專利名稱：在酵母胞漿內(nèi)合成聚羥基烷酸酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚羥基烷酸酯的生物合成，并更具體地涉及用于生產(chǎn)聚羥基烷酸酯的改良微生物株。
背景技術(shù)：
美國的塑料制品在1986年超過了220億公斤，在1991年超過了270億公斤，在1997年達(dá)到了350億公斤。所生產(chǎn)的這些塑料的近1/3都被用于短期的一次性應(yīng)用例如包裝。因此，城市所產(chǎn)生的固體廢物通常包含7％(重量)的塑料或18％(體積)的塑料。
絕大多數(shù)這些合成的聚合材料是不容易被生物降解的，因?yàn)槲⑸锿ǔ２缓邢翘烊淮嬖诘慕Y(jié)構(gòu)所需的酶，這些結(jié)構(gòu)包括塑料中的絕大多數(shù)單體和具有左手或“L”構(gòu)型的手性單體。事實(shí)上，絕大多數(shù)聚合物都被設(shè)計(jì)為擁有最大的穩(wěn)定性。
這么大規(guī)模的塑料廢物的產(chǎn)生帶來了巨大的環(huán)境和處理問題。在許多城市特別是在美國，垃圾掩埋空間正變得越來越少，并且其容量正在迅速地耗竭。預(yù)計(jì)每年可能有100萬噸塑料殘骸被廢棄到全球海洋，它們每年殺死了成千上萬的海洋動物?？稍傺h(huán)塑料只在有限的范圍應(yīng)用，而且對各種類型塑料的處理和分類上的困難都妨礙了這些塑料的再循環(huán)。
這些問題刺激了短周期塑料的發(fā)展。生物合成的聚合物-聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)因其可降解性、生物相容性、良好的成塑料性和力學(xué)性能，引起了國際生物工程界的重視。已經(jīng)有在酵母中合成PHA的途徑的報(bào)道，其是在過氧化酶體內(nèi)合成PHA，但是其產(chǎn)量受到了過氧化酶體的數(shù)量與體積的限制；同時過氧化酶體系統(tǒng)的誘導(dǎo)十分困難，而且其活性極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在酵母中合成PHA的新途徑，即在胞漿中合成PHA，該途徑可以完全消除上述的限制；并且充分利用酵母生長快，胞漿中炭通量高的優(yōu)勢。本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)聚羥基烷酸酯的微生物以及用于生產(chǎn)PHA的改良方法。在一些實(shí)施方案中，微生物包括轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。例如，利用異源PHA聚合酶催化，以聚合一種或多種羥基烷酸的方式在酵母中合成的PHA。酵母細(xì)胞的實(shí)例包括酵母菌屬(Saccharomyces)(例如啤酒酵母(S.cerevisiae))、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或任何其他合適的屬的細(xì)胞。生物合成的PHA通常積累在酵母內(nèi)并易被分離。下面更詳細(xì)地描述了這些實(shí)施方案和其他一些所預(yù)期的實(shí)施方案的一些其他細(xì)節(jié)。
上面對一些實(shí)施方案的概述并非意欲描述本發(fā)明的所有實(shí)施方案。下面的附圖、具體實(shí)施方案和實(shí)施例更具體地舉例說明了這些實(shí)施方案。


結(jié)合以下本發(fā)明的各個實(shí)施方案的詳細(xì)描述和附圖可以更充分地理解本發(fā)明，其中圖1顯示了聚羥基烷酸酯(PHA)的常見結(jié)構(gòu)；圖2是描述了用于PHA聚合酶(phaCl)基因表達(dá)的載體；圖3是一種用于大腸桿菌(Escherichia coli)?；o酶A脫氫酶(fadE)基因表達(dá)的載體；圖4顯示了當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，對啤酒酵母BY4743生成的PHA的GC-MS(氣相色譜和質(zhì)譜連用)分析；圖5表示在啤酒酵母pex5突變體胞漿內(nèi)表達(dá)的PHA合成途徑；圖6顯示了當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，對啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析；圖7顯示了當(dāng)不同的脂肪酸被用作為碳源時，對啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析；圖8顯示了當(dāng)十三烷酸和十一烷酸被用作為碳源時，對含有p2TG1T-700的啤酒酵母pex5-3c11所生成的PHA的GC-MS分析；圖9表示當(dāng)十二烷酸被用作為碳源時，不同的pH值對含有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA產(chǎn)量和細(xì)胞干重(CDW)的影響；圖10是當(dāng)十二烷酸用作為碳源時對帶有p2TG1T-700的啤酒酵母pex5-3c11所生成的PHA的GC-MS分析；圖11顯示了質(zhì)粒pDP-307和p2DP307T的構(gòu)造；圖12描述了用于scl-PHA合酶(phbC)基因表達(dá)的載體。
具體實(shí)施例方式
應(yīng)當(dāng)參照附圖閱讀下面的描述，其中同樣的附圖標(biāo)號表示在一些視圖中所出現(xiàn)的同樣的構(gòu)件。具體實(shí)施方案和附圖都舉例說明了所申請的發(fā)明的具體的實(shí)施例。
聚羥基烷酸酯(PHA)是一大類由微生物天然合成的聚合物，通常作為碳源、能量和還原等效物的儲存物質(zhì)。因?yàn)槠渚哂袕V泛的潛在應(yīng)用價值、而且可以由可再生的能源合成、同時作為生物可降解的和具有生物相容性的塑料，這類生物化合物已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。PHA是一種有商業(yè)前途的聚合物，它能被完全生物降解為二氧化碳和水；它的性能與聚丙烯的性能相似，聚丙烯占美國1986年的聚合物產(chǎn)品的11％；另外，它與人體具有生物相容性，這使得它成為醫(yī)學(xué)植入物的材料之一。目前，主要的研究方向已經(jīng)集中于設(shè)計(jì)改良合成“更聰明的”PHA的途徑，使其具有更為所需的和更有價值的物理性能。
