專利名稱：用于電化學(xué)測(cè)定被分析物或氧化還原酶的方法和敏感電極系統(tǒng)以及為此而使用的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在存在有一種氧化還原酶和一種可還原物質(zhì)的條件下電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法，所述可還原物質(zhì)將測(cè)試反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電子從氧化還原酶處傳送到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，該信號(hào)成為待測(cè)定的被分析物的量度，通過上述過程，可還原物質(zhì)被酶催還原并在電極上被氧化;或者本發(fā)明涉及在有酶作用物和上述可還原物質(zhì)存在的情況下電化學(xué)測(cè)定氧化還原酶的相應(yīng)方法。
此外，本發(fā)明涉及用于電化學(xué)測(cè)定樣品中的被分析物的敏感電極系統(tǒng)，它含有二種導(dǎo)電介質(zhì)，各導(dǎo)電介質(zhì)彼此隔離，借助于一個(gè)導(dǎo)電表面可使導(dǎo)電介質(zhì)與被檢測(cè)的樣品電接觸，在該電極系統(tǒng)中至少有一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶和可還原物質(zhì)，所述的可還原物質(zhì)可以在氧化還原酶和導(dǎo)電表面之間傳送電子;或者本發(fā)明涉及相應(yīng)的、用于測(cè)定氧化還原酶的敏感電極系統(tǒng)，其中，至少一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶和上述特征的可還原物質(zhì)。
最后，本發(fā)明還涉及將某些化合物用在電化學(xué)系統(tǒng)中作為在氧化還原酶與電極之間的電子載體。
用比色法測(cè)定液體中的被分析物是通過目視或光度來做出評(píng)定的，與此相比，相應(yīng)的電化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是，電化學(xué)反應(yīng)直接產(chǎn)生出可以被換算成濃度的電流。反之，比色法的測(cè)試途徑是間接的，要經(jīng)過電池→電流→光→剩余光(減弱或透射)→電流→測(cè)量值。
對(duì)于電化學(xué)測(cè)定法來說，必須使待測(cè)定的被分析物氧化或者使其轉(zhuǎn)變成一種可以利用化學(xué)方法或酶催法使之氧化的物質(zhì)。使被分析物或由其得到物質(zhì)在電極表面上直接氧化要求高的過電壓即電位。這種方法是沒有什么選擇性的。采用這種方法，在待檢測(cè)的樣品中存在的許多其它物質(zhì)也被氧化了。因此這種方法幾乎不能用于分析。
上述可以氧化的被分析物或由它所得到的可以氧化的物質(zhì)，通常與相應(yīng)的氧化還原酶和可還原物質(zhì)反應(yīng)，經(jīng)過還原后的上述可還原物質(zhì)在電極上可以再次被氧化。在這種情況下，這種可以氧化的被分析物或由其得到的可以氧化的物質(zhì)被酶有選擇性地氧化。這樣被還原的酶又被所存在的可還原物質(zhì)所氧化，而被還原的可還原物質(zhì)在電極上被氧化。從而，這種可還原物質(zhì)起到了電子載體的作用，它把電子從酶那里傳送到電極上。因此，其先決條件是，所選擇的可還原物質(zhì)應(yīng)當(dāng)迅速地、特定地被酶和被電極所轉(zhuǎn)變。
P.W.Carr等人描述了利用葡糖氧化酶進(jìn)行酶催化的、葡萄糖與氧(作為可還原物質(zhì))的反應(yīng)以及檢測(cè)在電極上形成的過氧化氫(參見“Theory and application of enzyme electrodes in analytical and clinical chemistry”，Publisher Wiley，New York(1980)，Papes 197-310。這種方法的缺點(diǎn)是，本身為強(qiáng)氧化劑的過氧化氫的付反應(yīng)以及由于使用高的正電位的結(jié)果在電極表面上發(fā)生的付反應(yīng)。因此這一方法要求予先進(jìn)行特定的分離，以除去待檢測(cè)樣品中的干擾成分。另外一個(gè)缺點(diǎn)是需要氧。空氣中的氧擴(kuò)散進(jìn)入樣品里并在樣品里成為決定反應(yīng)速度的因素，特別是在高的葡萄糖濃度下，從而在某些情況下可以使得這一方法的結(jié)果不真實(shí)。
在歐洲專利EP-A-0125137中描述了一種用于測(cè)定多種物質(zhì)混合物中某一組分的敏感電極系統(tǒng)，該系統(tǒng)至少具有二種導(dǎo)電介質(zhì)，它們彼此隔離，借助一個(gè)導(dǎo)電的表面可使它們與待檢測(cè)的樣品電接觸，從而這些導(dǎo)電表面中的一個(gè)接觸氧化還原酶和所謂的“媒質(zhì)化合物”，該化合物在該酶與導(dǎo)電表面之間傳送電子。一種有機(jī)金屬物質(zhì)被用來作為媒質(zhì)化合物，它至少具有二個(gè)有機(jī)環(huán)，每個(gè)環(huán)至少有二個(gè)共軛雙鍵，其中金屬原子與這些環(huán)中的每一個(gè)共用其電子。正如EP-A-0078636中那樣，二茂鐵或二茂鐵衍生物被用來作為優(yōu)選的媒質(zhì)化合物。就這一點(diǎn)來說，應(yīng)當(dāng)考慮到，這些化合物必須首先被氧化，例如氧化成為二茂鐵(ferrocinium)離子，然后它們才可以接受來自氧化還原酶的電子。這導(dǎo)致產(chǎn)生所謂的“起始電流”，在不存在被分析物的情況下就已經(jīng)有了這種“起始電流，當(dāng)然就干擾了以所產(chǎn)生的電流作為待測(cè)定的被分析物含量的量度的電流測(cè)定分析方法。此外，這種金屬有機(jī)化合物缺乏溶解性也是一個(gè)缺點(diǎn)，這是因?yàn)?，例如在使用氧化?如葡糖氧化酶)作為氧化還原酶時(shí)這將導(dǎo)致氧的優(yōu)先選擇，從而導(dǎo)致產(chǎn)生很小的電流并導(dǎo)致對(duì)氧的依賴性，特別是在較低的酶作用物濃度下。如果以被還原的形式使用這些電子載體，那么為了得到可以接受的起始電流，缺乏溶解度和/或使用低的濃度是必要的。
一般地說，人們所熟知的現(xiàn)有技術(shù)電化學(xué)測(cè)定方法中使用的電子載體的特點(diǎn)是，在有待檢測(cè)的被分析物存在情況下它們被氧化還原酶所還原并在電極上被重新氧化成為原來的化合物。如果起到電子載體作用的可還原物質(zhì)的濃度大大小于待測(cè)定的被分析物的濃度，那么只有動(dòng)態(tài)方法可以被實(shí)現(xiàn)。對(duì)于終點(diǎn)測(cè)定來說，為了使待測(cè)定的被分析物完全反應(yīng)，起電子載體作用的可還原物質(zhì)相對(duì)于待測(cè)定的被分析物來說必須以過量溶解的形式存在。在這種方法中，進(jìn)行反應(yīng)的可還原物質(zhì)的數(shù)量與待測(cè)定的被分析物成正比。與動(dòng)態(tài)測(cè)量相比，其突出優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)大了電流測(cè)定法中電流/濃度的線性范圍，以及在使用氧化酶作為氧化還原酶時(shí)，與氧相比提高了較高濃度的可還原物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)能力。但其缺點(diǎn)是為了實(shí)現(xiàn)完全反應(yīng)必須使用某種可還原物質(zhì)即氧化劑作為電子載體，其電位顯著高于酶作用物的電位，此外，在電化學(xué)測(cè)量中必須使用過量的氧化劑，這進(jìn)一步提高了所需要的電位。但是，高的工作電位有利于非特定的電極反應(yīng)，特別是在所要檢測(cè)的樣品中除了待測(cè)定的被分析物外還含有許多其它成分時(shí)。
在這方面，迄今還沒有用于通過酶催氧化還原反應(yīng)電化學(xué)測(cè)量被分析物的令人滿意的解決辦法。缺少滿足下列條件的起到電子載體作用的可還原物質(zhì)該物質(zhì)能普遍適用，能與氧化還原酶迅速反應(yīng)，并且在低電位下在電極表面上顯示出不受抑制的反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是解決這一問題。特別是要找到在電化學(xué)系統(tǒng)中可以在氧化還原酶和電極之間起到電子載體作用的可還原物質(zhì)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這一目的，本發(fā)明的特征概述于權(quán)利要求中。
本發(fā)明提供了一種在有氧化還原酶和可還原物質(zhì)存在的情況下電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法，所述的可還原物質(zhì)將測(cè)量反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電子從氧化還原酶那里傳送到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)作為待測(cè)定的被分析物的量度的信號(hào)，通過這一過程，上述可還原物質(zhì)被酶催還原并在電極上被氧化，這一方法的特征是，在電極上氧化形成的物質(zhì)不同于一開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種在有相應(yīng)的酶作用物和可還原物質(zhì)存在的情況下電化學(xué)測(cè)定氧化還原酶的方法，所述的可還原物質(zhì)能夠?qū)㈦娮佑裳趸€原酶處傳送到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)作為待測(cè)定的酶的量度的信號(hào)，通過這一過程，上述氧化還原酶被酶催還原并在電極上被氧化，這一方法的特征在于，在電極上氧化形成的物質(zhì)不同于一開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。
