專利名稱：Hsp70作為酶促活性調(diào)節(jié)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過利用分子伴侶Hsp70和溶酶體的磷脂二(單?；视?磷酸酯 (BMP，還被稱為LBPA)之間的相互作用來調(diào)節(jié)酶活性的領(lǐng)域。Hsp70-BMP相互作用調(diào)節(jié)了溶 酶體區(qū)室中與BMP相互作用的酶的活性，因此本發(fā)明提供了用于逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病理的方 式(means) 0
背景技術(shù)：
分子伴侶見于發(fā)生蛋白構(gòu)象重排的細(xì)胞的所有區(qū)室中，雖然蛋白合成是細(xì)胞內(nèi)不 折疊肽的主要來源，但當(dāng)面臨高溫或可能使蛋白結(jié)構(gòu)易變并由此易于不折疊和集聚的其它 刺激物的沖擊時(shí)，細(xì)胞利用包括產(chǎn)生保護(hù)蛋白在內(nèi)的特定細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行應(yīng)對。這種反應(yīng)是 可以在從原核生物至真核生物的各種細(xì)胞類型中觀察到的現(xiàn)象，被稱為熱休克反應(yīng)或熱應(yīng) 激反應(yīng)。由這種反應(yīng)誘導(dǎo)的蛋白被稱為熱休克蛋白(HSP)，其具有幾個(gè)家族。伴侶分子家族的主要實(shí)例是Hsp70蛋白。除了作為伴侶分子外，最近還發(fā)現(xiàn)該家 族參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的其它方面一一最明顯地通過其抗凋亡性質(zhì)，其在免疫中的功能以及癌細(xì) 胞對Hsp70上調(diào)的明顯依賴性。此外，Hsp70還可以在保護(hù)溶酶體完整性方面發(fā)揮作用。然 而其分子機(jī)制仍不清楚。溶酶體貯積病是一類罕見疾病，特征是物質(zhì)在溶酶體區(qū)室中集聚并引起溶酶體區(qū) 室不穩(wěn)定，由此對受影響的個(gè)體具有破壞性作用。由于物質(zhì)代謝中涉及的酶缺陷而使該物 質(zhì)在溶酶體區(qū)室中集聚。迄今為止，對于多數(shù)溶酶體貯積病還沒有可用的治療方法。這類疾病的根本原因 是特定溶酶體酶不能夠高效地代謝諸如脂質(zhì)的特定溶酶體物質(zhì)。因此，已經(jīng)針對這些疾病 中包括戈謝病(Gaucher disease)和法布里病(Fabry disease)的亞組采用通過向患者提 供重組酶的酶替代療法(ERT)。然而，ERT是一種費(fèi)用非常昂貴的治療形式，這可能限制了 其在某些領(lǐng)域的應(yīng)用，并且ERT還僅對已經(jīng)產(chǎn)生重組酶的特定類型的疾病有效。本發(fā)明旨 在提供用于治療溶酶體貯積癥的新方法。發(fā)明概述在本發(fā)明中，通過提供對Hsp70和細(xì)胞膜(尤其是質(zhì)膜和溶酶體膜)結(jié)合的分子 基礎(chǔ)的理解，公開了 Hsp70促進(jìn)溶酶體膜穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。由文獻(xiàn)已知Hsp70可以在保護(hù)溶酶體完整性中發(fā)揮作用，然而其分子機(jī)制仍不清 楚。此外，對于是否這種作用是主要的應(yīng)激可誘導(dǎo)的Hsp70(HspAlA/AlB，在本研究中稱為 Hsp70)所特有的或者是否其它Hsp70家族成員也可能具有相同性質(zhì)的問題，仍未得到解答。
這些未解答的問題促成了本發(fā)明的主要目的之一，即研究Hsp70的溶酶體保護(hù)作 用的分子基礎(chǔ)。為此，建立了產(chǎn)生重組Hsp70及其突變體的方法，即基于碘克沙醇梯度超 離心的亞細(xì)胞分級(jí)(subcellular fractionation)方案。在光致氧化誘導(dǎo)的溶酶體通透 化的基礎(chǔ)上建立了直接評價(jià)溶酶體膜完整性的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)使得可進(jìn)行實(shí)時(shí)顯微法評價(jià) Hsp70和其它成分敏化或保護(hù)溶酶體膜的能力的作用。在包括脂質(zhì)體90°光散射測定、色 氨酸熒光移位和表面等離子共振(BIAcore)的多種體外系統(tǒng)中都對重組Hsp70和突變體與 多種脂質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了研究。Hsp70的計(jì)算機(jī)(in silico)靜電表面模建有助于 Hsp70-BMP相互作用的概念性模型的建立。為了證明在體外系統(tǒng)中證實(shí)的脂質(zhì)相互作用的 體內(nèi)相關(guān)性，著眼于關(guān)于BMP和Hsp70兩個(gè)組分的BMP-Hsp70相互作用。為了進(jìn)一步證明 利用這種機(jī)制的可行性，對施用順鉬誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模型進(jìn)行了表征，并在癌細(xì)胞系和未 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系兩種細(xì)胞系中的所述細(xì)胞死亡系統(tǒng)中靶向溶酶體Hsp70。為了解決Hsp70對溶酶體膜穩(wěn)定性的作用的分子基礎(chǔ)，本發(fā)明人試圖建立可消 除胞質(zhì)的Hsp70的影響的系統(tǒng)，即需要使Hsp70直接靶向溶酶體。Nylandsted et al.的 電子顯微照片顯示Hsp70可存在于溶酶體內(nèi)，因此本發(fā)明人決定建立用于產(chǎn)生重組人 Hsp70(rHsp70)的方法，并期望利用細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)器作為直接向溶酶體遞送rHsp70的途徑。 本發(fā)明人在此繞開了向Hsp70添加可能破壞功能的溶酶體分選信號(hào)的需要，并避免了由于 過表達(dá)而可能引起的并發(fā)癥。內(nèi)吞方法還可以滴定rHsp70的量，并且從更長遠(yuǎn)的觀點(diǎn)出發(fā) 開啟了研究細(xì)胞外Hsp70的攝取機(jī)制的可能性。為了驗(yàn)證Hsp70的內(nèi)吞，在建立Hsp70產(chǎn)生方法后，用熒光團(tuán)Alexa Fluor 488 對其進(jìn)行標(biāo)記(Hsp70-AF488)。共聚焦成像顯示，確實(shí)可以這種方式使rHsp70靶向至溶 酶體。為了評價(jià)對溶酶體膜穩(wěn)定性的影響，本發(fā)明人接著建立了在單個(gè)溶酶體的水平上 定量溶酶體膜通透化的方法，并利用該方法評價(jià)了細(xì)胞內(nèi)吞的rHsp70的作用。這些方法 形成了實(shí)施例1和2的基礎(chǔ)，在實(shí)施例1和2中，本發(fā)明人證明，Hsp70通過與內(nèi)溶酶體 (endo-lysosomal)陰離子磷脂二(單酰基-甘油)磷酸酯(BMP)的pH依賴性高親和結(jié)合 而對溶酶體進(jìn)行穩(wěn)定，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的存活。Hsp70帶正電荷的AIPase結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合， 但還需要底物結(jié)合功能域以有效穩(wěn)定溶酶體。有趣的是，這種相互作用以及其產(chǎn)生的保護(hù) 作用取決于位于AIPase結(jié)構(gòu)域的帶正電荷的楔形內(nèi)的色氨酸90。重要的是，所述細(xì)胞保護(hù) 作用可以通過rHsp70的細(xì)胞內(nèi)吞遞送而獲得，并且尤其是通過BMP抗體或Hsp70抑制劑的 細(xì)胞外施用而逆轉(zhuǎn)。此外，本發(fā)明人還試圖將Hsp70的溶酶體膜保護(hù)機(jī)制與腫瘤產(chǎn)生和程序性細(xì)胞 死亡相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明人表征了通過施用常規(guī)化療劑順鉬啟動(dòng)的細(xì)胞死亡程序，并發(fā) 現(xiàn)其與caspases無關(guān)，但特征在于蛋白酶的溶酶體釋放。