聚羥基烷酸酯(PHA)是與圖1中所示的常見結(jié)構(gòu)相符合的羥基烷酸的聚酯。每個單體都含有碳和羥基官能團(tuán)。除非R基是氫原子，鄰近碳原子都是手性中心。在下面的表中列出了一些PHA的R基和P值。n值通常約為100到30,000。更復(fù)雜的PHA可以含有烯烴、分支的、鹵化的、苯基、羥基、環(huán)己基、酯基或腈R基。在Steinbuchel，BiomaterialsNovelMaterials from Biological Sources，pp.123-213，p.128，Stockton PressNew York(1991)中可找到在微生物合成的PHA中所檢測到的組分的列表，在此將其全部內(nèi)容一同并入作為參考。
表1所選的細(xì)菌的聚羥基烷酸酯

*這些聚合物是短鏈長度單體的聚羥基烷酸酯生理學(xué)數(shù)據(jù)和酶研究已經(jīng)顯示有著兩種不同類型的PHA由短鏈長度碳單體(shortchain length carbon monomers)形成的聚合物(在此稱為scl-PHA)和由中等鏈長度碳單體(medium chain length carbon monomers)生成的聚合物(在此稱為mcl-PHA)?！岸替滈L度碳單體”是具有3個碳原子(C3單體)到約5個碳原子(C5單體)的碳單體。短鏈長度碳單體的實(shí)例包括3-羥基丁酸和3-羥基戊酸，它們相應(yīng)以葡萄糖和丙酸與葡萄糖的混合物作為聚合酶底物所生成。“中等鏈長度碳單體”是具有約6個碳原子(C6單體)到約14個碳原子(C14單體)的碳單體。中等鏈長度碳單體的實(shí)例包括具有約6個到約12個碳原子的直鏈3-羥基烷酸，它們是由相應(yīng)的烷酸單體作為聚合酶底物所形成的。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了總共有91種PHA單體。
PHA聚合酶是能催化各成分單體聚合以生成PHA的酶，它在科學(xué)文獻(xiàn)中也被稱為PHA合酶或PHA合成酶。術(shù)語“scl-PHA聚合酶”在此指的是能催化包括3到約5個碳原子的單體或前體聚合生成scl-PHA同聚物或共聚物的PHA聚合酶。PHB聚合酶是scl-PHA聚合酶的實(shí)例。能用scl-PHA聚合酶合成的生物聚合物包括例如聚(3-羥基丁酸酯)和聚(3-羥基丁酸-共-3-羥基戊酸酯)的PHA。
“mcl-PHA聚合酶”在此指的是能催化包括約6個到約14個碳原子的單體或前體聚合生成mcl-PHA同聚物或共聚物的PHA聚合酶。用mcl-PHA聚合酶所合成的生物聚合物包括聚(3-羥基辛酸酯)(PHO)、聚(3-羥基己酸酯)(PHH)和聚(3-羥基癸酸酯)。
PHA聚合酶可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的PHA聚合酶包括對天然存在的聚合酶進(jìn)行添加、刪除、修飾或突變，這些可能會造成酶多肽序列中的一個或多個氨基酸的變化，但酶的催化活性依然存在，例如通過遺傳學(xué)加工方法修飾天然存在的聚合酶。例如，本發(fā)明的聚合酶可以包括具有信號肽(導(dǎo)向序列)功能的N末端或C末端氨基酸序列，信號肽可以把酶導(dǎo)向細(xì)胞的不同部位。PHA聚合酶活性可以是雙功能或多功能酶或酶復(fù)合物的一部分，因此名詞PHA聚合酶包括這些具有PHA聚合酶活性的雙功能或多功能的酶。
本發(fā)明涉及參與聚羥基烷酸酯生物聚合物的合成途徑的異源基因在轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)?！爱愒础焙怂崞位蚧蚴呛蟹钦５卮嬖谟诩?xì)胞內(nèi)的核苷酸序列的核酸片段或基因，例如存在于真核細(xì)胞內(nèi)的原核核苷酸序列。異源基因在此也指的是轉(zhuǎn)基因?！稗D(zhuǎn)基因的”在此指的是其中已經(jīng)被引入含有異源核苷酸序列的核酸片段的生物體。轉(zhuǎn)基因生物體中的轉(zhuǎn)基因是非常穩(wěn)定的和可遺傳的。異源核酸片段可以被或可以不被整合到宿主基因組中。
術(shù)語“酵母”在此指的是任何能被遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化的酵母，包括但不限于酵母屬(例如啤酒酵母)、畢赤酵母屬和克魯維酵母屬等等。
可以以任何常用的方式例如在懸浮液或在固體基質(zhì)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因酵母。微生物培養(yǎng)物通常生長在富含營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長在有氧條件下。
本發(fā)明的酵母被核酸片段轉(zhuǎn)化，核酸片段可以只包括異源核苷酸序列，或者包括異源核苷酸序列以及與其連接的調(diào)節(jié)序列。核酸片段可以是環(huán)狀的或線狀的、單鏈或雙鏈的、也可以是DNA、RNA或它們的任何修飾物或組合物。包括異源核苷酸序列的載體常被用于轉(zhuǎn)化生物體。載體可以是質(zhì)粒(整合型或自主型)、病毒載體或粘端質(zhì)粒。對質(zhì)粒骨架的選擇依賴于所形成的構(gòu)建體的所需的各種特性，例如選擇標(biāo)記物、質(zhì)粒復(fù)制速度等等。
在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，被編碼PHA聚合酶的異源核苷酸序列轉(zhuǎn)化的酵母，可以任選地被用另一種或多種異源核苷酸序列轉(zhuǎn)化，其中至少一種異源核苷酸序列編碼PHA生物合成中所用的其他的功能性酶，例如?；o酶A氧化酶和/或反-2-烯酰基輔酶A水合酶II。被轉(zhuǎn)化的用于生產(chǎn)PHA的酵母還可以被轉(zhuǎn)化來表達(dá)或過度表達(dá)?；o酶A合成酶。不同基因組合都可以表達(dá)在酵母中。
發(fā)明中的酵母可以是野生型酵母和包括pex5、pex7、pex8、pex13、pex14、pex18、pex21和/或fox3突變體的酵母菌株。酵母還可被進(jìn)一步地修飾，例如基因敲除其他pex、fox和/或脂肪酸合成途徑的基因。