另外，本發(fā)明還提供了，將一種能從氧化還原酶那里接受電子、形成富集電子的芳香胺的物質(zhì)在電化學(xué)系統(tǒng)中作為氧化還原酶與電極之間的電子載體的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一個(gè)用于測(cè)定液體樣品中的被分析物的敏感電極系統(tǒng)，它至少含有二種導(dǎo)電介質(zhì)，它們彼此隔離，借助于導(dǎo)電的表面可以使它們與待檢測(cè)的樣品電接觸，在該系統(tǒng)中，至少有一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶和可還原物質(zhì)，該可還原物質(zhì)能在氧化還原酶與導(dǎo)電表面之間傳遞電子，這一電極系統(tǒng)的特征在于，使用一種化合物作為可還原物質(zhì)，該化合物在被氧化還原酶還原之后在導(dǎo)電表面上被氧化成為一種與開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)不同的物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了一種用于電化學(xué)測(cè)定液體樣品中氧化還原酶的敏感電極系統(tǒng)，它至少含有二種導(dǎo)電介質(zhì)，它們彼此隔離，借助于一個(gè)導(dǎo)電表面可使每一導(dǎo)電介質(zhì)與待檢測(cè)的樣品電接觸，在該電極系統(tǒng)中，至少有一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶作用物和一種可還原物質(zhì)，該可還原物質(zhì)能在氧化還原酶與導(dǎo)電表面之間傳遞電子，這一系統(tǒng)的特征在于，使用一種化合物作為可還原物質(zhì)，該化合物在被氧化還原酶還原之后在導(dǎo)電表面上被氧化成為一種與開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)不同的物質(zhì)。
最后，本發(fā)明提供了，一種能從氧化還原酶那里接受電子、形成富電子的芳香胺的物質(zhì)用于制造本發(fā)明的敏感電極系統(tǒng)的應(yīng)用。
業(yè)已證明，已知的在有氧化還原酶和可還原物質(zhì)存在的條件下電化學(xué)測(cè)定被分析物的現(xiàn)有技術(shù)方法因必須用高電位而帶來的缺點(diǎn)-特別是在相對(duì)于待測(cè)定的被分析物而使用過量的起電子載體作用的可還原物質(zhì)時(shí)-通過不可逆反應(yīng)可以基本上被避免。由于在電極上形成的被氧化的物質(zhì)與一開始時(shí)用作可還原物質(zhì)的那種物質(zhì)不同，因此電化學(xué)測(cè)定可以在特別低的電位下進(jìn)行，從而免除了干擾反應(yīng)的危險(xiǎn)。在下述情況時(shí)也可以利用這一低電位的優(yōu)點(diǎn)，即與待測(cè)定的被分析物相比僅使用少量的起電子載體作用的可還原物質(zhì)的時(shí)候，也就是說在開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)及在電極上氧化形成的物質(zhì)被電化學(xué)方法所必需的氧化還原酶所還原的時(shí)候。如果開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)以及在電極上氧化形成的物質(zhì)被氧化還原酶還原成為同樣的物質(zhì)，那么初始使用的可還原物質(zhì)對(duì)于次生的可還原物質(zhì)來說就起到了累積形式的作用，該次生的可還原物質(zhì)在電極和酶之間重新循環(huán)，它與初始時(shí)使用的可還原物質(zhì)不同。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)歸因于下述事實(shí)可以被選擇作為可還原物質(zhì)的那些物質(zhì)通過酶催還原形成了一種化合物，該化合物在電極上在低電壓下即可以被氧化。在電極上氧化的過程中，只有其濃度微不足道的這種新氧化的物質(zhì)存在。迄今為止，經(jīng)過酶催還原的化合物都不得不在電極上被氧化回到初始時(shí)使用的、已經(jīng)以高濃度存在的可還原物質(zhì)。為此必須提高正電位。
在本發(fā)明的意義上可以有利地用來作為可還原物質(zhì)的化合物是這樣的一些化合物，它們?cè)谘趸€原酶所適用的作用物氧化過程中接受由酶產(chǎn)生的電子，并在這一過程中形成富電子的芳香胺。就這一點(diǎn)而言，富電子的芳香胺被理解為一種化合物，它富集了比苯胺更多的電子，由于電子的富集，它在電極上可以在低電位下被氧化。例如，下述所有苯胺衍生物都在考慮之列，這些苯胺在芳環(huán)上或在苯胺的氮上帶有一個(gè)或幾個(gè)+I或/和+M取代基，例如羥基、烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、一烷基氨基和二烷基氨基殘基。
烷基、烷氧基、烷硫基、一烷基氨基和二烷基氨基殘基是這樣一些殘基，其中烷基相當(dāng)于具有1-6個(gè)碳原子的、本身可被下列基團(tuán)取代的烴基殘基羥基、氨基(如果需要，被具有1-6個(gè)碳原子的烷基一次或多次取代)、PO3H2、SO2H或CO2H。酸性殘?jiān)黀O3H2、SO3H和CO2H可以就這樣存在也可以以鹽的形式存在，例如以銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽的形式存在。
芳氧基和芳硫基殘基是具有6-10個(gè)碳原子的芳族殘基，其中特別優(yōu)先選用苯氧基和苯硫基殘基。
銨鹽是含有銨離子NH+4的鹽，或者是含有被烷基、芳基或芳烷基殘基一次或多次取代的銨陽(yáng)離子的鹽。在烷基殘基和芳烷基殘基中的烷基指的是帶有1-6個(gè)碳原子的烴基殘基。芳基殘基和芳烷基殘基中的芳基是具有6-10個(gè)碳原子的芳族環(huán)狀系統(tǒng)，其中最為理想的是苯基。優(yōu)先選用的芳烷基殘基是芐基。
堿金屬鹽最好是鋰、鈉或鉀的鹽。堿土金屬鹽最好是鎂或鈣的鹽。
此外，苯胺衍生物被理解為包括下述化合物它們?cè)诜甲瀛h(huán)狀系統(tǒng)上帶有一個(gè)未被取代的氨基基團(tuán)或一個(gè)被+I或/和+M取代基(如烷基)一次或多次取代的氨基基團(tuán)，上述芳環(huán)系統(tǒng)與一個(gè)或幾個(gè)芳族或/和脂環(huán)族環(huán)稠合。就這一點(diǎn)而言，烴-芳族系統(tǒng)以及雜芳族化合物都被認(rèn)為是芳族環(huán)。其例子有稠合的苯環(huán)或萘環(huán)，或者稠合的吡啶環(huán)。
脂環(huán)族環(huán)被理解為帶有5-7個(gè)碳原子(最好是5或6個(gè)碳原子)的、飽和的或不飽和的環(huán)脂族化合物。
氨基基團(tuán)的可以允許的烷基取代基可以是帶有1-6個(gè)碳原子的烴基殘基，它們本身可以被羥基、氨基(如果需要，被具有1-6個(gè)碳原子的烷基一次或多次取代)、PO3H2、SO3H和CO2H所取代。酸性殘基PO3H2、SO3H和CO2H可以就這樣存在或以鹽例如銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽的形式存在，上面給出的定義也適用于這些鹽。
上文中舉出的+I或/和+M取代基的例子是不完全的。本專業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該知道某種給定的取代基是不是+I或/和+M取代基，所有這些取代基都應(yīng)認(rèn)為是在本發(fā)明中使用的富電子芳香胺中的可以接受的取代基。
可還原物質(zhì)在從氧化還原酶那里接受電子時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)生富集電子的芳香胺，隨后該芳香胺在電極上可以在低電位下被氧化。作為這樣的可還原物質(zhì)優(yōu)先選用下列通式Ⅰ的化合物組中的化合物以及通式Ⅱ的化合物X-R (Ⅰ)式中，R表示富集電子的芳族殘基，X表示NO或NHOH，
HO-N＝Y(jié) (Ⅱ)式中，Y表示一個(gè)醌型系統(tǒng)，該系統(tǒng)在還原之后在芳族狀態(tài)中是富電子的。
就這一點(diǎn)而言，富電子的芳族殘基被理解為上面所列的富電子芳香胺的替代物。
本發(fā)明的這些可還原物質(zhì)在接受來自氧化還原酶的電子時(shí)被還原成為芳族胺，并且在電極上氧化時(shí)它們不是被氧化成為原來的可還原物質(zhì)。本專業(yè)的技術(shù)人員都知道，在富電子的芳香胺發(fā)生電化學(xué)氧化時(shí)，電子從芳基殘基上脫離，導(dǎo)致形成一些原子團(tuán)或醌型系統(tǒng)。但是不形成醌型肟、羥胺和亞硝基化合物。
經(jīng)過電化學(xué)氧化的化合物常?？梢栽俅谓邮軄碜匝趸€原酶的電子，從而被還原回去成為富電子的芳香胺。因此，與待測(cè)定的被分析物相比可以以低的濃度使用本發(fā)明的可還原物質(zhì)。這樣，它們起到了由氧化還原酶處接受電子時(shí)形成的富電子芳香胺的累積形式的作用，并且可以作為電子載體在氧化還原酶與電極之間反復(fù)循環(huán)。
業(yè)已證明，本發(fā)明的電子載體的突出例子有N-(2-羥乙基)-N′-對(duì)亞硝基苯基-哌嗪，N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺，鄰-甲氧基-[N，N-雙-(2-羥乙基)]-對(duì)亞硝基苯胺，對(duì)-羥基亞硝基苯，N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪，對(duì)醌二肟，N，N-二甲基-對(duì)亞硝基苯胺，
N，N-二乙基-對(duì)亞硝基苯胺，N-(4-亞硝基苯基)-嗎啉，N-芐基-N-(5′-羧戊基)-對(duì)亞硝基苯胺，N，N-二甲基-4-亞硝基-1-萘胺，N，N，3-三甲基-4-亞硝基苯胺，N-(2-羥乙基)-5-亞硝基二氫吲哚，N，N-雙-(2-羥乙基)-3-氯-4-亞硝基苯胺，2，4-二甲氧基-亞硝基苯，N，N-雙-(2-甲氧基乙基)-4-亞硝基苯胺，3-甲氧基-4-亞硝基苯酚，N-(2-羥乙基)-6-亞硝基-1，2，3，4-四氫喹啉，N，N-二甲基-3-氯-4-亞硝基苯胺，N，N-雙-(2-羥乙基)-3-氟-4-亞硝基苯胺，N，N-雙-(2-羥乙基)-3-甲硫基-4-亞硝基苯胺，N-(2-羥乙基)-N-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙基)-4-亞硝基苯胺，N-(2-羥乙基)-N-(3-甲氧基-2-羥基-1-丙基)-4-亞硝基苯胺，N-(2-羥乙基)-N-(3-(2-羥基乙氧基)-2-羥基-1-丙基)-4-亞硝基苯胺，N-(2-羥乙基)-N-(2-(2-羥基乙氧基)-乙基)-4-亞硝基苯胺。
本發(fā)明中優(yōu)先選用的可還原物質(zhì)是N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺，最理想的是N-(2-羥乙基)-N-(2-(2-羥基乙氧基)-乙基)-4-亞硝基苯胺。
根據(jù)本發(fā)明可以被使用的通式Ⅰ的許多化合物是人們所熟知的。通式Ⅲ的亞硝基苯胺衍生物或這衍生物的鹽是新的
式中，R1表示氫、鹵素、烷氧基或烷硫基;
R2表示烷基殘基;
