專利名稱：：Hcv包膜蛋白顆粒:用于疫苗接種的用途的制作方法HCV包膜蛋白顆粒用于疫苗接種的用途本申請是申請日為1999年6月23日，申請?zhí)枮?9809890.6，發(fā)明名稱為"HCV包膜蛋白顆粒用于疫苗接種的用途"的發(fā)明專利申請的分案申請。發(fā)明領域本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)HCV包膜蛋白在處于異種亞型la或亞型lbHCV林慢性感染的黑猩猩中誘導有益的免疫應答。更具體地說，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)包膜蛋白的免疫原性高并導致既刺激細胞免疫應答，也刺激體液免疫應答。而且，本發(fā)明還涉及這樣的發(fā)現(xiàn)通過烷化作用封閉半胱氨酸產生免疫原性甚至更高的蛋白。此外，本發(fā)明的包膜蛋白可以加入到具有高免疫原性和免疫反應性的顆粒中。進一步證實這樣的顆?？梢约尤肫渌鞍?。發(fā)明背景丙型肝炎病毒(HCV)感染是發(fā)達國家和發(fā)展中國家存在的主要健康問題。據(jù)估計，約有l(wèi)-5。/o的世界人口受到丙型肝炎病毒的影響。HCV感染似乎是輸注性肝炎最重要的原因，并常常發(fā)展為慢性肝損害。而且有證據(jù)表明，HCV誘發(fā)肝細胞癌。所以，迫切需要可靠的診斷方法和有效的治療藥物。也需要對HCV污染的血液制品敏感和特異性的篩選方法以及對HCV培養(yǎng)的改良方法。HCV是約有9,600個堿基的正鏈RNA病毒，它編碼至少三種結構蛋白和6種非結構蛋白。根據(jù)序列同源性，結構蛋白在功能上分為唯一的核心蛋白和兩種包膜蛋白El和E2。El由192個氨基酸組成，并根據(jù)HCV基因型包含5-6個N-糖基化位點。E2蛋白由363-370個氨基酸組成，并根據(jù)HCV基因型包含9-11個N-糖基化位點(關于其綜述見Major和feinstone，1997;Maertens和Stuyver,1997)。El蛋白含有各種可變域(Maertens和Stuyver,1997)，而E2蛋白含有3個高變域，其中主域位于所述蛋白的N末端(Maertens和Stuyver,1997)。后一種包膜蛋白已通過重組技術在大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞產生。表達系統(tǒng)在高級真核生物、尤其是哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的應用產生被患者樣品中的抗體有效識別的包膜蛋白(Maertens等，1994)。已經提出El包膜蛋白需要E2包膜蛋白才能達到合適的折疊狀態(tài)(Deleersnyder等，1997)。另夕卜，已經提出El和E2可形成構成病毒包膜基本單位的異二聚體(Yi等，1997)。在Liang等的WO98/21338中，已將這些設想用于構建HCV顆粒，該顆粒由El和E2以及核心蛋白和P7組成。換句話說，現(xiàn)有技術沒有指出分別將El或E2用于免疫接種和其它目的。但是Houghton(1997)報告，采用重組gpElE2(4x25嗎)反復接種免疫3只慢性HCV感染黑猩猩并沒有誘發(fā)顯著的免疫應答。本申請的發(fā)明人推論，在慢性丙型肝炎患者誘導抗包膜免疫應答應該切實可行，并有益于所述患者，因為似乎較高水平的這樣的抗體與對干擾素治療的良好反應有關，從而有助于所述患者清除所述病毒(Matertens等的PCT/EP95/03031)。本發(fā)明的發(fā)明人進一步推論，因為在慢性HCV攜帶者中抗El抗體水平是所有HCV抗體中最低的，所以升高這些抗體的水平可能是有益的，而且所述細胞應答可誘導控制甚或消除所述宿主的感染。對E1的高水平細胞免疫似乎也與對千擾素治療的良好反應有關(Leroux-Roels等，1996)。除了抗E1免疫與干擾素治療有關的重要性外，其它種種跡象表明，HCV基因組的某些其它部分可能對誘導可允許控制感染的特異性免疫應答是重要的。在干擾素治療反應患者中還更為常見地觀察到對所述核心蛋白C末端區(qū)的T細胞反應性(Leroux-Roels等，1996)。在肝移植后消除了HCV的患者中證實了抗NS4B蛋白的潛在中和抗體(Villa等，1998)。也已對NS3中的幾種T細胞表位作圖，這幾種表位似乎與急性期清除HCV有關(參見Leroux-Roels等的PCT/EP94/03555;Leroux-Roels等，1996;Rehermann等，1996和1997;Diepolder等，1995和1997)。此外，抗NS5A的抗體如El抗體在oc干擾素治療之前為基線水平的長時性反應者(LTR)中具有較高水平，這是與無反應者比較而言。目前HCV的治療性疫苗接種還未取得成功。而且預防性疫苗接種僅顯示對HCV同種病毒抹的有效預防(Choo等，1994)。本發(fā)明涉及令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即給予HCV包膜抗原能夠顯著改善異種病毒株或分離抹感染的個體的慢性活動性肝炎的病況，對于異種亞型la或異種亞型lb感染都可以。實際上，給予6個劑量的50(igEls(即El的192-326氨基酸)的慢性感染的黑猩猩令人驚奇地顯示強烈的體液免疫和細胞免疫應答,所述免疫應答在后一疫苗接種之前的整個慢性感染期間均未成功建立。而且在免疫接種后2-5個月內在肝臟檢測不到病毒抗原并在免疫接種后至少5個月仍然不能檢測到病毒抗原。盡管血清的HCV-RNA滴度并未下降，但是血清肝臟酶水平顯示明顯正?；厔?。最重要的是，兩只受疫苗接種的黑猩猩的肝臟組織學均顯著改善。本發(fā)明還涉及的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，用于疫苗接種的El蛋白表達為不需要疏水性錨的單一HCV蛋白，它可形成穩(wěn)定的顆粒。還應該注意的是，為了避免誘導針對非相關表位的免疫應答，構建為從一個慢性攜帶者的單一血清樣品獲得的各個克隆的共有序列的用于免疫接種的E1蛋白。本申請另外涉及的發(fā)現(xiàn)是，通過采用基'因型不同于所述宿主感染的基因型的抗原可增強誘導所述抗E1應答。而且，本申請涉及以下發(fā)現(xiàn)例如借助于N-(碘乙基)-三氟乙酰胺、乙烯亞胺或活性鹵素如碘乙酰胺烷基化HCV包膜蛋白的半胱氨酸時，上述寡聚顆粒顯示甚至更高的免疫原性。最后，本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)在上述的寡聚顆粒中HCV包膜蛋白的半胱氨酸突變?yōu)槿魏纹渌烊淮嬖诘陌被?優(yōu)選突變?yōu)榈鞍彼帷⒐劝彼?、谷氨酰胺或賴氨酸，這樣的突變與原包膜蛋白相比也產生更高的免疫原性。發(fā)明目的由文獻可知，迫切需要開發(fā)可靠的HCV疫苗和有效的HCV治療藥物。所以，本發(fā)明的目的是提供能夠甚至在(不僅限于此)慢性HCV攜帶者中誘導針對HCV包膜蛋白的特異性體液免疫和細胞免疫的抗原制劑。所述相同抗原能用于所述免疫應答的診斷。更具體地說，本發(fā)明的目的是提供以上定義的抗原制劑，它含有單一HCV包膜蛋白的穩(wěn)定顆粒。應該清楚的是，這樣的顆?；蛑苽溥@樣的顆粒的方法是本領域未知的。而且，本領域沒有證據(jù)指出，包括這樣的穩(wěn)定顆?；蛩黾兓膯我籋CV包膜蛋白的任何抗原制劑可成功用作針對HCV的(異種)預防性或治療性疫苗。因此，本發(fā)明的目的是，除了提供編碼HCV抗原的DNA疫苗外，還提供能夠成功用作針對HCV的預防性劑或治療劑的穩(wěn)定顆粒的生產方法。更具體地說，本發(fā)明的目的是，提供基于去垢劑輔助顆粒形成的該穩(wěn)定顆粒的生產方法(參見下文)。此外，本發(fā)明的目的是提供從不同HCV基因型獲得抗原組成的顆粒的制備方法。此外，本發(fā)明的目的是提供為各個克隆的共有序列的抗原，所述共有序列使得所述蛋白更正確地折疊。這是為了避免刺激針對非相關表4立的免疫。而且，本發(fā)明的目的在于提供特別用于治療性疫苗接種的抗原制劑，其中所述抗原制劑基于感染慢性攜帶者的HCV的基因型。在該方面，本發(fā)明的目的是提供與慢性攜帶者的基因型或亞型不同或同種的基因型或亞型的包膜蛋白。本發(fā)明的再一目的是提供采用可聯(lián)用其它化合物的上述抗原或DNA疫苗治療或治療性疫苗接種慢性感染患者的方法。本發(fā)明的目的還在于提供針對HCV的預防性疫苗接種人類的方法。本發(fā)明的另一目的是提供高免疫原性的寡聚顆粒，高免疫原性的原因是HCV包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基突變?yōu)樘烊话被?優(yōu)選突變?yōu)榈鞍彼帷⒐劝彼?、谷氨酰胺或賴氨酸?；蛘呖赏榛疕CV包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基。特別是后一種蛋白可借助于乙烯亞胺、N-(碘乙基)三氟乙酰胺或活性卣素進行烷基化。在該方面，本發(fā)明的目的在于提供寡聚顆粒另外用作有效提供非HCV表位的載體的用途。本發(fā)明的再一目的是提供用抗包膜抗體如抗El抗體例如抗ElV2區(qū)抗體治療急性或慢性感染患者的方法，該方法單獨進行或聯(lián)合其它治療實施。本發(fā)明的另一目的是提供與本發(fā)明包膜蛋白一起的T細胞刺激抗原如核心抗原、El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B。我們認為下文陳述的實施方案已達到本發(fā)明的所有目的。圖表簡述表1提供得自單一慢性攜帶者的El克隆的序列，用于產生疫苗的El構建物為所有這些個體克隆的共有序列。Vl-V5,可變區(qū)1-5;C4,恒定域4;HR,疏水區(qū)；HCV-Bcon,在克隆和HCV-J之間可變的位置的共有序列。表2提供El疫苗蛋白和在感染黑猩猩Phil和Ton中發(fā)現(xiàn)的El蛋白的序列。Phil的lb亞型分離抹與疫苗抹的差異為5.92%。所述疫苗和Ton的la亞型分離抹的差異為20.74%。表3提供治療性疫苗接種在兩只慢性感染黑猩猩(Ton和Phil)誘導的改變的簡單概述。如圖8和11所示進行分析。另夕卜，根據(jù)肝臟活組織檢查對組織學和炎癥進行評價。表4提供用于繪制B細胞表位的肽序列。注意HR與V4V5重疊。表5顯示NS3的重排，以便制備攜帶所有與病毒清除有關的主要表位的較短的蛋白。表6顯示Els乙酰胺和Els馬來酰亞胺與慢性HCV攜帶者血清在LIA中的反應性的比較。將蛋白固定在LIA膜上。Els乙酰胺原樣噴射在LIA條上，而Els馬來酰亞胺(還含有生物素-馬來酰亞胺)與鏈霉親合素復合后進行噴射。將抗原結合到LIA膜上，基本上如Zrein等(1998)所述處理條帶。用綴合堿性磷酸酶的人抗IgG對針對這些抗原的人抗體進行顯色。NBT和BCIP用于所迷條帶的顯色。染色記為0.5-4,如Zrein等(1998)所釋。該分析的界限采用0.5,在表的下面給出了陽性樣品數(shù)(印os)和百分率(。/。pos)。圖1根據(jù)Maertens等(PCT/EP95/03031)所述表達和純化的Els和E2s蛋白在PBS/3%Empigen-BB中的尺寸排阻層析分布的重疊。圖2Els和E2s蛋白的尺寸排阻層析(SEC)分布的重疊。所述蛋白按照Maertens等(PCT/EP95/03031)表達和純化，并使其在PBS/0.2%CHAPS中于相同SEC柱上再進行一次層析，獲得估計表觀分子量為250-300kDa的特異性寡聚結構。采用3%甜菜堿可獲得相似的締合度。圖3Els和E2s蛋白的尺寸排阻層析(SEC)分布的重疊，所述蛋白按照Maertens等(PCT/EP95/03031)表達和純化，并使其在0.2%CHAPS或3。/。甜菜堿中進行第二次層析，獲得圖2所示的特異性寡聚結構，使其在0.05°/。CHAPS中于相同SEC柱上進行第三次層析，獲得估計表觀分子量為250-300kDa(E2s)和〉600kDa(Els)的特異性同寡聚結構。采用0.1%或0.5%甜菜堿可獲得相似締合度。圖4Els在PBS/0.05%CHAPS中的動態(tài)光散射分析，以顆粒數(shù)相對于所觀測的直徑(nm)的百分率表示。圖5Els在PBS/0.1。/。甜菜堿(頂部)或0.5%甜菜堿(底部)中的動態(tài)光散射分析，以顆粒數(shù)相對于所觀測的直徑(nm)的百分率表示。圖6(A)Els在PBS/0.05。/。CHAPS中的EM染色和(B)Els在PBS/3%甜菜^威中的EM染色。圖7Els在PBS/0.05o/oCHAPS中的顆粒大小分布。