啤酒酵母pex5突變體是可存活的，但蓄積有過氧化物酶體狀、小葉樣膜結(jié)構(gòu)并且不能輸入具有SKL信號肽序列的蛋白，例如過氧化物酶體基質(zhì)酶Fox2p。?；o酶A氧化酶-Fox1p進(jìn)入過氧化物酶體的途徑也是依賴于受體蛋白Pex5p。在pex5突變體中，可在胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)Fox2p和Fox1p，但是Fox3p位于過氧化物酶體內(nèi)。進(jìn)入啤酒酵母內(nèi)的脂肪酸的活化受到至少四種不同的酰基輔酶A合成酶的催化調(diào)控。這些酶中的其中一種酶Faa2p是一種帶有類似SKL信號肽序列的過氧化物酶體蛋白，而其他的三種酶沒有過氧化物酶體導(dǎo)向信號肽。Faa2p可以在pex5突變體的胞漿內(nèi)保持活性。轉(zhuǎn)基因的pex5突變體能在胞漿內(nèi)合成PHA。
可以用一種或多種核酸片段轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如可用一個包括編碼PHA聚合酶的異源核酸的載體以及包括編碼酰基輔酶A氧化酶的異源核酸的第二個載體轉(zhuǎn)化酵母。同樣地，在用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的同一核酸片段中可存在兩種或多種異源核酸，例如當(dāng)使用雙向啟動子(divergent promoter)時。PHA聚合酶可以是scl-PHA聚合酶或mcl-PHA聚合酶。編碼mcl-PHA聚合酶的核酸序列可來源于食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)。編碼scl-PHA聚合酶的核酸序列可來源于羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha)。本領(lǐng)域人員很容易地能從蛋白和核酸的數(shù)據(jù)庫例如GENEBANK中得到這些和其他合適基因的核苷酸序列。
用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的酵母的核酸片段可包括連接于編碼酶的核苷酸序列的啟動子序列。啟動子是能造成遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄的DNA片段。轉(zhuǎn)錄是根據(jù)DNA所含的遺傳信息生成RNA鏈。發(fā)明不受使用任何特殊的啟動子的限制。啟動子的調(diào)節(jié)信號作用是與細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶結(jié)合啟動下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。如果啟動子的確能或可被用于控制或調(diào)節(jié)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，它通常會被連接于核苷酸序列。在本發(fā)明中所用的啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動子。它可以是但不必須是異源于宿主的。
雙向啟動子也可被用于引入和調(diào)節(jié)多個基因。這些啟動子容許利用單一的、中心定位的啟動子序列來同時調(diào)節(jié)兩個分離的基因。雙向啟動子的實(shí)例包括GAL1-10啟動子。半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1、GAL7和GAL10可用于高水平地表達(dá)同源和異源基因。用調(diào)節(jié)蛋白GAL4和GAL80可在基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)GAL1、GAL7和GAL10啟動子所啟動的半乳糖代謝途徑。
異源核苷酸序列可任選地包括啟動核酸轉(zhuǎn)譯生成酶的起始位點(diǎn)(例如ATG密碼子)。它也可任選地包括終止轉(zhuǎn)譯的終止序列。終止序列通常是不存在對應(yīng)的氨基乙酰tRNA并據(jù)此終止多肽合成的密碼子。異源核苷酸序列還可任選地包括轉(zhuǎn)錄終止序列。
用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的酵母細(xì)胞的核酸片段可任選地包括一種或多種標(biāo)記物序列，它通常編碼基因產(chǎn)物，通常是酶，它可被生長培養(yǎng)基中的化合物所檢測或抑制。例如，標(biāo)記物序列的導(dǎo)入可使得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對抗生素產(chǎn)生耐藥性，或它能賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞特異代謝某種化合物的能力。例如，可產(chǎn)生卡那霉素、氨芐西林或硫酸巴龍霉素耐藥性的標(biāo)記物序列、在下面的實(shí)施例中所描述的URA3選擇標(biāo)記物和HIS3選擇標(biāo)記物、或酵母的補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷性突變的各種其他的基因例如G418。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母可包括編碼PHA聚合酶的第一異源核苷酸序列以及任選地編碼?；o酶A氧化酶的第二異源核苷酸序列和編碼反-2-烯酰基輔酶A水合酶II還原酶的第三異源核苷酸序列的一種或兩種。引入多個基因的一個策略是將多個啟動子和基因克隆到單個質(zhì)粒中。用多個不同的質(zhì)粒也可引入多個基因。為了維護(hù)重組DNA，每個質(zhì)粒都需要不同的選擇標(biāo)記物?？捎谜闲突蜃灾餍洼d體將多個基因引入到宿主中。
在酵母中，可將異源核苷酸序列導(dǎo)向于過氧化物酶體中，過氧化物酶體是合成PHA前體的位點(diǎn)的之一。在一些過氧化物酶體蛋白的C末端已經(jīng)找到了過氧化物酶體導(dǎo)向序列(信號肽)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有“SKL基序”的過氧化物酶體信號肽是一種普遍存在于哺乳動物、昆蟲、植物和酵母中的過氧化物酶體導(dǎo)向序列(信號肽)。SKL基序包括第一位點(diǎn)上的絲氨酸、丙氨酸或半胱氨酸；第二位點(diǎn)上的組氨酸或精氨酸；以及第三位點(diǎn)上的亮氨酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個序列甚至對于折疊或多單位蛋白都是有效的。在美國專利No.6,103,956(Sriene等)中可發(fā)現(xiàn)對過氧化物酶體導(dǎo)向序列的詳細(xì)綜述，在此將其全部內(nèi)容一同并入作為參考。