轉(zhuǎn)基因Hsp70以及細(xì)胞內(nèi)吞的 Hsp70能夠通過穩(wěn)定溶酶體膜而增強(qiáng)細(xì)胞在面臨順鉬攻擊時(shí)的存活。有趣的是，本發(fā)明人 證明，靶向溶酶體Hsp70本身或者其在溶酶體中的相互作用物二(單酰基-甘油)磷酸酯 (BMP)使轉(zhuǎn)化的前列腺細(xì)胞系對順鉬變得敏感(未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞沒有這種變化)，從而為利用 BMP-Hsp70相互作用作為癌癥治療的藥理學(xué)靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。有趣的是，雖然Hsp70_2與Hsp70具有86%的氨基酸同源性，但Hsp70_2不能直接 保護(hù)溶酶體膜。然而，缺失Hsp70-2也導(dǎo)致溶酶體膜通透化，并促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡。這 種作用不依賴于Hsp70-2與溶酶體區(qū)室之間的直接相互作用，而是通過晶狀體上皮源性生長因子(LEDGF)的下調(diào)(響應(yīng)Hsp70-2的缺失)關(guān)聯(lián)起來。本研究的方法和結(jié)果將在實(shí)施例部分進(jìn)行更詳細(xì)的闡述。在本發(fā)明中闡明了 Hsp70通過與溶酶體BMP的相互作用增強(qiáng)溶酶體穩(wěn)定性的細(xì)胞 保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)，這些發(fā)現(xiàn)為治療性靶向溶酶體貯積病提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明現(xiàn)在已經(jīng)證明，令人驚奇地，向細(xì)胞提供重組Hsp70有效逆轉(zhuǎn)溶酶體貯 積病(如本發(fā)明證明的尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)和法伯氏病(Farber disease))的病理。此外，向細(xì)胞提供Hsp70誘導(dǎo)劑苯甲醇有效逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病(如本發(fā) 明證明的尼曼-皮克病)的病理。因此，本發(fā)明提供了通過提供Hsp70或其功能片段或變體，或者通過提供Hsp70誘 導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物(co-inducer)而直接或間接提高有此需要的個(gè)體中Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度 和/或活性來治療溶酶體貯積病的方法。一方面，本發(fā)明涉及能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用 作藥物或用于溶酶體貯積癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性劑為Hsp70或其功能片段或變體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性劑為Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。另一方面，本發(fā)明提供了治療溶酶體貯積病的方法，其包括向有此需要的個(gè)體施 用本發(fā)明的生物活性劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述治療為預(yù)防、治愈或改善。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述溶酶體貯積病選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病 (Krabbe disease)、法布里病、戈謝病、唾液酸貯積病(Sialidosis)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不 良和鞘脂激活蛋白(saposin)缺乏病。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述溶酶體貯積病的特征在于具有所述疾病病理涉及的缺 陷酶的殘留酶促活性。本發(fā)明還涉及治療溶酶體貯積病的方法，其包括施用本發(fā)明的生物活性劑和至少 一種其它治療形式(modality)的組合。本發(fā)明再一方面提供了調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP(二(單酰 基甘油)磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步驟i)施用本發(fā)明的生物活性劑，ii)使BMP和Hsp70之間相互作用，禾口iii)調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性。另一方面，本發(fā)明涉及Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。一方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP相互作用，所 述方法包括施用Hsp70或其功能片段或變體并由此調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性的 步驟，其中所述Hsp70或其功能片段或變體是適合使BMP和Hsp70或所述功能片段或變體 之間相互作用的形式。優(yōu)選地，Hsp70或所述其功能片段或變體與BMP形成共價(jià)或非共價(jià) 復(fù)合物。優(yōu)選地，BMP與鞘脂激活蛋白相互作用。優(yōu)選地，所述鞘脂激活蛋白(Saposin)選自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂 激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
優(yōu)選地，所述酶選自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α -半乳糖苷酶、β -半 乳糖苷酶、β -半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、葡糖神經(jīng)酰胺酶和酸性神經(jīng)酰胺酶。優(yōu)選地，所述酶促活性的調(diào)節(jié)是上調(diào)所述酶的酶促活性。另一方面，本發(fā)明涉及Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。優(yōu)選地，所述 Hsp70或其功能片段或變體可用于治療、減緩或預(yù)防溶酶體貯積癥，例如尼曼-皮克病、戈 謝病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸貯積病。另一方面，本發(fā)明涉及提高化合物的攝取的方法，所述方法包括施用所述化合物 和Hsp70或其功能片段或變體的步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述Hsp70或其功能片段或變 體與所述化合物共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述Hsp70或其功能片段或變體與所述 化合物非共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及上調(diào)與溶酶體貯積癥(例如尼曼-皮克病、戈謝病、法伯氏 病、克拉伯病、法布里病和唾液酸貯積病)相關(guān)的酶的酶促活性的方法。優(yōu)選地，所述溶酶 體貯積癥為尼曼-皮克病。由于所述溶酶體貯積癥由酶促活性不足引起，因此本發(fā)明的目的是提高所述酶促 活性，從而減輕或治愈所述病癥。