圖8在lb感染黑猩猩(Phil)中6次連續(xù)的免疫接種和3次加強免疫接種(小箭頭所示)誘導的抗E1抗體的變化，以及ALT、HCVRNA和抗E1抗體的變化。采用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測結合至固相El的抗El抗體。TMB用作顯色底物。所述結果以終點效價表示。用臨床分析儀測定ALT水平，并以U/1表示。采用HCV監(jiān)測儀(Roche,Basel,瑞士)測定血清中的HCVRNA。采用特異性單克隆(ECACC收錄號為98031215,如EP申請第98870060.5號所述)半定量檢測在肝臟活組織檢查中染色的E2抗原量，從而測定肝臟的病毒負荷量。圖9用El免疫接種黑猩猩Phil誘導的抗體應答的表位作圖。針對各種肽的抗體反應性以間接ELISA檢測，其中生物素化肽(另參見表4)通過鏈霉親合素吸附到微量滴定板上。采用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測特異性抗體。TMB用作顯色底物。圖10免疫接種黑猩猩Phii之前和之后的淋巴細胞增殖分析結果。解凍PBMC并用不同抗原以一式三份進行刺激。陰性對照為單獨的培養(yǎng)基，5fig/ml濃度的刀豆球蛋白A用作陽性對照。在U形96孔微量滴定板中，將在150|il總體積中的細胞濃度為2-4x105細胞/孔的PBMC和所述對照或1|ag/mlEl—起在補加有10%熱失活FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37°C、含有5%C〇2的濕潤氛圍下培養(yǎng)90小時。在最后18小時以每孔0.5pCi(3H)胸苷對所述細胞施加脈沖。然后，將所述細胞收集在玻璃纖維濾膜上，并測定吸收標記。結果以刺激指數(shù)(SI)表示一式三份測定結果的抗原的平均cpm/單獨培養(yǎng)基的平均cpm。圖11在HCVla亞型感染的黑猩擺Ton中6次連續(xù)免疫接種和3次加強疫苗^l妄種(小箭頭所示)誘導的抗El抗體的變化。顯示血清ALT、HCVRNA變化和肝臟HCV抗原測定結果。通過間接ELISA測定抗El抗體采用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測結合至固相包被的El的特異性抗體。TMB用作顯色底物。結果以終點效價表示。用臨床分析儀測定ALT水平，并以U/1表示。采用HCV監(jiān)測儀(Roche,Basel,端士)測定HCVRNA。采用特異性單克隆(ECACC收錄號98031215,如EP申請第98870060.5號所述)在肝臟活組織檢查中染色E2抗原。半定量評價如下表示黑色方框表示細胞的大部分非常清晰的陽性染色，灰色方框表示在細胞少數(shù)部位具有清晰的染色，白色方框表示顯示沒有可檢測到的染色的活檢組織。HCVRNA用小黑色方框表示。用核心蛋白和E1染色可證實E2染色(資料未提供)。圖12用El免疫接種Ton誘導抗體應答的表位作圖。用間接ELISA檢測抗體對各種肽的反應性，其中生物素化肽(另參見表4)通過鏈霉親合素吸附到微量滴定板上。采用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測特異性抗體。TMB用作顯色底物。圖13分析在黑猩猩Ton中對la亞型和lb亞型El蛋白的El抗體應答。為此產生表達與lb基因型相同的El部分的la基因型El(衍生自HCV-H序列)的重組痘苗病毒(參見下文)。El產生自感染痘苗病毒的RK13細胞的粗裂解物(按Maertens等(PCT/EP95/0303l)所述制備)。用間接ELISA檢測抗體反應性，其中E1通過高甘露糖結合的雪地花蓮石成(Galanthusnivalis)凝集素(GNA)吸附到微量滴定板上。采用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測特異性抗體。TMB用作顯色底物。結果表示為差示OD(吸附El孔的OD減去沒有吸附El的孔的OD)。圖14免疫接種黑猩猩Ton之前和之后的淋巴細胞增殖分析結果。解凍冷凍的PBMC,并用不同抗原一式三份進行刺激。陰性對照為單獨的培養(yǎng)基，濃度為5^ig/ml的刀豆球蛋白A用作陽性對照。在U形96孔拔乏量滴定板中，將在150pl總體積中的細胞濃度為2-4x105細胞/孔的PBMC和所述對照或1(ig/mlEl—起在補加有10%熱失活FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37。C、含有5%C02的濕潤氛圍下培養(yǎng)90小時。在最后18小時以每孔0.5nCifH)胸苷對所述細胞施加脈沖。然后，將所述培養(yǎng)物收集在玻璃纖維濾膜上，并測定吸收標記。結果以刺激指數(shù)(SI)表示一式三份測定結果的抗原的平均cpm/單獨培養(yǎng)基的平均cpm。圖15用于表達其N末端高變區(qū)缺失的E2蛋白的構建物圖。構建物pvHCV-92和pvHCV-99是用于構建缺失突變體pvHCV-100和pvHCV-101的中間體構建物。圖16與圖15所示構建物相應的序列(核苷酸A;翻譯產物B)(參見上文)。圖17用實施例9所述的不同E1制劑免疫接種時在小鼠獲得的抗體效價。采用ELISA測定效價稀釋小鼠血清20倍并進一步系列稀釋(0.5log1Q),對包被在微量滴定板上的Els(乙酰胺或馬來酰亞胺修飾)進行溫育。洗滌后，用綴合過氧化物酶的抗小鼠IgG特異性第二抗血清檢測結合抗體。TMB用作顯色底物。結果表示為終點效價并顯示標準差(n=6)。圖18用不同Els制劑免疫接種小鼠誘導的抗體應答的表位作圖。用間接ELISA檢測抗體對各種肽的反應性，其中生物素化肽(表4列出)通過鏈霉親合素吸附到微量滴定板上。稀釋小鼠血清20倍，并采用綴合過氧化物酶的抗小鼠IgG.特異性第二抗血清檢測特異性抗體。TMB用作顯色底物。圖19用不同Els制劑免疫小鼠的免疫球蛋白同種型分布。特異性Ig類和亞類抗體吸附在微量滴定板上。從稀釋500倍的免疫血清捕獲小鼠Ig后，以l(ig/ml溫育Els。形成的免疫復合物再與針對E1的多克隆兔抗血清溫育。最后，用綴合過氧化物酶的山羊抗兔Ig第二抗血清檢測兔抗體。TMB用作顯色底物。結果對IgGl歸一化(即對于每一動物，IgGl信號分別記為1,其它同種型的所有結果都表示為對該IgGl結果的相對值)。圖20用Els-乙酰胺在約1000天兩次免疫4妄種黑猩猩Phil誘導的抗體效價。采用間接ELISA檢測抗El抗體用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測結合至固相El的特異性抗體。效價以單位/ml表示，這些單位是指基于人血清的固有標準。圖21用Els-乙酰胺在約900天兩次免疫接種黑猩猩Ton誘導的抗體效價。采用間接ELISA檢測抗El抗體用綴合過氧化物酶的抗人IgG特異性第二抗血清檢測結合至固相El的特異性抗體。效價以單位/ml表示，這些單位是指基于人血清的固有標準。圖22最后的減少去垢劑的步驟(0.2-0.05。/。CHAPS)的SEC分布單獨的El顆粒(A),單獨的E2顆粒(B)或El和E2的等摩爾混合物；混合顆粒(C)。該圖還顯示特異性檢測只有E1(上部)、只有E2(中間)的ELISA以及;f全測只有混合顆粒(底部)的ELISA的OD值的重疊。圖23最后的減少去垢劑的步驟(0.2-0.05。/。CHAPS)的SEC分布單獨的Ellb基因型顆粒(上部)，單獨的El4基因型顆粒(中間)或E1lb基因型和4基因型的等摩爾混合物；混合顆粒(底部)。該圖還顯示特異性檢測只有混合顆粒(另參見圖22)的ELISA的OD值的重疊。.發(fā)明詳述本文描述的發(fā)明吸收了以前公開的著作和待審批的專利申請。作為實例，這樣的著作包括科學論文、專利或待審批的專利申請。上文或下文引用的所有這些公開出版物和申請均通過引用結合到本文中。本發(fā)明涉及HCV疫苗接種。采用HCV抗原疫苗接種首次能夠成功實現(xiàn)對嚴重慢性活動性丙型肝炎黑猩猩的免疫治療。所述疫苗不僅誘導高免疫應答，而且誘導從肝臟清除病毒抗原，以及顯著改善肝臟病變和組織學活動性。本發(fā)明還涉及純化的單一HCV包膜蛋白，尤其是寡聚顆粒。所述寡聚顆粒主要包括HCV包膜蛋白，其直徑用動態(tài)光散射或盡可能以電子顯微鏡檢測為1—100nm。在該方面，應該強調的是，只有E1和/或E2蛋白或其部分(參見下文)能夠形成所述顆粒。所以，本發(fā)明的寡聚顆?；旧喜煌赪O98/21338中描述的HCV樣顆粒，該顆粒必需由El、E2、核心蛋白和P7組成。術語"基本上由HCV包膜蛋白組成的寡聚顆粒"本文定義為含有數(shù)個HCVEl和/或E2包膜蛋白的基本單位、具有特異性性質和形狀的結構,認為其分別獨立地由一個或兩個E1和/或E2單體組成。應該清楚的是，本發(fā)明的顆粒定義為沒有感染性HCVRNA基因組。本發(fā)明顆?？梢允强招牡那蛐翁匦缘母呒夘w粒,它由其中可加入脂質、去垢劑、HCV核心蛋白或輔助劑分子的包膜蛋白殼組成。后一種顆粒也可以用脂質體或載脂蛋白例如載脂蛋白B或低密度脂蛋白或用任何其它將所述顆粒導向特定器官或組織的手^a進行包嚢化。在此情況下，這樣的空心球形顆粒通常稱為"病毒樣顆粒"或VLP?；蛘撸龈呒夘w?？蔀楣腆w3求形結構，其中所述完整球體由HCVE1或E2包膜蛋白寡聚體組成，其中可以另外加入脂質、去垢劑、HCV核心蛋白或輔助劑分子，或其本身又可以以脂質體或載脂蛋白例如載脂蛋白B、低密度脂蛋白，或任何其它將所述顆粒導向特定器官或組織的手段例如脫唾液酸糖蛋白進行包嚢化。所述顆粒也可以由較小的結構組成(與上述空心或固體球形結構相比而言)，所述結構通常為圓形(參見下文)而且通常不含有單層以上的HCV包膜蛋白。所述較小顆粒的典型實例是由較少數(shù)目(通常為4-16個)的HCV包膜蛋白組成的玫瑰花樣結構。后者的具體實例包括本文例舉的用Els的0.2%CHAPS獲得的較小顆粒，所迷顆粒顯然含有8-10個Els單體。所述玫瑰花樣結構通常以平面組構而且為圓形，例如輪形。此外，脂質、去垢劑、HCV核心蛋白或輔助劑分子可以另外加入，或所述較小顆?？梢砸灾|體或載脂蛋白例如載脂蛋白B或低密度脂蛋白，或通過任何其它將所述顆粒導,特定器官或組織的手段進行包嚢化。較小顆粒也可以形成由相似的較少的HCVEl或E2包膜蛋白組成的小球形結構,其中可以另外加入脂質、去垢劑、HCV核心蛋白或輔助劑分子，或其本身又可以用脂質體或載脂蛋白例如載脂蛋白B或低密度脂蛋白，或任何其它將所述顆粒導向特定器官或組織的手段進行包囊化。按本領域眾所周知的動態(tài)光散射波術(參見以下實施例部分)測定以上定義的顆粒的大小(即直徑)，通常為1-100nm,更優(yōu)選為2-70nm,甚至更優(yōu)選2-40nm、3-20nm、5-16nm、7-14腦或8-12nm。本發(fā)明還涉及以上定義的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白選自HCVEl、HCVEls、HCVE2蛋白、SEQIDNO13或SEQIDNO14,或其部分。在Maertens等的PCT/EP95/03031中對HCVE1和HCVE2蛋白以及如何純化后一類蛋白的詳細描述進行了充分描述和特征鑒定?？梢园碝aertens等的PCT/EP95/03031中關于HCVEl或HCVEls的描述，相似地純化HCVEls、SEQIDNO13或SEQIDNO14或其部分。應該強調的是，后一文獻的全部內容，包括所有定義，都通過引用結合到本申請中。HCVEls蛋白是指El的氨基酸192-326,而且代表沒有其C末端疏水錨的El蛋白。術語"或其部分"是指一旦它們?yōu)楸景l(fā)明顆粒的部分，就是具有免疫原性的本文所述蛋白的任何部分。本發(fā)明還涉及本文所述寡聚顆粒，其中上述HCV包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基被烷基化，優(yōu)選通過烷基化劑例如活性卣素、乙烯亞胺或N-(碘乙基)三氟乙酰胺烷基化。在該方面，應該理解的是，烷基化的半胱氨酸是指其疏原子上的氫被(CH2)nR取代的半胱氨酸，其中n為O、1、2、3或4,R為H、COOH、NH2、CONH2、苯基或它們的任何衍生物?？捎帽绢I域任何已知的方法例如活性鹵素X(CH2)nR進行烷基化，其中X為鹵素如I、Br、Cl或F?；钚喳u素的實例有甲基碘、碘乙酸、碘乙酰胺和2-溴乙胺。烷基化的其它方法包括應用乙烯亞胺或N-(碘乙養(yǎng))三氟乙酰胺，它們均導致H被-CH2-CH2-NH2取代(Hermanson,1996)。