在一些實(shí)施方案中，在編碼酶的異源核苷酸序列中包括將酶導(dǎo)向到酵母過氧化物酶體中的氨基酸序列或信號肽。
用各種技術(shù)可將上述的異源核苷酸序列引入到酵母中?？梢杂秒姶┛?，或利用表面活性劑和/或二價陽離子鹽例如CaCl2或LiCl2的化學(xué)方法完成轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明提供了用于控制所合成的PHA的組成以及性能的方法。例如，通過添加適當(dāng)?shù)牡孜?例如脂肪酸和甘油)可以控制聚合物中偶數(shù)、奇數(shù)或偶數(shù)和奇數(shù)數(shù)目的單體的組合。另外，通過與脂肪酸一起添加例如丙酮酸和乙酸的底物也可以影響單體的分布。所提出的策略具有合成新的聚合物的能力，并且使所合成的聚合物具有所需的物理性能。
本發(fā)明在胞漿或在過氧化物酶體中由脂肪酸代謝的中間產(chǎn)物合成PHA。酵母宿主、聚合酶的單體特異性、其中聚合酶為活化的細(xì)胞區(qū)域、培養(yǎng)基中所供應(yīng)的底物都影響著PHA的組成。發(fā)明提供了控制所合成的PHA的組成以及其的性能的方法。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的公開內(nèi)容在很多方面都只是舉例說明的。只要不超過本發(fā)明的范圍，就可進(jìn)行細(xì)節(jié)上的變化，特別是在形狀、大小和步驟排列上的變化。本發(fā)明的范圍當(dāng)然是由后附的權(quán)利要求書所表達(dá)的語言所定義的。
實(shí)施例參照以下的實(shí)施例可以進(jìn)一步地闡述本發(fā)明，實(shí)施例被用于舉例說明部分優(yōu)選的實(shí)施方案，但不以任何的方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1用于將PHA基因引入到酵母內(nèi)的載體構(gòu)建啤酒酵母表達(dá)體系通常利用整合型或自主型質(zhì)粒將重組DNA引入到宿主內(nèi)。整合型質(zhì)粒通常是通過同源重組事件整合到宿主染色體中的DNA序列。這個事件發(fā)生在質(zhì)粒的導(dǎo)向序列和同源的宿主染色體序列之間。用于靶向整合的同源序列可以是獨(dú)特的或非獨(dú)特的序列。獨(dú)特的導(dǎo)向序列容許整合單一拷貝的轉(zhuǎn)化DNA。已經(jīng)用這個方法引入重組DNA和通過中斷特定基因生成突變體。整合型質(zhì)粒也可以被靶向于非獨(dú)特的序列。這些質(zhì)粒具有多個潛在的整合位點(diǎn)以及單次轉(zhuǎn)化可造成多個拷貝被整合到染色體中。
除了整合型質(zhì)粒外，通常用自主復(fù)制的質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)重組DNA。這些能獨(dú)立于染色體復(fù)制的序列正常地是相當(dāng)小的、環(huán)型DNA，但是也已經(jīng)發(fā)展出線性質(zhì)粒。與整合型質(zhì)粒不同，自主型質(zhì)粒必須指導(dǎo)它們自身的復(fù)制以及它們自身的分離。這些功能對于保證親代和子代細(xì)胞在細(xì)胞分裂后都保留有質(zhì)粒是必需的。除了分開使用自主型質(zhì)粒和整合基因外，還可以組合兩種體系。
在酵母的質(zhì)粒表達(dá)體系中所用的DNA復(fù)制序列可被分為兩類那些依據(jù)酵母染色體DNA序列的復(fù)制序列和那些依據(jù)內(nèi)源性2-微米環(huán)圈的復(fù)制序列。
自主復(fù)制序列(ARS)是依據(jù)染色體的DNA片段。通過復(fù)雜的過程，這些序列啟動了DNA復(fù)制，并且這些序列已經(jīng)被用于在酵母中獲得高頻率的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)構(gòu)建了組合有ARS序列和著絲粒DNA序列(CEN)的質(zhì)粒。相信CEN序列作用為細(xì)胞分裂期間紡錘絲的附著點(diǎn)。
2μm復(fù)制起點(diǎn)是保存相當(dāng)穩(wěn)定的、高拷貝數(shù)目的質(zhì)粒的最常用的方式。該復(fù)制起點(diǎn)來源于內(nèi)源性啤酒酵母2μm環(huán)圈。在多種酵母株中都能找到這個天然的酵母質(zhì)粒。2μm環(huán)圈的不同部分已經(jīng)用于調(diào)節(jié)表達(dá)載體的復(fù)制和分離。常用的部分是2.2kb EcorI片段，它在啤酒酵母的[cir+]株中保持有每個細(xì)胞10到40個之間的質(zhì)粒拷貝。盡管基于2μm的質(zhì)粒沒有基于CEN的質(zhì)粒那么穩(wěn)定，但是高拷貝數(shù)使得這些質(zhì)粒在需要高表達(dá)水平時是有用的。
因?yàn)閮蓚€目的，DNA轉(zhuǎn)化體系常采用選擇標(biāo)記物。首先，選擇標(biāo)記物容許在轉(zhuǎn)化后分離重組生物體，其次，選擇標(biāo)記物幫助保證重組種群在培養(yǎng)期間保留有轉(zhuǎn)化DNA。常用的酵母選擇標(biāo)記物被設(shè)計(jì)為補(bǔ)償營養(yǎng)缺陷的宿主突變。常見的選擇標(biāo)記物包括補(bǔ)償在代謝物例如腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或尿嘧啶的合成中所涉及到的突變基因。盡管不很常見，一些酵母選擇標(biāo)記物傳遞了對廣譜抗生素例如G418的耐藥性。
啤酒酵母啟動子可以被歸類于兩種大分類之中的一種組成型或誘導(dǎo)型。組成型啟動子連續(xù)地指導(dǎo)基因表達(dá)，以及發(fā)現(xiàn)它通常被用于調(diào)節(jié)廣泛使用的基因例如那些來自糖酵解的基因。對于只在某些環(huán)境條件下需要的基因，它的表達(dá)通常受誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)節(jié)。例如，參與半乳糖代謝的啤酒酵母基因受已被很好研究的誘導(dǎo)型啟動子體系的調(diào)節(jié)。
對于在啤酒酵母中的有效的高水平表達(dá)，常需要mRNA終止序列。mRNA穩(wěn)定性被認(rèn)為是它的核苷酸序列的一個參數(shù)，所以保持mRNA分子盡可能的小以避免任何非必需的失穩(wěn)定的序列是有用的。