R3表示羥烷基殘基;或者R2和R3是相同的或不同的，它們各代表一個(gè)二烷基氨基烷基殘基、一個(gè)羥基烷氧基烷基或烷氧基烷基殘基(如果需要，在烷基部分中被OH取代)或一個(gè)聚烷氧基烷基殘基(如果需要，在烷基部分中被一個(gè)羥基殘基取代);或者R2和R3形成一個(gè)被硫或氮間斷的亞烷基殘基，其中氮被烷基、羥烷基、羥基烷氧基烷基、烷氧基羥烷基、二噁烷基某基-烷基或聚烷氧基烷基殘基所取代，如果需要，它們每一種在烷基部分中被羥基殘基取代;或者若R1相對(duì)于NR2R3來說處在鄰位上，那么R2同R1一起表示一個(gè)亞烷基殘基，從而R3表示一個(gè)羥烷基殘基;若亞烷基殘基含有3個(gè)碳原子，那么根據(jù)需要它還表示一個(gè)烷基殘基;若R1不是氫，那么R2和R3是相同的或不同的，各表示一個(gè)羥烷基殘基。
就這方面而言，鹵素指的是氟、氯、溴或碘，特別是氟和氯最為理想。烷基、烷氧基或烷硫基是具有1-6個(gè)碳原子的殘基，其中具有1-3個(gè)碳原子的最理想。上面對(duì)烷基所下的定義也適用于下列殘基中的烷基部分羥烷基、二烷基氨基烷基、羥基烷氧基-烷基、烷氧基烷基、聚烷氧基烷基、烷氧基-羥烷基和二惡烷基某基-烷基殘基。
二惡烷基某基殘基是這樣一種殘基，其中一個(gè)二惡烷環(huán)狀系統(tǒng)被鍵聯(lián)到一個(gè)烷基殘基上。它最好是一個(gè)1，4-二惡烷環(huán)狀系統(tǒng)，即
聚烷氧基烷基殘基是一個(gè)-烷基-(烷氧基)n-烷氧基殘基，式中的n＝1-10，n＝1-4更為可取，最理想的是n＝1-3。亞烷基殘基是一個(gè)直鏈或支鏈的(最好是直鏈)、飽和或不飽和的(最好是飽和的)烴鏈，它由2-5(最好是2-4個(gè))碳原子帶有二個(gè)自由接合點(diǎn)組成。在上述R2和R3的被硫或氮間斷的亞烷基殘基的含義范圍內(nèi)，優(yōu)先選擇通過包含通式Ⅲ的氮原子而形成的硫代嗎啉或哌嗪殘基，特別是哌嗪殘基。
在由R1和R2形成的亞烷基殘基的含義范圍內(nèi)，優(yōu)先選擇通過包含通式Ⅲ的芳環(huán)而形成的二氫吲哚或1，2，3，4-四氫喹啉殘基。
作為通式Ⅲ的本發(fā)明亞硝基苯胺衍生物的鹽，優(yōu)先選擇強(qiáng)酸特別是礦物酸(如鹽酸、硫酸，硝酸和磷酸)的鹽。氫氯化物特別理想，它們是鹽酸的鹽。
根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)先選擇下列新的亞硝基苯胺衍生物及它們的鹽a)2，2′-[(3-氟-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇，b)2，2′-[(3-氯-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇，c)2，2′-[(3-甲氧基-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇，d)2，2′-[(3-甲基 基-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇，e)2-[(2-羥基乙氧基)乙基-(4-亞硝基苯基)氨基]乙醇，f)2-[(2-甲氧基乙氧基)乙基-(4-亞硝基苯基)氨基]乙醇，g)1-[N-(2-羥乙基)-(4-亞硝基苯胺基)]-3-甲氧基-2-丙醇，h)1-[N-(2-羥乙基)-(4-亞硝基苯胺基)]-3-(2-羥基乙氧基-2-丙醇，i)1-甲基-4-(4-亞硝基苯基)-哌嗪，j)4-(4-亞硝基苯基)-1-哌嗪基-乙醇，k)5-亞硝基-1-二氫吲哚乙醇，l)1-甲基-6-亞硝基-1，2，3，4-四氫喹啉，m)6-亞硝基-3，4-二氫-1(2H)喹啉乙醇。
其中，優(yōu)先選擇化合物a)、d)、e)、f)、g)、和h)及其鹽，化合物e)或它的鹽-特別是氫氯化物-最為理想。
通式Ⅲ的化合物可以通過使通式Ⅳ的化合物與亞硝酸鹽反應(yīng)來制備
式中，R1、R2和R3的含義與通式Ⅲ的化合物相同。由J.J.D′Amico等人的論文(見J.Amer.Chem.Soc.81，5957(1959))獲知一種類似的方法。
作為亞硝酸鹽最好是使用堿金屬亞硝酸鹽，其中的堿金屬可以是鋰、鈉、鉀、銣或銫，優(yōu)先選用亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，特別是亞硝酸鈉。反應(yīng)最好是在酸性介質(zhì)中于低溫下進(jìn)行。溫度低于10℃特別是在-10和+5℃之間時(shí)比較有利。
通式Ⅳ的化合物與亞硝酸鹽的反應(yīng)在水介質(zhì)中進(jìn)行比較有利。PH應(yīng)低于3，最好是低于2。
在上述反應(yīng)的一個(gè)最佳實(shí)施方案中，首先向含水的酸性介質(zhì)中加入通式Ⅳ的化合物或它的鹽，最好是礦物酸(如鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸)的鹽，使之冷卻，然后將該反應(yīng)混合物保持在低溫，與此同時(shí)加入亞硝酸鹽，最好是溶解形式的亞硝酸鹽。若也使用水介質(zhì)作為亞硝酸鹽的溶劑則更為有利。加入亞硝酸鹽后，將反應(yīng)混合物保持在低溫直至反應(yīng)完畢。為了處理該反應(yīng)混合物，最好用有機(jī)溶劑萃取，由萃取液中分離出產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明可用于作為電子載體的化合物可以以被氧化的形式貯存和使用。用這種方法避免初始電流，終點(diǎn)測(cè)定可以用過量的電子載體進(jìn)行。按本發(fā)明可用作電子載體的化合物在貯存過程中是穩(wěn)定的，它們可以與氧化還原酶迅速反應(yīng)。最重要的是，在使用氧化酶時(shí)，它們能夠與氧競(jìng)爭(zhēng)，并可以以超過待測(cè)定的被分析物最高濃度的量使用。由于本發(fā)明的電子載體在水介質(zhì)中具有良好的溶解性，使得上述后一性能成為可能。
在電化學(xué)測(cè)定體液中的被分析物時(shí)，按照本發(fā)明可用于作為電子載體的化合物的突出優(yōu)點(diǎn)是，它們不會(huì)被體液中具有還原作用的物質(zhì)非酶催還原，或者說這種還原的程度微不足道。本發(fā)明的電子載體在電極表面上迅速地被氧化，并且，處于還原形式的這種電子載體對(duì)氧是不敏感的。對(duì)于這些化合物，可以使用低電位在電極上進(jìn)行氧化。
在本發(fā)明中，把待測(cè)定的物質(zhì)稱為被分析物。它通常是若干種物質(zhì)構(gòu)成的混合物中的某一成分。就這方面來說，當(dāng)測(cè)定體液例如血液、血漿、血清或尿液中的某一被分析物時(shí)，本發(fā)明的方法具有特殊的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榫瓦@方面而言，最重要的是只與該生物多組分系統(tǒng)中的一種組分發(fā)生特定反應(yīng)。
本發(fā)明的電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法是建立在下述事實(shí)的基礎(chǔ)上，即被分析物本身被氧化還原酶氧化并因而形成了相應(yīng)的酶作用物，或者被分析物在一個(gè)或幾個(gè)予先的反應(yīng)中-最好是酶催反應(yīng)-被轉(zhuǎn)變成一種可以被氧化還原酶氧化的化合物。在這一氧化過程中產(chǎn)生的電子與待測(cè)定的被分析物的量成正比。如果這些電子被本發(fā)明的可還原物質(zhì)傳送到電極上，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)作為待測(cè)定的被分析物的量度的信號(hào)?？梢圆捎秒娏鳒y(cè)定方法也可采用電位測(cè)定法，前者是測(cè)定電流，后者是測(cè)定電壓。
本發(fā)明的方法所使用的氧化還原酶優(yōu)先選用氧化酶、非NAD(P)依賴性的脫氫酶或心肌黃酶。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以用葡糖氧化酶測(cè)定葡萄糖，用乳酸氧化酶測(cè)定乳酸，用甘油磷酸酯氧化酶測(cè)定甘油磷酸酯，用膽甾醇氧化酶測(cè)定膽甾醇。作為非NAD(P)依賴性脫氫酶，例如可以使用葡萄糖-染色氧化還原酶來測(cè)定葡萄糖。心肌黃酶也可以表示成NADH染色氧化還原酶，它非常適合用來檢測(cè)NADH。
在必須電化學(xué)測(cè)定某種被分析物，而該被分析物本身不能作為氧化還原酶的作用物的情況下，可以通過一個(gè)或幾個(gè)予先的反應(yīng)-特別是酶催反應(yīng)-將該被分析物轉(zhuǎn)變成一種被氧化還原酶接受作為作用物的化合物。例如，甘油三酯是可以測(cè)定的，因?yàn)樗鼈兘柚邗ッ副唤怆x成為甘油和酸性殘?jiān)?，再用甘油激酶使甘油轉(zhuǎn)變成甘油磷酸酯和腺苷三磷酸(ATP)，最后利用甘油磷酸酯氧化酶使其氧化，在這后一步驟中產(chǎn)生的電子被本發(fā)明的電子載體傳送到電極上從而產(chǎn)生一個(gè)電流，這一電流與被測(cè)定的樣品中的甘油三酯的量成正比。
采用類似的方法也可以測(cè)定總膽甾醇量，用膽甾醇酯酶使膽甾醇酯解離，再借助于膽甾醇氧化酶測(cè)定這樣所形成的膽甾醇。在這種情況下，所形成的膽甾醇的量和在借助于膽甾醇氧化酶而氧化的過程中釋放出的電子也與要測(cè)定的總膽甾醇的量成正比，上述電子借助于本發(fā)明的可還原物質(zhì)被傳送到電極上。
心黃肌酶可以用來測(cè)定NADH。來自心肌黃酶的電子也可以借助于本發(fā)明的可還原物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到電極上。許多生物物質(zhì)都可以被酶催反應(yīng)、生成NADH，因此用這種方法可以通過酶催反應(yīng)序列使許多被分析物轉(zhuǎn)變成NADH，最后再借助于心肌黃酶和本發(fā)明中用的可還原物質(zhì)測(cè)定它。
根據(jù)以上所述不言而喻，按照本發(fā)明如果使用一種被認(rèn)為是酶作用物的相應(yīng)的化合物以及一種本發(fā)明的可還原物質(zhì)，那么當(dāng)然也可以測(cè)定氧化還原酶。這樣，如果在有相應(yīng)的敏感電極系統(tǒng)存在的情況下使葡萄糖和本發(fā)明的電子載體與要測(cè)定的樣品接觸，就可以電化學(xué)測(cè)定葡糖氧化酶。
本發(fā)明方法的一個(gè)突出特征是，用來將電子從氧化還原酶處轉(zhuǎn)移到電極上的可還原物質(zhì)在以被氧化的形式貯存時(shí)是穩(wěn)定的，此外它易溶于水，這一點(diǎn)對(duì)于測(cè)定體液例如血液、血漿、血清和尿液中的被分析物特別重要。本發(fā)明可以使用的可還原物質(zhì)與氧化還原酶迅速反應(yīng)，并能有力地與氧競(jìng)爭(zhēng)，特別是在與氧化酶的反應(yīng)中。由于它們的溶解性，它們可以用于測(cè)定電流的終點(diǎn)法，在這種方法中要求可還原物質(zhì)的量要超過待測(cè)定的被分析物最高濃度。由于本發(fā)明能夠使用的可還原物質(zhì)被體液中存在的還原劑非酶催還原的程度是微不足道的，它們?cè)陔姌O表面上迅速被氧化，并且在還原的形式時(shí)對(duì)氧極不敏感，因此這些物質(zhì)非常適用于特定地、無干擾地電化學(xué)測(cè)定被分析物。此外，這種無干擾地、特定地電化學(xué)測(cè)定被分析物首先是建立在下述事實(shí)基礎(chǔ)上根據(jù)本發(fā)明能使用的可還原物質(zhì)只需要小的電極電位。