本文使用的術語"烷化劑"是指能夠進行本文所述烷基化作用的化合物。這樣的烷基化最終產生能夠模擬其它氨基酸的修飾半胱氨酸。用乙烯亞胺烷基化產生結構上類似的賴氨酸，其方式為導入新的胰蛋白酶切割位點(Hermanson1996)。同樣，應用曱基碘產生類似的氨基酸即蛋氨酸，而應用-典乙酸和碘乙酰胺分別產生類似的氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺。相似的是，這些氨基酸優(yōu)選用于半胱氨酸的直接突變。所以，本發(fā)明涉及本文所述的寡聚顆粒，其中本文所述的HCV包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基突變?yōu)樘烊话被幔瑑?yōu)選突變?yōu)榈鞍彼?、谷氨酸、谷氨酰胺或賴氨酸。術語"突變的"是指對編碼這些氨基酸的核酸的定點誘變，即本領域眾所周知的方法例如通過PCR的定點誘變或通過寡核苷酸介導誘變的定點誘變，如Sambrook等所述(1989)。本文使用的術語"純化的"是指其中目的組分例如HCV包膜蛋白或寡聚顆粒占組合物總組分的至少35。/。的組合物。所述目的組分優(yōu)選占所述組合物總組分部分的至少約40%，更優(yōu)選至少約50%,甚至更優(yōu)選至少約60%，甚至更優(yōu)選至少約70%,甚至更優(yōu)選至少約80%,甚至更優(yōu)選至少約卯°/。，甚至更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%。所述組合物可以在不影響本文所用的百分純度的測定的情況下含有其它化合物例如碳水化合物、鹽、脂質、溶劑等。"分離的"HCV寡聚顆粒意指至少為35%純度的HCV寡聚顆粒組合物。在該方面，應該清楚的是，本文使用的術語"純化的單一HCV包膜蛋白"是指基本純形式的分離的HCV包膜蛋白。本丈使用的術語"基本純化的寡聚顆粒"和"單一HCV包膜蛋白"是指HCV寡聚顆粒或單一HCV包膜蛋白，使得它們能夠用于體外的診斷方法和治療學。這些HCV寡聚顆?；旧喜缓毎鞍住⑤d體來源的蛋白或其它HCV病毒組分。通常將這些顆粒或蛋白純化至均一(至少80%純度，優(yōu)選為85%,更優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%,更優(yōu)選97%,更優(yōu)選98%,更優(yōu)選99%,甚至更優(yōu)選至少99.5。/。,最優(yōu)選采用常規(guī)方法例如SDS-PAGE和銀染色法檢測不到污染蛋白)。本發(fā)明還涉及以上定義的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白為HCVEl、HCVEls、HCVE2、SEQIDNO13和/或SEQIDNO14或其部分的任何可能的混合物，例如本發(fā)明顆?；究梢园?，HCVEl蛋白和HCVE2蛋白、HCVEl蛋白和HCVfels蛋白、HCVEls蛋白和HCVE2蛋白以及HCVEl蛋白、HCVEls蛋白和HCVE2蛋白。而且，本發(fā)明還涉及以上定義的寡聚顆粒，其中所述蛋白衍生自不同HCV病毒抹、亞型或基因型，例如所述蛋白衍生自基因型lb和基因型4，或為得自一種HCV病毒株或基因型以及至少一種其它HCV病毒抹或基因型的HCV包膜蛋白組成的混合物。在Maertens等的PCT/EP95/04155中對不同HCV病毒抹或基因型進行了明確定義以及特征鑒定。再一次強調，該文獻的全部內容包括所有定義通過引用結合到本申請中。因此，本發(fā)明涉及包含衍生自本領域已知的任何HCV病毒株或基因型的包膜蛋白的寡聚顆粒，或涉及包含衍生自本領域已知的任何HCV病毒抹或基因型的蛋白的混合物的顆粒。在該方面，本發(fā)明還涉及衍生自以下例舉和實施例部分中(參見下文)的各個克隆的共有序列。本發(fā)明還涉及可用一種方法獲得的本文所述的寡聚顆粒，以及涉及生產所述寡聚顆粒的所述方法。所述方法的特征在于以下步驟(I)純化HCV包膜蛋白，可能包括應用任選的第一種去垢劑。實質上，步驟(I)的純化方法已在Maertens等的PCTEP93/03031中進行了詳細的描述。重要的是，按照本發(fā)明，PCTEP95/03031中所述的純化方法中例如用NEM-生物素的封閉步驟和本申請所述的最好用碘乙酰胺的烷基化步驟一起進行。而且步驟(I)的純化方法可能包括應用二硫鍵裂解劑以及可能包括應用烷化劑。最后，步驟(I)的方法獲得純化的HCV包膜蛋白溶液。(II)用去垢劑或鹽置換所述純化的HCV包膜蛋白的溶液，導致形成寡聚顆粒。'(III)回收或純化所述寡聚顆粒，可能包括進一步降低步驟(II)的去垢劑或鹽的濃度，這進一步有助于形成和穩(wěn)定在所述置換后形成的寡聚顆粒。本發(fā)明更優(yōu)選涉及本文所定義的寡聚顆粒以及生產所述顆粒的方法，其中所述任選的第一種去垢劑是Empigen-BB。本發(fā)明更優(yōu)選涉及本文所定義的寡聚顆粒以及生產所述顆粒的方法，其中所述步驟(II)的去垢劑是CHAPS、辛基葡萄糖苷(octylglucaside)或吐溫，或任何其它去垢劑，吐溫更優(yōu)選為吐溫-20或吐溫-80。本發(fā)明更優(yōu)選涉及本文所定義的寡聚顆粒以及生產所述顆粒的方法，其中所述鹽為甜菜堿。本發(fā)明甚至更優(yōu)選涉及上述定義的寡聚顆粒以及生產所述顆粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用濃度為1%-10%以及其中所述CHAPS或吐溫的4吏用濃度為0.01%-10%,或所述甜菜^^的使用濃度為0.01%-10%。本發(fā)明甚至更優(yōu)選涉及以上定義的寡聚顆粒以及生產所述顆粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用濃度為3%以及其中所述CHAPS或甜菜;威的使用濃度分別為0.2%或0.3%,此后變換緩沖液而所述CHAPS或甜菜堿的使用濃度分別為0.05%或0.1-0.5%。需要理解的是，上述方法中所用的所有百分率均為重量/體積。應該清楚的是，上述方法(同樣參見PCT/EP95/03031和本申請的實施例部分)是如何生產本發(fā)明所述顆粒的實例。在該方面，本發(fā)明還涉及任何其它可用于生產本發(fā)明所述寡聚顆粒的本領域已知的方法，例如省略PCT/EP95/03031和所迷實例部分(見下文)所述的還原劑以及使用替代的宿主細胞，所述細胞在內質網(wǎng)中具有最佳的氧化還原態(tài)，用于還原半胱氨酸橋。另外，應該清楚的是，可使用所有烷基甜菜堿，例如具有Cn尾的甜菜堿，其中N=1-20中的一個正整數(shù)，以及甜菜堿衍生物，例如磺基甜菜堿。因為首次采用純化的HCV抗原免疫接種成功免疫治療嚴重慢性活動性丙型肝炎的黑猩猩，所以本發(fā)明還涉及純化的單一HCV包膜蛋白尤其是El或Els。而且，本發(fā)明涉及包含所述單一HCV包膜蛋白的組合物以及其作為HCV疫苗的用途或其用于生產HCV疫苗的用途。為了避免"i秀導針對不相關表位的免疫應答，優(yōu)選構建作為各個亞型、病毒抹或克隆的共有序列的用于疫苗接種的HCV包膜蛋白。因此，本發(fā)明還涉及HCV抗原(肽、蛋白或多核苷酸形式)用于免疫接種或診斷的用途。此外，本發(fā)明還涉及本文所定義的寡聚顆粒及其用途，其中所述HCV包膜蛋白由共有序列編碼，該共有序列基于分離株的準種變異性(分離抹共有序列)或基于一個亞型(亞型共有序列)、型或種(型或種共有序列)或全部HCV屬(屬共有序列)中的不同分離株的共有序列。因此，該共有HCV包膜蛋白的氨基酸序列是衍生自分離株-、亞型-、抹-或屬共有序列的共有序列。術語"共有"的含義特別涉及到Maertens和Stuyver(1997)和其中所引用的文獻。本發(fā)明的寡聚顆粒具有特別有效的表位(參見下文)。所以，所述寡聚顆粒是使本發(fā)明表位可誘導非常有效的免疫應答的手段。在本申請中，應該理解的是，本文所定義的HCV包膜蛋白不需要只含有HCV表位。形成所述寡聚顆粒的HCV包膜蛋白可僅含有衍生自HCV的表位，也可以含有衍生自其它外源性致病因子例如HBV或HIV的表位。換句話說，具有HCV包膜蛋白支架的所述寡聚顆粒除了可提供HCV表位外，還能夠用作提供非HCV表位的載體。所以，本發(fā)明還涉及本文所定義的但是可能不具有HCV表位、可能含有非HCV表位的寡聚顆粒以及其應用和生產。本文所用的術語"外源性致病因子"是指無論存活與否都能夠誘發(fā)免疫應答、不是所述宿主內源性的、不是HCV的任何致病因子。具體地說，該術語是指病原體、變應原和半抗原。病原體包括朊病毒、病毒、原核生物和真核生物。更具體地說，病毒特別包括HBV、HIV或單純皰滲病毒但不包括HCV。變應原包括當在所述變應原接觸宿主時能夠在宿主獨立地激發(fā)免疫應答的物質或分子。半抗原激發(fā)免疫應答的能力類似于變應原，但是與變應原相比，半抗原需要載體分子。，本發(fā)明還涉及包含以上所定義的寡聚顆粒的組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及疫苗組合物。術語"疫苗組合物"是指能夠誘導針對HCV的保護(無論是部分還是完全保護)的免疫原性組合物。所以，它包含HCV狀、蛋白或多核香酸?？笻CV的保護特指對人的保護，但是也指對人類以外的靈長類、trimera小鼠(Zauberman等，1999)或其它哺乳動物的保護。本發(fā)明顆?？梢砸栽瓨?、生物素化形式(如WO93/18054中所解釋)和/或與中和抗生物素蛋白(A^wfra/"e^vW/")(MolecularProbesInc.,Eugene,OR,USA)復合的形式使用。還值得注意的是，"疫苗組合物"除了包含活性物質外，還含有合適的賦形劑、稀釋劑、載體和/或佐劑，所述添加劑本身不會誘導產生對接受所述組合物的個體有害的抗體，也不會誘導保護。合適的載體通常顯著減緩大分子的代謝，所述大分子例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒顆粒。這樣的載體是本領域才支術人員眾所周知的。優(yōu)選的增強所述組合物有效性的佐劑包括但不限于氫氧化鋁、WO93/19780中所述的鋁與3-O-脫?；瘑瘟柞Ｖ|A的組合、WO93/24148所述的^^酸鋁、在美國專利第4,606,918號中所述的N-乙?；?胞壁酰基-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙?；?去甲胞壁?；?normuramyl)-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨?；?L-丙氨酸2-(1，2，二椋櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)乙胺和含有單磷酰脂質A的RIBI(ImmunoChemResearchInc.,Hamilton,MT,USA)、脫毒內毒素、海藻糖-6,6-二霉菌酸酯以及在2%角^烯/吐溫80乳劑中的細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。MPL、TDM或CWS三種組分中任何一種也可以單獨4吏用或2x2聯(lián)合使用。jt匕夕卜，可以4吏用"i者濁口Stimulon(CambridgeBioscience,Worcester,MA,USA)或SAF-1(Syntex)的佐劑，以及可以4吏用以下佐劑QS21和3-去-O-乙酰單磷酰脂質A(WO94/00153)的組合，或MF-59(Chiron),'或聚[二(羧苯氧基離子(carboxylatophenoxy)),磷腈]基佐劑(VimsResarchInstitute),或嵌段共聚物基佐劑如Optivax(Vaxcel，Cythx),或菊4分基佐劑如Algammulin和Gammalnulin(Anutech),不完全氟氏佐劑(IFA)或Gerbu制劑(GerbuBiotechnik)。應該理解的是，完全氟氏佐劑(CFA)也可用于非人類用途以及研究目的。"疫苗組合,"還可含有賦形劑和稀釋劑，它們本身是無毒和非治療性的，例如水、鹽水、甘油、乙醇、濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質、防腐劑等。疫苗組合物通常制備為可注射的液體溶液或懸浮液。也可以制備為在注射前適于用液體載體溶解或懸浮的固體形式。所述制劑也可以以脂質體乳化或包囊化以增強佐劑作用。所述多肽也可以加入免疫刺激復合物和急香類如QuilA(ISCOMS)中。