大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建如在Jackson，Recombinant Modulation of the phbCAB Operon Copy Numberin Ralstoniaeutropha and Modification of the Precursor Selectivity of the Pseudomonas oleovorans PolymeraseI.Masters Dissertation.University of Minnesota.St.Paul，Minn.，(1998)中所描述的那樣，構(gòu)建含有來自食油假單胞菌的phaCl基因和來自羅氏真養(yǎng)菌的phaB、phaA基因的載體質(zhì)粒pPT700(圖2)。
將過氧化物酶體導(dǎo)向序列(PTS)加入到pPT700中以形成另一個質(zhì)粒pPT755。質(zhì)粒pPT755的構(gòu)建如下通過PCR克隆pPT700得到phaCl基因。所用的引物是5’-ATTATCGATGAGTAACAAGAACAACGATGAG-3’和5’-GGAATTCATAGCTTGGAACGCTCGTGAACGTAGG-3’它們給基因增加了上游ClaI和下游EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。3’引物將三個氨基酸肽(SKL)添加到phaCl基因的3’末端。這個I型過氧化物酶體導(dǎo)向序列(-SKL-COOH，PTS1)被用于蘋果酸脫氫酶(MDH3)在啤酒酵母的過氧化物酶體內(nèi)的靶向表達(dá)。用ClaI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，并將其與經(jīng)同樣酶切的pPT700連接以生成pPT755。
啤酒酵母質(zhì)粒構(gòu)建體由含有2μm復(fù)制起點(diǎn)、HIS3標(biāo)記物、TEF1啟動子和URA3終止序列的質(zhì)粒p2TG1T(H)構(gòu)建出質(zhì)粒p2TG1T-700(H)(圖2)。利用ClaI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒pPT700(圖2)，從中分離得到食油假單胞菌的mcl-PHA聚合酶基因(phaCl)，并將其連接到經(jīng)相似消化的p2TG1T(H)中。利用ClaI和EcoRI酶切質(zhì)粒pPT755，從而得到含有PTS1過氧化物酶體導(dǎo)向序列的食油假單胞菌的mcl-PHA聚合酶基因(phaCl)，并將其連接到經(jīng)相似消化的p2TG1T(H)中以生成p2TG1T-755(H)。
實(shí)施例2在啤酒酵母中生產(chǎn)PHA的常用材料和方法除非有其他的說明，所有的化合物都購自Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)或FisherScientific(Fair Lawn，NJ)。
菌株質(zhì)粒被常規(guī)地生長于大腸桿菌菌株DH5α中(Life TechnologiesTM，Gaithersburg，MD)。大腸桿菌品種中心(Yale University，NewHaven，CT)提供了大腸桿菌β-氧化缺陷型菌株。
在下面的表2中列出了所用的啤酒酵母菌株。從Invitrogen(Carlsbad，CA)得到啤酒酵母BY4743、BY4741-YIL160C和BY4743-YDR244W(其為pex5雜合子菌株)。從BY4743-YDR244W孢子生成菌株wt-16-4和pex5-16-2，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(F.Sherman，MethodsEnzymol，350，3-41(2002))雜交兩種pex5單倍體菌株制成pex5-3c11。將帶有PHA聚合酶基因的啤酒酵母菌株保存于SD培養(yǎng)基(0.67％無氨基酸的酵母氮基、2％葡萄糖和氨基酸)中。
表2.啤酒酵母菌株的列表

aCarlson et al.，“Metabolic pathway analysis of a recombinant yeast for rational strain development，”Biotechnol Bioeng，79，121-134(2002).
bLeaf et al.，“Saccharomyces cerevisiae expressing bacterial polyhydroxybutyrate synthase produces poly-3-hydroxybutyrate，”Microbiology(Reading，England)，142(Pt 5)，1169-1180(1996).
細(xì)菌生長培養(yǎng)基大腸桿菌常規(guī)地生長于LB培養(yǎng)基(10g/L Bacto胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、5g/LBacto酵母浸液(Difco)、10g/L NaCl)或2xYT培養(yǎng)基(16g/L Bacto胰蛋白胨、10g/L Bacto酵母浸液、5g/L NaCl)中。當(dāng)用Zeo基因作為篩選標(biāo)記物時，將轉(zhuǎn)化大腸桿菌生長于加有Zeocin(25μg/ml)的低鹽LB培養(yǎng)基中。每升低鹽LB培養(yǎng)基含有10g胰蛋白胨、5g酵母浸液和5g NaCl，pH為7.5。加入脂肪酸有助于生成PHA。在恰當(dāng)時，加入氨芐西林或卡那霉素。正常地在30℃或37℃下孵育大腸桿菌培養(yǎng)物。
將野生型啤酒酵母培養(yǎng)物生長于YPAD培養(yǎng)基(10g/L Bactro酵母浸液、20g/L Bactro胰蛋白胨、20g/L葡萄糖、40mg/L硫酸腺嘌呤)中。加入腺嘌呤以抑制ade1和ade2突變體的回復(fù)。將轉(zhuǎn)基因酵母菌株生長于SD基本培養(yǎng)基(有或無氨基酸的6.7g/L Bactro酵母氮基、10-20g/L D-葡萄糖)中。進(jìn)行以下的添加以補(bǔ)償啤酒酵母BY4743的營養(yǎng)缺陷型突變20mg/L蛋氨酸、20mg/L亮氨酸和20mg/L組氨酸。為了避免因一些組分的熱穩(wěn)定性不好所產(chǎn)生的問題，過濾消毒(Supor-200濾盤、孔徑0.2μm，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)所有的培養(yǎng)基組分。對于搖瓶和生物反應(yīng)器試驗(yàn)，使用加濃的SD基本培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可比標(biāo)準(zhǔn)的SD培養(yǎng)基形成更高的生物量。對先前描述的培養(yǎng)基的修改包括100mg/L腺嘌呤、100mg/L蛋氨酸、150mg/L賴氨酸和80mg/L組氨酸。