本發(fā)明的電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法不局限于特定的電化學(xué)裝置。例如，可以使用現(xiàn)有技術(shù)的敏感電極系統(tǒng)。原則上說，下述敏感電極系統(tǒng)可適用于測(cè)定液體樣品中的被分析物它們至少含有二種導(dǎo)電介質(zhì)作為電極，這些導(dǎo)電介質(zhì)彼此隔離，借助于一個(gè)導(dǎo)電表面可以使每一導(dǎo)電介質(zhì)與要檢測(cè)的樣品電接觸。就這一敏感電極系統(tǒng)而言，可以設(shè)想只使用二個(gè)電極，即一個(gè)工作電極和一個(gè)參比電極。沒有參比電極即只有工作電極和反電極的測(cè)量裝置也是可以的。在這種情況下，電壓只在外表上保持恒定。也可以使用三個(gè)電極，即一個(gè)參比電極、一個(gè)工作電極和一個(gè)反電極。由現(xiàn)有技術(shù)中可以獲知相應(yīng)的敏感電極系統(tǒng)，例如參見G.Henze and R.Neeb，“Elektrochemische Analytik”(電化學(xué)分析)，Springer-Verlag(1986)。
對(duì)于電化學(xué)測(cè)定被分析物來說，重要的是，(至少)一個(gè)電極-即導(dǎo)電表面-接觸到氧化還原酶和能在氧化還原酶與導(dǎo)電表面之間傳遞電子的可還原物質(zhì)。在這一點(diǎn)上，可以設(shè)想所需要的所有試劑與要檢測(cè)的樣品一起處在溶液中;或者這些試劑中的一部分-最好是氧化還原酶和/或傳送電子的可還原物質(zhì)-被固定在電極上，其余的處在溶液中;或者測(cè)量所必需的所有試劑都固定在電極上。原則上說，工作電極是否接觸氧化還原酶和以被溶解的形式起到電子載體作用的可還原物質(zhì)，或者這些物質(zhì)是否是以固體物質(zhì)形式被涂于電極上，以及，根據(jù)需要它們?cè)谂c要檢測(cè)的液體樣品接觸時(shí)溶解，抑或在與待檢測(cè)的液體樣品接觸后仍保持固定在電極上，這一切對(duì)于敏感電極系統(tǒng)的功能都不是至關(guān)重要的。
不言而喻，以上所述同樣適用于氧化還原酶的測(cè)定。必須注意的是，敏感電極系統(tǒng)接觸氧化還原酶和本發(fā)明的可還原物質(zhì)。除此之外，對(duì)于測(cè)定被分析物所作的描述都可相應(yīng)地應(yīng)用于這種情況。
附圖進(jìn)一步描述了本發(fā)明

圖1-a)部分電子載體濃度大于或等于要測(cè)定的被分析物濃度時(shí)在本發(fā)明方法中可以使用的可還原物質(zhì)的作用及敏感電極系統(tǒng)的示意圖。
圖1-b)部分在現(xiàn)有技術(shù)方法中載運(yùn)電子的物質(zhì)的作用及現(xiàn)有技術(shù)敏感電極系統(tǒng)的示意圖。
圖2-a)部分傳送電子的物質(zhì)的濃度遠(yuǎn)小于要測(cè)定的被分析物濃度時(shí)在本發(fā)明方法中能使用的可還原物質(zhì)的作用和敏感電極系統(tǒng)的示意圖。
圖2-b)部分在現(xiàn)有技術(shù)方法中傳遞電子的物質(zhì)的作用和現(xiàn)有技術(shù)敏感電極系統(tǒng)的示意圖。
圖3用于實(shí)施本發(fā)明方法的敏感電極系統(tǒng)，其中，所需要的物質(zhì)存在于溶液中。
圖4用于實(shí)施本發(fā)明方法的敏感電極系統(tǒng)，它設(shè)計(jì)成一次性使用的可置換的敏感元件。
圖5按本發(fā)明電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖時(shí)用N，N-雙(2-羥乙基)-對(duì)-亞硝基苯胺作為傳遞電子的物質(zhì)由循環(huán)電壓電流圖(cyclovoltammograms)得到的在不同葡萄糖濃度下陽(yáng)極電流密度畸峰值的曲線圖。
圖6是一個(gè)曲線圖，它表明在按本發(fā)明測(cè)定NADH時(shí)的電流密度與NADH濃度之間的關(guān)系。
圖7N-(2-羥乙基)-N′-對(duì)亞硝基苯基-哌嗪和N，N-雙(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺的循環(huán)電壓電流圖(cyclovoltammogramms)。
圖8按照本發(fā)明的方法在有和沒有大氣氧存在的情況下用N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)哌嗪作為傳遞電子的物質(zhì)時(shí)電流密度對(duì)葡萄糖濃度的關(guān)系曲線圖。
圖9按照現(xiàn)有技術(shù)方法在有和沒有大氣氧存在的情況下用四硫富瓦烯作為傳遞電子的物質(zhì)時(shí)電流密度對(duì)葡萄糖濃度的關(guān)系曲線圖。
圖10按照本發(fā)明方法用N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺作為傳遞電子的物質(zhì)在用乳酸脫氫酶啟動(dòng)測(cè)試反應(yīng)后各不同時(shí)間的電流密度對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)濃度的關(guān)系曲線圖。
圖11根據(jù)本發(fā)明的方法用圖4所示的一次性電極測(cè)定葡萄糖時(shí)的電流-時(shí)間曲線。
圖12按照本發(fā)明的方法使用圖4所示的一次性電極在10秒鐘反應(yīng)時(shí)間后的電流對(duì)葡萄糖濃度的關(guān)系曲線圖。
在圖1和圖2中分別表示了，使用的傳遞電子的物質(zhì)的量超過要測(cè)定的被分析物時(shí)(圖1)以及與被分析物濃度相比使用很少量的傳遞電子的物質(zhì)時(shí)(圖2)本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)方法之間的區(qū)別。按照?qǐng)D1b)的現(xiàn)有技術(shù)方法，在有待測(cè)定的被分析物或由其衍生的物質(zhì)(Sred)存在的情況下，傳遞電子的物質(zhì)(Eox1)被轉(zhuǎn)變成還原的形式(Ered)，而被分析物或由其衍生的物質(zhì)被酶催氧化成為(Sox)。被還原的電子載體(Ered)在電極上釋放出電子從而被氧化回到-開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)(Eox1)。
反之，按照?qǐng)D1a)的本發(fā)明方法，在要測(cè)定的被分析物或由其衍生得到的物質(zhì)(Sred)酶催氧化成為(Sox)的過程中，起電子載體作用的可還原物質(zhì)(Eox1)轉(zhuǎn)變成被還原的形式(Ered)。隨后在電極上陽(yáng)極氧化過程中，形成了被氧化形式的電子載體(Eox2)，它與一開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)(Eox1)是不同的。由于在開始電化學(xué)氧化時(shí)根本不存在Eox2的結(jié)果，Ered在特別低的電位下就可以被氧化。在選擇本發(fā)明的傳遞電子的可還原物質(zhì)時(shí)，應(yīng)滿足較低的電位就足以使酶催形成的被還原形式(Ered)發(fā)生陽(yáng)極氧化。用這種方法可以避免伴隨發(fā)生干擾反應(yīng)，在較高的電位被施加到電極上時(shí)要檢測(cè)的樣品中的伴生物質(zhì)被氧化從而發(fā)生這些干擾反應(yīng)，并導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)電流，使所得結(jié)果不真實(shí)。在圖1b)的現(xiàn)有技術(shù)方法中，由于過量的Eox1因而需要比開始時(shí)用的可還原物質(zhì)(Eox1)的電位更高的電位來使酶催形成的電子載體的被還原形式(Ered)重新氧化。
如果起電子載體作用的可還原物質(zhì)(Eox1)的量少于要測(cè)定的被分析物或由其衍生而得到的物質(zhì)(Sred)，那么根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法(圖2b)，由于被還原的形式(Ered)被陽(yáng)極氧化成為開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)(Eox1)，因此這種可還原物質(zhì)可以在電極與酶之間反復(fù)地循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的方法(圖2a)，如果在電極上形成的氧化形式的電子載體(Eox2)被經(jīng)過還原的酶以及開始時(shí)用的可還原物質(zhì)(Eox1)所還原，那么對(duì)于Eox2/Ered電子載體系統(tǒng)來說(Eox1)可以起到穩(wěn)定的累積形式(Storage form)的作用。
原則上說，適用于現(xiàn)有技術(shù)方法的所有敏感電極系統(tǒng)都可以用于本發(fā)明的方法。因此圖3的敏感電極系統(tǒng)可以被使用，該系統(tǒng)參見G.Henze and R.Neeb，“Electrochemische Analytik”，Springer Verlag(1986)。
在這一系統(tǒng)中，工作電極(1)、反電極(2)和參比電極(3)浸在要檢測(cè)的液體樣品(4)中。這些電極可以使用常用的物質(zhì)。例如，工作電極和反電極(1，2)可以由貴金屬或者用于制造這些電極的那些金屬構(gòu)成。優(yōu)先選擇用于工作電極和反電極(1，2)的材料例如是金和鉑。參比電極(3)也可以由用于此目的的常規(guī)系統(tǒng)構(gòu)成。例如優(yōu)先選用銀/氯化銀系統(tǒng)。參比電極(3)通過一個(gè)鹽橋-例如氯化鉀溶液-與要檢測(cè)的液體樣品中的其余的電極系統(tǒng)(1，2)相接。
本發(fā)明方法的氧化還原酶或氧化還原酶系統(tǒng)(取決于要測(cè)定的是一種被分析物還是一種氧化還原酶)以及起電子載體作用的可還原物質(zhì)，可以被溶解在要檢測(cè)的樣品(4)中，抑或?qū)⑺鼈內(nèi)炕虿糠止潭ㄔ诠ぷ麟姌O(1)上。這些電極彼此電連接的方式取決于要測(cè)量的電信號(hào)以及它們必須被控制的方式，本專業(yè)的技術(shù)人員都很熟悉連接的方式。
