèn)可作為屬于GRAS狀態(tài)而批準(zhǔn)用于食品或飼料的食品添加劑或直接飼喂微生物制品的細(xì)菌宿主細(xì)胞組成的組。在本發(fā)明一具體的實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主細(xì)胞被認(rèn)為在用于奶制食物產(chǎn)品上是GRAS的，但其他的GRAS類別也被考慮到本發(fā)明中。歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)已在協(xié)作編寫具有在食物中使用具有安全歷史記錄的微生物目錄。該完整目錄記載于G.Mo-gensen等(2002)的“InventoryofMicroorganismwithadocumentedhistoryofuseinfood”。BulletinoftheInternationalDairyFederation，No.377page10-19(在此并入作為參考)。因此，在本發(fā)明一重要的實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是選自由細(xì)菌組成的組，其中，細(xì)菌是根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)的，具有用于食物和飼料(包括在直接飼喂微生物制品中的使用)而無(wú)副作用的記錄歷史的微生物。特別是選自具有良好的食物和飼料安全使用的歷史記錄的一組乳酸菌。通常，乳酸菌可被描述為革蘭陽(yáng)性、觸酶陰性兼性厭氧菌或微需氧菌，其對(duì)糖發(fā)酵，產(chǎn)生包括以乳酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物在內(nèi)的酸。工業(yè)上用得最多的乳酸菌包括非致病的乳球菌屬(Lactococcusspp.)、鏈球菌屬(Streptococcusspp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)、明串珠菌屬(Leuconostocspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)和丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.)。此外，屬于嚴(yán)格厭氧菌的組的產(chǎn)乳酸菌的細(xì)菌也通常包含在乳酸細(xì)菌的組中，包括雙歧桿菌(bifidobacteria)，即雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)，這些細(xì)菌常被單獨(dú)用作食物起子培養(yǎng)物或添加劑，或與乳酸細(xì)菌組合使用。因此，本發(fā)明的另一重要的實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主細(xì)胞選自一組非致病的細(xì)菌屬，其通常由非致病的雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)、乳球菌(Lactococcusspp.)、明串珠菌屬(Leuconostocspp.)、酒球菌屬(Oenococcusspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)和鏈球菌屬(Streptococcusspp.)組成。在丹麥，所有的食物培養(yǎng)物必須告知丹麥獸用和食物管理局，并且在用于食物工業(yè)之前，它們的應(yīng)用需被管理局接受。表1列出了批準(zhǔn)的食物培養(yǎng)物已被歸類的細(xì)菌的種和亞種。對(duì)這些細(xì)菌的接受意味著它們被認(rèn)為是安全的，因此，對(duì)這些安全的“食品級(jí)”的細(xì)菌特異的，即感染這些細(xì)菌的噬菌體也通常被認(rèn)為是安全的。因此，在本發(fā)明的一重要實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是選自由以下細(xì)菌組成的組球形節(jié)桿菌、青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙岐桿菌(原為兩歧雙歧桿菌，Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、干酪短桿菌、亞麻類短桿菌、黃色棒狀桿菌、產(chǎn)氣腸球菌、屎腸球菌、蜂房哈夫尼菌、變異庫(kù)克菌、德氏乳桿菌乳酸亞種、嗜酸乳酸菌、營(yíng)養(yǎng)乳桿菌、短營(yíng)養(yǎng)乳桿菌林氏變種、巴伐利亞乳桿菌、短乳桿菌、短乳桿菌林氏變種、保加利亞乳桿菌、肉食乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、干酪乳桿菌鼠李糖變種、乳脂乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、德氏乳桿菌乳酸亞種、farciminis乳桿菌、瑞士乳桿菌、詹氏乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸乳桿菌乳酸亞種、乳酸乳桿菌乳酸生物變種雙乙酰乳酸亞種、賴氏乳桿菌、副干酪乳桿菌(原為干酪乳桿菌)、副干酪副干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌副干酪亞種、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、清酒乳桿菌(早期為營(yíng)養(yǎng)乳桿菌)、舊金山乳桿菌、木糖乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種、乳酸乳球菌(原為鏈球菌)乳脂亞種、嗜酸乳球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌雙乙酰乳酸種(原為雙乙酰乳酸鏈球菌)、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳酸雙乙酰乳酸亞種、肉質(zhì)明串珠菌、嗜橙明串珠菌、葡萄糖明串球菌、腸膜明串珠菌乳脂亞種、假腸膜明串珠菌、變異微球菌、酒類酒球菌(原為酒明串珠菌Leuconostocoenos)、乳酸片球菌、戊糖片球菌、丙酸丙酸桿菌、阿拉伯糖丙酸桿菌、費(fèi)氏丙酸桿菌精子亞種、費(fèi)氏丙酸桿菌、薛氏丙酸桿菌、infirmominiatum紅冬孢酵母、肉糖葡萄球菌、木糖葡萄球菌、唾液鏈球菌嗜熱亞種、乳脂鏈球菌、雙乙酰乳酸鏈球菌、耐久鏈球菌、糞鏈球菌、乳酸鏈球菌、和嗜熱鏈球菌(原為唾液鏈球菌嗜熱亞種)。由表1和上述討論可知，選自由節(jié)桿菌屬(Arthrobacterspp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、哈夫尼菌屬(Hafniaspp.)、克氏庫(kù)克菌屬(Kocuriaspp.)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、乳球菌屬(Lactococcusspp.)、明串球菌屬(Leuconostocspp.)、微球菌屬(Micrococcusspp.)、酒球菌屬(Oenococcusspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidiumspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)和鏈球菌屬(Streptococcusspp.)組成的細(xì)菌屬中的非致病的微生物非常有可能獲得政府部門的許可，從而構(gòu)成本發(fā)明另一重要實(shí)施方式。一些其他的非致病性微生物，包括芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)，特別是凝結(jié)芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)，遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)也被美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心和/或類似機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，被認(rèn)為是可安全地用于動(dòng)物飼料中的直接飼喂微生物產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步重要的實(shí)施方式是細(xì)菌宿主細(xì)胞選自由非致病的凝結(jié)芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組成的非致病性細(xì)菌的組。為了使GMO能用于食物，必須符合一系列的安全條件且必須能夠在美國(guó)得到GRAS的狀態(tài)。盡管沒(méi)有對(duì)“食品級(jí)”GMO構(gòu)成的官方定義，但已有工作定義被詳細(xì)闡述(Johansen，(1999)Geneticengineering(b)Modificationofbacteria.InEncyclopediaofFoodMicrobiology(Robinson，R.，Batt，C.andPatel，P.，eds).AcademicPress，London，pp.917-921)，以及至少一種符合該定義的乳球菌菌株已被確認(rèn)為GRAS且在美國(guó)已上市。該定義的一個(gè)重要元素是食品級(jí)GMO只可含有來(lái)自相同物種的DNA。在更為廣泛的食品級(jí)的定義中，來(lái)自其他GRAS食品微生物的基因被認(rèn)為是可接受的(Johansen，1999)。在任何一種情況下，都不允許使用抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記。在大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)內(nèi)構(gòu)建出的許多菌株均是為了“概念證明”之目的，因而它們通常不需要是食品級(jí)的。因此，抗生素抗性標(biāo)記由于操作上容易而被使用。如果這些菌株被用于工業(yè)，則有必要消除所有不適當(dāng)?shù)腄NA，或重新構(gòu)建更適合的菌株。盡管這樣的病毒如本發(fā)明的顆粒不含有任何基因操縱的遺傳材料，只含有其自生種類的遺傳材料，從而很難被歸類于GMO，但實(shí)際上關(guān)于GMOs的安全性的討論繼續(xù)存在，以及隨之而產(chǎn)生的本發(fā)明一有意思的關(guān)于制造嵌合顆粒的方法的實(shí)施方式中，在加入所述兩種或多種遺傳要素前，細(xì)菌宿主細(xì)胞可被認(rèn)為是滿足Johansen(1999)定義的食品級(jí)的微生物或食品級(jí)的GMO。使用這些安全的微生物保證了在嵌合噬菌體衍生的顆粒的最終制劑中不含有毒因子(例如超抗原、內(nèi)毒素、脂多糖等)，(由于它們與這些安全的微生物沒(méi)有關(guān)系)，而這些有毒因子可能是其他潛在的非安全微生物(如大腸桿菌)所固有的。這點(diǎn)不同代表了本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的重要的改進(jìn)，在現(xiàn)有技術(shù)中，通常描述了使用潛在的非安全的微生物來(lái)制造類似產(chǎn)品，例如病毒樣顆粒。通常，天然噬菌體的基因組編碼一或多個(gè)成分，這些成分獨(dú)自或與其他噬菌體或細(xì)菌編碼的因子協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)菌宿主細(xì)胞的溶解。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，借助于噬菌體基因組編碼的一個(gè)或多個(gè)成分(“噬菌體編碼的溶解成分”)的作用，顆粒從所述細(xì)菌宿主細(xì)胞中釋放。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，噬菌體編碼的溶解成分由原生遺傳要素編碼，但也構(gòu)想出其他的實(shí)施方式，其中至少一個(gè)噬菌體編碼的融胞成分是由不同的遺傳要素編碼。一種這樣的情形是在至少一個(gè)噬菌體編碼的溶解成分是由與原生遺傳要素不同的噬菌體基因組或原噬菌體基因組編碼，或甚至是由一個(gè)或多個(gè)反式互補(bǔ)遺傳要素編碼時(shí)出現(xiàn)。