PHA生產(chǎn)時，離心收集生長于葡萄糖培養(yǎng)基中的處于生長停滯期的菌體，在水中洗滌細(xì)胞一次并將細(xì)胞按1∶10稀釋重懸于含有0.67％無氨基酸酵母氮基、1％甘油、0.4％Tween80和適宜的脂肪酸的新鮮SOG1培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)pex5突變體時，在培養(yǎng)基中加入遺傳霉素(G418)。將酵母在SOG1培養(yǎng)基中再培養(yǎng)5-6天，然后收集分析PHA?；蛴?mM磷酸或5mM檸檬酸緩沖液將培養(yǎng)基的pH值控制在4.5到7.0。
搖瓶培養(yǎng)在搖瓶研究中，所有的試驗(yàn)條件都被重復(fù)三次。將培養(yǎng)物生長于含有50ml培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中。以200rpm和30℃下操縱搖床。所有報(bào)告的數(shù)據(jù)都是至少三次搖瓶培養(yǎng)結(jié)果的平均值。
PHA檢測方法用多種方法分析大腸桿菌和酵母細(xì)胞樣本中的PHA的存在和濃度。尼羅紅染色顆粒是檢測PHA的標(biāo)準(zhǔn)方法。氣相色譜法和氣象色譜-質(zhì)譜法提供了存在羥基烷酸衍生物的證據(jù)并將其定量化，但是它不能確定出該衍生物是否是聚合的。
尼羅紅染色尼羅紅是常被用于檢測細(xì)菌的PHA顆粒的染料。它染色脂類包括PHA，同時它也是膜可溶性的。離心細(xì)菌細(xì)胞樣本，拋棄上清液。將細(xì)胞稀釋于150μl ddH2O中，并加入7μl尼羅紅儲備液(50mg/ml丙酮溶液)。在混和后，將樣本在室溫下孵育5分鐘。在配有用于檢測488nm尼羅紅熒光的紫外燈的顯微鏡下觀察染色細(xì)胞。
氣相色譜法用丙醇裂解法制備用于氣相色譜(GC)分析的樣本。將來一定容積的濕細(xì)胞沉淀到螺旋口的玻璃試管中。用3到5ml丙酮洗滌，并干燥過夜。然后加入0.5mL 1，2-二氯乙烷(Fisher)、0.5mL含有20％HCl(Fisher)和80％1-丙醇(Fiesher)的酸化丙醇溶液、以及50μL 2mg/mL苯甲酸(Sigma)作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物。將試管封口并在沸水池中加熱2到3小時。在試管已經(jīng)被冷卻到室溫后，往每個試管中加入1mL無離子水以萃取PHA。將試管充分地混和，將所形成的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到用于GC分析的注射瓶中。
將樣本注射到配有Hewlett Packard 7673A自動注射器的Hewlett Packard 5890A氣相色譜儀中。采用了具有30m長和0.05μm薄膜厚度的融化二氧化硅毛細(xì)血管柱DB-WAX30W(J&W Scientific)，用火焰電離檢測器檢測所分離到的組分。所用的溫度值為60℃0.5分鐘，以每分鐘增加10℃的速度增加15分鐘并在210℃保持15分鐘。
通過計(jì)算被苯甲酸峰的區(qū)域所除的PHA峰的區(qū)域的商(Q)以及將Q值結(jié)果與一系列PHA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，確定出樣本瓶內(nèi)的PHA含量。
氣相色譜-質(zhì)譜法如在前述的小節(jié)中所描述的那樣，制備用于氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)的樣本。將樣本注射到配有DB-WAX柱的氣相色譜-質(zhì)譜儀中。GC-MS提供了類似于GC單獨(dú)所生成的氣相色譜頻譜。在上述的酸化丙醇裂解制品期間，PHA被分解為它的組成單體，它們每個都與丙醇形成酯。在質(zhì)譜測定法中，氣化并片段化所形成的分子，所造成的離子片段的模式形成了指紋，通過該指紋可以鑒定出分子。代表甲基缺失的質(zhì)譜131和代表丙基缺失的質(zhì)譜81被用作診斷峰(表3)。
表3.PHA片段質(zhì)譜

核磁共振波譜法質(zhì)子核磁共振波譜法(1H-NMR)被用于驗(yàn)證存在聚合物而不是只存在它的組成單體或另一種羥基烷酸衍生物。稱量并低壓凍干生長于搖瓶培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣本。通過用氯仿在Soxhlet萃取器(Kimex)中回流2天從細(xì)胞中提取出PHA。蒸發(fā)所形成的氯仿溶液并將殘留物重懸于2.5ml氯仿中并用甲醇稀釋到12.5ml以生成1∶5氯仿∶甲醇溶液。在形成沉淀24小時后，將溶液在4,000x g下離心15分鐘。在甲醇中輕輕洗滌所倒出的沉淀物，并將其重懸于0.75ml氘化氯仿(Sigma)中。然后將樣本轉(zhuǎn)移到氘化氯仿沖洗的NMR試管中，并用300MHzNicolet NT-300WB Ff-NMR分析樣本。
實(shí)施例3新的具有獨(dú)特性能的聚羥基烷酸的合成途徑我們通過在酵母中表達(dá)能聚合中等鏈長度(R)-3-羥基前體分子(mcl-PHA)的聚合酶導(dǎo)致了中等鏈長度mcl-PHA的形成。這些被加工的酵母被證實(shí)能在胞漿內(nèi)合成由6-13個碳原子的單體(C6-C13)所組成的PHA。通常mcl-PHA單體來自于過氧化物酶體中的β-氧化途徑生成的代謝物。因此，這個結(jié)果說明β-氧化途徑并不只是被限定于過氧化物酶體內(nèi)，它在酵母的胞漿內(nèi)也可表現(xiàn)出功能性。在過氧化酶體內(nèi)合成PHA的產(chǎn)量受到了過氧化酶體的數(shù)量與體積的限制；同時過氧化酶體系統(tǒng)的誘導(dǎo)十分困難，而且其活性極低。如果能在胞漿中合成PHA，則可以完全消除上述的限制。我們的這個發(fā)現(xiàn)可使PHA合成過程更為經(jīng)濟(jì)，并為合成具有獨(dú)特材料性能的聚合物提供了代謝加工策略。