疫苗組合物包含免疫有效量的本發(fā)明多肽和任何其它上述組分。"免疫有效量"是指以單劑量或系列分劑量給予個體的有效預防量或治療量。該劑量隨以下因素而不同所治療個體的健康和生理狀況、所治療個體的分類群(例如人類、人類以外的靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)建立有效免疫應答的能力、所需要保護的程度、疫苗配方、治療醫(yī)生的評價、感染的HCV病毒抹和其它相關因素。預期所述劑量是可通過常規(guī)試驗確定的較寬劑量范圍。通常該劑量范圍為0.01-1000iLig/劑，更特別為0.1-100)ig/劑。所述疫苗組合物常規(guī)為胃腸外給予，通常為注射例如皮下或肌內給予。適合其它給藥方法的其它制劑包括口服制劑和栓劑。給藥治療可以是單劑量方案或多劑量方案。所述疫苗可以聯(lián)合其它免疫調節(jié)劑給予。所以，本發(fā)明涉及使用本文定義的寡聚顆粒預防性誘導針對HCV的免疫。值得注意的是，疫苗也可以用于治療以上所述個體，在此情況下的疫苗稱為"治療疫苗"。本發(fā)明還涉及以上定義的組合物，它還包含HCV核心蛋白、Ei、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B蛋白，或其部分。El、E2和/或E1E2顆?？梢岳缏?lián)合T細胞刺激抗原，例如核心蛋白、P7、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B。本發(fā)明特別涉及以上定義的組合物，其中所述NS3蛋白或其部分具有SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的氨基酸序列(詳見實施例部分)。這些NS3蛋白的純化優(yōu)選包括可逆性修飾半胱氨酸殘基，甚至更優(yōu)選磺化半胱氨酸。在Maertens等的PCT/EP99/02547中已描述了用于NS3蛋白的獲得這樣的可逆性修飾包括磺化的方法。要強調的是，該文獻的全部內容包括所有定義通過引用結合到本申請中。由上可知，本發(fā)明還涉及以上定義的寡聚顆?；蛞陨隙x的組合物用于生產HCV疫苗組合物的用途。本發(fā)明特別涉及應用本文定義的寡聚顆粒誘導抗慢性HCV攜帶者的HCV的免疫的用途。本發(fā)明更特別涉及在任何其它治療之前、同時或之后應用本文定義的寡聚顆粒誘導抗慢性HCV攜帶者的HCV的免疫的用途，所述其它治療例如眾所周知的干擾素治療，可聯(lián)合或不聯(lián)合給予少量治療HCV的藥物，例如病毒唑。這樣的組合物也可以在肝移植之前或之后、或推測感染(例如針刺傷)后使用。另外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明寡聚顆?；虮景l(fā)明單一HCV包膜蛋白的試劑盒，用以檢測生物樣品中的HCV抗體。本文使用的術語"生物樣品"是指從個體分離的組織或體液樣品，包括但不限于例如血清、血漿、淋巴液、皮膚外部，呼吸道、腸道和泌尿生殖道、卵母細胞、眼淚、唾液、乳、血細胞、胂瘤、器官、胃分泌液、粘液、脊髓液、外分泌物如大便、尿液、精子等。因為本發(fā)明寡聚顆粒和單一HCV包膜蛋白具有高度免疫原性，既可刺激體液免疫應答，又可刺激細胞免疫應答，所以本發(fā)明還涉及用于檢測HCV相關性T細胞應答、包含本發(fā)明寡聚顆?；蚣兓膯我籋CV包膜蛋白的試劑盒。例如可按實施例部分所述或Leroux-Roels等在PCT/EP94/03555中所述檢測HCVT細胞應答。需要強調的是，該文獻的全部內容包括所有定義通過引用結合到本申請中。應該清楚的是，本發(fā)明還涉及應用特異性HCV免疫球蛋白治療和預防HCV感染。本發(fā)明首次證實足量水平的HCV抗體尤其是HCV包膜抗體誘導緩解丙型肝炎疾病。還首次證實足量水平的抗體能夠結合循環(huán)病毒，以及抗體-復合的病毒的存在與HCV抗原從肝臟消失和肝臟病變緩解相一致。HCV包膜抗體可通過疫苗接種誘導或可以在從HCV感染血庫或得自已接種HCV疫苗者的血液中純化出該抗體后通過注射被動轉移。所以本發(fā)明還涉及針對上述寡聚顆粒或上述組合物或單一HCV包膜蛋白產生的特異性抗體。本發(fā)明特別涉及包含檢測HCV抗原的所述抗體的試劑盒。本文使用的術語"特異性抗體"是指針對本發(fā)明公開的寡聚顆粒特異性的表位產生的抗體。換句話說，特異性抗體是針對產生自寡聚顆粒形成的表位或僅存在于寡聚顆粒上的表位產生的抗體。而且，已知有產生HCV肽的各種方法。這些方法可產生能夠提供表位的HCV肽?？梢韵胂笥眠@些各異的方法獲得的HCV肽能夠提供相似的表位。相似表位是產生自不同生產或純化方法但是可被一種抗體和所述相同抗體識別的表位。然而，本發(fā)明寡聚顆粒提供非常有效的表位。因此，在所述寡聚顆粒上的表位是高免疫原性的。所以，本發(fā)明還涉及寡聚顆粒上的表位，與不是按照本發(fā)明生產的HCV-欣一即不是通過去垢劑輔助顆粒形成產生的HCV-肽相比，所述表位的免疫原性至少高IO倍，優(yōu)選至少高20倍，優(yōu)選至少高50倍，優(yōu)選至少高100倍，優(yōu)選至少高500倍，最優(yōu)選高1000倍。本領域技術人員應該認識到，例如能夠;f企測所述免疫原性，并因此可通過給予相似量的用以上兩種方法中的每一種方法生產的肽免疫哺乳動物，對免疫原性進行比較。而且，所述術語"特異性抗體"也是指針對純化的單一HCV包膜蛋白產生的抗體。本文使用的術語"抗體"是指多克隆或單克隆抗體。術語"單克隆抗體"是指具有均一抗體群的抗體組合物。術語'"抗體"不受限于所述抗體的物種或來源，也不受限于其制備方法。此外，術語"抗體"也指人源化抗體，其中免疫球蛋白構架區(qū)的至少一部分得自人免疫球蛋白序列和單鏈抗體，例如如美國專利第4,946,778號所述，也指保持原抗體的抗原結合功能和特異性的抗體片段如F化、F(ab)2、Fv和其它片段。而且，本發(fā)明的另一特征是應用上迷寡聚顆?；蛏鲜鼋M合物檢測抗HCV包膜蛋白的抗體。本文使用的術語"用以檢測"是指適合用于檢測的本領域已知的任何分析。該術語特別指WO96/13590所述的任何免疫分析。在本發(fā)明中術語"肽"、"多肽"和"蛋白"交替使用。"多肽"是指氨基酸聚合物(氨基酸序列)，而不是指具體長度的所述分子。因此，寡肽包含在多肽定義中。應該理解的是，肽模擬物本身包括在術語"多欣"、"肽"和"蛋白"中。本發(fā)明還涉及應用本文所述寡聚顆粒誘導抗HCV的免疫，其特征為所述寡聚顆粒用作一系列的時間和化合物的一部分。關于這點，應該理解的是，術語"一系列的時間和化合物"是指以一定時間間隔給予個體用于刺激免疫應答的化合物。后一化合物可包含任何以下組分寡聚顆粒、HCVDNA疫苗組合物、HCV多肽。在該方面，系列給予包括以下任何一種給予方法(I)以一定時間間隔給予HCV抗原例如寡聚顆粒，或(II)HCV抗原例如寡聚顆粒聯(lián)合HCVDNA疫苗組合物給予，其中所述寡聚顆粒與所述HCVDNA疫苗組合物可以同時給予，或以不同時間間隔包括以變化的時間間隔給予，或(III)(I)或(II)可結合其它HCV肽以一定時間間隔給予。在該方面，應該清楚的是，HCVDNA疫苗組合物包括編碼HCV包膜肽的核酸，所述包膜肽包括El-、E2-、El/E2-肽、Els肽、SEQIDNO13、SEQIDNO14、NS3肽、其它HCV肽、或所述肽的部分。而且，需要理解的是，所述HCV肽包括HCV包膜肽，包括El-、E2-、El/E2-肽、Els肽、SEQIDNO13;SEQIDNO14、NS3欣、其它HCV肽、或所述肽的部分。術語"其它HCV肽"是指任何HCV肽或其片段，前提是所述HCV肽不是E1、E2、Els、SEQIDNO13、SEQIDNO14或NS3。在上述方案的第II項中，所述HCVDNA疫苗組合物優(yōu)選包含編碼HCV包膜肽的核酸。在上述方案的第II項中，所述HCVDNA疫苗組合物甚至更優(yōu)選包括編碼HCV包膜肽的核酸，它可結合HCV-NS3DNA疫苗組合物。在該方面，應該清楚的是，HCVDNA疫苗組合物包含含可操作性連接至轉錄調節(jié)元件、編碼上述HCV肽的多核苷酸序列的質粒載體。本文使用的術語"質粒載體"是指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。優(yōu)選的載體為能夠自主復制和/或表達與其連接的核酸的質粒。一般來說，質粒載體是其載體形式不與染色體結合的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)，但是不限于此。本文使用的"多核苷酸序列"是指諸如脫氧核糖核酸(DNA)以及適當時的核糖核酸(RNA)的多核苷酸。也應該理解的是該術語包括為同等物的根據(jù)核苷酸類似物制得的RNA或DNA類似物以及單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。本文使用的術語"轉錄調節(jié)元件"是指含有必需的調節(jié)元件的核苷酸序列，這樣當導入活的脊推動物細胞時，它能夠指導細胞器生產所述多核苷酸編碼的翻譯產物。術語"可操作性連接的"是指其中裝配所述組分以便實現(xiàn)其常規(guī)功能的一種并列。因此，可搡作性連接至核苷酸序列的轉錄調節(jié)元件能夠實現(xiàn)所述核苷酸序列的表達。本領域技術人員可認識到，可以成功使用不同的轉錄啟動子、終止子、攜帶載體或特異性基因序列。最后，本發(fā)明涉及檢測HCV抗體的免疫分析，該免疫分析包括(1)提供本文定義的寡聚顆?；蚣兓膯我籋CV包膜蛋白，或其功能等同物，(2)將生物樣品與所述寡聚顆?；蛩鯤CV包膜蛋白在允許形成抗體-抗原復合物的條件下進行溫育，(3)確定是否形成包含所述寡聚顆?；蛩鯤CV包膜蛋白的所述抗體-抗原復合物?，F(xiàn)在將參照闡明特別有利的實施方案的以下實施例說明本發(fā)明。但是，值得注意的是，這些實施方案僅僅是說明性的，而不能解釋為以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例l:HCVE1蛋白的表達、純化和去垢劑輔助的同型寡聚反應按照Maertens等(PCT/EP94/0303l)所述方案采用重組痘苗病毒pvHCV-llA從RK13細胞表達以及純化HCVEls蛋白(氨基酸192-326)。另外，將表觀分子量相當于El同型二聚體(約60kDa,圖1)的純化的El蛋白的3%Empigen-BB合并，然后再將合并的流分加樣于尺寸排阻層析柱(按照PCT/EP95/03031)，在存在0.2%CHAPS或3%甜菜堿的情況下進行層析。令人驚奇的是，盡管EIS蛋白缺乏其膜錨區(qū)，但是用兩種去垢劑能夠獲得表觀分子量為260-280kDa的均一群體的特異性相關的E1同型寡聚體(圖2)。這樣的同型寡聚結構可含有約數(shù)目為9的Els單體。應該清楚的是，該單體數(shù)目是初步的估計，因為所述寡聚體的形狀可以明顯影響其以尺寸排阻層析測定的表觀分子量。當將0.2%CHAPS轉換為0.05%CHAPS并重復相同步驟，所述表觀分子量進一步漂移超過了所述柱的分離度(柱出現(xiàn)空隙，>600kDa,圖3),說明形成了顆粒。3%甜菜堿轉換為0.1%甜菜堿產生一群相似性質的Els寡聚體(資料未提供)。根據(jù)能夠實現(xiàn)相似的去垢劑輔助的寡聚反應可選用其它去垢劑。導致顆粒形成的寡聚反應不是CHAPS或甜菜堿獨有的，因為用吐溫-20或吐溫-80或辛基葡萄糖普可獲得相似的結果。而且進一步去除可能產生甚至更大的顆粒的去垢劑也是可能的。所以可能不再需要存在去垢劑以獲得顆粒。用例如SCC而不用任何去垢劑可以獲得所述顆粒。值得注意的是，El單體約31kDa,而E2單體約70kDa。但是這些值可隨所述蛋白的糖基化狀態(tài)而不同。實施例2:用動態(tài)光散射分析Els的高級寡聚結構為了證實產生顆粒的意外結果，對按照實施例1制備的在0.05%'CHAPS和0.1%甜菜堿中的Els制劑或通過稀釋在0.5。/。甜菜堿中的制劑制備的在0.1%甜菜堿中的制劑進行動態(tài)光散射(DLS)分析。動態(tài)光散射技術檢測布朗運動并將其與顆粒大小聯(lián)系起來。顆粒越大，則布朗運動越慢。布朗運動的速率定義為稱為擴散系數(shù)的特性(通常用符號D表示)。根據(jù)擴散系數(shù)采用以下的Stokes-Einstdn方程計算顆粒大小d(H)二kT/3兀riD,其中d(H)為流體直徑，k為Boltzmann常數(shù)，T為絕對溫度，tj為粘度。值得注意的是，測定的直徑是指顆粒如何在一種流體中擴散的值。因此，它稱為流體直徑。