已經(jīng)證明，Hsp70與BMP相互作用。由于BMP作為其它多種蛋白的輔因子，Hsp70和 BMP之間的相互作用可以調(diào)節(jié)所述其它多種蛋白的功能。例如，BiflMtSaSMase的輔因子。 因此，Hsp70和BMP之間的相互作用可以提高aSMase的活性。由于尼曼-皮克病與aSMase 活性的降低有關(guān)，因此Hsp70可以通過提高aSMase的活性來減輕或治愈尼曼-皮克病。類 似地，BMP作為鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D的輔因 子發(fā)揮作用。這些鞘脂激活蛋白在其它溶菌酶貯積癥中均有涉及，因此Hsp70可以通過提 高鞘脂激活蛋白或與所述鞘脂激活蛋白相關(guān)的酶的活性來減輕或治愈其它溶酶體貯積癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在溶酶體貯積癥的治療中同時(shí)施用Hsp70和酶替代 療法。在這種方式中，由于Hsp70的酶激活作用，因此可以顯著降低所必需的酶量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用Hsp70促進(jìn)酶替代療法中酶的攝取，由此提高被相關(guān) 細(xì)胞攝取的酶量。定義和簡稱aSMase/ASMADD70 AIF AO Apaf-I Bag-I Bcl-2 Bid BMP CARD Caspase CHIP
酸性鞘磷脂酶
用于 Hsp70 的源自 AIF 的誘館(AIF-derived decoy for Hsp70)
凋亡誘導(dǎo)因子
吖啶橙
凋亡蛋白酶激活因子-1
Bcl-2 ^ijliiIitSi=I (Bcl-2 associated athanogene-1)
B細(xì)胞淋巴瘤/白雪病2
BH3相互作用結(jié)構(gòu)域凋亡激動(dòng)蛋白
二(單?；视?磷脂
Caspase
半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶 Hsp70-結(jié)合蛋白的羧基末端
CytC 細(xì)胞色素C
DD 死亡結(jié)構(gòu)域
DED 死亡效應(yīng)域
dsRNA 雙鏈RNA
eHsp70 細(xì)胞外Hsp70
ER 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
ERT酶替代療法
FADD 包含F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白
HIP Hsp70相互作用蛋白
HRP 辣根過氧化物酶
HS 熱休克/熱應(yīng)激
HSE 熱休克元件
HSF 熱休克因子
Hsp 熱休克蛋白
HspBPl 熱休克蛋白結(jié)合蛋白1
IAP 凋亡蛋白抑制蛋白
iMEF永生化的鼠胚胎成纖維細(xì)胞
JNK c-Jun氨基末端激酶
LAMP-I/-2 溶酶體相關(guān)膜蛋白-1/-2
LBPA 溶血二磷脂酸(lysobisphospha1
LEDGF 晶狀體上皮源性生長因子
LMP 溶酶體膜通透化
MIC-I 巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞因子1
MOMP 線粒體外膜通透化
MPR甘露糖6-磷酸受體
MTT 3- (4，5- 二甲基-2-噻唑基)-2，
NPD尼曼-皮克病
NPDAA型尼曼-皮克病
NPDBB型尼曼-皮克病
NPDCC型尼曼-皮克病
NPDDD型尼曼-皮克病
PCD 程序性細(xì)胞死亡
PKC 蛋白激酶C
POPC 棕櫚酰-油酰-磷脂酰膽堿
POPS 棕櫚酰-油酰-磷脂酰絲氨酸
RNAi RNA干擾
ROS 活性氧
SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差
siRNA 小干擾RNA
Smac/Diablo 第二個(gè)線粒體來源的caspase激活因子tBid 截短 BidTNF 腫瘤壞死因子TNFR TNF-受體TRADD TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TRAF TNFR 相關(guān)因子溶酶體貯積癥(LSD)所使用的術(shù)語“溶酶體貯積癥”和“溶酶體貯積病”同義。Hsp70的功能片段術(shù)語“Hsp70的功能片段”解釋為表示Hsp70的具有預(yù)期功能 的任何片段。與酶促活性的調(diào)節(jié)有關(guān)時(shí)，功能片段是能夠調(diào)節(jié)所述酶促活性的片段。與提 高物質(zhì)的攝取有關(guān)時(shí)，Hsp70的功能片段是能夠提高所述物質(zhì)的攝取的片段。應(yīng)該理解，所 述功能片段的精確量化作用可能與全長分子的作用不同。在一些情況下，所述功能片段可 能確實(shí)比全長分子更有效。此外，從片段的較小尺寸考慮，使用片段代替全長分子可能是有 利的。Hsp70的功能變體術(shù)語“Hsp70的功能變體”解釋為表示Hsp70的具有預(yù)期功能 的任何變體。與酶促活性的調(diào)節(jié)有關(guān)時(shí)，功能變體是能夠調(diào)節(jié)所述酶促活性的變體。與提 高物質(zhì)的攝取有關(guān)時(shí)，Hsp70的功能變體是能夠提高所述物質(zhì)的攝取的片段。應(yīng)該理解，所 述功能變體的精確量化作用可能與全長分子的作用不同。在一些情況下，所述功能變體可 能確實(shí)比全長分子更有效?！吧锘钚詣?即在生物學(xué)上具有活性的物質(zhì)/試劑)是提供可以通過體內(nèi)或體 外證明的某些藥理學(xué)作用(通常為有益作用)的任何試劑、藥物、化合物、物質(zhì)組分或組合 物。在本文中使用的該術(shù)語進(jìn)一步包括在個(gè)體中產(chǎn)生局部或全身作用的任何生理學(xué)或藥理 學(xué)活性物質(zhì)。生物活性劑的另外實(shí)例包括，但不限于包含寡糖或由寡糖組成的試劑，包含 多糖或由多糖組成的試劑，包含任選糖基化的肽或由任選糖基化的肽組成的試劑，包含任 選糖基化的多肽或由任選糖基化的多肽組成的試劑，包含核酸或由核酸組成的試劑，包含 寡核苷酸或由寡核苷酸組成的試劑，包含多核苷酸或由多核苷酸組成的試劑，包含脂質(zhì)或 由脂質(zhì)組成的試劑，包含脂肪酸或由脂肪酸組成的試劑，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯組成 的試劑，以及包含次級(jí)代謝物或由次級(jí)代謝物組成的試劑。在個(gè)體(例如人和其它任何動(dòng) 物)的治療中，生物活性劑可以用于預(yù)防疾病、治療疾病。本文使用的生物活性劑是能夠提 高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“藥”或“藥物”包括作用于人或動(dòng)物體局部或全身的在生物學(xué)上、 生理學(xué)上或藥學(xué)上具有活性的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“治療”和“療法”等同地表示治愈性治療、預(yù)防性治療和改善性 治療或減輕性治療。該術(shù)語包括用于獲得可以在臨床上建立的有益的或期望的生理學(xué)結(jié)果 的方法。出于本發(fā)明的目的，有益的或預(yù)期的臨床效果包括，但不限于緩解癥狀，減小疾病 的程度，穩(wěn)定(即不惡化)病況，延遲或減慢病況/癥狀的發(fā)展或惡化，改善或減輕病況或 癥狀，以及不論可測與否的緩和(部分或完全)。本文使用的術(shù)語“減輕”及其變式表示，與 不施用本發(fā)明組合物相比，生理病況或癥狀的程度和/或有害表現(xiàn)減少和/或發(fā)展時(shí)間減 慢或延長。如果根據(jù)構(gòu)成術(shù)語“治療”和“療法”的定義的標(biāo)準(zhǔn)測定，所治療的病況有變化，則“治療效果”或“療效”是明顯的。如果有至少5%的改善，優(yōu)選10%的改善，更優(yōu)選至少 25%，甚至更優(yōu)選至少50%，如至少75%，最優(yōu)選至少100%的改善，則所治療的病況有“變 化”。