圖4中顯示了一種可用于測(cè)定葡萄糖的一次性電極的結(jié)構(gòu)。所需的電極及其附帶的引線被安裝在一種絕緣的載體材料(8)例如聚碳酸酯箔上。適用的方法例如有網(wǎng)板印刷法、噴墨法、蒸發(fā)涂敷法或薄膜法。圖4中，(5)是工作電極，(55)是附帶的導(dǎo)電引線，(6)是帶有引線(66)的參比電極，(7)是帶有相應(yīng)引線(77)的反電極。這些電極和引線可以使用慣用的導(dǎo)電材料。例如可以使用商品石墨印染漿來制造連接到電極上的導(dǎo)電引線。這些電極主要含有貴金屬如銀、金或鉑。在圖4的本發(fā)明敏感電極系統(tǒng)中，工作電極含有一些電化學(xué)測(cè)定被分析物或氧化還原酶所必需的試劑。例如，對(duì)于測(cè)定葡萄糖來說這些試劑是葡糖氧化酶、本發(fā)明的傳遞電子的可還原物質(zhì)、使要測(cè)定的樣品的PH值對(duì)于酶催反應(yīng)達(dá)到最佳值的緩沖物質(zhì)，根據(jù)需要還可以有洗滌劑和溶脹劑，以獲得用使得該混合物導(dǎo)電的物質(zhì)制造電極所必需的稠度以及使得這一混合物可以被加工成糊。例如可以加入石墨粉作為使其導(dǎo)電的材料。參比電極(6)和反電極(7)及相應(yīng)的引線(66)和(77)例如可以用含氯化銀粉末的商品銀導(dǎo)電糊制備。圖4的敏感電極系統(tǒng)可以按約10×30mm的尺寸制造?？蓪⒁獧z測(cè)的溶液涂于電極表面上或者可以將試驗(yàn)樣品載體浸入待檢測(cè)的液體中，使電極表面為液體所覆蓋。在電流測(cè)定時(shí)，向電極上加一個(gè)電壓;測(cè)量與要測(cè)定的被分析物成正比的電流。為此，測(cè)量反電極(7)和工作電極(5)之間的電流，對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)使參比電極(6)和工作電極(5)之間保持予定的電壓。為了使引線的電阻不產(chǎn)生影響，測(cè)量工作電極(5)和參比電極(6)之間的電壓要在零電流下進(jìn)行。如果對(duì)電極電位的精度要求很低，可以免去在零電流下測(cè)量電壓，或者參比電極(6)可以同時(shí)作為反電極(7)工作。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1葡萄糖檢測(cè)使用圖3的敏感電極系統(tǒng)。工作電極(1)由面積0.1cm2的金絲構(gòu)成。反電極(2)是面積為0.1cm2的鉑絲，而參比電極(3)是由Orion Research Inc.Company(Boston，Massachusetts，USA)生產(chǎn)的銀/氯化銀系電極。
0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液和0.1摩爾/升氯化鉀(PH7.0);10毫摩爾/升N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺和濃度在0～100毫摩爾/升之間的葡萄糖的溶液在反應(yīng)容器中。
通過向反應(yīng)混合物中添加葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)及隨后混合，啟動(dòng)測(cè)量反應(yīng)。添加葡萄糖氧化酶的量應(yīng)使在反應(yīng)混合物中的濃度為0.5mg/ml(125U/ml)。添加葡萄糖氧化酶一分鐘后，用恒電位器(Mod.273 EG & G，Princeton Applied Research，Princeton，New Jersey，USA)以100mV/S的掃描速度測(cè)定循環(huán)電壓電流曲線(cyclovoltammogram)。第一個(gè)最大的氧化電流估計(jì)為150mV。獲得的結(jié)果示于圖5中。添加葡萄糖氧化酶5分鐘后，或當(dāng)氧被排除時(shí)(在氬氣下)，相應(yīng)的測(cè)量值沒有產(chǎn)生顯著的變化。結(jié)果是陽(yáng)極電流密度最大值與葡萄糖濃度的線性關(guān)系一直保持到葡萄糖濃度達(dá)到約30毫摩爾/升，這由圖5的曲線可以看出。在葡萄糖濃度高于30毫摩爾/升時(shí)，用作傳遞電子的物質(zhì)的N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺完全轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的苯二胺。所以高于30毫摩爾/升的葡萄糖濃度并不導(dǎo)致電流進(jìn)一步的增加。由于產(chǎn)生一個(gè)苯二胺分子需要二個(gè)葡萄糖分子，并且葡萄糖總量中三分之二是以β形式存在、從而可以被葡萄糖氧化酶轉(zhuǎn)變，因此，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10毫摩爾/升電子載體物質(zhì)被30毫摩爾/升葡萄糖完全轉(zhuǎn)變正好與理論計(jì)算相符。
用葡萄糖-染色-氧化還原酶(EC1.1.99.17)取代葡糖氧化酶(EC1.1.3.4)在0.1摩爾/升三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH7.0)并添加1%牛血清清蛋白中獲得類似的結(jié)果。
實(shí)施例2NADH檢測(cè)結(jié)構(gòu)和測(cè)量裝置如實(shí)施例1所述。反應(yīng)容器中裝有0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH7.0)、10毫摩爾/升N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺和濃度在0-10毫摩爾/升的NADH。添加并混合由微生物制造的心肌黃酶(NADH染色-氧化還原酶)，并將酶同反應(yīng)混合物混合，從而開始測(cè)量。酶的添加量應(yīng)使反應(yīng)混合物中的酶濃度為0.2mg/ml(3U/ml)。反應(yīng)1分鐘后測(cè)量電流密度，得到圖6中所示的線性的電流密度-濃度關(guān)系的曲線。
實(shí)施例3測(cè)定乳酸使用與實(shí)施例1同樣的試驗(yàn)結(jié)構(gòu)及同樣的電子載體還可以測(cè)定乳酸。使用乳酸氧化酶(EC1.1.3.2)作為酶，并使用0.1摩爾/升檸檬酸緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH5.5)作為緩沖液。
實(shí)施例4測(cè)定甘油磷酸鹽如果用甘油磷酸鹽氧化酶(EC1.1.3.21)取代實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶、緩沖液用0.1摩爾/升三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH8.0)代替，則可以相似地測(cè)定甘油磷酸鹽。
實(shí)施例5測(cè)定膽固醇用由鏈霉菌(Streptomyce)制造的膽甾醇氧化酶(EC1.1.3.6)代替實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶，用10毫摩爾/升N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪取代其中的電子受體，用0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH5.5)帶有2% Triton×100R代替其中的緩沖液，可以與實(shí)施例1相似地測(cè)定膽固醇。
實(shí)施例6本發(fā)明的傳遞電子的可還原物質(zhì)下面表1中所列化合物以10毫摩爾/升的濃度在0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH7.0)中同50毫摩爾/升葡萄糖和0.5mg/ml葡萄糖氧化酶(125U/ml)反應(yīng)。在這種情況下采用實(shí)施例1中所述的測(cè)量方案。相應(yīng)的循環(huán)電壓電流曲線圖產(chǎn)生了用葡萄糖氧化酶和葡萄糖還原的電子載體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氫電極的峰電位(單位mV)。
表1中列出1分鐘后和10分鐘后在最高氧化峰的電位上的氧化電流比作為轉(zhuǎn)化率的量度。
表1電子載體峰電位a轉(zhuǎn)換率bN－(2－羥乙基)－N＇-對(duì)亞硝基苯基哌嗪34097N，N－雙－(2－羥乙基)－對(duì)亞硝基苯胺21094鄰甲氧基－［N，N－雙－(2－羥乙基］一對(duì)亞硝基苯胺17035對(duì)亞硝基苯酚 22062對(duì)醌二肟C250 35N，N一二甲基－4－亞硝基－1－萘胺 17525N，N，3一三甲基－4－亞硝基苯胺22056N－(2－羥乙基)－5－亞硝基二氫吲哚80 86N，N－雙－(2－羥乙基)－3－氯－4－亞硝基苯胺315722，4一二甲氧基一亞硝基苯 13095N，N一雙一(2－甲氧基乙基)－4－亞硝基苯胺245683－甲氧基－4－亞硝基苯酚 14030N－(2－羥乙基)－6－亞硝基－1，2，34－四氫喹啉9582
N，N一二甲基－3－氯－4－亞硝基苯胺 27527N，N一雙一(2－羥乙基)－3－氟－4亞硝基苯胺26074N，N一雙一(2－羥乙基)－3－甲硫基一4－亞硝基苯胺 19521N－(2－羥乙基－N－2－(2－甲氧基乙氧基)－乙基)－4－亞硝基苯胺 21059N－(2－羥乙基)－N－(3－甲氧基－2－羥基－1－丙基)－4－亞硝基苯胺22565M－(2－羥乙基)－N－(3－(2－羥基乙氧基－2－羥基－1－丙基)－4－亞硝基苯胺 21054a用葡萄糖氧化酶和葡萄糖還原的電子載體的第一峰電位(單位mV，與Ag/Agcl相對(duì))。
b與反應(yīng)時(shí)間為10分鐘時(shí)的電流相比，反應(yīng)時(shí)間為1分鐘時(shí)循環(huán)電壓電流曲線圖中的第一最大值電流(%)。
c濃度5×10-4摩爾/升。
N-(2-羥乙基)-N′-對(duì)亞硝基苯基-哌嗪和N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺的循環(huán)電壓電流曲線示于圖7中。為了避免受殘余葡萄糖反應(yīng)干擾，用10毫摩爾/升葡萄糖測(cè)量循環(huán)電壓電流曲線，同時(shí)記錄該曲線。