擴散系數(shù)得自自相關函數(shù)(光的強度波動隨時間而變化)。所述儀器應用計算機控制的相關器自動計算自相關函數(shù)的強度。為了測定大小分布，校正上述自相關函數(shù)，獲得線性曲線，所逸儀器配有分析大小分布的計算機程序。但是，所述技術具有類似于稱為多角激光散射(MALLS)技術的限制性假設，據(jù)認為這兩種方法都不能獲得絕對值。DLS的大小分布結果應當解釋為半定量多分散性指標，而不是真正代表分布。將含有Els顆粒(80-400)AgEls/mlPBS-0.05%CHAPS,0.1%或0.5%甜菜堿)的樣品吸入配有10mWHeNe激光的LSP3.53DLS儀器(PolymerLabs)的檢測室中。圖4(Els的0.05%CHAPS)和圖5(Els的0.1%或0.5%甜菜堿)顯示分析讀數(shù)。這些分析確實證實了所獲得Els結構為球形、單分散顆粒的意外結果。在PBS/0.1。/。甜菜堿中的Els顆粒平均大小分布為21.3±4nm,在PBS/0.5。/。甜菜石成中顆粒大小分布為27.9±5nm,而Els在PBS/0.05%CHAPS中獲得的直徑為12.5nm。實施例3:采用電子顯微鏡分析大小和形狀采用1%乙酸雙氧鈾的標準陰性染色在碳穩(wěn)定的透明塑膠(formvar)柵格(formvargrid)上顯色10(ilEls(226pg/ml的PBS/0.05%CHAPS;和143嗎/ml的PBS/3。/。甜菜堿)。樣品上樣30秒，然后用dH20沖洗之后染色5秒，并進行照相(圖6)。統(tǒng)計學分析獲得以下結果在CHAPS中的Els顆粒的平均直徑為8.7±0.27nm(4.3-29.0范圍；95%CI5.4),在甜菜堿中的Els顆粒較不均一，平均直徑為9.7±0.55nm(4.3-40.5范圍；950/oCI11.0)。令人驚奇的是，最初SEC分析顯示其分子量為250-300kDa的3%甜菜堿制劑顆粒甚至較最初顯示分子量為>600kDa的0.05%CHAPS制劑顆粒更大。所以我們推測用3。/。甜菜堿獲得的中間體同型寡聚型Els可以隨時間形成更高級顆粒。該出人意外的結果指出了獲得更高級顆粒的其它可能性。顆粒大小分布(圖7)顯示CHAPS制劑是單分散，盡、管觀測到較大顆粒的拖尾現(xiàn)象(高至0.05%CHAPS的29nm)。因為在DLS分析中對較大顆粒估測過高，所以這些較大的顆粒雖然數(shù)目較少，但其存在可以解釋由DLS分析獲得的較大直徑(實施例2)。直徑的差異也可以用這樣的事實解釋DLS檢測運動的顆粒，而電子顯孩么鏡檢測靜態(tài)顆粒。應該清楚的是，以下實施例所示的這些制劑的免疫原性源自完整的所述制劑，并可能產生自平均、較小或較大顆粒，或它們的混合物。實施例4:免疫接種慢性感染HCVlb亞型的黑猩猩用El(氨基酸192-326)接種已用HCVlb亞型病毒株感染13年以上(免疫接種前5015天)的黑猩猩(Phil),所述El得自不同lb基因型病毒抹，在氨基酸水平上的同一性為95.1°/。(另參見表2)，并按實施例l-3所述制備。黑猩猩總共接受6次肌內免疫接種，每次按照生產商的方案(RibiInc.Hamilton,MT)注射50[ig在與RIBIR-730(MPLA+TDM+CWS)混合的PBS/0.05%CHAPS中的El。6次免疫接種以3次注射的兩個系列給予，每次注射間隔3周，兩個系列之間的遲滯期為6周。在免疫接種前150天開始、免疫接種期間直到免疫接種后1年(但是參見下文)，連續(xù)檢測該黑猩猩的各種顯示HCV誘導的疾病活動的參數(shù)。這些參數(shù)包括血液化學ALT、AST、丫GT,血清病毒負荷，肝臟病毒負荷和肝臟組織學。另外，在體液水平和細胞水平監(jiān)測對免疫接種的免疫應答。在此期間，還要監(jiān)測動物的免疫接種的任何副作用，例如行為變化、臨床癥狀、體重、體溫和局部反應(紅、腫、硬結)。未檢測到這樣的副作用。只要抗E1的抗體水平達到最大，ALT(尤其是yGT,資料未提供)水平明顯下降(圖8)。只要所述抗體的水平開始下降，ALT就非常迅速地反彈，但是只要抗E1仍然可檢測到，yGT就保持在較低水平。在其中抗E1可檢測到期間，肝臟的E2抗原下降至幾乎檢測不到的水平，而在這些抗體消失后不久所述E2抗原反彈。在核心抗原和E2抗原在肝臟中檢測不到的同時，肝臟炎癥也明顯減輕(另參見表3)。這是疫苗誘導肝臟損傷減輕的主要證據(jù)，這可能是因為將病毒抗原從其主要靶器官肝臟清除了、至少是部分清除了。用AmplicorHCV監(jiān)測器(Roche,Basel,瑞士)監(jiān)測的血清病毒血癥水平在整個研究期間大致無變化。體液應答的更詳細的分析顯示，最大終點效價達到14.5x103(在第6次免疫接種后)，此效價在免疫接種后1年降至檢測不到的水平(圖8)。圖9顯示，可由肽模擬、B細胞識別的主要表位位于E2的N末端區(qū)(肽V1V2和V2V3,詳見表4所用的肽)。因為對重組E1的反應性更高更持久，所以也可以根據(jù)該圖推論，識別這些肽的抗體僅僅代表抗E1的總抗體群的部分。其余部分針對肽不能模擬的表位，即不連續(xù)表位。這樣的表位僅存在于完整的El分子上甚或僅存在于顆粒樣結構上。這樣的針對E1的免疫應答是獨特的，至少與在人慢性HCV攜帶者(Maertens等的WO96/13590)和黑猩猩(vanDoom等，1996)中通常觀測到的相比，它在其天然感染過程中升高抗E1抗體。在這些患者中，抗E1也部分針對不連續(xù)表位，但是大部分是針對C4表位(±50%患者血清)，小部分是針對V1V2(2-70%范圍，取決于所述基因型)，對V2V3的反應性僅僅例外地記錄到(Maertens等，1997)。T細胞反應性分析表明，所述疫苗也以特定方式刺激免疫系統(tǒng)的該部分，因為這些T細胞的刺激指數(shù)從1升高至2.5,而且在后續(xù)期間保持略微升高(圖10)。就是此T細胞反應性僅見于干擾素治療的長時性反應者(參見Leroux-Roels等的PCT/EP94/03555;Leroux-RoeLs等，1996)。實施例5:用不同亞型免疫接種慢性HCV攜帶者-用lb基因型的El接種已用la基因型HCV感染IO年以上(免疫接種前3809天)的黑猩猩(Ton),所述El在氨基酸水平上的同一性僅為79.3%(另參見表2),并按前述實施例所述制備。該黑猩猩總共接受6次肌內免疫接種，每次按照生產商的方案(RibiInc.Hamilton,MT)注射50嗎在與RIBIR-730混合的PBS/0.05%CHAPS中的El。6次免疫接種以3次注射的兩個系列給予，每次注射間隔3周，兩個系列之間的遲滯期為4周。在免疫接種前250天開始、免疫接種期間直到免疫接種后9個月(但是參見下文)，連續(xù)檢測該黑猩猩的各種顯示HCV誘導的疾病活動的參數(shù)。這些參數(shù)包括血液化學ALT、AST、丫GT,血清病毒負荷，肝臟病毒負荷和肝臟組織學。另外，在體液水平和細胞水平監(jiān)測對免疫接種的免疫應答。在此期間，還要監(jiān)測動物的免疫接種的任何副作用，例如行為變化、臨床癥狀、體重、體溫和局部反應(紅、胂、硬結)。未檢測到這樣的副作用。只要抗E1的抗體水平達到最大，ALT(尤其是yGT,資料未提供)水平明顯下降(圖11)。只要所述抗體的水平開始下降，ALT和yGT就反彈，但是在整個后續(xù)期間ALT和yGT保持校低水平。與免疫接種前(85±11U/l)相比，免疫接種后ALT水平(62士6U/1)甚至顯著下降。因為在血清中較少組織損傷標記恢復，所以這些發(fā)現(xiàn)首次表明，免疫接種誘導肝臟疾病的改善。在其中抗E1仍然高于1.0x103效價期間4企測不到E2抗原水平，^旦是在較低El抗體水平時又可4全測到E2抗原水平。HCV抗原消失的同時，肝臟炎癥也從中度慢性活動性肝炎顯著減輕為最輕型的慢性遷延性肝炎(表3)。這是疫苗誘導肝臟損傷減輕的另一個主要證據(jù)，可能是因為將所述病毒從其主要靶器官肝臟清除了、至少是部分清除了。用AmplicorHCV監(jiān)測器(Roche,Basel,瑞士)監(jiān)測的血清病毒血癥水平在整個研究期間保持在大致相似的水平。體液應答的更詳細的分析顯示，達到的最大終點效價是30x103(在第6次免疫接種后)，此效價在免疫接種后9個月降至0.5x103(圖11)。圖12顯示，可由肽沖莫擬和B細胞識別的主要表位位于N末端區(qū)(肽V1V2和V2V3，詳見表4所用的肽)。因為對重組E1的反應性更高更持久，所以也可以才艮據(jù)該圖推論，識別這些肽的抗體僅僅代表抗El的總抗體群的部分。其余部分最可能是針對肽不能模擬的表位，即不連續(xù)表位。這樣的表位僅存在于完整的El分子上甚或僅存在于顆粒樣結構上。針對El的這樣的免疫應答是獨特的，至少與在可;f全測到抗El的人慢性HCV攜帶者中通常觀測到的相比。在這些患者中，抗E1也部分是不連續(xù)的，但是大部分是針對C4表位(土50。/。患者血清)，小部分是針對V1V2(2-70%范圍，取決于所述基因型)，對V2V3的反應性僅僅例外地記錄到(Maertens等，1997)。因為此黑猩猩感染la分離抹，所以也評價了針對El-la抗原的交叉反應性的抗體應答。由圖13可見，確實產生了這樣的交叉反應抗體，盡管它們僅占總抗體群的部分。肝臟病毒抗原的重新出現(xiàn)與血清可監(jiān)測抗laEl抗體的消失之間的相關性是顯著的。T細胞反應性分析表明，所述疫苗也以特定方式刺激免疫系統(tǒng)的該部分，因為這些T細胞的刺激指數(shù)從0.5升高至5，而且在后續(xù)期間保持高水平(圖14)。實施例6:用El再次加強免疫HCV慢性攜帶者因為如在實施例4和5中所觀測到的El抗體效價不穩(wěn)定且隨時間而降低，甚至在.lb感染的黑猩猩中降至檢測不到的水平，所以需要研究該抗體應答是否能夠通過額外的加強接種增強。兩只黑猩猩均再次以間隔3周的3次連續(xù)肌內免疫接種(50卩LgEl,與RIBI佐劑混合)免疫。根據(jù)圖8和11可判斷，抗E1應答的確能夠被加強，肝臟的病毒抗原再次降低到4全測限制水平以下。盡管在丁on中，血清病毒負荷仍然恒定不變(圖11)。在后續(xù)期間首次檢測到病毒血癥水平<105基因組相當量/ml-。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，如第一系列免疫接種的已有情況，lbHCV病毒抹感染的黑猩猩(Phii)應答的抗El效價比laHCV病毒抹感染的黑猩猩的應答效價4氐(第一輪的最大效價Phil為14.5x103,Ton為30x103;在額外的加強免疫后，Phil僅為1.2x103,Ton為48x103)。盡管兩只黑猩猩的有益效應似乎相似，但是根據(jù)此試驗可以得出結論用得自另一亞型或基因型的E1蛋白免疫接種慢性攜帶者可能特別有益于達到較高的效價，可能避免了宿主存在的而且是由感染亞型或基因型誘導的預先存在的特異性免疫抑制。另一方面，在類似環(huán)境(lb疫苗+lb感染)中觀測到低效價可能表明大量抗體與病毒結合。所以所述誘導的抗體可能具有中和能力。實施例7a:構建結合已知與控制感染有關的主要表位的NS3蛋白除了El中的所述表位之外，其它表位也可能與急性期清除HCV或干擾素治療有關。幾種這樣的表位定位于NS3中(Leroux-Roeld等，1996;Rehermann等，19%和1997;Diepolder等，1995和1997)。兩種主要的表位是Rehermann和助手作圖的CTL表位(氨基酸1073-1081)和Diepolder和助手作圖的T細胞(CD斗)表位(氨基酸1248-1261)。遺憾的是，這些表位分散在整個NS3蛋白上。為了獲得至少這些可用的表位，需要較大的蛋白(氨基酸1073-1454)。產生這樣的大蛋白通常產量低，并在疫苗接種時產生僅小部分是針對重要表位的應答。所以，生產較小的蛋白應該更好解決此問題。為了這樣做，需要將一些表位重新置于這樣的較小蛋白上。利用現(xiàn)有的認識，即另一個CTL表位(氨基酸1169-1177)與HCV清除無關(Rehermann等，1996,1997),設計NS3分子，它從氨基酸1166開始至氨基酸1468結束(表5)。該構建物已經包括了Weiner和助手以及Diepolder和助手描述的表位。通過將U67-U80區(qū)突變?yōu)?071-1084區(qū)序列，使不相關的CTL表位變?yōu)镽ehermann和助手發(fā)現(xiàn)的與病毒清除有關的表位。另外修飾該構建物以在位置1166含有蛋氨酸，從i^使得可以啟動翻譯。在大腸桿菌中將切除該蛋氨酸，因為其后4妻有丙氨酸。這樣，引入在天然NS3中不存在的新表位的限制降至最小。另一方面，如果該蛋白的表達繁復，可將CTL表位連接至氨基酸1468的C末端，詳見表(5。