所述變化可基于所治療個(gè)體病況的嚴(yán)重程度的改善，或者基于利用生物活性劑或生物 活性劑和本發(fā)明的藥物組合物治療和不治療的個(gè)體群病況改善頻率的差異。“生物活性劑”的“藥理學(xué)上的有效量”、“藥學(xué)上的有效量”或“生理學(xué)上的有效量” 是在使用本發(fā)明所述藥物組合物時(shí)，為在所治療的個(gè)體血流中或作用部位(即肺、胃系統(tǒng)、 結(jié)腸系統(tǒng)、前列腺等)提供預(yù)期水平的活性劑以產(chǎn)生預(yù)期的生理反應(yīng)所需要的此組合物中 存在的活性劑的量。準(zhǔn)確的量將取決于多種因素，例如活性劑、組合物的活性、所采用的遞 送裝置、組合物的物理特征、計(jì)劃的患者用法(即每天施用的劑量數(shù))和患者因素等，并且 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文提供的信息而容易地確定。可以在一次給藥中，或者通過 多次施用總和為有效量的量(優(yōu)選在M小時(shí)的時(shí)間內(nèi))而施用“有效量”的生物活性劑。 可以通過用于測定合適量和給藥時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)臨床方法確定有效量。應(yīng)該理解，“有效量”可 以是由醫(yī)療專家和/或個(gè)人確定的經(jīng)驗(yàn)性和/或個(gè)性化(根據(jù)個(gè)案)結(jié)果。本文使用的術(shù)語“增強(qiáng)”和“提高”有益效果及其變式是指，與安慰劑相比生物活 性劑的治療效果，或者本發(fā)明的藥物治療的治療效果高于通常利用不含本發(fā)明生物活性劑 的藥物組合物所獲得的治療效果的提高。作為施用生物活性劑的結(jié)果，當(dāng)治療效果的強(qiáng)度 和/或程度得到促進(jìn)和/或提高時(shí)，“治療效果的提高”是明顯的?！爸委熜Ч奶岣摺边€包 括治療益處的時(shí)間得到延長。它還可以表現(xiàn)為，與施用不含生物活性劑的較高量的藥物組 合物相比，當(dāng)共同施用所述藥物組合物和本發(fā)明提供的生物活性劑時(shí)獲得相同益處和/或 效果所需要的所述藥物組合物的量較低。優(yōu)選但不必需地，所述效果的增強(qiáng)引起對所述藥 物組合物單獨(dú)不能有效治療或者治療效果較小的急性癥狀的治療。與單獨(dú)施用藥物組合物 相比，當(dāng)本發(fā)明的生物活性劑與藥物組合物共同施用時(shí)治療效果具有至少5%的提高，例如 治療效果具有至少10%的提高，則實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)(提高)。優(yōu)選地，所述提高為至少25%，更 優(yōu)選至少50 %，甚至更優(yōu)選至少75 %，最優(yōu)選至少100 %。本文使用的“共同施用”、“同時(shí)施用”或“一起施用”生物活性劑或者生物活性劑 和現(xiàn)有藥物是指，在一定時(shí)間內(nèi)施用本發(fā)明的一種或多種生物活性劑，或者施用本發(fā)明的 一種或多種生物活性劑和現(xiàn)有藥物組合物。所述時(shí)間優(yōu)選小于72小時(shí)，例如48小時(shí)，例如 小于M小時(shí)，例如小于12小時(shí)，例如小于6小時(shí)，如小于3小時(shí)。然而，所述術(shù)語還表示可 以同時(shí)施用所述生物活性劑和治療性組合物。術(shù)語“個(gè)體”指脊椎動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物中的一種，優(yōu)選包括人在內(nèi)的靈長類。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文使用的個(gè)體為任意年齡的人，男性或女性。“有此需要的個(gè)體”是指可以從本發(fā)明受益的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述有此 需要的個(gè)體為患病個(gè)體，其中所述疾病為溶酶體貯積病。術(shù)語“天然核苷酸”或“核苷酸”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的任意四種脫氧核苷酸dA、 dG、dT和dC(DNA的組分)和四種核苷酸A、G、U和C (RNA的組分)。各種天然的核苷酸包括 糖部分(核糖或脫氧核糖)、磷酸部分和天然/標(biāo)準(zhǔn)的堿基部分或基本由上述部分組成。天 然核苷酸根據(jù)熟知的堿基配對原則(Watson和Crick)與互補(bǔ)核苷酸結(jié)合，其中腺嘌呤(A) 與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配對，鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對，其中相應(yīng)的堿基對是互 補(bǔ)且反向平行的核苷酸鏈的一部分。堿基配對引起預(yù)定的互補(bǔ)核苷酸之間的特異雜交。堿基配對是酶能夠催化合成與模板寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸的基礎(chǔ)。在這種合成中，結(jié)構(gòu)單 元(通常為A、T、U、C或G的核糖衍生物或脫氧核糖衍生物的三磷酸酯)在模板寡核苷酸的 指導(dǎo)下形成具有正確的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)寡核苷酸?；パa(bǔ)序列對其寡核苷酸序列的識(shí)別由形 成堿基對的相應(yīng)相互作用堿基介導(dǎo)。實(shí)質(zhì)上，導(dǎo)致堿基配對的具體相互作用由堿基的大小 以及堿基的氫鍵供體和受體的模式控制。大的嘌呤堿基(A或G)與小的嘧啶堿基(T、U或C) 配對。此外，堿基之間的堿基配對識(shí)別還受堿基之間形成的氫鍵的影響。在Watson-Crick 堿基配對幾何中，利用連接兩個(gè)環(huán)原子的中間氫鍵和在任意一側(cè)結(jié)合附加于各所述環(huán)的官 能基團(tuán)的氫鍵，利用與受體基團(tuán)配對的供體基團(tuán)，使六元環(huán)(天然寡核苷酸中的嘧啶)與由 稠合六元環(huán)和五元環(huán)(天然寡核苷酸中的嘌呤)構(gòu)成的環(huán)系統(tǒng)并列。本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段和通過連接、剪切、 核酸內(nèi)切酶作用和核酸外切酶作用中任何一種產(chǎn)生的片段。核酸分子可以由天然存在 的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的類似物(例如天然存在的核苷酸的 α-對映體形式)或二者的組合的單體構(gòu)成。修飾核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌 呤堿基部分具有變化。糖修飾包括，例如利用鹵素、烷基基團(tuán)、胺和疊氮基團(tuán)取代一個(gè)或 多個(gè)羥基基團(tuán)，或者可以使糖官能化作醚或酯。此外，還可以用空間上和電子上相似的 結(jié)構(gòu)，例如氮雜-糖和碳環(huán)糖類似物取代完整的糖部分。堿基部分的修飾的實(shí)例包括烷 基化嘌呤和嘧啶，?；堰驶蜞奏せ蛘咂渌熘碾s環(huán)取代物。核酸單體可以通過磷酸 二酯鍵或這些連接的類似物進(jìn)行連接。磷酸二酯鍵連接的類似物包括硫代磷酸酯、二硫 代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、 phosphoroanilothioate,phosphorani 1 idate和氨基磷酸酯等。術(shù)語“核酸分子”也包括， 例如包含連接至聚酰胺骨架上的天然存在的或修飾的核酸堿基的所謂的“肽核酸”。核酸可 以為單鏈或雙鏈。術(shù)語“核酸分子的互補(bǔ)物”是指與參考核苷酸序列相比具有互補(bǔ)核苷酸序列并且 為反方向的核酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'與5' CCCGTGCAT 3'互補(bǔ)?！