實(shí)施例7本發(fā)明電子載體和現(xiàn)有技術(shù)的電子載體的比較a)按照實(shí)施例1中所述的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用濃度為10-4摩爾/升在磷酸鹽緩沖液(PH7.0)中的N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪。在葡萄糖濃度為0-3毫摩爾/升之間測(cè)量循環(huán)電壓電流曲線，得到如圖8所示的電流密度與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線。在低濃度下可以看出，大氣氧具有某種影響，通過在氬氣下測(cè)量可以避免這一影響。以較高濃度(10-2摩爾/升)使用電子載體時(shí)獲得了與使用氬氣作為保護(hù)氣體相同的結(jié)果。使用葡萄糖脫氫酶代替葡萄糖氧化酶也可以避免氧對(duì)測(cè)量的影響。
b)當(dāng)按現(xiàn)有技術(shù)使用四硫富瓦烯作為電子載體而不是按本發(fā)明用N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪作電子載體時(shí)，電流密度與葡萄糖濃度的關(guān)系如圖9所示。四硫富瓦烯顯示出受氧的干擾程度明顯高于用本發(fā)明電子載體的情況。另外還有測(cè)得低得多的電流濃度。
四硫富瓦烯溶解度很低。為了獲得在磷酸鹽緩沖液(PH7.0)中濃度為10-4摩爾/升，必須使用2.5%Tween 20R作為洗滌劑。由于缺乏溶解性因而不可能將四硫富瓦烯濃度明顯地調(diào)整提高以減小氧的干擾，而這在本發(fā)明的電子載體情況下是可以辦得到的。
實(shí)施例8測(cè)定酶a)乳酸脫氫酶檢測(cè)按照類似于實(shí)施例1的試驗(yàn)安排制備下列溶液0.1摩爾/升磷酸鈉緩沖液，0.1摩爾/升氯化鉀(PH9.0)
10毫摩爾/升N，N-雙-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺0.1摩爾/升D，L-乳酸鹽(鈉鹽)1U/ml由微生物制取的心肌黃酶10毫摩爾/升NAD+。
在強(qiáng)力攪拌(磁攪拌器，1000轉(zhuǎn)/分)的同時(shí)，在75mV對(duì)銀/氯化銀的恒定電位下測(cè)量電流。通過添加乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27)開始這一過程。添加不同量的乳酸脫氫酶，在每種情況下在100、200、300、400、500和600秒后進(jìn)行測(cè)量。獲得的電流/時(shí)間曲線如圖10所示?？v坐標(biāo)的LDH活性是按照通常的丙酮酸鹽還原試驗(yàn)測(cè)定。
b)葡萄糖脫氫酶檢測(cè)與NAD相關(guān)的葡萄糖脫氫酶的檢測(cè)可以類似地按a)中的描述在下述溶液中進(jìn)行0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液、0.1摩爾/升氯化鉀(PH7.0)帶有10毫摩爾/升NAD+、10毫摩爾/升本發(fā)明電子載體、1U/ml心肌黃酶和0.1摩爾/升葡萄糖。
可以相應(yīng)地測(cè)定氧化酶、心肌黃酶或不依賴于NAD的脫氫酶。
實(shí)施例9用于測(cè)定葡萄糖的一次性電極系統(tǒng)采用網(wǎng)板印刷法使用適當(dāng)?shù)挠∪緷{將工作電極(5)、參比電極(6)、反電極(7)和引線(55，66，77)安裝在聚碳酸酯箔(8)上，制成圖4所示的敏感電極系統(tǒng)。引線由商品石墨印染漿(Acheson 421 SS，Deutsche Acheson Colloids，Ulm，German Federal Republic)構(gòu)成。參比電極(6)和反電極(7)由混合有20%(重量)粉末氯化銀的商品銀導(dǎo)電糊構(gòu)成(Acheson SS 24566，Deutsche AchesonColloids，Ulm，German Federal Republic)。
對(duì)于工作電極(5)，將3毫摩爾/升N，N-雙-羥乙基-對(duì)亞硝基苯胺、每100g混合物500KU葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶，純度等級(jí)Ⅱ，Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，German Federal Republic)、30%(重量)石墨粉(UF296/97，Graphitwerke Kropfmuhl，German Federal Republic)和4%(重量)1，2-亞乙基二醇均勻分布于2%(重量)的羥乙基纖維素在0.05摩爾/升磷酸鈉緩沖液(PH7.0)中的溶脹混合物中(Natrosol 250G，Hercules BV，Rijswijk，Netherlands)。這些電極的面積是工作電極(5)4×6mm2＝24mm2，參比電極(6)1×1.5mm2＝1.5mm2，反電極(7)1×1.5mm2＝1.5mm2。
將網(wǎng)板印刷制造的敏感電極系統(tǒng)浸入測(cè)量溶液中，該溶液含0.05摩爾/升磷酸鈉緩沖液(PH7.0)、0.1摩爾/升氯化鈉和0-45毫摩爾/升葡萄糖，浸入的方式應(yīng)使電極表面被要檢測(cè)的液體所覆蓋。圖11所示的電流/時(shí)間曲線是對(duì)于集成的銀/氯化銀參比電極(6)在200mv電位下記錄的。在10秒鐘測(cè)量時(shí)間后，標(biāo)繪電流值得到圖12所示的校準(zhǔn)曲線，該曲線表明電流與葡萄糖濃度的關(guān)系。
實(shí)施例10制備2，2′-[(4-亞硝基芳基)亞氨基]雙-乙醇在一個(gè)帶攪拌器、溫度計(jì)和滴液漏斗的4升三頸燒瓶中，分批地將2摩爾N，N-雙-(β羥乙基苯胺)(或其芳基取代的類似物)添加到200ml水和400ml濃鹽酸的混合液中，同時(shí)強(qiáng)力地?cái)嚢琛Ｓ美洳蹖⑺萌芤豪鋮s到0℃，在0-2℃于20分鐘內(nèi)滴加148g(2.1摩爾)亞硝酸鈉在200ml水中的溶液，同時(shí)進(jìn)行攪拌。然后在0℃進(jìn)一步攪拌30分鐘，將大部分黃色到綠色的結(jié)晶亞硝基化合物吸出，用200ml冰冷卻的、半濃縮的鹽酸將濾餅洗滌二次。為了提純，將粗制品溶解到900ml水中，添加400ml濃鹽酸，同時(shí)用力攪拌，在室溫下攪拌30分鐘，然后在冰冷卻的同時(shí)再攪拌30分鐘。隨后將獲得的晶體溶解到580ml水中，添加265ml濃鹽酸，在室溫下攪拌30分鐘，再在冰上冷卻的同時(shí)攪拌30分鐘。吸出所形成的晶體，每次用150ml冰冷丙酮沖洗三次，再每次用200ml二乙醚沖洗二次，在室溫下于真空中干燥。用這種方法可獲得下列化合物a)2，2′-[(4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇-氫氯化物。
理論產(chǎn)率的32.8%，綠色晶體;熔點(diǎn)160℃(分解)。使用相應(yīng)的芳基取代的類似物可類似地獲得下列化合物b)2，2′-[(3-氟-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇-氫氯化物理論產(chǎn)率的26.5%，黃色晶體;閃點(diǎn)140℃(分解)。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶乙酸醇乙酯/甲醇＝5∶1，Rf＝0.59。
由3-氟-N，N-雙-[2-羥乙基)苯胺(Chem.Abstr.57，13922)制備。
c)2，2′-[(3-氯-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇-氫氯化物理論產(chǎn)率的21%，黃色晶體;熔點(diǎn)154℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.72。
由3-氯-N，N-雙-[2-羥乙基]苯胺(M.Freifelder，G.R.Stone，J.Org.Chem.26，1499(1961))制備。
d)2，2′-[(3-甲氧基-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇-氫氯化物。
理論產(chǎn)率的32%，赭色晶體;熔點(diǎn)145-146℃(分解)。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.4。
由3-甲氧基-N，N-雙[2-羥乙基]苯胺(M.Freifelder etal.J.Org.Chem 26，1499(1961))制備。
e)2，2′-[(3-甲基巰基-4-亞硝基苯基)亞氨基]雙-乙醇-氫氯化物理論產(chǎn)率的59.3%，紅褐色晶體;熔點(diǎn)148℃(分解)。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶乙酸乙酯/甲醇＝5∶1，Rf＝0.53。
由3-甲基巰基-N，N-雙-[2-羥乙基]苯胺制備(可由下述方法獲得將0.1摩爾3-甲基巰基苯胺溶解到50ml4N乙酸和0.35摩爾環(huán)氧乙烷中，在室溫下攪拌12小時(shí)。添加過量NaHCO3溶液，用二氯甲烷萃取，用柱色譜法在硅膠60(Merck)上提純-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.18，產(chǎn)率25%，無色油)。
f)2-[甲基(3-氯-4-亞硝基苯基)氨基]乙醇-氫氯化物理論產(chǎn)率的15%，黃色晶體;熔點(diǎn)147℃(分解)。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，Rf＝0.34。
由2-[甲基(3-氯苯基)氨基乙醇(可由下述方法獲得在10%NaOH存在下用甲基碘將2-[(3-氯苯基)氨基]乙醇沸煮3小時(shí);用柱色譜法在硅膠60(Merck)上提純-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.39，產(chǎn)率25%，無色油)制備。
實(shí)施例112-[(2-羥基乙氧基)-乙基-(4-亞硝基苯基)氨基]乙醇?xì)渎然?br> A)2-[(2-羥基乙氧基)乙基-(苯基)氨基]乙醇
將146g(0.8摩爾)2-(2-苯胺基乙氧基)乙醇(利用苯胺與2-(2-氯乙氧基)乙醇反應(yīng)獲得，產(chǎn)率54%，無色油，沸點(diǎn)131-133℃)溶解到500ml4N乙酸中，用冷槽冷卻到0℃，同時(shí)進(jìn)行攪拌，在0-10℃下于5分鐘內(nèi)滴加70.5g即約79ml(1.6摩爾)環(huán)氧乙烷。在室溫下將其靜置12小時(shí)后，添加500ml水，在攪拌的同時(shí)進(jìn)行中和，一小部分一小部分地小心地添加總量200g的NaHCO3，然后用500ml二氯甲烷萃取釋出的堿，每次用250ml二氯甲烷再搖動(dòng)三次，合并有機(jī)相，用硫酸鈉干燥，吸出并在真空中濃縮。獲得178.2g產(chǎn)物。
TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.18。
B)2-[2-羥基乙氧基)-乙基-(4-亞硝基苯基)氨基]乙醇?xì)渎然?