盡管許多不同的因子已經(jīng)與噬菌體誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解建立了聯(lián)系，本發(fā)明的一個(gè)重要的實(shí)施方式是一種生產(chǎn)方法，在該方法中，噬菌體基因組編碼的一種或多種成分包含穴蛋白和/或細(xì)胞內(nèi)溶素和/或溶解酵素。對(duì)生產(chǎn)含有嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物的方法的優(yōu)選應(yīng)用是提供含本發(fā)明的嵌合顆粒的組合物供人或動(dòng)物攝取。這樣的組合物的一個(gè)例子是含有顆粒的發(fā)酵的乳制品的組合物，例如酸奶。在這類發(fā)酵食品的情況下，在一定條件下導(dǎo)致形成嵌合顆粒的細(xì)菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物與進(jìn)行奶制品發(fā)酵的細(xì)菌培養(yǎng)物可以是同一培養(yǎng)物。由于細(xì)菌/病毒系統(tǒng)可被認(rèn)為是“安全的食品級(jí)”有機(jī)體，因此對(duì)于人類攝取也是安全的，所以這樣的含有顆粒的酸奶可上市，且可聲稱具有與嵌合顆粒的附加表面展示因子有關(guān)的額外的好處。盡管不需要進(jìn)一步從可直接上市的為獲得發(fā)酵的組合物的細(xì)菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化或分離嵌合顆粒，在某些應(yīng)用中，對(duì)于嵌合顆粒的其他應(yīng)用，可能會(huì)需要純化或分離步驟。這類應(yīng)用的一個(gè)例子是應(yīng)用嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如嵌合噬菌體、嵌合噬菌體樣或嵌合噬菌體菌影顆粒)來(lái)產(chǎn)生疫苗，該應(yīng)用要求嵌合顆粒從細(xì)菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中至少有一定程度的分離或純化。因此，本發(fā)明也提供一種獲得含有至少兩種不同表面展示蛋白的噬菌體衍生的顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)獲得組合物，從該組合物中可按上述分離出所述嵌合噬菌體衍生的顆粒，和(ii)從組合物中分離出嵌合噬菌體衍生的顆粒。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”指嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物幾乎不含多余的成分，這些成分通常是伴隨著天然狀態(tài)的顆粒(即產(chǎn)生顆粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中的非嵌合顆粒的成分，例如，細(xì)菌、細(xì)菌碎片和生長(zhǎng)介質(zhì)成分)。特別的，這意味著至少50％的多余成分從組合物中被除去，更優(yōu)選的是至少75％的被除去，最優(yōu)選的是至少99％的多余成分從組合物中被除去。已有技術(shù)描述了許多可用于分離噬菌體顆粒的方法。由于本發(fā)明的顆粒在許多方面看似嵌合噬菌體樣顆粒，這些方法中的很多都能用于從組合物中分離的嵌合噬菌體衍生的顆粒?？梢灶A(yù)期，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的用于噬菌體純化的方法，例如離心(包括CsCl密度離心)、聚乙二醇(PEG)沉淀和親和色譜來(lái)分離或純化顆粒。這些和其他適合的分離方法的詳細(xì)描述可在Ausubel等(ed.)″CurrentProtocolsinMolecularBiology″.JohnWileyandSons，1995；和Sambrook，J.等，MolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY，Vol.1，2，3，1989中找到。這兩本書均在此并入作為參考。嵌合顆粒還可以使用基于所述顆粒的固有物理性質(zhì)的分離方法加以純化，例如(但不限于)微米和納米過(guò)濾、分子大小排除和等電點(diǎn)聚焦。如在此描述的，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如嵌合噬菌體、嵌合噬菌體樣或嵌合噬菌體菌影顆粒)的方法，該嵌合噬菌體衍生的顆粒除了至少一正常的噬菌體成分外，還展示或包含了至少一附加成分，其中，該至少一正常噬菌體成分由包含絕大部分的噬菌體基因組(原生遺傳要素)的遺傳要素編碼，該至少一附加成分由不同的遺傳要素(反式互補(bǔ)遺傳要素)編碼。本發(fā)明的顆粒的一個(gè)重要的特點(diǎn)是它們不含有編碼至少部分附加成分的序列。盡管反式互補(bǔ)遺傳要素只編碼一個(gè)或多個(gè)嵌合顆粒的成分，原生遺傳要素通常含有絕大部分的噬菌體基因組編碼大量的噬菌體蛋白。如圖1所示，三種噬菌體顆粒通常含有除至少一附加成分外的若干正常噬菌體成分。在大多數(shù)情形下，這樣的顆粒具有與天然的噬菌體隔離種群相似的大小和外觀，從該天然的噬菌體隔離種群得到原生遺傳要素。在本文中，得到原生遺傳要素的天然的噬菌體隔離種群被成為“原生顆?！?。本發(fā)明的嵌合顆粒可只含有噬菌體成分，例如，它們可主要由原生遺傳要素編碼的正常的噬菌體成分和一個(gè)或幾個(gè)從反式互補(bǔ)遺傳要素表達(dá)的源自完全無(wú)關(guān)的病毒的噬菌體成分構(gòu)成。這種情況是在當(dāng)本發(fā)明被用于產(chǎn)生表達(dá)噬菌體編碼的毒力因子的嵌合顆粒時(shí)出現(xiàn)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，顆粒除了若干正常噬菌體成分外，還展示出至少一個(gè)附加成分，該附加成分不一定是正常噬菌體成分。本發(fā)明描述的病毒/宿主細(xì)胞體系可主要包含較寬范圍內(nèi)的任意成分，其與所形成的顆粒發(fā)生聯(lián)系或結(jié)合到其上，從而是位于反式互補(bǔ)遺傳要素上的基因不能整合進(jìn)嵌合顆粒。然而，在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的至少一種附加成分是蛋白。在一特別的實(shí)施方式中，由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的至少一種附加成分是融合蛋白，該融合蛋白是在引導(dǎo)融合蛋白到所述嵌合噬菌體衍生的顆粒表面的肽序列和不相關(guān)的肽序列之間的融合。許多已描述過(guò)的蛋白在噬菌體組裝和釋放過(guò)程中被引導(dǎo)到噬菌體的表面。這種蛋白中的一類是噬菌體衣殼蛋白，是一種形成噬菌體殼或衣殼的蛋白。當(dāng)包含“功能部分”的肽融合到另一感興趣的肽時(shí)，融合的肽將會(huì)被引導(dǎo)到衣殼上，所述“功能部分”在此定義為引導(dǎo)蛋白到衣殼上的噬菌體衣殼蛋白的部分。結(jié)果是感興趣的肽，例如感興趣的抗原或抗原表位被引導(dǎo)到噬菌體殼上，并展示在嵌合顆粒的殼的表面。從而，在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，融合蛋白包含一肽序列，該肽序列含有噬菌體衣殼蛋白的功能部分。除了構(gòu)成所有噬菌體所必須部分的衣殼蛋白之外，噬菌體可含有其他表面結(jié)構(gòu)。與衣殼蛋白類似，構(gòu)成這些其他結(jié)構(gòu)的蛋白含有信號(hào)(肽序列)，該信號(hào)引導(dǎo)蛋白到噬菌體的表面。這種表面展示噬菌體蛋白的例子是那些形成噬菌體頸部、噬菌體頸須、噬菌體尾部、噬菌體基片和/或噬菌體尾絲的蛋白。另外，也預(yù)測(cè)出了使用這些蛋白來(lái)引導(dǎo)融合蛋白到噬菌體表面。如前所討論的，本發(fā)明的重點(diǎn)是提供嵌合顆粒，其主要是基于通常被公認(rèn)安全的病毒/宿主細(xì)胞體系。一組被通常認(rèn)為是安全的有機(jī)體的細(xì)菌是乳酸菌。一些工業(yè)上最為有用的乳酸菌是在乳球菌種中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。在真正的工業(yè)裝置中，盡管非常小心避免噬菌體感染，但噬菌體感染仍在無(wú)規(guī)律的時(shí)隔發(fā)生。因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選含有乳球菌種以及與其相關(guān)的噬菌體的病毒/宿主細(xì)胞體系。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選類似乳球菌型噬菌體c6A的噬菌體。這種噬菌體的一個(gè)具體例子是噬菌體c2。這組噬菌體是非常復(fù)雜的噬菌體，且許多噬菌體蛋白可被用于構(gòu)建融合蛋白，其將被引導(dǎo)到噬菌體的表面。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包含一肽序列，其包含噬菌體衣殼蛋白的功能部分，所述噬菌體衣殼蛋白選自由gpL1，gpL2，gpL3，gpL4，gpL5，gpL6，gpL7，gpL8，gpL9，gpL10，gpL11，gpL12，gpL13，gpL14，gpL15，gpL16和gpL17組成的噬菌體蛋白的組，這些噬菌體蛋白衍生自與乳球菌型噬菌體c6A類似或相同的噬菌體，如噬菌體c2。盡管噬菌體基因組可通過(guò)許多方法進(jìn)入到細(xì)胞中，但通常最有效的將基因組引入到宿主細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中的方法是通過(guò)感染。因此，在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及感染性的嵌合噬菌體或嵌合噬菌體樣顆粒。由于本發(fā)明的嵌合噬菌體菌影顆粒不含有遺傳材料，從而不能將它們的基因組引入到宿主細(xì)胞中，所以它們不被認(rèn)為是感染性的。但它們通?？杀磉_(dá)與原生顆粒類似的“宿主細(xì)胞特異性”，從而可黏附到特定細(xì)菌上，產(chǎn)生若干具有早期噬菌體感染特征的舉動(dòng)。因此，本發(fā)明的一實(shí)施方式是嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如，嵌合噬菌體、嵌合噬菌體樣或嵌合噬菌體菌影顆粒)，對(duì)于感染性的嵌合噬菌體或嵌合噬菌體樣顆粒而言是具有感染性的，或?qū)τ谇逗鲜删w菌影顆粒而言，能夠黏附到特定細(xì)菌上，產(chǎn)生若干具有早期噬菌體感染特征的舉動(dòng)，且展現(xiàn)出由原生遺傳要素決定的宿主特異性。在本發(fā)明的大多實(shí)施方式中，嵌合噬菌體衍生的顆粒保持了與天然噬菌體隔離種群相同的宿主特異性，而原生遺傳要素即衍生自該天然噬菌體隔離種群(即“原生顆?！?。盡管存在宿主細(xì)胞特異性，從而在大多數(shù)裝置中被確定為原生遺傳要素，反式互補(bǔ)遺傳要素也被認(rèn)為可編碼確定宿主細(xì)胞范圍或宿主特異性的成分。因此，還構(gòu)思出了一嵌合噬菌體衍生的顆粒，其中，宿主特異性相對(duì)于天然噬菌體隔離種群發(fā)生了改變。類似的，原生遺傳要素、反式互補(bǔ)遺傳要素或甚至這兩種類型的要素均可編碼一些因子或包含基因的變異，從而導(dǎo)致嵌合噬菌體衍生的顆粒，其展示出與天然噬菌體隔離種群相比的增加的或減少的或甚至消失的感染細(xì)菌的能力，其中，原生遺傳要素即衍生自該天然噬菌體隔離種群。根據(jù)這里定義的不具有感染性的顆粒的例子是嵌合噬菌體樣或嵌合噬菌體菌影顆粒，這是由于這些嵌合顆粒不含有任何遺傳材料。如前所述，反式互補(bǔ)遺傳要素編碼在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式中的融合蛋白。通常，由于具有部分噬菌體衣殼蛋白，而衣殼蛋白包含定位信號(hào)以確保因子展示在顆粒表面，所以這種融合蛋白被引導(dǎo)到表面上。然而，由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的因子也可通過(guò)其他機(jī)制而被引導(dǎo)到噬菌體的表面上。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，融合蛋白能夠與病毒編碼的成分發(fā)生締合，且由于這種締合，融合蛋白將在嵌合噬菌體的組裝和從宿主細(xì)胞釋放的過(guò)程中被引導(dǎo)到嵌合噬菌體的表面上。