按Maertens等所述(PCT/EP99/02547;克隆19b;HCV氨基酸1188-1468用作原料)，分離并表達HCVNS-3片段編碼序列。將由Rehermarm描述的并不存在于19bNS-3片段中的CTL表位與該片段融合。構建N末端和C末端融合物，因為所述融合物對表達7K平、對蛋白水解破壞的敏感性和功能性的作用可能受所述表位的位置的影響。采用pIGRI2NS-3質粒作PCR模板，將分別與RehermannCTL表位的N末端和C末端融合的NS319b編碼序列(分別稱為NS-319bTn和NS-319bTc)首先亞克隆入pGEM-T(Promega)克隆載體中，產生載體pGEM-TNS-319bTn和pGEM-TNS-319bTc,其中所述質粒為在X嗜菌體的左側啟動子控制下表達NS-319b片段的大腸桿菌表達質粒。DNA序列分析證實PCR擴增的序列。在T細胞表位序列融合至NS-3的N末端區(qū)的情況下，采用帶有CTL表位的長有義引物和與NS-319b終止密碼子3'序列同源的短反義引物進行PCR。引物序列如下所示。引物卯38(有義)5'-GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3'(SEQIDNO5)引物1901(反義)5'-TTTTATCAGACCGC^^CTGCG-3,(SEQIDNO6)在C末端融合的NS-3的情況下，用與NS-319b起始密碼子5，序列同源的短有義引物和在框內終止密碼子之前帶有CTL表位的長反義引物進行PCR。'引物序列如下。引物102(有義)5'-AGCAAACCACCAAGTGGA-3'(SEQIDNO7)引物9039(反義)5'-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTCGCCAGGCTGAAGTCGACTOTCTGG-3'(SEQIDNO8)以克隆入pGEM-T栽體的編碼序列為原料，將NS-319bT序列插入pIGRI2大腸桿菌表達載體中。對于N末端融合的NS-319bT,分離作為379bpNcoI/SnaBI片^爻的NS-319bT編碼序列，并將其與載體、pIGRI2NS-3的SnaBI/AlIwNI和AlwNI/Nco1片l炎連4妻。產生載體pIGRI2NS-3Tn。對于C末端融合的NS-319bT,分離作為585bpSnaBI/Spel片段的NS-319bT編碼序列，并將其插入SnaBI/SepI斷開的載體pIGRI2NS-3,產生載體pIGRI2NS-3Tc。之后pIGRI2NS-3Tn和pIGRI2NS-3Tc載體均轉化至大腸桿菌表達菌抹MC1061(pAcI)中，在溫度誘導XPL啟動子后，采用多克隆兔抗NS-3血清以SDS-PAGE和蛋白質印跡分析表達水平。NS-319bTn蛋白的氨基酸序列MATdNGVCWTVYHGRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSFPAWQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTnTGAHTYSTYGKFLADGGCSGGAYDinCDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLJFCHSKKKCDEL^AKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS(SEQIDNOl)NS-319bTc蛋白的氨基酸序列MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTrTTGAPnTSTYGKFLADGGCSGGAYD邁CDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIP正VIKGGRHUFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVWVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLATCINGVCWTVYHG(SEQIDNO2)NS-319bTn編碼區(qū)的核苷酸序列ATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGG丁CGTGCGGC丁GTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAG丁CTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGG丁CTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATT〔ACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCrAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAAACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACnTGACTNO3)NS-319bTc編碼區(qū)的核苷酸序列ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGC八GACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATC人TAATCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTOCGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTTAA(SEQIDNO4)實施例7b:純化NS-319bTn和NS-319bTc蛋白得自錐形瓶培養(yǎng)的大腸桿菌細胞用細胞破碎器(CSL，B型)以1.4kbar在50mMTRIS,pH8中破碎。離心(15000g,30min,4°C)使該裂解物澄清。棄上清液，因為用于N末端和C末端構建物的NS3均回收在沉淀物中。結果所獲得的該沉淀物對于N末端構建物而言是高度穩(wěn)定的，在溶解之前可以徹底洗潦(第一次洗滌用2%十二烷基肌氨酸鈉、0.5M氯化胍和10mMDTT,第二次和第三次洗滌用1%TritonX-100、0.5M氯化胍和10mMEDTA)。C末端構建物的情況就不是如此。對N末端構建物進行進一步純化。洗滌的沉淀最終溶解于6M氯化胍/50mMNa2HP04，pH7.2中，并如Maertens等(PCT/EP99/02547)所述將其磺酸化。首先將所述磺酸化沉淀物在SephadexG25柱上對6M尿素/50mM三乙醇胺，pH7.5進行脫鹽，最后在相同的《爰沖組合物中以兩次連續(xù)的陰離子交換層析進行純化。第一次陰離子交換在HyperDQ(50jim)柱(BioSpraInc.Marlborough,Ma.USA)上進行，并在0.11-0.19MNaCl中回收NS3。稀釋后，將這些流分上第二個HyperDQ(20—柱(BioSpraInc.Marlborough,Ma.USA),并在含有0,125MNaCl的流分中回收NS3。將這些流分對6M尿素的PBS，pH7.5脫鹽。根據(jù)繼之以銀染色的SDS-PAGE估測最終純度>90%。用EDMAN降解的N末端測序表明該NS3具有完整的N末端，其中所述目的表位存在于正確序列中。還證實了用于起始翻譯的蛋氨酸按預定^7除。實施例8:構建沒有高變區(qū)I的E2蛋白已注意到對E2的HVRI區(qū)的免疫顯性同源應答。該應答在疫苗方法中幾乎沒有應用，因為疫苗方法是異源性建立(疫苗抹總是與現(xiàn)場抹不同)。所以誘導產生針對更保守但是免疫原性更小的E2區(qū)的抗體的E2蛋白必需缺失該區(qū)。通過《子細分析E2前導序列和E2高變區(qū)，從而設計用于表達沒有HVRI的E2蛋白的最理想的構建物。該構建物允許從位置氨基酸409而不是氨基酸384開始表達E2肽。使用El的C末端20個氨基酸作為前導序列。但是，因為關于該HVR的描述不明確，所以制備了第二種類型的構建物(從氨基酸412幵始)，它在右側位置被切割的可能性也非常高。中間體構建物pvHCV-99(另參見圖15和16)在所述表達盒中E2-715的編碼序列應該在E1前導信號肽之后，從Met364開始。所以，在含有具有長型El信號肽(從Met347開始)的E2-715HCVlb亞型的編碼序列的質粒pvHCV-92(圖15)中，用EcoRI和Ncol進行雙消化，然后用T4DNA聚合酶進行5，突出端的填平反應，從而制備缺失。連接所獲得平端(再環(huán)化6621bp片^R)，產生編碼與短E1前導信號肽(從Met364開始)相同的蛋白(E2-715)的質粒pvHCV-99。pvHCV-99以ICCG3635保藏于在病毒抹目錄〔strainlist)中。應該清楚的是，可以使用不同長度的HCV或異源信號序列。質粒pvHCV-100和-101應該在E2序列中含有缺失，即缺失高變區(qū)I(HVR-I)。在質粒pvHCV-100中，缺失氨基酸384(His)-408(Ala),而在質粒pvHCV-101中缺失氨基酸384(His)-41l(Ile)。構建pvHCV-100設計以下兩種寡核苷酸用于構建pvHCV-100:HCV-pr409[8749]:5'-CTTTGCCGGCGTCGACGGGCAGAAAATCCAGCTCGTAA-3'(SEQIDNO9)HCV-pr408[8750]:5'-TTACGAGCTGGATTTTCTGCCCGTCGACGCCGGCAAAG-3'(SEQIDNO10)用Gpt-pr[3757]和HCV-pr408[8750]PCR擴增(95°C變性5分鐘，30個周期的擴增包括55'C退火，72'C聚合反應1分鐘和95°C各變性1分鐘，72°C延長10分鐘)pvHCV-99模板獲得221bp片段，而用HCV-pr409[8749]和Tkr-pr[3756]擴增獲得1006bp片段。兩種PCR片段相互重疊19個核香酸。用Gpt-pr[3757]和Tkr-pr[3756]引物通過PCR裝配并擴增這兩種片段。產生的1200bp片段用EcoRI和HinDIII消化，并連接入EcoRI/HinDIII消化的pgsATA18[ICCG1998]載體(5558bp)中。通過限制酶切分析和序列分析對該構建物pvHCV-100進行分析，并將其在病毒抹目錄中以ICCG3636保藏。構建pvHCV-lOl設計以下兩種寡核苷酸用于構建pvHCV-101:HCV-pr411[8747]:5'-CTTTGCCGGCGTCGACGGGCAGCTCGTAAACACCAACG-3'(SEQIDNO11)HCV-pr410[8748〗5'-CGTTGGTGTTTACGAGCTGCCCGTCGACGCCGGCAAAG-3'(SEQIDNO12)用Gpt-pr[3757]和HCV-pr410[8748]PCR擴增pvHCV-99模板獲得221bp片段，而用HCV-pr411[8747]和Tkr-pr[3756]擴增獲得997bp片段。兩種PCR片段相互重疊19個核苷酸。用Gpt-pr[3757]和Tkr-pr[3756]通過PCR裝配并擴增這兩種片段。產生的1200bp片段用EcoRJ和HinDIII消化，并連接入EcoRI/HinDIII消化的pgsATA18[ICCG1998]載體(5558bp)中。通過限制酶切分析和序列分析對該構建物pvHCV-101進行分析，并將其在病毒抹目錄中以ICCG3637保藏。用序列分析檢查所有質粒，并將其保藏于Innogenetics病毒株目錄。對于每種質粒，在無菌條件下制備兩種基本DNA制劑(PLASmix),并將其合并。測定其DNA濃度，并用限制酶切分析進行QA。按Maertens等(PCT/EP95/0303l)所述采用純化的DNA產生重組痘苗病毒。但是在WHO認證的Vero細胞中產生重組病毒vvHCV-100和vvHCV-101。經過兩輪的噬菌斑純化后，按Maertens等(PCT/EP95/03031)所述通過蛋白質印跡分析分析表達產物。采用特異性抗E2單克隆抗體(IGH212,可從在InnogeneticsN.V.,Zwijnaarde,比利時的本發(fā)明人處獲得)顯示蛋白，其中vvHCV-100的單克隆抗體的估測分子量為69和37kDa，vvHCV-101的單克隆抗體的估測分子量為68和35kDa。這些分子量表明存在糖基化和非糖基化兩種E2蛋白，這一點通過在進行蛋白質印跡分析之前用PNGaseF處理該樣品得到證實。所述處理使得分別檢測到vvHCV-100和vvHCV-101僅有37kDa和35kDa各一種蛋白。