將280ml濃鹽酸和140ml水的混合液注入一個(gè)2升的帶攪拌器、滴液漏斗和溫度計(jì)的三頸燒瓶中，用干冰冷槽冷卻到-5℃，在恒溫下于10分鐘內(nèi)滴加178g(0.79摩爾)上述A)中獲得的物質(zhì)，再攪拌15分鐘。在0℃添加60g(0.87摩爾)亞硝酸鈉在120ml水中的溶液，由此，溶液變成血紅色到褐色，在0℃再攪拌30分鐘。隨后添加500ml水稀釋(反應(yīng)混合物PH值為1.4)，在最高15℃冰冷的同時(shí)滴加218ml濃氨水溶液直到PH9。用400ml正丁醇萃取釋出的亞硝基堿5次，在旋轉(zhuǎn)式汽化器中蒸出溶劑。獲得212.8g深綠色油。為了除去無機(jī)產(chǎn)物，將其與250ml的甲苯/丙酮＝1∶1的混合液混合，吸出不溶解的部分并用50ml甲苯/丙酮＝1∶1洗滌。剩下18.4g無機(jī)物質(zhì)殘余物。將濾液在硅膠60柱(直徑7.5cm，填充平面90cm，分離液體甲苯/丙酮＝1∶1)上用色譜法提純。獲得155g亞硝基堿(深綠色油)。將其溶解在600ml丙酮中，并同滴入的250ml飽和鹽酸醚液反應(yīng)。在冰冷卻的同時(shí)攪拌30分鐘，然后將所形成的晶體吸出，用100ml丙酮洗滌三次，在室溫下于真空中用五氧化二磷干燥。獲得159.9g(＝理論產(chǎn)率69.6%)的標(biāo)題化合物;熔點(diǎn)118℃，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝1∶1，Rf＝0.24。
實(shí)施例12用類似于實(shí)施例11的方法制備下列化合物a)1-[N，N-(2-羥乙基)-(4-亞硝基苯胺基)]-3-(2-羥基乙氧基)-2-丙醇?xì)渎然?
理論產(chǎn)率的10.5%，橙黃色晶體，熔點(diǎn)104℃(分解);TLC-硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/甲醇＝5∶1，Rf＝0.13由1-[N，N-(2-羥乙基)苯胺基)]-3-(2-羥基乙氧基)-2-丙醇
(它由1-[N-(苯胺基)]-3-(2-羥基乙氧基)-2-丙醇制備
它由苯胺和1-氯-3-(2-羥基乙氧基)-2-丙醇獲得-產(chǎn)率21.5%，無色油，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.6)在4N乙酸存在下與環(huán)氧乙烷反應(yīng)而制備。產(chǎn)率71%，無色油，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.43b)1-[N-(2-羥乙基)-(4-亞硝基苯胺基)]-3-甲氧基-2-丙醇?xì)渎然?
產(chǎn)率44.5%，淺黃色晶體，熔點(diǎn)122℃(分解)。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相二氯甲烷/甲醇＝49∶1，Rf＝0.55由(±)-3-(N-(2-羥乙基)苯胺基]-1-甲氧基-2-丙醇(Deutsches Reichspatent 603808(1933)-Friedlander 21，295)，(沸點(diǎn)11212-214℃)制備。
c)2-[(2-甲氧基乙氧基)乙基-(4-亞硝基苯基)氨基]乙醇
理論產(chǎn)率的25%，深褐色樹脂。TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，Rf＝0.49;二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.77(經(jīng)過非晶形收濕的氫氯化物和NH3);
由2-[(2-甲氧基乙氧基)乙基-(苯基)-氨基]乙醇(A)制備
它由苯胺和2-甲氧基乙氧基-氯乙烷獲得(加熱到90℃1小時(shí)，在硅膠60(Merck)上用甲苯/乙酸乙酯＝5∶1進(jìn)行柱色譜分離。這樣形成的N-(2-甲氧基乙氧基-乙基)苯胺(Rf＝0.69，無色油狀)
與環(huán)氧乙烷和4N乙酸一起結(jié)果產(chǎn)生(A)。無色油，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶1，Rf＝0.31，d)2-[2-(2-(2-(2-甲氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(亞硝基-苯基)氨基]乙醇
理論產(chǎn)率的63%，綠色油，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝1∶5，Rf＝0.64由2-[2-(2-(2-2甲氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(苯基)氨基]乙醇制備起始化合物按下述方法制備理論產(chǎn)率的20.5%的黃色油，Rf＝0.5
由苯胺和二乙基甘醇-雙-(2-氯乙基醚)(Perry.Hibbert Can.J.Res.14 81(1936)通過加熱到140℃4小時(shí)，隨后在硅膠60(Merck)上用甲苯/乙酸乙酯＝2∶1進(jìn)行柱色譜分離而獲得。
它同環(huán)氧乙烷在4N乙酸中反應(yīng)幾乎定量地得到
米黃色油，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，Rf＝0.61。
使用在甲醇中的NaOCH3(在回流下加熱24小時(shí)，蒸發(fā)，加水，溶解到乙酸乙酯中，隨后將粗制品在硅膠60(Merck)上用甲苯/丙酮＝5∶2進(jìn)行柱色譜提純)，獲得理論產(chǎn)率51.3%的產(chǎn)物，無色油，Rf＝0.21。
實(shí)施例13N-(4-亞硝基苯基)-N-[(2-二乙氨基)-乙基]-N，N′-二乙基-1，2-乙烷-二胺-三氫氯化物
熔點(diǎn)125℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶異丙醇/乙酸正丁酯/水/濃NH3水＝50∶30∶15∶5，Rf＝0.56。
由N-[二-(2-二乙氨基)乙基]苯胺制備。
實(shí)施例14制備1-N-取代的4-(4-亞硝基苯基)-哌嗪
a)1-甲基-4-(4-亞硝基苯基)-哌嗪-二氫氯化物
由0.3摩爾1-苯基哌嗪通過與0.2摩爾磷酸三甲酯一起加熱到150℃4小時(shí)、添加NaOH離析并且二乙醚萃取以及在硅膠60(Merck)上用二氯甲烷/甲醇＝5∶1進(jìn)行柱色譜提純(根據(jù)Stewart et al，J.Org.Chem.13，134(1948))，得到17.62g(0.1摩爾)1-甲基-4-苯基-哌嗪(40.1%的理論產(chǎn)率，沸點(diǎn)0.0582-84℃，Rf＝0.31)，無色液體。將其溶解到20ml濃鹽酸和10ml水的混合液中，然后在0-2℃下于15分鐘內(nèi)滴加8g(0.12摩爾)亞硝酸鈉在16ml水中的溶液，在10℃下攪拌30分鐘。在同一溫度下添加60ml濃氨水，同時(shí)進(jìn)一步冷卻，添加100ml水加以稀釋，每次用100ml二氯甲烷靠搖動(dòng)將紅褐色溶液(PH9)萃取三次，用Na2SO4干燥有機(jī)相，將其吸出并蒸發(fā)。將殘余物(20.6g苔蘚綠晶體)溶解到40ml甲醇中，同20ml飽和鹽酸醚液反應(yīng)，同時(shí)冷卻。在吸出及用20ml乙醚洗滌二次后，獲得15.8g(56.8%理論產(chǎn)率)的苔蘚綠標(biāo)題化合物晶體，熔點(diǎn)187-189℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.72。類似地制備下列化合物b)4-(4-亞硝基苯基)-1-哌嗪-乙醇-二氫氯化物
由2-(4-苯基-哌嗪基)-乙醇制備(Kremer，J.Amer.Chem.Soc 58，379(1963))，淺灰色晶體;從甲醇/水＝7∶1再結(jié)晶提純，熔點(diǎn)170-173℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.67。
c)3-[4-(4-亞硝基苯基)-1-哌嗪基]-1，2丙二醇-二氫氯化物
由1-苯基-4-(2，3-二羥基丙基)-哌嗪制備(H.Howell等人，J.Org.Chem.27，1711(1962))，呈綠色晶體，熔點(diǎn)163℃(分解)-TLC硅膠60(Merck)，流動(dòng)相∶乙酸乙酯/甲醇＝2∶1，Rf＝0.41
d)4-(4-亞硝基苯基)-α-(甲氧基甲基)-哌嗪-1-乙醇-二氫氯化物
由1-苯基-4-(2-羥基-3-甲氧基丙基)-哌嗪制備(H.Howell等人，J.Org.Chem.27，1711(1962))，呈黃色晶體，熔點(diǎn)162℃(分解)-TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，Rf＝0.51e)2-[2-(4-(4-亞硝基苯基)-1-哌嗪基)乙氧基]-乙醇-二氫氯化物
由2-[2-(4-(苯基)-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇制備(由2摩爾1-苯基哌嗪和1-[2-氯乙氧基]-2-甲氧基乙烷獲得(后者根據(jù)美國(guó)專利2，837，574))，呈綠色晶體，熔點(diǎn)134℃(分解)-TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶乙酸乙酯/甲醇＝5∶1，Rf＝0.31。
f)1-(1，4-二惡烷基某基)甲基-4-(4-亞硝基苯基)-哌嗪-二氫氯化物
由1-(1，4-二惡烷基某基)甲基-4-(苯基)-哌嗪制備(該化合物由1-氯-3-(β-羥基乙氧基)-2-丙醇(M.S.Kharash，W.Nudenberg，J.Org.Chem.8，189(1943))，同1-苯基哌嗪加熱到130℃5小時(shí)、用乙酸乙酯萃取并蒸發(fā)，在硅膠60(Merck)上一流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶2，用柱色譜提純來獲得)，黃綠色晶體，熔點(diǎn)166℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/甲醇＝5∶1，Rf＝0.69。
實(shí)施例15亞硝基雜環(huán)a)5-亞硝基-1-二氫吲哚乙醇?xì)渎然?