在另一實(shí)施方式中，融合蛋白含有肽序列，其能與除了包含顆粒定位信號(hào)的部分噬菌體衣殼蛋白之外的病毒編碼的成分發(fā)生締合。由融合蛋白締合的病毒編碼的成分可以是任意的病毒編碼的成分，包括與原生顆粒不同的病毒的成分以及存在于天然噬菌體隔離種群中的病毒編碼的蛋白，其中，所述噬菌體基因組的絕大部分(原生顆粒)即衍生自該天然噬菌體隔離種群。類似的，融合蛋白預(yù)期被構(gòu)建成能夠在細(xì)菌宿主溶胞之前和在嵌合顆粒從宿主細(xì)胞中釋放出之后，與所述原生顆粒隔離種群的病毒編碼的一種或多種蛋白締合。融合蛋白還可進(jìn)一步為所謂的“結(jié)合伴侶”的一部分。“結(jié)合伴侶”通常是通過(guò)非共價(jià)作用而能特異性地結(jié)合到另外一部分上的物質(zhì)。結(jié)合伴侶的例子包括配體—受體、抗生蛋白鏈菌素—生物素、多聚組氨酸—鎳螯合物、抗體—抗原、藥物—靶和酶—底物相互作用。結(jié)合伴侶在治療和診斷領(lǐng)域都極為有用。為了避免融合蛋白必須與野生型噬菌體編碼的衣殼蛋白競(jìng)爭(zhēng)嵌合噬菌體中的“開(kāi)放”的或自由位點(diǎn)的情形，可使用在編碼特定衣殼蛋白作為原生遺傳要素的基因中攜帶“破壞”突變的噬菌體基因組。這樣的破壞突變的例子有錯(cuò)義突變和缺失。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是基于相對(duì)復(fù)雜的噬菌體類型，其含有更多的衣殼蛋白。除此之外，在一些實(shí)施方式中，還含有如噬菌體頸部、噬菌體頸須、噬菌體尾部、噬菌體基片和/或噬菌體尾絲這些結(jié)構(gòu)的蛋白。大體上對(duì)可由一個(gè)或多個(gè)反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的融合蛋白的數(shù)目沒(méi)有嚴(yán)格的限制。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及的顆粒除了含有至少一個(gè)正常的噬菌體成分外，還含有至少兩個(gè)不是由原生遺傳要素編碼的附加成分。融合蛋白的不相關(guān)的肽序列對(duì)應(yīng)于融合蛋白的附加成分(即在大多數(shù)實(shí)施方式中為非病毒部分)，并大體上可為任何序列。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，不相關(guān)的肽序列源自植物、人、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌或病毒的基因組，或者也可以是合成的或任意產(chǎn)生的氨基酸序列。特別的，序列可源自植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌的病原體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，不相關(guān)的肽序列是源自那些與植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌的相互作用可能是致病的微生物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，不相關(guān)的肽序列是源自由特定序列的氨基酸或其部分組成的毒力因子。術(shù)語(yǔ)“部分”對(duì)應(yīng)于允許對(duì)抗所述毒力因子的特定抗體產(chǎn)生的最小長(zhǎng)度的氨基酸序列。通常，肽的這部分構(gòu)成了被稱為抗原決定簇的部分?！翱乖砦弧敝付嚯牡目乖瓫Q定簇?？乖砦豢芍缓凶钌?個(gè)氨基酸，其在空間構(gòu)象上對(duì)抗原表位是獨(dú)特的。通常，抗原表位至少由6個(gè)這樣的氨基酸組成，更常見(jiàn)的是至少由8-10個(gè)這樣的氨基酸組成。盡管不致病，但由其中分離出不相關(guān)的肽序列的微生物仍可被認(rèn)為是無(wú)益的。這種無(wú)益的微生物的例子是那些降低飼養(yǎng)效率，例如是減少由飼料中吸收的營(yíng)養(yǎng)但不導(dǎo)致任何疾病的微生物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述融合蛋白的不相關(guān)的肽序列是源自那些與植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌相互作用并可被認(rèn)為是無(wú)益的但不致病的微生物。本發(fā)明的一項(xiàng)有意思的應(yīng)用是將技術(shù)應(yīng)用于在噬菌體療法中延長(zhǎng)噬菌體顆粒在胃腸道中的保留時(shí)間。例如，黏液素—結(jié)合蛋白可表達(dá)在噬菌體的殼上。該蛋白會(huì)將噬菌體錨定在腸內(nèi)，且允許噬菌體特異性地感染(通過(guò)其自由尾部)它的致病靶微生物。另外，噬菌體也可用蛋白進(jìn)行殼標(biāo)記，這種蛋白有助于噬菌體結(jié)合到益生細(xì)菌菌株上。這樣，嵌合顆粒和益生細(xì)菌就能夠容易地被一并施用，且得到益生細(xì)菌在腸內(nèi)延長(zhǎng)的保留時(shí)間。因此，在本發(fā)明一重要的實(shí)施方式中，所述融合蛋白的不相關(guān)的肽序列編碼那些有助于和/或容許嵌合噬菌體衍生的顆粒結(jié)合到在固體表面、生物膜、人或動(dòng)物細(xì)胞或其他微生物中發(fā)現(xiàn)的受體上的蛋白或肽。融合蛋白的不相關(guān)的肽序列也可含有那些有助于和/或容許嵌合噬菌體顆粒、噬菌體樣顆粒、或噬菌體菌影顆粒有條件地結(jié)合到基質(zhì)(例如鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)金屬親和色譜基質(zhì))上的蛋白或肽(例如多聚組氨酸)。這樣的肽序列可被用于純化所述嵌合噬菌體衍生的顆粒。它們還可被用作標(biāo)簽(或抗原表位)以用于免疫接種。在本發(fā)明的最優(yōu)秀的實(shí)施方式中，融合蛋白的不相關(guān)的肽序列編碼能夠引起人和/或動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答的抗原和/或過(guò)敏原。再有，融合蛋白也可是結(jié)合伴侶對(duì)的部分。現(xiàn)有技術(shù)中的若干例子顯示出結(jié)合伴侶在治療和診斷領(lǐng)域都極為有用，因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，不相關(guān)的肽序列包含允許至少一個(gè)分子的特異性結(jié)合，特別的，在融合蛋白起到細(xì)胞外受體的功能時(shí)可作為一種預(yù)期情況?？梢韵氲降挠锌赡芙Y(jié)合到這樣的融合蛋白上的分子有很多。特別的，相關(guān)的分子是具有如蛋白、脂蛋白、糖蛋白、糖類或脂質(zhì)這樣的生物起源的分子，但也包括如各種金屬(例如Cd，Ni，F(xiàn)e)和有著非生物起源(例如某些殺蟲劑或它們的降解產(chǎn)品)的某些有機(jī)分子也是相關(guān)的。在一些情況下，毒素對(duì)各種顆?；虼蟮姆肿咏Y(jié)構(gòu)的實(shí)際結(jié)合將導(dǎo)致毒素的失活或中和。也可通過(guò)加入毒素結(jié)合顆粒到溶液或懸浮液中，使得毒素結(jié)合到顆粒上并通過(guò)離心等而從溶液或懸浮液中移除顆粒，從而可從溶液或懸浮液中將毒素取代。因此，本發(fā)明的一個(gè)附加實(shí)施方式是使用嵌合顆粒結(jié)合和/或中和生物毒素。如前所述，提供嵌合顆粒給兩種或多種不同展示它們的融合蛋白完全在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。預(yù)計(jì)該展示兩種或多種特異性結(jié)合親和性的嵌合顆粒，在此稱為“附加標(biāo)簽”將會(huì)有廣泛的應(yīng)用。這種有用的附加標(biāo)簽的例子是在前描述過(guò)的結(jié)合伴侶。當(dāng)一種附加標(biāo)簽是結(jié)合伴侶的成員，例如，多聚組氨酸，而其他的標(biāo)簽特異性地結(jié)合到毒素上時(shí)，則這樣的顆?？煞奖愕赝ㄟ^(guò)親和色譜移除，從而將毒素移除，此時(shí)這樣的顆粒將對(duì)于從溶液或懸浮液中移除毒素有用。類似的，附加標(biāo)簽可被用于嵌合顆粒的純化或分離。因此，本發(fā)明的另一個(gè)有意思的實(shí)施方式是一組合物，其含有嵌合噬菌體衍生的顆粒，該顆粒展示了有助于它們結(jié)合和/或下游純化的附加標(biāo)簽。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)藥物組合物的方法，該方法包括本發(fā)明的方法中的步驟，且進(jìn)一步包括將至少一所述嵌合顆粒配成藥學(xué)上可接受的形式。如果本發(fā)明的嵌合噬菌體顆粒給動(dòng)物施用，它們將作為疫苗起到向免疫系統(tǒng)傳遞特異性抗原的作用。此外，它們還可被特異性地標(biāo)記，以T-或B-淋巴細(xì)胞為靶傳遞抗原物質(zhì)。與減毒活疫苗或傳統(tǒng)的去活疫苗不同的是，不會(huì)有毒力基因水平傳播到宿主的常駐菌群的可能。進(jìn)而，標(biāo)記的噬菌體也不可能轉(zhuǎn)換為致病的變種，而這樣的轉(zhuǎn)變可能發(fā)生在減活的或活的疫苗中。因此，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，嵌合噬菌體衍生的顆粒被用于產(chǎn)生疫苗。特別的，在對(duì)可施用于人和/或動(dòng)物的黏膜表面的病毒，包括結(jié)膜、胃腸道、呼吸道和尿道的病毒考慮后認(rèn)為特別優(yōu)選的是基于乳酸乳球菌的疫苗。在某些情況下，發(fā)現(xiàn)含有抗原的組合物可被用于治療過(guò)敏。因此，本發(fā)明的另一個(gè)重要的實(shí)施方式是使用包含嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物治療過(guò)敏。多重標(biāo)記的顆?？杀挥糜诎邢蚝蜌⑺腊┘?xì)胞或病原體細(xì)胞。例如，一種標(biāo)記可特異地針對(duì)癌性細(xì)胞或病原體，而第二種標(biāo)記可編碼毒素。有可能在這種顆粒結(jié)合到癌細(xì)胞之前由宿主中釋放細(xì)胞毒素。因此，這些顆粒可作為靶向殺傷的平臺(tái)。另外，認(rèn)為嵌合顆粒可由蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并使之能夠特異性地結(jié)合到殼上或覆蓋在病原體上。如果要求病原體在它的宿主內(nèi)結(jié)合到特定的受體，以發(fā)揮病原體的功效(例如在腸內(nèi))，則其后病原體可被有效地中和。這特別對(duì)于功能性食物是一項(xiàng)值得關(guān)注的應(yīng)用。因此，在本發(fā)明另一最優(yōu)選的實(shí)施方式中，嵌合噬菌體衍生的顆粒被用于生產(chǎn)組合物，該組合物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)而排除病原體或不期望的微生物。本發(fā)明的顆粒被認(rèn)為對(duì)生產(chǎn)組合物是特別有效的，該組合物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)而排除病原體或不期望的與人和/或動(dòng)物的黏膜表面包括結(jié)膜、胃腸道、呼吸道和尿道相關(guān)的微生物。進(jìn)一步認(rèn)為這些顆粒將找到更為廣闊的應(yīng)用，甚至能用于生產(chǎn)可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)而排除病原體或不期望的微生物的組合物，這些組合物與農(nóng)用植物和/或種子相關(guān)。益生菌構(gòu)成了一類被定義為對(duì)動(dòng)物或人類宿主產(chǎn)生有益效果的活微生物有機(jī)體的微生物。有益效果包括改善腸內(nèi)微生物群的微生物平衡以及改善常駐的微生物群的性能。益生菌的有益效果可通過(guò)對(duì)一組不期望的特定有機(jī)體產(chǎn)生直接的拮抗效應(yīng)而體現(xiàn)，通過(guò)對(duì)這組有機(jī)體的代謝的影響或通過(guò)對(duì)動(dòng)物或人宿主免疫系統(tǒng)的一般刺激作用而導(dǎo)致它們的數(shù)量減少。