得自pvHCV-100的成熟E2的氨基酸序列QKIQLVNTNGSWHIN^TALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGrVPASQVCGPVYCFIPSPWVGTTDRFGVPTY而GANDSDVULNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHREEAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAWSLYK(SEQIDNO13)得自pvHCV-101的成熟E2的氨基酸序列QLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCdVPASQVCGPVYCFTPSPWVGTrDRPGVPTYNW.GANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFE"CNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTIlPALSTGIJHLHQNIVDyQYLYGVGSAWSLVIK_(SEQIDNO14)實施例9:免疫原性進一步改進的El顆粒如實施例1所述，按照Maertens等的PCT/EP95/03031所述方案純化Els蛋白。該方案包括用馬來酰亞胺衍生物(N-乙基馬來酰亞胺和生物素-馬來酰亞胺，均得自Sigma)共價修飾半胱氨酸(游離半胱氨酸和參與分子內橋的半胱氨酸，后者需要在用DTT還原這些半胱氨酸橋后進行修飾)。作為馬來酰亞胺封閉的替代方法，也可以評估活性卣素。這些化合物即活性卣素通過烷基化封閉游離半胱氨酸。作為實例可以評估活性卣素(碘乙酰胺，Merck)。相同的方案用于純化E1,如Maertens等(PCT/EP95/03031)所迷，4旦是用碘乙酰胺代替馬來酰亞胺化合物。用該方法獲得的Els蛋白在整個純化步驟過程中具有類似于所述馬來酰亞胺封閉蛋白的性質。在最后按實施例1所述降低去垢劑.濃度至0.05%CHAPS或轉換為0.5%甜菜堿時，按DLS測定，獲得相似的顆粒。但是當用該乙酰胺-修飾的Els免疫小鼠時見到了令人驚奇的效果。在總的3個系列的6只小鼠中，采取注射3次Els免疫每只小鼠，每次間隔3周，每次注射包括5iLigEls(100fig/mlPBS)，并S奪其與等體積RIBI佐劑(R-700)混合。第一個系列接受用0.05°/。CHAPS配制.的El-馬來酰亞胺，第二個系列接受也是用0.05%CHAPS配制的El-馬來酰亞胺，而第三個系列接受用0.12%甜菜堿配制的El-乙酰胺。最后，在第三次免疫后10天從所有小鼠取血。分別測定每只動物針對El-馬來酰亞胺和El-乙酰胺的終點效價(定義為仍然產生高寸本底值2倍的OD值的血清的稀釋度)。圖17顯示這些終點效價，以均值和標準差表示。接受El-馬來酰亞胺的小鼠僅建立能夠識別含有馬來酰亞胺的表位的抗體應答(對El-乙酰胺根本沒有反應性)，顯然，^接受E1-乙酰胺的小鼠建立針對真正的El表位的抗體應答，因為所述抗體對E1-乙酰胺和E1-馬來酰亞胺均有反應性。在其它試驗中清楚地證實了定E1特定區(qū)的抗體。結果示于圖18,證實用E1-乙酰胺(CHAPS和甜菜堿配制的)免疫的小鼠的確建立了能夠識別肽V1V2、V2V3、V3V4、V5C4、C4V6的抗體應答。因為V6不是Els的組成部分，所以我們可以得出結論針對C4、V3(V3V4是陽性，而V4V5是陰性)和V1V2產生抗體。用Els-馬來酰亞胺免疫的小鼠僅建立針對V1V2和V2V3肽的非常低的應答。這再次強調了這樣的事實檢測到的相當高效價的這些抗馬來酰亞胺-Els的小鼠抗體主要針對馬來酰亞胺依賴性表位。另外，我們能夠證實Els-乙酰胺誘導的應答部分屬于Thl型，因為大量的誘導抗體屬于IgG2(a+b)亞型。甚至甜菜堿制劑的IgG2量高于CHAPS制劑(圖19)。根據(jù)這些結果可得出結論其中至少一個半胱氨酸(但是可能多于一個半胱氨S^)烷基化的HCV包膜蛋白是免疫原性非常強的蛋白。所以用甜菜堿配制的乙酰胺修飾的El也用來再加強免疫黑猩猩Phil和Ton。以間隔3周的兩次連續(xù)的肌內免疫接種(50jig與RIBI佐劑混合的El，見實施例4和5)再次免疫兩只黑猩猩。根據(jù)圖20和21可判定，的確能夠再次加強抗El應答，注射2次后達到的應答水平高于先前的免疫接種獲得的水平。相對于標準品進行滴定，標準品為3種人高效價抗El血清(得自慢性HCV攜帶者)的混合物。這些血清的抗El效價定義為1單位/ml。在黑猩猩Phil(圖20)中，在2次免疫接種后僅誘導2倍于人攜帶者的效價。在黑猩猩Ton(圖21)中誘導的效價增高高達140倍。這再次強調了這些El-顆粒的高免疫原性。實施例10:烷基化El具有高品質的診斷用途進一步評價作為檢測人慢性HCV攜帶者血清樣品中的抗El抗體的抗原的實施例9所述的Els-乙酰胺。例如將這些抗原結合至LIA-膜，而且基本上按Zrein等(1998)所述處理條帶。首先評價72個血液供者的血清樣品，以確定能夠用于所述分析的El抗原的最適濃度，以便排除"假"陽性。證實Els-馬來酰亞胺的最適濃度為8(ig/ml,而Els-乙酰胺的濃度高至50嗎/ml也不會產生假陽性結果(沒有樣品顯示相對染色高于0.5)。Els-馬來酰亞胺和Els-乙酰胺最適濃度分別采用8(ig/ml和50jig/ml，對24份HCV慢性攜帶者血清篩選抗Els抗體。如表6所示，Els-乙酰胺明顯導致更多的樣品評價為陽性(67。/。，而Els-馬來酰亞胺為38%)。沒有發(fā)現(xiàn)只有Els-馬來酰亞胺評價陽性的樣品。對于Els-馬來酰亞胺和Els-乙酰胺評價均陽性的樣品，后者的反應性更高。根據(jù)本實施例可以得出結論烷基化HCV包膜蛋白與馬來酰亞胺修飾的包膜蛋白相比，是檢測人抗體的更好抗原。實施例11:產生含有El和E2的混合顆粒按Maertens等的PCT/EP95/030301所述產生并純化Els和E2s(vvHCV-44)，實際上不同的是以采用碘乙酰胺的烷基化代替馬來酰亞胺修飾。將單獨的或等摩爾混合物的Els和E2s的3%empigen進樣于用PBS/0.2%CHAPS平衡的Superdex-200PC3.2/30柱上。設計該柱以用于尸/a，ac/fl丄X5(瑞典)的5"M4irHPLC儀器。利用3種不同的夾心ELISA篩選各個流分。對于這些ELISA,以2pg/ml包被El-(IGH207)和E2-(IGH223)特異性單克隆。溫育稀#%2500倍的凝膠過濾流分。將兩種綴合生物素的其它El(IGH200)和E2(IGH212)單克隆用于檢測結合抗原。鏈霉親合素-HRP/TMB體系用于使結合的生物素變?yōu)榭稍?50nm檢測的黃色。在同種組合(抗El包被/抗El檢測或抗E2包被/抗、戸2檢測)和異種組合(抗El包被/抗E2檢測)中使用上述ELISA體系。后者在理論上只檢測其中El和E2均加入的顆粒。合并活性流分，在10kDa濾器上濃縮，再在PBS/0.05%CHAPS平衡的Superdex-200上層析。采用不同的ELISA組合測試所有這些流分的反應性。根據(jù)圖22可以判定,與單獨的E1相比，El中加入E2不會導致保留時間的明顯改變，表明確實仍然存在顆粒。這些顆粒含有E1和E2兩者，因為只有在這種組合中異種ELISA評價為陽性。實施例12:產生含有兩種不同基因型的El的混合顆粒按Maertens等的PCT/EP95/030301所述產生并純化lb基因型和4基因型的Els(vvHCV-72),實際上不同的是對lb基因型以采用碘乙酰胺的烷基化代替馬來酰亞胺修飾。將單獨的或等摩爾混合物的Els-lb和Els-4的3%empigen進樣于用PBS/0.2%CHAPS平衡的Superdex-200PC3.2/30柱上。該柱i殳計成和戶/7armadflZJG5(瑞典)的SM47r^HPLC儀器共用。合并含有主要蛋白的流分，在10kDa濾器上濃縮，再在PBS/0.05%CHAPS平衡的Superdex-200上層析。采用僅檢測含有兩種基因型的El的顆粒的ELISA組合測試所有這些流分的反應性。對于此ELISA，以2嗎/ml包被鏈霉親和素。溫育稀釋2500倍的凝膠過濾流分。只識別1和IO基因型的El的El單克隆抗體(IGH200)用于檢測所述結合抗原。山羊抗小鼠-HRP/TMB體系用于使所述分析物變?yōu)榭稍?50nm檢測的黃色。4艮據(jù)圖23判定，El-lb中加入El-4不會導致所述蛋白保留時間的明顯改變，表朋確實仍然存在顆粒。這些顆粒含有兩種E1蛋白，即lb基因型和4基因型的Els,因為只有在這種組合中ELISA評價為陽性。參考文獻一覽表DeleersnyderV.,PillezA.，WychowskiC.,BlightK.,XuJ.,HahnY.S.,RiceC.M.，DubuissonJ.,天然丙型肝炎病毒糖蛋白復合物的形成，J.Virol.1997:71:697-704。DiepolderHM，ZachovalR,HoffmannRM,WierengaEA,SantantonioT,JungMC，EichenlaubD,PapeGR.，在急性丙型肝炎病毒感染的病毒清除中T淋巴細胞應答非結構蛋白3的可能機制，Lancet1995:346:1006-1007。DiepolderHM,GerlachJT，ZachovalR,HoffmannRM,JungMC,WierengaEA,ScholzS,SantantonioT,HoughtonM，SouthwoodS,SetteA,PapeGR.,在急性丙型肝炎感染的非結構蛋白3中的免疫顯性CD4十T細月包表4立，J.Virol.,1997:71:6011-6019。Fancy,D.A.,Melcher,K.，Johnston,S.T.和Kodadek,T.,研究多蛋白復合物的新化學六組氨酸標記用作蛋白交聯(lián)劑的受體，ChemBiol(1996)3:551-559。G.T.Hermanson述于BioconjugateTechniques(1996)第I部分第1.43節(jié)和第2.2.1節(jié)，AcademicPressSanDiegoCA,USA。HoughtonM.，HCV免疫疫苗石幵制情況，第四屆國際丙型肝炎病毒和相關病毒會議，衛(wèi)星專題會議預防和治療HCV感染的,斤方法，1997年3月7日，東京，曰本。Leroux-RoelsG,EsquivelCA,DeLeysR,StuyverL,ElewautA,PhilippeJ,DesombereI,ParadijsJ,MaertensG,在用ct干4尤素治療的'I"曼寸生丙型肝炎感染的患者中對丙型肝炎病毒核心蛋白、El、E2和NS3的淋巴增殖性應答，Hepatology1996:23:'8-16。MaertensG.和StuyverL.,丙型肝炎病毒的基因型和基因變務，述于病毒性肝炎的分子醫(yī)學，編輯HarrisonTJ.和ZuckermanA.J.1997。MajorM.E.和FeinstoneS.M.,丙型肝炎的分子病毒學，kep—atology1997:25:1527-1538。MaertensG.，DeplaE.,DucatteeuwA.,VandeponseeleP.,BosmanF.,VennemanA.,deMartynoffG.,StuyverL.,DekeyserF.,VandeperreB.,ZreinM.和BuyseM,A.,Hepatology1997:26:186A。RehermannB,ChangKM,McHutchinsonJ,KokkaR,HoughtonM，Rice'CM,ChisariFV.,在慢性感染患者中不同細胞毒性T淋巴細胞對乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的反應性，JVirol199670:7092-7102。RehermannB,TakakiA，LiebetrauA,LudaS,SeifertU，SalhaK,MannsM,WieseM,在單一來源性HCV感染暴發(fā)后18年的患者中細胞毒性和輔助性T細胞應答的特征，Hepatology,1997:26:406A。Sambrook,J.,Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989),分子克隆，實驗室手冊，第二版，ColdSpringHarborUniversityPress,ColdSpringHarbor,NY,USA。