這一亞硝基化合物由1-二氫吲哚乙醇制備(該化合物按下述方法得到在1摩爾細(xì)粉K2CO3存在下在回流下將1摩爾二氫吲哚同1摩爾2-氯乙醇加熱，得到理論產(chǎn)率的63.8%的無色油，沸點(diǎn)0.1128-130℃，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶甲苯/丙酮＝5∶2，Rf＝0.42，添加氨同二氯甲烷后以堿的形式被分離出。以鹽酸醚液轉(zhuǎn)變成氫氯化物。獲得淺褐色晶體，熔點(diǎn)180℃，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝5∶1，Rf＝0.51b)1-甲基-6-亞硝基-1，2，3，4-四氫喹啉氫氯化物
制備標(biāo)題化合物，原料為1-甲基-1，2，3，4-四氫喹啉(靠加熱1，2，3，4-四氫喹啉和三甲基磷酸酯(根據(jù)Huisgen等人，Chem.Ber.92，203(1959)獲得)用類似例10和11的普通方式制備粗制品，在硅膠60(Merck)上用異丙醇/乙酸正丁酯/水＝5∶3∶2提純。添加鹽酸醚液后將其溶解在丙酮中，獲得標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)123-124℃(分解)，TLC硅膠60，流動(dòng)相∶異丙醇/乙酸正丁酯/水＝5∶3∶2，Rf＝0.7。
c)6-亞硝基-3，4-二氫-1(2H)-喹啉-乙醇?xì)渎然?
由2-(3，4二氫-2H-喹啉-1-基)乙醇(Zaheer等人，Indian J.chem.1，479(1963)，沸點(diǎn)5140-144℃)獲得標(biāo)題化合物。粗制品的提純靠柱色譜法在硅膠60(Merck)上，流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1。從異丙醇和鹽酸醚液沉淀出氫氯化物并從乙醇中再結(jié)晶獲得標(biāo)題化合物，10.5%的理論產(chǎn)率，赭色晶體，熔點(diǎn)193-195℃(分解)，TLC硅膠60(Merck)-流動(dòng)相∶二氯甲烷/甲醇＝19∶1，Rf＝0.36。
權(quán)利要求
1.在氧化還原酶和可還原物質(zhì)存在下電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法，所述的可還原物質(zhì)將測(cè)量反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電子從氧化還原酶處傳送到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)成為要測(cè)定的被分析物的量度的信號(hào)，由此，上述可還原物質(zhì)被酶催還原并在電極上被氧化，這里在電極上氧化形成的物質(zhì)與開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)不同。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)以及在電極上氧化形成的物質(zhì)被氧化還原酶還原。
3.權(quán)利要求1和2之一所述的方法，其中作為可還原物質(zhì)使用的化合物是這樣的化合物，它接受在測(cè)量反應(yīng)中產(chǎn)生的來自氧化還原酶的電子、形成一個(gè)富電子的芳香胺。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中作為可還原物質(zhì)使用的化合物是通式Ⅰ的化合物組中的化合物和通式Ⅱ的化合物X-R (Ⅰ)式中R表示富電子的芳族殘基，X表示NO或NHOH，HO-N＝Y(jié) (Ⅱ)式中，Y表示在還原形成的芳族狀態(tài)富電子的醌型系統(tǒng)。
5.權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中使用氧化酶、不依賴NAD(P)的脫氫酶或心肌黃酶作為氧化還原酶。
6.在相應(yīng)的酶作用物和可還原物質(zhì)存在下電化學(xué)測(cè)定氧化還原酶的方法，所述可還原物質(zhì)能將電子從氧化還原酶處傳遞到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)成為要測(cè)定的酶的量度的信號(hào)，由此，可還原物質(zhì)被酶催還原并在電極上被氧化，其中，在電極上氧化形成的物質(zhì)不同于一開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。
7.一種可以從氧化還原酶那里接受電子、形成富電子的芳香胺的物質(zhì)在電化學(xué)系統(tǒng)中作為氧化還原酶與電極之間的電子載體的應(yīng)用。
8.用于電化學(xué)測(cè)定液體樣品中的被分析物的敏感電極系統(tǒng)，至少含二種導(dǎo)電介質(zhì)，所述導(dǎo)電介質(zhì)彼此隔離，借助于導(dǎo)電的表面可使每一導(dǎo)電介質(zhì)同被檢測(cè)的樣品電接觸，其中至少一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶和可還原物質(zhì)，該可還原物質(zhì)可在氧化還原酶和導(dǎo)電表面之間傳送電子，其中，作為可還原物質(zhì)使用的化合物在被氧化還原酶還原后在導(dǎo)電表面上被氧化，氧化形成的物質(zhì)不同于一開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8所述的敏感電極系統(tǒng)，其中，最開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)以及在導(dǎo)電表面上氧化形成的化合物被氧化還原酶還原。
10.用于電化學(xué)測(cè)定液體樣品中的氧化還原酶的敏感電極系統(tǒng)，至少含二種導(dǎo)電介質(zhì)，所述導(dǎo)電介質(zhì)彼此隔離，借助于導(dǎo)電表面可使每一導(dǎo)電介質(zhì)同被檢測(cè)樣品電接觸，其中至少一個(gè)導(dǎo)電表面接觸氧化還原酶作用物和可還原物質(zhì)，所述的可還原物質(zhì)可以在氧化還原酶和導(dǎo)電表面之間傳遞電子，其中，作為可還原物質(zhì)使用的化合物被氧化還原酶還原后在導(dǎo)電表面上被氧化，氧化形成的物質(zhì)不同于最開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。
11.一種可以接受來自氧化還原酶的電子、形成富電子芳香胺的物質(zhì)用于制造權(quán)利要求8或10所述的敏感電極系統(tǒng)的應(yīng)用。
12.通式Ⅲ的亞硝基苯胺衍生物或它們的鹽
式中，R1表示氫、鹵素、烷氧基或烷硫基;R2代表烷基殘基;R3代表羥烷基殘基;或者R2和R3是相同或不同的，它們代表一個(gè)二烷基氨基烷基殘基、一個(gè)羥基烷氧基烷基或烷氧基烷基殘基(如果需要，在烷基部分被OH取代)、或者聚烷氧基烷基殘基(如果需要，在烷基部分被羥基殘基取代);或者R2和R3形成一個(gè)被硫或氮間斷的亞烷基殘基，氮被烷基、羥烷基、羥基烷氧基烷基、烷氧基羥烷基、二惡烷基某基-烷基或聚烷氧基烷基殘基取代，如果需要，它們每一種本身在烷基部分被羥基殘基取代;或者如果R1在NR2R3鄰位，R2同R1一起表示亞烷基殘基，那么R3代表羥烷基殘基;如果亞烷基殘基含3個(gè)碳原子，則根據(jù)需要，它也代表烷基殘基;如果R1不是氫，則R2和R3相同或不同，每個(gè)代表羥基烷基殘基。
13.權(quán)利要求12所述化合物的制備方法，其中，使通式Ⅳ的化合物同亞硝酸鹽反應(yīng)
式中，R1、R2和R3的含義同權(quán)利要求12。
全文摘要
本發(fā)明的主題是一種在氧化還原酶和可還原物質(zhì)存在的情況下電化學(xué)測(cè)定被分析物的方法，所述可還原物質(zhì)將測(cè)量反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電子從氧化還原酶處傳送到電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)作為要測(cè)定的被分析物的量度的信號(hào)，由此，可還原物質(zhì)被酶催還原，并在電極上被氧化，該方法的特征在于，在電極上被氧化形成的物質(zhì)不同于最開始時(shí)使用的可還原物質(zhì)。本發(fā)明還包括相應(yīng)的敏感電極系統(tǒng)和適當(dāng)?shù)幕衔锏膽?yīng)用。最后，新的亞硝基苯胺衍生物及其制備方法也是本發(fā)明的內(nèi)容。
文檔編號(hào)C07C211/52GK1054666SQ9110125
公開日1991年9月18日 申請(qǐng)日期1991年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月3日
發(fā)明者約阿希姆·霍恩斯, 于爾根·謝夫勒 申請(qǐng)人:曼海姆泊靈格股份公司