益生菌可通過(guò)產(chǎn)生抗細(xì)菌的化合物和/或通過(guò)成功競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和/或黏附在胃腸道的位點(diǎn)上而抑制不期望的腸內(nèi)有機(jī)體。此外，它們還可通過(guò)增加或減少酶活性而改變微生物代謝，或可通過(guò)增加抗體水平或增加巨噬細(xì)胞活性而刺激免疫系統(tǒng)。益生菌還甚至可表達(dá)抗腫瘤的活性或協(xié)助降低血膽固醇水平，(Fuller(1989)；Elmer(2001))。益生菌微生物經(jīng)確定屬于微生物中的酵母、真菌和細(xì)菌。益生菌制劑的一個(gè)重要方面是它必須與活的微生物有關(guān)。在本文中，可感染宿主細(xì)胞的噬菌體和噬菌體樣顆粒被認(rèn)為是活的微生物。如上文和實(shí)施例中所描述的，本發(fā)明的嵌合顆粒在施用了適當(dāng)量后，可拮抗特定的多組不期望的有機(jī)體，抑制不期望的腸內(nèi)有機(jī)體，刺激免疫系統(tǒng)和通過(guò)多條途徑使宿主健康受益。因此，本發(fā)明的顆粒完全可被稱作益生菌微生物或益生菌試劑。于是，在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，嵌合噬菌體衍生的顆粒被用于產(chǎn)生益生菌組合物。盡管嵌合噬菌體菌影顆粒在本文中不被認(rèn)為是活的有機(jī)體，嵌合噬菌體菌影顆?？稍谝嫔M合物的制造過(guò)程中發(fā)揮重要作用，作為對(duì)益生菌有機(jī)體的補(bǔ)充，提供給益生菌組合物某些額外的好處。在另一實(shí)施方式中，顆粒被用于生產(chǎn)直接飼喂微生物組合物。這樣的直接飼喂微生物除了含有本發(fā)明的嵌合顆粒外，還可含有益生菌細(xì)菌。噬菌體療法主要是利用噬菌體消除和/或減少致病的和/或其他不期望的微生物的數(shù)目。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明描述的組合物含有用于噬菌體療法中的根據(jù)前面所述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的嵌合噬菌體衍生的顆粒。這種組合物在許多情況下，是做成藥物組合物的形式，其除了含有嵌合顆粒外，還配入了藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。藥學(xué)上合適的載體的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括磷酸鹽緩沖生理鹽水、水、乳劑、例如油/水乳劑、各種類型的潤(rùn)濕劑、無(wú)菌溶液等。含有這些載體的組合物可通過(guò)傳統(tǒng)方法配方。對(duì)傳統(tǒng)配方技術(shù)的綜述可參見(jiàn)如″TheTheoryandPracticeofIndustrialPharmacy″(Ed.LachmanL.等，1986)或Laulund(1994)，這些在此并入作為參考。可向受治療者施用合適劑量的這些藥物組合物。適當(dāng)組合物的施用可通過(guò)不同方法進(jìn)行，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部的、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)進(jìn)行施用。劑量設(shè)計(jì)將由主治醫(yī)師以及一些臨床因素決定。已為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知，對(duì)一個(gè)患者的劑量取決于許多因素，包括患者的大小、身體表面積、年齡、施用的具體化合物、性別、施用的時(shí)間和途徑、一般健康和其他同時(shí)服用的藥物。本發(fā)明的嵌合顆粒也可有非治療方面的應(yīng)用，以減少或控制存在于規(guī)定環(huán)境中致病的和/或不期望的微生物的數(shù)目。因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，嵌合噬菌體衍生的顆?？杀惶囟ㄓ米鲗?duì)致病的和/或不期望的微生物的生物防除劑。本發(fā)明的嵌合顆?？山?jīng)改造而表達(dá)對(duì)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素劑的特異性結(jié)合親合力，從而可用作所述細(xì)胞毒素試劑的載體。一特殊的情況出現(xiàn)在細(xì)胞毒素劑是蛋白質(zhì)分子時(shí)，其經(jīng)翻譯融合到噬菌體(衣殼)蛋白的功能形式上。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式是一組合物，其包含嵌合噬菌體衍生的顆粒，通過(guò)采用不同于那些與傳統(tǒng)的噬菌體療法或噬菌體生物防除相關(guān)的方法，通過(guò)傳遞一種或多種細(xì)胞毒素試劑，所述組合物被用來(lái)中和、殺死和/或阻礙病原體或不期望的微生物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，通過(guò)采用不同于那些與傳統(tǒng)的噬菌體療法或噬菌體生物防除相關(guān)的方法，通過(guò)將病原體或不期望的微生物從產(chǎn)生對(duì)身體有害的特質(zhì)的聯(lián)系中排除，所述組合物被用來(lái)中和、殺死和/或阻礙病原體或不期望的微生物。圖例圖1.天然噬菌體顆粒的概念圖(1)，嵌合噬菌體顆粒(2)，嵌合噬菌體菌影顆粒(3)和嵌合噬菌體樣顆粒(4)。核酸(DNA或RNA)用圓圈表示，并以箭頭“a”表示。表面展示的因子用小球表示，并以箭頭“b”表示。圖2.SDS-PAGE凝膠照片示出了獲得了具有嵌合gpL15蛋白(即gpL15-H)的噬菌體顆粒。泳道(lane)1，在MG1363上繁殖的φc2(對(duì)照)；泳道2，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15)(對(duì)照)；泳道3，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔離種群1)；泳道4，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔離種群2)；泳道5，從MG1363中提取的所有蛋白(對(duì)照)；泳道6，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15)(對(duì)照)；泳道7，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔離種群1)；泳道8，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔離種群2)；泳道9，SeeBlue2ProteinStandard(Invitrogen，Carlsbad，CA.)。圖3.蛋白質(zhì)印跡(westernblot)照片示出了所獲得的含有g(shù)pL15-H的嵌合噬菌體顆粒。泳道1，在MG1363上繁殖的Φc2(對(duì)照)；泳道2，在MG1363上繁殖的φc2(pJMS245::I15)(對(duì)照)；泳道3，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔離種群1)；泳道4，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔離種群2)；泳道5，從MG1363中提取的所有蛋白(對(duì)照)；泳道6，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15)(對(duì)照)；泳道7，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔離種群1)；泳道8，從MG1363中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔離種群2)；泳道9，SeeBlue2ProteinStandard(Invitrogen，Carlsbad，CA.)。實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建適合組成產(chǎn)生嵌合顆粒的宿主細(xì)胞。ConstructionofaHostCellsSuitablefortheConstitutiveProductionofChimericParticles.細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件。所有微生物介質(zhì)均購(gòu)自Becton，Dickinson&Company(Sparks，MD)。除非另外說(shuō)明，所有其他試劑均為分析等級(jí)，且購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。大腸桿菌菌株MC1061(Huynh等，1985)和OneShotTop10(Invitrogen，Carlsbad，CA.)在LB培養(yǎng)液(Luria-Bertanibroth)中，通氣下于37℃繁殖。乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactissubsp.Cremoris)菌株MG1363(Gasson，1983)和其衍生物在M17培養(yǎng)液輔以0.5％(w/v)葡萄糖(M17-G)中，通氣下于30℃繁殖。噬菌體c2(Φc2)和其嵌合衍生物在M17-G輔以10mMCaCl2(M17-GC)中于30℃C下在MG1363的衍生物上繁殖。當(dāng)選用重組大腸桿菌時(shí)，視情況向介質(zhì)中加入氯霉素(5μg/mL)或紅霉素(100μg/mL)。當(dāng)選用重組乳酸乳球菌時(shí)，視情況向介質(zhì)中加入氯霉素(5μg/mL)或紅霉素(5μg/mL)。對(duì)于固體介質(zhì)，加入瓊脂，使其最終濃度為1.5％(w/v)的基部瓊脂和為0.75％(w/v)的頂部瓊脂。細(xì)菌原種保持在含有15％(v/v)甘油的新鮮培養(yǎng)基中于-70℃。核酸的純化。按Sambrook等(1982)和O’Sullivan與Klaenhammer(1993)中所分別描述的，從大腸桿菌和乳酸乳球菌分離出少量的質(zhì)粒DNA試劑。按制造商說(shuō)明，使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(PlasmidMidiPreparationKit)(Qiagen，Chatsworth，CA)分離出大量的質(zhì)粒DNA試劑。視情況分別使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAquickGelExtractionKit)(Qiagen)或PCR純化試劑盒(PCRPurificationKit)(Qiagen)從瓊脂糖凝膠或酶反應(yīng)中提取DNA。按制造商說(shuō)明，使用Lambda試劑盒(LambdaKit)(Qiagen)制備乳酸乳球菌Φc2基因組的DNA。DNAligationswerepurifiedandconcentratedpriortoelectroporationusingtheMinElutePCRPurificationKit(Qiagen).使用MinElutePCR純化試劑盒(MinElutePCRPurificationKit)(Qiagen)，在進(jìn)行電穿孔之前對(duì)連接后的DNA(DNAligations)純化和濃縮。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和重組DNA技術(shù)。使用TripleMasterDNA聚合酶混合劑(TripleMasterDNAPolymeraseMix)(Eppendorf，Hamburg，Germany)或ExTaqTM聚合酶(ExTaqTMPolymerase)(TaKaRa，Shiga，Japan)，通過(guò)iCycler溫度循環(huán)反應(yīng)器(iCyclerthermalcycler)(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。DNA寡核苷酸引物由Invitrogen，Inc.(Carlsbad，CA)合成。