胺蛛x的核酸分子”是指沒有整合在生物體的基因組DNA中的核酸分子。例如，已 經(jīng)從細(xì)胞的基因組DNA分離的編碼生長因子的DNA分子即為分離的DNA分子。分離的核酸 分子的另一個(gè)實(shí)例是沒有整合在生物體的基因組中的化學(xué)合成的核酸分子。已經(jīng)從特定物 種分離的核酸分子小于該物種的染色體的完整DNA分子?！昂怂岱肿訕?gòu)建體”是已經(jīng)通過人為介入進(jìn)行修飾從而包含以天然不存在的排列 結(jié)合或并列的核酸片段的單鏈或雙鏈核酸分子。“線性DNA”是指具有游離5’和3’末端的非環(huán)狀DNA分子。可以通過酶促降解或 物理斷裂由閉合的環(huán)狀DNA分子(例如質(zhì)粒)制備線性DNA?！盎パa(bǔ)DNA(cDNA) ”是反轉(zhuǎn)錄酶由mRNA模板形成的單鏈DNA分子。通常，采用與部 分mRNA互補(bǔ)的引物起始反轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員還使用術(shù)語“cDNA”表示由此類單鏈DNA 分子及其互補(bǔ)DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。術(shù)語“cDNA”還表示由RNA模板合成的cDNA分 子的克隆。“異源DNA”是指在給定宿主細(xì)胞中天然不存在的DNA分子或DNA分子群。異源于 具體宿主細(xì)胞的DNA分子可以包含源自所述宿主細(xì)胞的物種的DNA(內(nèi)源DNA)，只要宿主DNA與非宿主DNA(即異源DNA)結(jié)合。例如，可以將包含非宿主DNA片段的DNA分子認(rèn)為是 異源DNA分子，其中所述非宿主DNA片段編碼可操作地與包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的宿主DNA片段 連接的多肽。相反，異源DNA分子可以包含可操作地與外源啟動(dòng)子相連的內(nèi)源基因。作為 另一個(gè)示例，如果DNA分子被引入到缺乏野生型基因的突變細(xì)胞內(nèi)，則也可以將包含源自 野生型細(xì)胞的所述基因的該DNA分子認(rèn)為是異源DNA。“多肽”是天然產(chǎn)生的或合成的氨基酸殘基聚合物，優(yōu)選其僅通過肽鍵相連。通過 非宿主DNA分子表達(dá)產(chǎn)生的多肽為“異源”肽或多肽。本文使用的術(shù)語“多肽”涵蓋了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已經(jīng)經(jīng)過翻譯后修飾或可以不經(jīng)過翻譯后修飾。翻 譯后修飾可以為，例如磷酸化、甲基化和糖基化。術(shù)語“表達(dá)”是指基因或基因產(chǎn)物的生物合成?！半s交”表示不同來源的核酸鏈的退火；S卩，在初始時(shí)沒有配對的兩條DNA鏈的互 補(bǔ)區(qū)之間形成堿基對。根據(jù) Sambrook et al. ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989)，1. 101-1. 104，對術(shù)語“在嚴(yán)格條件下的雜 交”進(jìn)行定義。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下的雜交表示，利用IX SSC和0. 1% SDS在50°C、優(yōu)選 在55 °C、更優(yōu)選在62 °C且最優(yōu)選在68°C洗滌1小時(shí)后，尤其是在0. 2 X SSC^PO. SDS中 在50°C、優(yōu)選在55°C、更優(yōu)選在62°C且最優(yōu)選在68°C洗滌1小時(shí)后，觀察到陽性雜交信號(hào)。“完全同源”的延長(stretch)定義為配對核苷酸沿著相互作用的核苷酸的序列的 匹配；在天然存在的RNA中，A與U配對，G與C配對?！皢?dòng)子”為指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子位于基因的5’非編碼 區(qū)，與結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相鄰近。在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子內(nèi)的序列元件通 常以共有核苷酸序列為特征。如果啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則在對誘導(dǎo)劑的應(yīng)答中提高轉(zhuǎn) 錄速率。相反，如果啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，則誘導(dǎo)劑不能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率。還已知有阻遏型 啟動(dòng)子。“調(diào)控元件”是調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。例如，調(diào)控元件可以包含與能夠排 他地或優(yōu)先地在特定細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子結(jié)合的核苷酸序列。這些類 型的調(diào)控元件通常與以“細(xì)胞特異性”、“組織特異性”或“器官特異性”的方式表達(dá)的基因
纟口口?！霸鰪?qiáng)子”是一種類型的調(diào)控元件，其能夠提高轉(zhuǎn)錄效率，而不論增強(qiáng)子相對于轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)的距離或方向?！翱寺≥d體”為具有能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力的核酸分子，例如質(zhì)粒、粘 ?；蚣?xì)菌噬菌體?？寺≥d體通常包含一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)允許 以可確定的方式插入核酸分子，而不使載體喪失主要的生物功能；和編碼標(biāo)記基因的核苷 酸序列，該序列適合用于轉(zhuǎn)化有所述克隆載體的細(xì)胞的鑒別和篩選。標(biāo)記基因通常包括提 供四環(huán)素或氨芐青霉素抗性的基因?！氨磉_(dá)載體”是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的核酸分子。通常，表達(dá)載體包含轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)常常處于啟動(dòng)子的控制之下，將此類基因稱為“可 操作地連接至”所述啟動(dòng)子上。類似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，則調(diào)控元件 和核心啟動(dòng)子被可操作地連接。被稱作“轉(zhuǎn)錄載體”的較簡單載體僅能夠轉(zhuǎn)錄但不能翻譯 它們能夠在靶細(xì)胞中復(fù)制但不能表達(dá)，其與表達(dá)載體不同。轉(zhuǎn)錄載體用于擴(kuò)增其插入物。