材料和方法菌株和培養(yǎng)基在大腸桿菌DH5α中保存并繁殖所有的質(zhì)粒。從Invitrogen得到啤酒酵母株BY4743(Mata/αhis3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0)。在SD培養(yǎng)基(0.67％無氨基酸的酵母氮基、2％葡萄糖和氨基酸)中保存帶有PHA聚合酶質(zhì)粒的啤酒酵母。生產(chǎn)PHA時，離心收集生長于葡萄糖培養(yǎng)基中的處于生長停滯期的菌體，在水中洗滌細(xì)胞一次并將細(xì)胞按1∶10稀釋重懸于含有0.67％無氨基酸的酵母氮基、1％甘油、0.4％Tween 80和脂肪酸的新鮮SOG1培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在SOG1培養(yǎng)基中再生長5-6天，然后在收集分析PHA。用5mM檸檬酸緩沖液將培養(yǎng)基的pH值維持在5。
克隆過程在實(shí)施例1中描述了以及在圖2中描繪了質(zhì)粒p2TG1T-700(H)和p2TG1T-755(H)。
對PHA的分析用在實(shí)施例2中所描述的氣相色譜-質(zhì)譜法分析研究胞漿PHA。
結(jié)果食油假單胞菌PHA聚合酶在酵母胞漿內(nèi)的表達(dá)在這個實(shí)施例中，在啤酒酵母BY4743的胞漿內(nèi)表達(dá)食油假單胞菌PHA聚合酶。質(zhì)粒p2TG1T-700含有高拷貝數(shù)的酵母2μm復(fù)制起點(diǎn)和HIS3選擇標(biāo)記物。PHA聚合酶是處于組成型TEF1啟動子和URA3轉(zhuǎn)錄終止序列的控制下。p2TG1T-755(H)與p2TG1T-700(H)結(jié)構(gòu)基本一樣，除了其帶有的食油假單胞菌聚合酶被修飾成含有先前描述的I型過氧化物酶導(dǎo)向序列。
中等鏈長度(MCL)-PHA的生成按照在材料和方法中所描述方法的培養(yǎng)重組酵母，并將十二烷酸(C12)用作為碳源。Mcl-PHA聚合酶的胞漿表達(dá)造成了PHA的生成，PHA蓄積到總的細(xì)胞干重(CDW)的近0.014％。圖4顯示當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，對啤酒酵母BY4743所生成的PHA的分析。只顯示了具有質(zhì)荷比值為131的峰。圖4A顯示了對野生型啤酒酵母BY4743的GC-MS分析。圖4B顯示了對具有質(zhì)粒p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743的GC-MS分析。C12PHA(聚3-羥基十二烷酸)峰、C10(聚3-羥基癸酸)峰、C8(聚3-羥基辛酸)和C6(聚3-羥基己酸)峰都清晰可見。所有峰的質(zhì)荷比都與具有食油假單胞菌PHA聚合酶的大腸桿菌所生成的PHA進(jìn)行比較。導(dǎo)向過氧化物酶體的PHA聚合酶菌株(BY4743/p2TG1T-755(H))被用作為陽性對照。在相同的條件下，該菌株在過氧化物酶體中所蓄積的MCL-PHA最多到CDW的0.054％(圖4C和表4)。
表4當(dāng)偶數(shù)脂肪酸被用作為碳源時，啤酒酵母BY4743所生成的PHA含量和單體組成。

nd未檢測到酵母胞漿生成的MCL-PHA的組成為了確定碳源對PHA單體組成的影響，將重組酵母培養(yǎng)在含有以下一種脂肪酸的SOG1培養(yǎng)基中油酸、十三烷酸(C13)、十二烷酸(C12)和十一烷酸(C11)。表4和5顯示所蓄積的PHA的組成是依賴于外來添加的脂肪酸的性質(zhì)。當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，C12PHA是PHA的主要成分?？侾HA的約58％是由C12單體所組成的，但沒有檢測到C14PHA(表4)。在具有質(zhì)粒p2TG1T-755(H)的酵母BY4743中，由于油酸在過氧化物酶體內(nèi)被降解，因此導(dǎo)向過氧化物酶體的PHA聚合酶將顯著量的C10-C6單體整合到PHA內(nèi)。
同樣地，生長在十三烷酸(C13)和十一烷酸(C11)中的重組酵母含有范圍從C13到C7的奇數(shù)鏈單體，并且主要成分是C13和C11單體(表5)。當(dāng)酵母生長在油酸中時，在表達(dá)胞漿聚合酶的菌株中沒有檢測到PHA，但是具有靶向于過氧化物酶體的PHA聚合酶的菌株蓄積了近0.0385％細(xì)胞干重的PHA(表4)。
表5.當(dāng)不同的奇數(shù)鏈長的脂肪酸被用作為碳源時，帶有質(zhì)粒p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743所生產(chǎn)的PHA含量和聚酯的PHA單體組成。

nd未檢測到討論胞漿表達(dá)PHA聚合酶的酵母菌株不能由油酸(C18)生成PHA。但是在表達(dá)導(dǎo)向過氧化物酶體的PHA聚合酶的菌株中可由油酸生成PHA。這些結(jié)果說明β氧化中間物不能橫穿過氧化物酶體膜以及非靶向的mcl-PHA聚合酶不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體內(nèi)。
表達(dá)胞漿聚合酶的重組酵母積累的PHA單體具有不同于所添加的脂肪酸長度的碳骨架，根據(jù)這一觀察，我們提出β-氧化至少可以部分發(fā)生在啤酒酵母的胞漿中(圖5)。對這種現(xiàn)象的一個可能的解釋是β-氧化酶首先在胞漿內(nèi)合成，然后這些酶再轉(zhuǎn)譯修飾后被轉(zhuǎn)移到過氧化物酶體中。這就導(dǎo)致了這些β-氧化酶會在胞漿內(nèi)臨時保持活性，從而在胞漿完成脂肪酸的β-氧化。事實(shí)上，一些研究已經(jīng)顯示在酵母胞漿內(nèi)可發(fā)現(xiàn)15-25％的β-氧化酶活性。PHA前體的另一個可能的來源是來自脂肪酸生物合成。外來添加的脂肪酸和脂肪酸生物合成途徑都為胞漿中合成的mcl-PHA提供了炭源。
實(shí)施例4酵母pex5突變體內(nèi)的PHA的生產(chǎn)我們已經(jīng)顯示如果在啤酒酵母內(nèi)表達(dá)來自食油假單胞菌的mcl-PHA聚合酶就可在胞漿內(nèi)合成mel-PHA(實(shí)施例3)，并推論可以利用細(xì)胞漿內(nèi)存留的β-氧化酶合成mcl-PHA前體。