視情況將限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)被整合進(jìn)入DNA引物的5′端，以助PCR產(chǎn)物的克隆。連接反應(yīng)(Ligationreactions)使用T4DNA連接酶(Invitrogen，Carlsbad，CA.)并按制造商說(shuō)明進(jìn)行。視情況可使用小牛小腸道堿性磷酸酶(calfintestinalalkalinephosphatase)(Promega，Madison，W1)以助PCR產(chǎn)物的克隆。DNA測(cè)序反應(yīng)由NorthwoodsDNA，Inc.(Solway，MN)進(jìn)行，并使用Lasergenev5.0(DNAstar，Inc.，Madison，W1)或CloneManager6.0版本(ScientificandEducationalSoftware，Durham，NC)對(duì)DNA序列進(jìn)行分析。細(xì)菌轉(zhuǎn)化。所有的電穿孔均使用Bio-RadGenePulser(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)進(jìn)行，裝置調(diào)配到25μF，2.5kV，和200Ω。按Sambrook等(1982)中所描述制備電穿孔法勝任大腸桿菌MC1061；按HoIo和Nes(1989)中所描述的方法制備電穿孔法勝任乳酸乳球菌MG1363。基因制品L15(gpL15-H)表達(dá)系統(tǒng)。盡管也可使用其他肽和蛋白，在該項(xiàng)研究中，gpL15被用作在Φc2衣殼表面整合以及展示模型抗原的載體。這種43.2kDa的蛋白已知為Φc2衣殼的主要結(jié)構(gòu)成分(Lubbers等，1995)，并參與到扁長(zhǎng)頭部的噬菌體的宿主細(xì)胞識(shí)別(Stuer-Lauridsen等，2003)。引物JS16_F-gpL15和JS36_R-gpL15-H被用于擴(kuò)增I15-H(SEQIDNo.1)，這是乳酸乳球菌Φc2I15-H基因的重組版本。I15-H編碼gpL15-H，其是一翻譯融合蛋白，在其羧基端展示了六個(gè)鄰近的組氨酸殘基(六聚組氨酸(hexahistidine))(SEQIDNo.2)。作為對(duì)照，引物JS16_F-gpL15和JS17_R-gpL15被用于擴(kuò)增來(lái)自乳酸乳球菌Φc2的基因組(對(duì)照)的野生型(未標(biāo)記的)I15基因。BamHI內(nèi)切限制酶識(shí)別位點(diǎn)被整合入引物JS16_F-gpL15，JS17_R-gpL15和JS36_R-gpL15-H的5′端。所得PCR產(chǎn)物用BamHI限制，并獨(dú)立地連接到由BamHI限制的pJMS245(＝pTRK687，Sturino(2002))，其編碼氯霉素抗性，作為可選的標(biāo)記。所得質(zhì)粒DNA經(jīng)純化和電穿孔而進(jìn)入電穿孔法勝任大腸桿菌中。氯霉素抗性菌落形成單元(CFUs)經(jīng)篩選以用于呈現(xiàn)插入的基因，插入基因的定位由限制分析確定，并由DNA測(cè)序確定。含有正義定位的插入基因的質(zhì)粒pJMS245::I15和pJMS245::I15-H被獨(dú)立地電穿孔進(jìn)入到MG1363。氯霉素抗性菌落形成單元經(jīng)篩選以用于pJMS245::I15或pJMS245::I15-H的呈現(xiàn)。使用的引物JS16_F-gpL15(SEQIDNo.3)5′-CGCGGATCCAGATCTCACAATAGAAAGGGTATATAAATG-3′JS17_R-gpL15(SEQIDNo.4)5′-CGCGGATCCAGATCTCTATCCATTGTGTAGCCCTC-3′JS36_R-gpL15-H(SEQIDNo.5)5′-CGCGGATCCCCCGGGCTAATGATGATGATGATGATGTCCATTGTGTAGCCCTCTCATTCC-3′實(shí)施例2嵌合噬菌體的制備噬菌體的沉淀和用SDS-PAGE進(jìn)行顯示。對(duì)數(shù)中期的乳酸乳球菌MG1363，MG1363(pJMS245::I15)和兩個(gè)獨(dú)立的MG1363(pJMS245::/I15)隔離種群的培育物分別被野生型Φc2感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1。可允許裂解性感染進(jìn)行，直到培養(yǎng)物的細(xì)胞被完全溶解。按Sambrook等(1982)中所描述的方法，用聚乙二醇(PEG)沉淀法濃縮效價(jià)＞5×109溶菌斑形成單位(PFU)/ml的500mL的噬菌體溶菌液。按制造商說(shuō)明，使用Novex4-12％Bis-TrisGels(Invitrogen，Carlsbad，CA.)，在1×MOPS緩沖液中，對(duì)經(jīng)濃縮的噬菌體溶菌液在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。作為對(duì)照，通過(guò)珠子撹打(beadbeating)，也從未感染的對(duì)照培養(yǎng)物中分離出總蛋白。圖2示出了由SDS-PAGE獲得的代表結(jié)果。通過(guò)珠子撹打(beadbeating)，從未感染的對(duì)照培養(yǎng)物中分離出總蛋白(泳道5-8)，并與PEG-沉淀的野生型Φc2(泳道1-2)和嵌合標(biāo)記的Φc2(泳道3-4)比較。在泳道1-4的gpL15蛋白如同42-kDa的蛋白那樣移動(dòng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致(Lubbers等，1995)。與預(yù)料的相同，除了野生型(噬菌體編碼的)gpL15蛋白外，只有那些在MG1363(pJMS245::I15-H)上繁殖的噬菌體顆粒被發(fā)現(xiàn)含有42+-kDagpL15-H的蛋白，而該種蛋白是通過(guò)宿主編碼的質(zhì)粒產(chǎn)生的反式結(jié)構(gòu)。與此相反，gpL15-H蛋白的表達(dá)的水平不足以在總蛋白提取物中顯示出來(lái)，該總蛋白提取物是從生長(zhǎng)在無(wú)噬菌體感染(泳道7-8)中的兩個(gè)獨(dú)立的MG1363(pJMS245::I15-H)隔離種群中分離出的。然而，gpL15-H蛋白在泳道3-4中的清楚的顯現(xiàn)表明了gpL15-H蛋白是(i)由MG1363(pJMS245::I15-H)表達(dá)，且(ii)當(dāng)被宿主以反式表達(dá)時(shí)能有效地整合進(jìn)入噬菌體顆粒中。并且，由于在泳道3-4中的gpL15-H的強(qiáng)度幾乎與那些在泳道1-2中顯示的野生型gpL15蛋白的強(qiáng)度相稱，這就表明了由于在感染前的高度表達(dá)，大多數(shù)的野生型(噬菌體編碼的)gpL15被宿主編碼的gpL15-H蛋白所正確地取代。整合進(jìn)入嵌合噬菌體顆粒中的gpL15-H的免疫檢測(cè)。按制造商說(shuō)明，使用Trans-BlotSemi-DryTransferCell(Bio-Rad)，將SDS-PAGE凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μm的InvitrolonPVDF膜上。使用WesternBreeze發(fā)色試劑盒(ChromagenicKit)(Invitrogen，Carlsbad，CA.)來(lái)確定六聚組氨酸標(biāo)簽的存在。代表結(jié)果示于圖3。在蛋白質(zhì)印跡法分析中，小鼠抗六聚組氨酸IgG1抗體(Roche)被用作初次抗體，而堿性磷酸單酯酶-結(jié)合的抗小鼠1gG抗體(Invitrogen，Carlsbad，CA.)在發(fā)色檢測(cè)中被使用。如所預(yù)料的，gpL15-H僅在繁殖于MG1363(pJMS245::I15-H)(泳道3-4)隔離種群上的噬菌體中被檢測(cè)到，但在從未感染噬菌體的MG1363(pJMS245::I1S-H)對(duì)照培養(yǎng)物(泳道7-8)中分離出的總蛋白中，為一可見(jiàn)但不明顯的帶。如在SDS-PAGE凝膠上所示，泳道3-4中的gpL15-H帶強(qiáng)度比泳道7-8中的大，這表明gpL15-H蛋白通過(guò)整合進(jìn)入噬菌體顆粒中而得到濃縮。實(shí)施例3將gpL15-H抗原整合到缺乏gpL15-H編碼基因和鄰近質(zhì)粒DNA的嵌合Φc2顆粒中。質(zhì)粒轉(zhuǎn)換頻率的評(píng)價(jià)。按Birkeland和HoIo(1993)所描述那樣進(jìn)行轉(zhuǎn)換研究，從而估計(jì)編碼抗原重組融合蛋白的由宿主編碼的質(zhì)粒錯(cuò)誤地整合進(jìn)入噬菌體顆粒的頻率(表2)。MG1363天生對(duì)氯霉素敏感，其自發(fā)突變?yōu)閷?duì)氯霉素抗性的頻率極低，濃度為5μg/mL(＜1.9×10-9)。早先在乳酸乳球菌MG1363(pJMS245)，MG1363(pJMS245::I15)和MG1363(pJMS245::I15-H)上繁殖經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的噬菌體，在MG1363的存在下培養(yǎng)，檢測(cè)MG1363轉(zhuǎn)化成氯霉素抗性顯型(phenotype)的頻率。在所有情況下，均未觀察到氯霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體。這些結(jié)果表明，現(xiàn)有系統(tǒng)是制備由無(wú)同源宿主編碼的核酸編碼敢興趣的抗原的嵌合標(biāo)記的噬菌體顆粒的優(yōu)異平臺(tái)。表2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)換頻率a。a每個(gè)結(jié)果均是兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)施例4構(gòu)建適合條件性產(chǎn)生嵌合顆粒的宿主細(xì)胞。pH-誘導(dǎo)的gpL15-H表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。Pst1限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)被整合入引物JS14_F-pH和JS15_R-pH的5′端。使用JS14_F-pH和JS15_R-pH，由載體pAMJ586(Madsen等，1999)擴(kuò)增含pH-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子P170(GenBankAccessionNumberAJ011913)的118堿基對(duì)(bp)片段。PCR片段被Pst1限制，并連接到可復(fù)制大腸桿菌和乳酸菌的穿梭載體pJMS124的Pst1位點(diǎn)，其編碼紅霉素抗性作為一可選標(biāo)記。所得質(zhì)粒DNA經(jīng)純化并獨(dú)立地由電穿孔進(jìn)入到電穿孔法勝任大腸桿菌中。紅霉素抗性CFUs經(jīng)篩選以用于pJMS124::P170的呈現(xiàn)。使用pJMS124-特異性引物M13F或M13R，并結(jié)合使用引物JS14_F-pH，由PCR確定P170插入基因的定位。引物JS16_F-gpL15和JS17_R-gpL15被用于擴(kuò)增含野生型I15的來(lái)自乳酸乳球菌Φc2(對(duì)照)基因組的PCR片段。如上所述，引物JS16_F-gpL15和JS36_R-gpL15-H再次被用于擴(kuò)增編碼gpL15-H的I15基因的重組版本。這些DNA片段由BamHI限制，并獨(dú)立地連接到BamHI限制的pJMS124。所得質(zhì)粒DNA經(jīng)純化并獨(dú)立地由電穿孔進(jìn)入到電穿孔法勝任大腸桿菌中，紅霉素抗性CFUs經(jīng)篩選，以用于pJMS124::I15或pJMS124::I15-H的呈現(xiàn)。含有正義定位的插入基因的重組質(zhì)粒被獨(dú)立地電穿孔進(jìn)入乳酸乳球菌MG1363中。紅霉素抗性CFUs經(jīng)篩選，以用于pJMS124::P170::I15或pJMS124::P170::I15-H的呈現(xiàn)。使用該系統(tǒng)，可按別處所描述(Madsen等，1999)，通過(guò)用乳酸減少培養(yǎng)基的pH到pH5.5以20分鐘來(lái)刺激pH誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯期后，可將pH提高回pH7.0，再用Φc2在MOI為0.1下感染平衡的培養(yǎng)物。