“重組宿主”是包含異源核酸分子，例如克隆載體或表達(dá)載體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染描述的是將外來物質(zhì)引入真核細(xì)胞中。用于非病毒方法的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”最常 用于指哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而術(shù)語“轉(zhuǎn)化”優(yōu)選用于描述非病毒DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)菌和非動(dòng)物真核細(xì) 胞，例如真菌、藻類和植物?；瘜W(xué)方法和物理方法均可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞?！岸嚯摹笔翘烊划a(chǎn)生的或合成的氨基酸殘基聚合物，其優(yōu)選僅通過肽鍵連接。通過 非宿主DNA分子表達(dá)產(chǎn)生的多肽為“異源”肽或多肽。本文使用的術(shù)語“多肽”涵蓋了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已經(jīng)經(jīng)過翻譯后修飾或可以不經(jīng)過翻譯后修飾。翻 譯后修飾可以為，例如磷酸化、甲基化和糖基化?！鞍被釟埢笨梢詾殡逆I或不同于肽鍵的鍵連接的天然或非天然氨基酸殘基。氨 基酸殘基可以為D-構(gòu)型或L-構(gòu)型。氨基酸殘基包括被包含碳原子或碳原子鏈的中心部分 分開的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，它們的至少之一包括至少一個(gè)側(cè)鏈或 官能團(tuán)。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基團(tuán)，COOH是指存在于氨基酸或肽 的羧基末端的羧基基團(tuán)。常用術(shù)語氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。J. Biol. Chem.， 243 :3552-59 (1969) and adopted in 37 C. F. R. ,section 1.822(b) (2)中列出的標(biāo)準(zhǔn)命名 法的天然氨基酸屬于下表1中列出的氨基酸組。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。 非天然氨基酸的實(shí)例是，例如37 C. F. R. section 1.822(b) (4)中列出的氨基酸，其均通過 引用并入本文。此外，非天然氨基酸殘基包括，但不限于經(jīng)修飾的氨基酸殘基、L-氨基酸殘 基和D-氨基酸殘基的立體異構(gòu)體。
權(quán)利要求
1.能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其作為藥物或用于溶酶體 貯積癥的治療。
2.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑為Hsp70或其功能片段或變體。
3.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70或其功能片段或變體與野生型 Hsp70蛋白具有100%的同源性。
4.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70或其功能片段或變體與野生型 Hsp70蛋白具有99. 9-95 %的同源性，例如95-90 %的同源性，如90-85 %的同源性，例如 85-80 %的同源性，如80-75 %的同源性，例如75-60 %的同源性。
5.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑是Hsp70。
6.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70是全長Hsp70。
7.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑為Hsp70的功能片段或變體。
8.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體的全長小于 641個(gè)氨基酸，如小于625個(gè)氨基酸，例如小于600個(gè)氨基酸，如小于575個(gè)氨基酸，例如小 于550個(gè)氨基酸，如小于525個(gè)氨基酸，例如小于500個(gè)氨基酸，如小于475個(gè)氨基酸，例如 小于450個(gè)氨基酸，如小于425個(gè)氨基酸，例如小于400個(gè)氨基酸，如小于375個(gè)氨基酸，例 如小于350個(gè)氨基酸，如小于325個(gè)氨基酸，例如小于300個(gè)氨基酸，如小于275個(gè)氨基酸， 例如小于250個(gè)氨基酸，如小于225個(gè)氨基酸，例如小于200個(gè)氨基酸，如小于175個(gè)氨基 酸，例如小于150個(gè)氨基酸，如小于125個(gè)氨基酸，例如小于100個(gè)氨基酸，如小于75個(gè)氨 基酸，例如小于50個(gè)氨基酸，如小于25個(gè)氨基酸。
9.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體的全長大于 10個(gè)氨基酸，如大于25個(gè)氨基酸，例如大于50個(gè)氨基酸，如大于75個(gè)氨基酸，例如大于100 個(gè)氨基酸，如大于125個(gè)氨基酸，例如大于150個(gè)氨基酸，如大于175個(gè)氨基酸，例如大于 200個(gè)氨基酸，如大于225個(gè)氨基酸，例如大于250個(gè)氨基酸，如大于275個(gè)氨基酸，例如大 于300個(gè)氨基酸，如大于325個(gè)氨基酸，例如大于350個(gè)氨基酸，如大于375個(gè)氨基酸，例如 大于400個(gè)氨基酸，如大于425個(gè)氨基酸，例如大于450個(gè)氨基酸，如大于475個(gè)氨基酸，例 如大于500個(gè)氨基酸，如大于525個(gè)氨基酸，例如大于550個(gè)氨基酸，如大于575個(gè)氨基酸， 例如大于600個(gè)氨基酸，如大于625個(gè)氨基酸。
10.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體具有的氨 基酸取代為Hsp70的0. 1-1 %的氨基酸殘基，如1-2 %的氨基酸殘基，例如2-3 %的氨基 酸殘基，如3-4%的氨基酸殘基，例如4-5 %的氨基酸殘基，如5-10 %的氨基酸殘基，例如 10-15%的氨基酸殘基，如15-20%的氨基酸殘基，例如20-30%的氨基酸殘基，如30-40% 的氨基酸殘基，例如40-50%的氨基酸殘基，如50-60%的氨基酸殘基，例如60-70%的氨基 酸殘基，如70-80 %的氨基酸殘基，例如80-90 %的氨基酸殘基，如90-100 %的氨基酸殘基。
11.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體的全長 為5-25個(gè)氨基酸，如25-50個(gè)氨基酸，例如50-75個(gè)氨基酸，如75-100個(gè)氨基酸，例如 100-125個(gè)氨基酸，如125-150個(gè)氨基酸，例如150-175個(gè)氨基酸，如175-200個(gè)氨基酸，例 如200-225個(gè)氨基酸，如225-250個(gè)氨基酸，例如250-275個(gè)氨基酸，如275-300個(gè)氨基酸，例如300-325個(gè)氨基酸，如325-350個(gè)氨基酸，例如350-375個(gè)氨基酸，如375-400個(gè)氨基 酸，例如400-425個(gè)氨基酸，如425-450個(gè)氨基酸，例如450-475個(gè)氨基酸，如475-500個(gè)氨 基酸，例如500-525個(gè)氨基酸，如525-550個(gè)氨基酸，例如550-575個(gè)氨基酸，如575-600個(gè) 氨基酸，例如600-625個(gè)氨基酸，如625-640個(gè)氨基酸。
12.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體包含Hsp70 的AIPase結(jié)構(gòu)域的全部或部分。
13.如權(quán)利要求7所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70的功能片段或變體在 Hsp70ATPase結(jié)構(gòu)域的第90位氨基酸位置包含色氨酸。
14.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70或其功能片段或變體為重組 Hsp70 (rHsp70)。
15.如權(quán)利要求2所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70源自選自人(homosapiens), 小鼠(mus musculus)、牛、狗、大鼠、鼬、豬、綿羊和猴的哺乳動(dòng)物。