vanDoomU,KleterB,PikeI,QuitW.,丙型肝炎病毒分離抹的血清型和基因型發(fā)現(xiàn)，JClinMicrobiol1996;34:1784-1787。VillaE.，ButtafocoP.,GrottolaA.,ScarcelliA.,GianniniF.,ManertiF.,抗HCV的中和抗體肝移植實驗模型，J.Hepatol.1998:28:WeinerAJ,EricksonAL，KansoponJ,CrawfordK,MuchmoreE,HoughtonM，WalkerCM，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)逃逸突變與遷延型丙型肝炎病毒(HCV)感染的關系，PrincessTakamatsuSymp,1995:25:227-235。YiM.,NakamotoY.,KanekoS.,YamashitaT.，MurakamiS.,丙型肝炎病毒E1和E2雜聚締合重要區(qū)圖解，Virol.1997a:231:119-129。Zauberman，A.,Nussbaum,O.,Ilan,E.,Eren,R.,Ben-Moshe,O.,Arazi,Y.,Berre，S.，Lubin,I.，Shaouval,D.，Galun，E.,Reisner,Y.和Dagan,S.,trimera小鼠系統(tǒng)丙型肝炎病毒感染和評價治療藥物的小鼠模型，1999年6月6-9日，口月l4.3.，載于第六屆國際丙型肝炎病毒感染和相關病毒專題會議，BethesdaUSA。Zrein,M.,Louwagie，丄，Boeykens,R，Govers,L.，Hendrickx,G.，Bosman，F(xiàn).，Sablon,E"Dema甲illy,C.,Boniface,M.禾口Saman,E.(1998),對用于人嗜T淋巴細胞病毒感染的血清學證實和鑒別的新免疫分析的評價，Clin.Diagn.Lab.Imm.5:45-49。表1.HCV-B的Els共有序列AA位置^200233235251253271293298304313314322區(qū)VIV3V3V4V4HR孤V5C4C4C4C4HCV-JISFS1LFY*VS-HCV-BomMNSAVFIHCITMHCC19A.....LHCC19B-D......Y-—-HCC19C...........THCC隱............HCC隨-D-I.......HCC11U............HCC111B-----HCCI14............HCCI17.---I.......P50，14*沒有標示完全保守的、Els的氨基酸192-326之間的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表5*氨基酸1188MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAK...建議序列GGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGVAK...天然序列雙下劃線基本CTL表位單下劃線周圍其它天然氨基酸所述表位及其周圍氨基酸在C末端直接連才妄VDFSLATCINGVCWTVYHG建議序列VDFSLDPTFTIETITLPQD天然序列氨基酸1468表6<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>權利要求1.主要包括HCV包膜蛋白而且其直徑為1-100nm的寡聚顆粒。2.按照權利要求1的寡聚顆粒，其直徑為2-40nm。3.按照權利要求1或2中任一項的寡聚顆粒，其中所述HCV包膜蛋白的氨基S交序列為產生自分離株-、亞型-、病毒抹-或種屬-共有序列的共有序列。4.按照權利要求1-3中任一項的寡聚顆粒，它們可能含有非-HCV-表位。5.按照權利要求l-4中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基^皮烷基化。6.按照權利要求5的寡聚顆粒，其中所述半胱氨酸殘基借助于活性卣素、乙烯亞胺或N-(碘乙基)三氟乙酰胺進行烷基化。7.按照權利要求1-4中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白的至少一個半胱氨酸殘基突變?yōu)樘烊话被?，所述天然氨基酸?yōu)選選自蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸。8.按照權利要求l-7中的任一項的寡聚顆粒，其中所迷包膜蛋白為HCVE1蛋白或其部分。9.按照權利要求1-7中的任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白為HCVEls蛋白或其部分。10.按照權利要求1-7中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白為HCVE2病毒或其部分。11.按照權利要求1-7中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白為SEQIDNo13和/或SEQIDNo14或它們的部分。12.按照權利要求1-11中任一項的寡聚顆粒，其中所迷包膜蛋白由分離的核苷酸共有序列、亞型核苷酸共有序列、種核苷酸共有序列或屬核苷酸共有序列或它們的部分編碼。13.按照權利要求1-7中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白　為HCVE1、HCVEls、HCVE2蛋白和/或SEQIDNol3和/或SEQIDNo14或它們的部分的混合物。14.按照權利要求1-13中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白或其部分得自不同的HCV病毒抹或基因型。15.按照權利要求1-14中任一項的寡聚顆粒，其中所述包膜蛋白或其部分為得自一種病毒抹或基因型HCV和至少一種其它病毒株或基因型HCV的HCV包膜蛋白組成的混合物。16.按照權利要求1-15中任一項的寡聚顆粒，可用具有以下步驟特征的方法制得I-純化HCV包膜蛋白溶液，-可能包括使用一種任選的第一種去垢劑，-可能包括使用二硫鍵裂解劑，-可能包括使用烷化劑，II-用去垢劑或鹽置換所述純化HCV包膜蛋白的所述溶液，產生寡聚顆粒，III-純化所述置換后生成的寡聚顆粒，-可能包括進一步降低步驟II的去垢劑或鹽的濃度。17.按照權利要求16的寡聚顆粒，其中所述任選的第一種去垢劑為Empigen-BB,其中所述步驟II的去垢劑為CHAPS、辛基葡萄糖苷(octylglucaside)、吐溫或任何其它去垢劑，其中所述鹽為甜菜^4。18.按照權利要求16或17中任一項的寡聚顆粒，其中所述Empigen-BB的使用濃度為1%-10%，其中所述CHAPS或吐溫的使用濃度為0.01%-10%,或所述甜菜^威的使用濃度為0.01%-10%。19.生產權利要求卜14中任一項的寡聚顆粒的權利要求16-18中任一項的方法。20.生產權利要求1-14中任一項的寡聚顆粒的方法，其特征在于以下步驟I-純化HCV包膜蛋白溶液，-可能包括使用一種任選的第一種去垢劑，-可能包括使用二硫鍵裂解劑，-可能包括使用烷化劑，II-用去垢劑或鹽置換所述純化HCV包膜蛋白的所述溶液，產生寡聚顆粒，III-純化所述置換后生成的寡聚顆粒，-可能包括進一步降低步驟n的去垢劑或鹽的濃度。21.按照權利要求20生產寡聚顆粒的方法，其中所述任選的第一種去垢劑為Empigen-BB,其中所述步驟II的去垢劑為CHAPS、辛基葡萄糖苷、吐溫或任何其它去垢劑，其中所述鹽為甜菜堿。22.按照權利要求20或21任一項生產寡聚顆粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用濃度為1%-10%，其中所述CHAPS或吐溫的使用濃度為0.01%-10%,或所述甜菜^威的^f吏用濃度為0.01%-10%。23.包含權利要求1-22中任一項的寡聚顆粒的組合物。24.權利要求23的組合物，它還包含HCV核心蛋白、P7、El、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B蛋白或其部分。25.權利要求24的組合物，其中所述NS3蛋白或其部分具有SEQIDNo1或SEQIDNo2所示的氨基酸序列。26.權利要求1-25中任一項的寡聚顆粒的用途，該用途為用于生產HCV疫苗組合物。27.權利要求1-25中任一項的寡聚顆粒的用途，該用途為用于在慢性HCV攜帶者誘導抗HCV的免疫。28.權利要求27的寡聚顆粒的用途，該用途用于在任何其它治療之前、同時或之后在慢性HCV攜帶者誘導抗HCV的免疫。29.權利要求27的寡聚顆粒的用途，該用途用于在肝移植之前或之后、或在推定感染后在HCV感染個體誘導抗HCV免疫。30.權利要求1-28中任一項的寡聚顆粒的用途，該用途用于預防性誘導抗HCV的免疫。31.權利要求1-28中任一項的寡聚顆粒的用于誘導抗HCV免疫的用途，其特征為所述寡聚顆?；蛩鼋M合物用作一系列時間與化合物的一部分。32.用作HCV疫苗的權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蚪M合物。33.用于在慢性HCV攜帶者中誘導抗HCV免疫的權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蚪M合物。34.用于在任何其它治療之前、同時或之后在慢性HCV攜帶者中誘導抗HCV免疫的權利要求33的寡聚顆?；蚪M合物。35.用于在肝移植之前或之后、或在推定的感染之后在HCV感染個體中誘導抗HCV免疫的權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蚪M合物。36.用于預防性誘導抗HCV免疫的權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蚪M合物。37.用于誘導抗HCV免疫的權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蚪M合物，其特征在于所述寡聚顆粒是一系列時間與化合物的一部分。38.純化的單一HCV包膜蛋白。39.權利要求38的純化的單一HCV包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是E1或Els。40.含有權利要求38或39中任一項的純化的單一HCV包膜蛋白的纟且合物。41.用作HCV疫苗的權利要求40的組合物。42.用作HCV疫苗的權利要求40的組合物的用途。43.用于生產HCV疫苗的權利要求40的組合物的用途。44.針對權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；蜥槍嗬?8-40中任一項的純化的單一HCV包膜蛋白產生的特異性抗體。45.用于治療或預防HCV感染的權利要求44的特異性抗體的用途。46.用于檢測HCV抗原的試劑盒，它包括權利要求44的特異性抗體。47.用于檢測生物樣品中存在的HCV抗體的試劑盒，它在合適的容器中含有權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；驒嗬?8-40中任一項的純化的單一HCV包膜蛋白。48.檢測HCV相關性T細胞應答的試劑盒，它包括權利要求1-25中任一項的寡聚顆?；驒嗬?8-40中任一項的純化的單一HCV包膜蛋白。49.檢測HCV抗體的免疫檢測法，所述免疫4企測法包括(1)提供權利要求1-25中任一項的寡聚顆粒或權利要求38-40中任一項的純化的單一HCV包膜蛋白，或它們的部分，(2)將生物樣品與所述寡聚顆?；蛩鯤CV包膜蛋白在允許形成抗體-抗原復合物的條件下進行溫育，(3)檢測是否形成包含所述寡聚顆粒或所述HCV包膜蛋白的所述抗體-抗原復合物。全文摘要本發(fā)明涉及HCV包膜蛋白顆粒用于疫苗接種的用途。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)HCV包膜蛋白在慢性HCV感染的黑猩猩誘導有益的免疫應答。優(yōu)選采用以去垢劑輔助的方式生產的顆粒型HCV包膜蛋白進行疫苗接種。當將這樣的包膜蛋白給予慢性HCV攜帶者時，所述包膜蛋白具有高度免疫原性，并既刺激細胞免疫應答，又刺激體液免疫應答。文檔編號G01NGK101397335SQ20081010000公開日2009年4月1日申請日期1999年6月23日優(yōu)先權日1998年6月24日發(fā)明者A·波斯曼,E·德普拉,F·范韋寧戴勒,G·梅爾滕斯申請人:基因創(chuàng)新有限公司