這樣，如果裂解性感染能夠進(jìn)行至少一個(gè)裂解周期或直到培養(yǎng)物完全溶解，就可得到嵌合標(biāo)記的噬菌體。JS14_F-pH(SEQIDNo.6)5′-AAAACTGCAGGAACTATGAATATCCACTCC-3′JS15_R-pH(SEQIDNo.7)5′-AAAACTGCAGTAGACAACAAAATAGTAGAAG-3′M13F(SEQIDNo.8)5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′M13R(SEQIDNo.9)5′-AACAGCTATGACCATG-3′實(shí)施例5表達(dá)F18-型菌毛的大腸桿菌菌株的競(jìng)爭(zhēng)排除為了展示競(jìng)爭(zhēng)排除的原理，設(shè)計(jì)出以下實(shí)驗(yàn)，使用表達(dá)F18-型菌毛的大腸桿菌菌株作為致病有機(jī)物的模型。表達(dá)F18-型菌毛的大腸桿菌菌株(ECF18)，已知導(dǎo)致豬的斷奶后下痢(post-weaningdiarrhea)和水腫病(Ha等，2003)。具體的，F(xiàn)18黏附素(adhesin)(FedF)(位于這些菌毛的端部)對(duì)調(diào)節(jié)特異性附著到豬胃腸道負(fù)責(zé)(Smeds等，2001)。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)edF的功能性形式將在嵌合顆粒的表面展示。給豬喂食不同量的這些顆粒，并觀察是否這些顆粒競(jìng)爭(zhēng)地排除ECF18細(xì)菌。在實(shí)驗(yàn)中，由乳酸乳球菌噬菌體c2構(gòu)建了表達(dá)了融合蛋白的載體，該融合蛋白含有FedF黏附素(來(lái)自F18+豬-病原體大腸桿菌F107/86)和gpL15衣殼蛋白。通過(guò)SOEingPCR(Horton，R.M.，1995)，完整的fedF基因被融合進(jìn)完整的I15基因的5′或3′。按制造商說(shuō)明，使用T4DNA(Gibco-BRLLifeTechnologies，Inc.)連接酶將融合等位基因連接到pJMS124::P170(3α)。按制造商說(shuō)明，使用微型洗提試劑盒(MiniEluteKit)(Qiagen)純化所得質(zhì)粒(pJMS124::P170::I15::fedF)DNA。然后，按制造商說(shuō)明，使用Bio-Rad基因?qū)雰x(GenePulser)(Bio-RadLaboratories)以及Sambrook等(1989)的方法，將該連接電穿孔進(jìn)入到電穿孔法勝任大腸桿菌。紅霉素抗性菌落經(jīng)篩選，以用于pJMS124::P170::I15-H::fedF的呈現(xiàn)。如Holo和Nes(1995)中所描述，這些質(zhì)粒將被電穿孔進(jìn)入乳酸乳球菌MG1363。除了使用pJMS124::P170::I15::fedF外，嵌合噬菌體將通過(guò)以上實(shí)施例2中表示的方法制備。在確定時(shí)間內(nèi)，以確定量將經(jīng)純化所得的嵌合噬菌體喂食給豬(測(cè)試)。第二組豬(對(duì)照)不會(huì)被喂食嵌合噬菌體，而喂食相當(dāng)劑量的無(wú)菌鹽水。然后，兩組豬(測(cè)試和對(duì)照)均接種確定劑量的大腸桿菌F107/86。接種后，觀察斷奶后下痢和水腫病的癥狀。通過(guò)蛋白質(zhì)雜交(westernhybridization)監(jiān)視嵌合顆粒的排泄物一段時(shí)間，并通過(guò)定量PCR監(jiān)視大腸桿菌F107/86的釋放。在此描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，包括發(fā)明人知道的實(shí)施本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。在閱讀了上述說(shuō)明后，這些優(yōu)選實(shí)施方式做出變異對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。發(fā)明人可預(yù)計(jì)到本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)恰當(dāng)?shù)貞?yīng)用這樣的變異，且也可預(yù)計(jì)到本發(fā)明可在不局限于此處描述的范圍內(nèi)加以實(shí)施。因此，本發(fā)明包括專利法允許范圍內(nèi)的所有對(duì)權(quán)利要求中的主題的等同的改變。此外，除非另有指出或與本文有明顯抵觸，對(duì)上述要素的各種可能的組合也包括在本發(fā)明內(nèi)。在本專利文件中所引用的文獻(xiàn)將全文并入作為參考。文獻(xiàn)Ausubel，F(xiàn).M.，etal.(eds.).″CurrentProtocolsinMolecularBiology″.JohnWileyandSons.1995.Birkeland，N.andHoIo，H.1993.TransductionofaplasmidcarryingthecohesiveendregionfromLactococcuslactisbacteriophageΦLC3.Appl.Environ.Microbiol.591966-1968.Blake，D.P.，Hillman，K.，F(xiàn)enlon，D.R.，Low，J.C.(2003)TransferofantibioticresistancebetweencommensalandpathogenicmembersoftheEnterobacteriaceaeunderilealconditions.J.Appl.Microbiol.95428-36.CharlierG，BertschingerHU，WildP，VandekerckhoveJ，etal.1993.TheroleofadhesiveF107fimbriaeandofSLT-IIvtoxininthepathogenesisofedemadiseaseinpigs.ZentralblBakteriol.278(2-3)445-50.Davis，S.S.(2001)Nasalvaccines.Adv.DrugDeliv.Rev.5121-24.Elmer，G.W.(2001).Probiotics″livingdrugs″.AmJHealthSystPharm.58(12)1101-9).FAO/WHOjointExpertConsultationonEvaluationofHealthandNutritionalPropertiesofProbioticsinFoodIncludingPowderMilkwithLiveLacticAcidBacteria，October2001.http://www.mesanders.com/probio_report.pdf.Foss，D.L.andMurtaughMP.(2000)Mechanismsofvaccineadjuvanticityatmucosalsurfaces.Anim.HealthRes.Rev.13-24.Fuller，R.(1989)Probioticsinmanandanimals.JApplBacteriol66365-78.Gasson，M.J.1983.PlasmidcomplementsofStreptococcuslactisNCDO712andotherlacticstreptococciafterprotoplast-inducedcuring.J.Bacteriol.154625-629.HaSK，ChoiC，ChaeC.(2003)PrevalenceofageneencodingadhesininvolvedindiffuseadherenceamongEscherichiacoliisolatesinpigswithpostweaningdiarrheaoredemadisease.JVetDiagnInvest.15(4)378-81.HoIoH，NesIF.1995.TransformationofLactococcusbyelectroporation.MethodsMoIBiol.；47195-9.HoIo，H.，andI.F.Nes.1989.High-frequencytransformation，byelectroporation，ofLactococcuslactissubsp.cremorisgrownwithglycineinosmoticallystabilizedmedia.Appl.Environ.MicrobiolHorton，R.M.(1995)PCR-mediatedrecombinationandmutagenesisSOEingtogethertailor-madegenes.MoI.Biotechnol.393-99.Huynh，T.V.，R.A.Young，andR.W.Davis.1985.ConstructionandscreeningcDNAlibrariesinλgt10andλgt11.InDNAcloning，vol.I.D.M.Glover(ed.).OxfordIRLPressLtd.，pp.49-78.lmberechtsH，deGreveH，HernalsteensJP，SchlickerC，BouchetH，PohlP，Johansen，E.(1999)Geneticengineering(b)Modificationofbacteria.InEncyclopediaofFoodMicrobiology(Robinson，R.，Batt，C.andPatel，P.，eds.).AcademicPress，London，pp.917-921.Lachman，L.etal(ed.)(1986)TheTheroryandPracticeofIndustrialPharmacy.ThirdEdition.Lea&Fibiger，Philadelphia.Laulund，S.(1994)Commercialaspectsofformulation，productionandmarketingofprobioticproducts.InHumanHealthThecontributionofmicroorganisms，pp.158-173.Gibson，S.A.W.(Ed.).Springer-Verlag，London.Lubbers，M.，Waterfield，N.，Beresford，T.，LePage，R.，andJarvis，A.1995.Sequencingandanalysisoftheprolate-headedlactococcalbacteriophagec2genomeandidentificationofthestructuralgenes.Appl.Environ.Microbiol.614348-4356.MadsenSM，AruauJ，VrangA，GivskovM，lsraelsenH.1999.Mol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的顆粒的組合物的制備方法，所述方法包括向安全的宿主細(xì)胞引入(例如，通過(guò)轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化)一個(gè)或多個(gè)遺傳要素，其單獨(dú)或組合對(duì)噬菌體衍生的顆粒進(jìn)行編碼。2.權(quán)利要求1的制備包含嵌合噬菌體衍生的顆粒的方法，其中，所述安全的宿主細(xì)胞選自由其使用經(jīng)美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心評(píng)價(jià)為公認(rèn)安全(GRAS)的細(xì)菌，并根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)，是具有在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄的微生物的細(xì)菌組成的組。3.