16.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。
17.如權(quán)利要求16所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物。
18.如權(quán)利要求16所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑是Hsp70輔誘導(dǎo)物。
19.如權(quán)利要求18所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70輔誘導(dǎo)物是羥胺衍生物。
20.如權(quán)利要求19所述的生物活性劑，其中，所述羥胺衍生物選自氯吡哌醇 (BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345 和 BGP-15。
21.如權(quán)利要求19所述的生物活性劑，其中，所述羥胺衍生物是 Arimoclomol(BRX-220)。
22.如權(quán)利要求17所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70誘導(dǎo)物是膜流化劑。
23.如權(quán)利要求22所述的生物活性劑，其中，所述膜流化劑選自苯甲醇、庚醇、AL721、 二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇、利多卡因、羅哌卡因、布比卡 因和馬比佛卡因。
24.如權(quán)利要求16所述的生物活性劑，其中，所述Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物選自依地福 新(ET-18-0CH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸膽堿)、塞來昔布、羅非昔布、 乙酰水楊酸、水楊酸鈉、吲哚美辛、PGAU PGj2、2-環(huán)戊烯-1-酮、過氧化物酶增殖物激活型 受體Y-激動(dòng)劑、長春新堿、紫杉醇、吡格列酮、卡鉬、多柔比星、氟達(dá)拉濱、異環(huán)磷酰胺、阿 糖胞苷、格爾德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤殼菌素、除莠霉素_A、花生四烯酸、MG132、乳胞 素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞鋅(L-肌肽鋅)、地塞米 松、可卡因、煙堿、醇、α -腎上腺素激動(dòng)劑、環(huán)戊烯酮前列腺素、芍藥苷、甘草甜素、雷公藤紅 素、二氫雷公藤紅素、二氫雷公藤紅素二乙酸酯和姜黃素。
25.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑是亞致死熱療。
26.如權(quán)利要求25所述的生物活性劑，其中，所述亞致死熱療包括提高個(gè)體的溫度至 約38°C的核心溫度，如約39°C，例如約40°C，如約41V，例如約42°C，如約43°C的核心溫 度。
27.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑包括Hsp70或其功能片段 或變體和Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物的組合。
28.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑包括Hsp70或其功能片段 或變體和提高Hsp70和BMP之間的相互作用的物質(zhì)的組合。
29.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述治療為預(yù)防、治愈或改善。
30.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯 氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、唾液酸貯積病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和鞘脂激活蛋白 缺乏病。
31.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑，其中，所述生物活性劑經(jīng)腸胃外施用于有此需要 的個(gè)體。
32.如權(quán)利要求31所述的生物活性劑，其中，所述腸胃外施用是靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射。
33.如權(quán)利要求31所述的生物活性劑，其中，所述腸胃外施用是靜脈內(nèi)輸注。
34.如權(quán)利要求33所述的生物活性劑，其中，所述靜脈內(nèi)輸注進(jìn)行的時(shí)間為10分 鐘-20分鐘，如20-30分鐘，例如30-40分鐘，如40-50分鐘，例如50-60分鐘，如60-90分 鐘，例如90-120分鐘，如2小時(shí)-3小時(shí)，例如3-4小時(shí)，如4_5小時(shí)，例如5_6小時(shí)，如6_7 小時(shí)，例如7-8小時(shí)。
35.如權(quán)利要求31所述的生物活性劑，其中，所述腸胃外施用是經(jīng)粘膜遞送。
36.如權(quán)利要求35所述的生物活性劑，其中，所述經(jīng)粘膜遞送是舌下遞送。
37.如權(quán)利要求35所述的生物活性劑，其中，所述經(jīng)粘膜遞送是口含遞送。
38.如權(quán)利要求35所述的生物活性劑，其中，所述經(jīng)粘膜遞送是吹入遞送。
39.如權(quán)利要求35所述的生物活性劑，其中，所述經(jīng)粘膜遞送是鼻內(nèi)遞送。
40.Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。
41.調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP(二(單?；视?磷酸酯)相互作 用，所述方法包括以下步驟i)施用權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)所述的生物活性劑，ii)使BMP和Hsp70之間相互作用，和iii)調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述Hsp70與BMP形成共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合物。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，BMP與鞘脂激活蛋白相互作用。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白選自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激 活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述酶選自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、 酸性神經(jīng)酰胺酶、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神經(jīng)酰 胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述酶促活性的調(diào)節(jié)是所述酶促活性的提高。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述酶促活性的提高是提高1-5%，如5-10 %， 例如 10-15 %，如 15-20 %，例如 20-25 %，如 25-30 %，例如 30-35 %，如 35-40 %，例如 40-45 %，如 45-50 %，例如 50-60 %，如 60-70 %，例如 70-80 %，如 80-90 %，例如 90-100 %， 如 100-120 %,例如 120-140 %,如 140-160 %,例如 160-180 %,如 180-200 %,例如 200-250 %，如 250-300 %，例如 300—400 %，如 400—500 %，例如 500—750 %，如 750—1000 %，例如 1000-1500%，如 1500-2000%，例如 2000-5000%