制備包含嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如，嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆粒或嵌合噬菌體菌影顆粒)的方法，所述顆粒含有至少兩種不同表面展示蛋白，所述方法包括以下步驟(i)獲得至少兩種遺傳要素，其中至少一種所述遺傳要素(原生遺傳要素)包括相當(dāng)部分的噬菌體基因組，其中至少一種其他的所述遺傳要素(反式互補(bǔ)遺傳要素)編碼至少一種成分(附加成分)的合成，該至少一種成分在組裝和/或釋放顆粒的過(guò)程中被引導(dǎo)至所述顆粒的表面；(ii)用所述兩個(gè)或多個(gè)遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化適合的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是安全的宿主細(xì)胞(例如選自由其使用經(jīng)美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心評(píng)價(jià)為公認(rèn)安全(GRAS)的細(xì)菌，并根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)，是具有在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄微生物的細(xì)菌組成的組；(iii)在允許由所述原生遺傳要素編碼的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行表達(dá)的條件下，以及所述至少一種在組裝和/或釋放顆粒的過(guò)程中被引導(dǎo)至所述顆粒的表面附加成分進(jìn)行表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主細(xì)胞；(iv)在一定條件下，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物形成顆粒，該顆粒包含至少一種由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的附加成分，但不包含由反式互補(bǔ)遺傳要素編碼的所述至少一種附加成分的至少一部分的編碼序列；以及(v)獲得包含嵌合噬菌體衍生的顆粒的組合物。4.根據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其中，所述遺傳要素通過(guò)以下方法被引入到宿主細(xì)胞中，該方法包括以下步驟(i)用至少一種反式互補(bǔ)遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化適合的細(xì)菌宿主細(xì)胞；(ii)用所述原生遺傳要素轉(zhuǎn)染、感染和/或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，用所述兩種或多種遺傳要素于所述適合的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包含細(xì)胞融合。6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述嵌合噬菌體衍生的顆粒包含若干正常(例如2個(gè)，3個(gè)或多個(gè)野生型的)噬菌體成分。7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述原生遺傳要素在該方法中復(fù)制。8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述成分是融合蛋白，其中，所述融合蛋白是在編碼指導(dǎo)融合蛋白到所述嵌合噬菌體衍生的顆粒表面的蛋白或肽的序列和不相關(guān)的肽或蛋白編碼序列之間的翻譯融合。9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述至少一種其他遺傳要素是選自由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)位子、原噬菌體、原噬菌體殘?bào)w、假噬菌體、附加體和噬粒組成的組的遺傳要素。10.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述至少兩種遺傳要素中的至少一種遺傳要素通過(guò)噬菌體感染轉(zhuǎn)移到所述細(xì)菌宿主細(xì)胞中。11.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是選自由其使用已通過(guò)美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心評(píng)價(jià)為公認(rèn)安全(GRAS)的并批準(zhǔn)用于食品、飼料或直接飼喂微生物制品的添加劑的細(xì)菌宿主細(xì)胞組成的組。12.根據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其中，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞就其在奶制食物產(chǎn)品中的應(yīng)用而言是被認(rèn)為GRAS的。13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是選自由細(xì)菌組成的組，其中，所述細(xì)菌是根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)的、具有用于食物而無(wú)副作用的記錄歷史的微生物。14.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，宿主細(xì)胞是選自乳酸菌組。15.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，宿主細(xì)胞是選自由節(jié)桿菌屬(Arthrobacterspp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、哈夫尼菌屬(Hafniaspp.)、克氏庫(kù)克菌屬(Kocuriaspp.)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、乳球菌屬(Lactococcusspp.)、明串球菌屬(Leuconostocspp.)、微球菌屬(Micrococcusspp.)、酒球菌屬(Oenococcusspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriunspp.)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidiumspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)和鏈球菌屬(Streptococcusspp.)的非致病的細(xì)菌屬組成的組。16.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，宿主細(xì)胞是選自由非致病的細(xì)菌組成的組包括球形節(jié)桿菌、青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙岐桿菌(原為兩歧雙歧桿菌，Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、干酪短桿菌、亞麻類短桿菌、黃色棒狀桿菌、產(chǎn)氣腸球菌、屎腸球菌、蜂房哈夫尼菌、變異庫(kù)克菌、德氏乳桿菌乳酸亞種、嗜酸乳酸菌、營(yíng)養(yǎng)乳桿菌、短營(yíng)養(yǎng)乳桿菌林氏變種、巴伐利亞乳桿菌、短乳桿菌、短乳桿菌林氏變種、保加利亞乳桿菌、肉食乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、干酪乳桿菌鼠李糖變種、乳脂乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、德氏乳桿菌乳酸亞種、乳酸桿菌(Lactobacillusfarciminis)、瑞士乳桿菌、詹氏乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸乳桿菌亞種、乳酸乳桿菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種、賴氏乳桿菌、副干酪乳桿菌(原為干酪乳桿菌)、副干酪副干酪乳桿菌、副干酪乳酸桿菌副干酪亞種、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、清酒乳桿菌(早期為營(yíng)養(yǎng)乳桿菌)，舊金山乳桿菌、木糖乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種、乳酸乳球菌(原為鏈球菌)乳脂亞種、嗜酸乳球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌雙乙酰乳酸種(原為雙乙酰乳酸鏈球菌)、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳酸雙乙酰乳酸亞種、肉質(zhì)明串珠菌、嗜橙明串珠菌、葡萄糖明串球菌、腸膜明串珠菌乳脂亞種、假腸膜明串珠菌、變異微球菌、酒類酒球菌(原為酒明串珠菌Leuconostocoenos)、乳酸片球菌、戊糖片球菌、丙酸丙酸桿菌、阿拉伯糖丙酸桿菌、費(fèi)氏丙酸桿菌精子亞種，費(fèi)氏丙酸桿菌、薛氏丙酸桿菌、Rhodosporidiuminfirmominiatum、肉糖葡萄球菌、木糖葡萄球菌、唾液鏈球菌嗜熱亞種、乳脂鏈球菌、雙乙酰乳酸鏈球菌、耐久鏈球菌、糞鏈球菌、乳酸鏈球菌、嗜熱鏈球菌(原來(lái)為唾液鏈球菌嗜熱亞種)、凝結(jié)芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。17.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，在加入所述兩種或多種遺傳要素前，細(xì)菌宿主細(xì)胞可被認(rèn)為是滿足Johansen(1999)定義的微生物或食品級(jí)的GMO。18.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)噬菌體的和/或宿主的基因組編碼的成分的作用，所述不含有有編碼至少部分所述融合蛋白的序列的嵌合噬菌體衍生的顆粒從所述細(xì)菌宿主細(xì)胞中釋放。19.根據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其中，所述噬菌體基因組編碼的一種或多種成分包含穴蛋白和/或細(xì)胞內(nèi)溶素和/或溶解酵素。20.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述嵌合顆粒通過(guò)非噬菌體誘導(dǎo)的溶解，包括物理分裂過(guò)程(例如聲波降解法)和/或加入化學(xué)物質(zhì)(例如噬菌體溶素，溶解酵素等)溶解，從而從所述宿主細(xì)胞釋放。21.獲得嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如，嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)的方法，所述嵌合噬菌體衍生的顆粒包括至少兩種不同的表面展示蛋白，所述方法包括以下步驟(i)獲得組合物，可按前述任一項(xiàng)權(quán)利要求從所述嵌合噬菌體衍生的顆粒分離出該組合物，和(ii)從所述組合物中分離出嵌合噬菌體衍生的顆粒。22.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)通過(guò)傳統(tǒng)的分批發(fā)酵制備嵌合噬菌體衍生顆粒的方法。23.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)通過(guò)連續(xù)發(fā)酵，包括固定化細(xì)胞技術(shù)制備嵌合噬菌體衍生顆粒的方法。24.可由上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法獲得的嵌合噬菌體衍生顆粒。25.嵌合噬菌體衍生顆粒(例如，嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)，除了至少一正常的噬菌體成分外，還展示了至少一附加成分，所述至少一正常噬菌體成分由包含絕大部分的噬菌體基因組，原生遺傳要素的遺傳要素編碼，所述至少一附加成分由不同的遺傳要素，反式互補(bǔ)遺傳要素編碼；所述顆粒的進(jìn)一步特征在于其不包含編碼至少一部分所述至少一種附加成分的序列；并是通過(guò)使用安全的宿主細(xì)胞制備的，所述宿主細(xì)胞例如是選自由其使用經(jīng)美國(guó)食品和藥品管理局、獸用醫(yī)藥中心評(píng)價(jià)為公認(rèn)安全(GRAS)的細(xì)菌、和根據(jù)歐洲食品和飼料培養(yǎng)物協(xié)會(huì)和國(guó)際乳制品聯(lián)盟(EFFCA/IDF)，是具有在食物中使用無(wú)副作用歷史記錄微生物的細(xì)菌組成的組的細(xì)胞。26.權(quán)利要求24或25的顆粒，其中，所述顆粒除了若干正常噬菌體成分外，還展示至少一種附加成分。27.根據(jù)上述權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述顆粒不包含編碼所述至少一種附加成分的任何序列。28.根據(jù)上述權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)的顆粒，其中，由不同的基因要素編碼的所述至少一種附加成分是融合蛋白，其是在指導(dǎo)融合蛋白到所述顆粒表面的肽序列和不相關(guān)的肽序列之間的融合。29.根據(jù)上述權(quán)利要求，其中，所述融合蛋白包含具有噬菌體(衣殼)蛋白的功能部分的肽序列。30.根據(jù)上述權(quán)利要求，其中，所述噬菌體(衣殼)蛋白是噬菌體頭部、噬菌體原頭、菌體頸部、噬菌體頸須、噬菌體尾部、噬菌體基片和/或噬菌體尾絲的成分。31.根據(jù)上述權(quán)利要求，其中，所述噬菌體蛋白是選自由gpL1，gpL2，gpL3，gpL4，gpL5，gpL6，gpL7，gpL8，gpL9，gpL10，gpL11，gpL12，gpL13，gpL14，gpL15，gpL16和gpL17組成的噬菌體蛋白的組衍生自與乳球菌型噬菌體c6A，包括噬菌體c2類似的噬菌體。32.根據(jù)上述權(quán)利要求24-31中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述顆粒是感染性的。33.根據(jù)上述權(quán)利要求24-32中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述顆粒是感染性的，并表現(xiàn)出宿主特異性，該宿主特異性由所述包含絕大部分噬菌體基因組的遺傳要素(原生遺傳要素)決定。34.根據(jù)上述權(quán)利要求24-33中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述顆粒展現(xiàn)出宿主特異性，該宿主特異性由所述至少一種不同遺傳要素(反式互補(bǔ)遺傳要素)決定。35.根據(jù)上述權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述宿主特異性得以保持并與天然噬菌體隔離種群的相同，從該天然的噬菌體隔離種群衍生所述噬菌體基因組的絕大部分(即“原生顆?！?。36.根據(jù)權(quán)利要求24-35中的顆粒，其中，所述宿主特異性相對(duì)于天然噬菌體隔離種群有改變，從該天然的噬菌體隔離種群衍生所述噬菌體基因組的絕大部分。37.根據(jù)權(quán)利要求24-36中的顆粒，其中，所述顆粒展現(xiàn)出相對(duì)于天然噬菌體隔離種群而言增加的或降低的感染細(xì)菌的能力，從該天然的噬菌體隔離種群衍生所述噬菌體基因組的絕大部分(即原生遺傳要素)。38.根據(jù)權(quán)利要求22-31和37中的顆粒，其中，所述顆粒是非感染性的。39.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，其中，顆粒不含有任何遺傳材料。40.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述融合蛋白能與病毒編碼的成分發(fā)生締合。41.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述融合蛋白能與病毒編碼的天然噬菌體隔離種群中所含的蛋白締合，從該天然的噬菌體隔離種群衍生所述噬菌體基因組的絕大部分(即原生顆粒)。42.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，其中，所述融合蛋白能在細(xì)菌細(xì)胞溶解前，與所述病毒編碼的一種或多種天然噬菌體隔離種群的蛋白締合。43.根據(jù)權(quán)利要求41的顆粒，其中，所述融合蛋白能在所述嵌合顆粒由宿主細(xì)胞釋放后，與所述病毒編碼的一種或多種天然噬菌體隔離種群的蛋白締合。44.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，其中，除了所述至少一種正常噬菌體成分外，該顆粒還包括至少兩種附加成分，其不被所述包含絕大部分噬菌體基因組的遺傳要素編碼。45.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列是源自植物、人、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌或病毒的基因組。46.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列是源自植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌的病原體。47.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列是源自那些與植物、人、動(dòng)物、真菌或細(xì)菌的相互作用可能是致病的微生物。48.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列編碼含有由特定序列的氨基酸或其部分組成的毒力因子。49.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列編碼促進(jìn)和/或使得顆粒能夠結(jié)合到固體表面、生物膜、人和動(dòng)物的細(xì)胞或其他微生物中的受體上的蛋白或肽。50.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列包含促進(jìn)和/或使得顆粒能夠有條件地結(jié)合到用于純化所述顆粒的基質(zhì)上的蛋白或肽序列(例如多聚組氨酸)。51.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列編碼能引起人和/或動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答的抗原和/或過(guò)敏原。52.根據(jù)權(quán)利要求28的顆粒，其中，所述融合蛋白的所述不相關(guān)的肽序列是能特異性地結(jié)合到至少一個(gè)分子上的肽。53.根據(jù)權(quán)利要求51的顆粒，其中，結(jié)合到所述融合蛋白上的至少一個(gè)分子是蛋白質(zhì)、脂蛋白、糖蛋白、糖類、脂質(zhì)或類似的生物起源的分子。54.根據(jù)權(quán)利要求52的顆粒，其中，結(jié)合到所述融合蛋白上的至少一個(gè)分子起到細(xì)胞外受體的功用。55.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合噬菌體衍生的顆粒在制備疫苗中的應(yīng)用。56.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備免疫刺激性輔藥中的應(yīng)用。57.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備組合物中的應(yīng)用，該組合物包含對(duì)選自由哺乳動(dòng)物、魚和鳥組成的組的有機(jī)物免疫系統(tǒng)的特異性抗原。58.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備組合物中的應(yīng)用，該組合物競(jìng)爭(zhēng)排除病原體或不期望的微生物。59.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備組合物中的應(yīng)用，該組合物競(jìng)爭(zhēng)排除與人和/或動(dòng)物的黏膜表面，包括結(jié)膜、胃腸道、呼吸道和尿道相關(guān)的病原體或不期望的微生物。60.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備組合物中的應(yīng)用，該組合物競(jìng)爭(zhēng)排除與人類農(nóng)業(yè)中的植物和/或種子相關(guān)的病原體或不期望的微生物。61.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備益生菌類組合物和/或原生菌類組合物中的應(yīng)用。62.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒在制備直接飼喂微生物組合物中的應(yīng)用。63.一種組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如，嵌合噬菌體顆粒、嵌合的噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)，用于噬菌體療法。64.一種組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，用作生物防除劑控制特定病原體和/或不期望的微生物數(shù)量。65.一種組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，通過(guò)采用不同于那些與傳統(tǒng)的噬菌體療法或噬菌體生物防除相關(guān)的方法，通過(guò)傳遞一種或多種細(xì)胞毒素試劑，該組合物被用來(lái)中和、殺死和/或阻礙病原體或不期望的微生物。66.一種組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，通過(guò)采用不同于那些與傳統(tǒng)的噬菌體療法或噬菌體生物防除相關(guān)的方法，通過(guò)將病原體或不期望的微生物從產(chǎn)生對(duì)身體有害的特質(zhì)的聯(lián)系中排除，該組合物被用來(lái)中和、殺死和/或阻礙病原體或不期望的微生物。67.組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，用作過(guò)敏的治療。68.組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，用作結(jié)合和/或中和生物毒素。69.組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的顆粒，該顆粒展示了有助于它們結(jié)合和/或下游純化的附加標(biāo)簽。70.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合噬菌體衍生的顆粒(例如，嵌合噬菌體顆粒、嵌合噬菌體樣顆?；蚯逗鲜删w菌影顆粒)，其表面展示了一種或多種不相關(guān)的肽序列，該肽序列作為促進(jìn)所述顆粒純化后的異源的生物活性分子的非共價(jià)結(jié)合的通用接合體。71.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合噬菌體衍生的顆粒，其表面展示了一種或多種不相關(guān)的肽序列，該肽序列作為促進(jìn)所述顆粒純化后的一個(gè)或多個(gè)異源的生物活性分子通過(guò)化學(xué)或酶處理而共價(jià)連接的通用接合體。全文摘要本發(fā)明的目的是提供嵌合噬菌體衍生的顆粒，其可用作安全食品級(jí)的載體來(lái)向活的細(xì)胞呈遞各種因子(例如，抗原、毒力蛋白、受體、配體等)。除了含有至少一種正常噬菌體或病毒成分外，顆粒還含有至少一種附加因子，其不是由嵌合顆粒的遺傳材料編碼。這種顆粒的應(yīng)用包括但不限于疫苗研究、病原體中和、化學(xué)結(jié)合和/或中和(例如毒素)，以及競(jìng)爭(zhēng)排除。此外，該技術(shù)還可用于延長(zhǎng)噬菌體療法中噬菌體顆粒的保留時(shí)間，和/或特異性地靶向生物膜的給定顆粒。文檔編號(hào)C12P1/04GK101068567SQ200580039274公開(kāi)日2007年11月7日申請(qǐng)日期2005年9月19日優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日發(fā)明者約瑟夫·米蘭德·斯圖里諾申請(qǐng)人:科·漢森有限公司