48.治療溶酶體貯積病的方法，所述方法包括向有此需要的個(gè)體施用權(quán)利要求1-39中 任一項(xiàng)所述的生物活性劑。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述治療為預(yù)防、治愈或改善。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述治療延長了有此需要的所述個(gè)體的預(yù)期壽命。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述預(yù)期壽命提高了6個(gè)月-1年，如1年-2年， 例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6_7年，如7-8年，例如8_9年，如9_10 年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如 25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90 年，如90-100年。
52.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯積病選自尼曼-皮克病、法伯氏病、 克拉伯病、法布里病、戈謝病、唾液酸貯積病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和鞘脂激活蛋白缺乏 病。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯積病的特征是在細(xì)胞內(nèi)積聚的鞘 脂增加。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述治療將細(xì)胞內(nèi)積聚的鞘脂降低了至少5%， 如至少10%，例如至少15%，如至少20%，例如至少25%，如至少30%，例如至少35%，如 至少40%，例如至少45%，如至少50%，例如至少55%，如至少60%，例如至少65%，如至 少70%，例如至少75%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%，例如至少95%，如至少 100%。
55.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述鞘脂選自鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、半乳糖苷神經(jīng) 酰胺、球形三酰神經(jīng)酰胺、糖基神經(jīng)酰胺、GM3和硫腦苷脂。
56.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述生物活性劑被配制為藥物組合物。
57.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為A型尼曼-皮克病或B型尼曼-皮克病。
58.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為法伯氏病。
59.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為克拉伯病。
60.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為唾液酸貯積病。
61.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。
62.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為戈謝病。
63.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積癥為法布里病。
64.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯積癥為鞘脂激活蛋白缺乏病。
65.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述溶酶體貯 積病的特征是具有與所述疾病病理相關(guān)的缺陷酶的殘余酶促活性。
66.如權(quán)利要求1所述的生物活性劑或如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述殘余酶促 活性為 0. -50%，如 0. 1-1%，例如 1-2%，如 2-3%，例如 3-4%，如 4_5%，例如 5-6%， 如 6-7%，例如 7-8%，如 8-9%，例如 9-10%，如 10-11%，例如 11-12%，如 12-13%，例如 13-14%，如 14-15%，例如 15-20%，如 20-25%，例如 25-30%，如 30-35%，例如 35-40%, 如40-45%，例如45-50%的殘余酶促活性。
67.治療溶酶體貯積病的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)所述的生物 活性劑和至少一種其它治療形式的組合。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是用于溶酶體貯積 病的常規(guī)或已知治療形式。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式同時(shí)或序貫施用。
70.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是酶替代療法 (ERT)。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述ERT選自Cerezyme (注射用伊米苷酶)、 美格魯特、Fabrazyme (β半乳糖苷酶)和利甫蓋素(α半乳糖苷酶)。
72.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，向患有戈謝病的個(gè)體施用所述生物活性劑和 Cerezyme (注射用伊米苷酶)或美格魯特的組合。
73.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，向患有法布里病的個(gè)體施用所述生物活性劑和 Fabrazyme (^半乳糖苷酶)或利甫蓋素(α乳糖苷酶)的組合。
74.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是止痛物品。
75.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是皮質(zhì)類固醇。
76.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是移植。
77.權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述移植選自骨髓移植、臍帶血移植和干細(xì)胞移植。
78.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是底物減少療法。
79.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述至少一種其它治療形式是對癥和支持療法， 如物理療法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP相互作用，所述方法包括施用或誘導(dǎo)Hsp70或其功能片段或變體并從而調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性的步驟，其中所述Hsp70或其功能片段或變體是適合使BMP和Hsp70或所述功能片段或變體之間相互作用的形式。
文檔編號(hào)A61P3/00GK102123729SQ200980131985
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者托馬斯·基爾克高·延森, 瑪麗亞·海倫娜·耶泰萊 申請人:奧菲澤米有限公司