為了在啤酒酵母的胞漿內(nèi)利用β-氧化中間物合成mcl-PHA，關(guān)鍵的過氧化物酶體的蛋白包括Faa2p、Fox1p和Fox2p與PHA聚合酶在胞漿內(nèi)同時都必須是活化的(圖5)。過氧化物酶體基質(zhì)的酶是通過利用一種信號肽(導(dǎo)向序列)的方法從胞漿內(nèi)輸入到指定的細(xì)胞器內(nèi)。已經(jīng)鑒定出兩種不同的信號，相信它們足以將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體中。一種是存在于大多數(shù)過氧化物酶體基質(zhì)蛋白的C末端過氧化物酶體信號肽(PTS1)，另一種是定位于一些過氧化物酶體蛋白(例如Fox3p)的N末端30個氨基酸內(nèi)的過氧化物酶體信號肽(PTS2)。PTS1包括C末端三肽SKL或它的保守變異體(S/A/C)(K/R/H)(L/M)。Pex5p是PTS1的受體，而攜帶PTS2的蛋白的傳輸是依賴于受體Pex7p。
啤酒酵母pex5突變體是可存活的，但蓄積了過氧化物酶體狀、小葉樣膜結(jié)構(gòu)并且不能輸入具有SKL信號肽的過氧化物酶體基質(zhì)酶，例如Fox2p。?；o酶A氧化酶、Fox1p遵循著一條新的、非PTS1的輸入途徑，但也是依賴于受體Pex5p。在pex5突變體中，可在胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)Fox2p和Fox1p，但是Fox3p位于過氧化物酶體內(nèi)。
進(jìn)入啤酒酵母內(nèi)的脂肪酸的活化受到至少四種不同的?；o酶A合成酶催化調(diào)控。這些酶中的其中一種酶Faa2p是一種帶有PTS1導(dǎo)向序列的過氧化物酶體蛋白，而其他的三種酶沒有過氧化物酶體導(dǎo)向序列。Faa2p可以在pex5突變體的胞漿內(nèi)保持活性。
我們在pex5受體突變體的胞漿內(nèi)表達(dá)了食油假單胞菌mcl-PHA聚合酶，以測定啤酒酵母是否能在胞漿內(nèi)合成更高水平的mcl-PHA，。
菌株和培養(yǎng)基在大腸桿菌DH5α中保存并繁殖質(zhì)粒。在實(shí)施例2中描述了所用的所有的啤酒酵母和培養(yǎng)基。用磷酸(5mM)或檸檬酸(5mM)緩沖液將培養(yǎng)基的pH值控制在4.5到7.0。
克隆過程在實(shí)施例1(圖2)中描述了質(zhì)粒p2TG1T-700(H)和p2TG1T-755(H)。
對PHA的分析用在實(shí)施例2中所描述的氣相色譜-質(zhì)譜法分析研究胞漿PHA。
結(jié)果mcl-PHA聚合酶在野生型和pex5雜合子酵母菌株中的胞漿表達(dá)用PHA聚合酶質(zhì)粒p2TG1T-700(H)轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株BY4743、wt-16-4、BY4743-YDR244W、D603、YPH499和YPH500，將重組酵母培養(yǎng)在含有0.5g/L十二烷酸的培養(yǎng)基中。Mcl-PHA聚合酶的胞漿表達(dá)造成了PHA的合成。在啤酒酵母BY4743中，胞漿聚合物水平達(dá)到了總細(xì)胞干重(CDW)的近0.015％，而在BY4743-YDR244W中，聚合物水平達(dá)到了細(xì)胞干重的約0.026％，這比BY4743PHA菌株高出1.7倍。圖6顯示了當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，對啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析。圖6A顯示從啤酒酵母BY4743-YDR244W的樣本中所得到的GC-MS譜圖。圖6B顯示了從帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W的樣本中所得到的GC-MS譜圖。C12(聚3-羥基十二烷酸)峰、C10(聚3-羥基癸酸)峰、C8(聚3-羥基辛酸)和C6(聚3-羥基己酸)峰都清晰可見，說明這些單體都存在于PHA聚合物內(nèi)。所有峰的質(zhì)荷比都與具有食油假單胞菌PHA聚合酶的大腸桿菌所生成的PHA進(jìn)行了比較。在單倍體的野生型菌株wt-16-4中，所積累的PHA達(dá)到了細(xì)胞干重的約0.025％。
質(zhì)粒p2TG1T-755(H)表達(dá)了導(dǎo)向過氧化物酶體的mci-PHA聚合酶，帶有質(zhì)粒p2TG1T-755(H)的酵母菌株被用作陽性對照。用同樣的培養(yǎng)方法，PHA在BY4743-YDR244W、BY4743和wt-16-4的過氧化物酶體中相應(yīng)地積累PHA到細(xì)胞干重的0.042％、0.053％和0.054％(表6和圖6C。在野生型酵母菌株D603、YPH499和YPH500中都沒有檢測到胞漿mcl-PHA。
雜合pex5突變體所生成的胞漿mcl-PHA的組成為了確定碳源對PHA單體組成的影響，將重組酵母培養(yǎng)在含有以下一種脂肪酸的SOG1培養(yǎng)基中油酸(C18，1g/L)、十四烷酸(C14，0.5g/L)/十三烷酸(C13，0.5g/L)、十二烷酸(C12，0.5g/L)、十一烷酸(C11，0.3g/L)或癸酸(C10，0.3g/L)。在表7和8中總結(jié)了分析的結(jié)果。數(shù)據(jù)證實(shí)PHA單體組成是強(qiáng)烈地依賴于外來添加的脂肪酸(圖7)。當(dāng)C10脂肪酸被用作為碳源時，C10PHA占了總生物聚合物的約72％，而沒有檢測到C12PHA(表7)。
同樣地，生長在十三烷酸(C13)和十一烷酸(C11)中的重組酵母生成了含有范圍從C13到C7的奇數(shù)鏈單體的PHA，并且主要成分是C13和C11單體(表8)。
當(dāng)重組酵母細(xì)胞生長在含有十四烷酸(C14)的培養(yǎng)基中時，只檢測到微量的C10、C8和C6PHA。在生長在油酸的培養(yǎng)物中沒有檢測到PHA。
Pex5突變體菌株內(nèi)的胞漿mcl-PHA的合成用表達(dá)PTS1標(biāo)記的或非標(biāo)記的mcl-PHA聚合酶的質(zhì)粒(相應(yīng)地為p2TG1T-755(H)、p2TG1T-700(H))轉(zhuǎn)化啤酒酵母pex5-3c11(純合二倍體pex5突變體菌株)和pex5-16-2(單倍體pex5突變體菌株)。這些突變體菌株不能生長在外來脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基要添加甘油(1-3％，v/w)作為生長碳源。十二烷酸(0.4g/L)被用作PHA合成的碳源。培養(yǎng)基沒有使用緩沖液控制pH值。在培養(yǎng)5-6天后，收集細(xì)胞并分析PHA。
表達(dá)來自質(zhì)粒p2TG1T-700(H)的PHA聚合酶的啤酒酵母菌株pex5-3c11和pex5-16-2相應(yīng)地蓄積PHA達(dá)到它們的細(xì)胞干重的近0.053％和0.031％。與野生型酵母菌相似，pex5突變體中的PHA包括C12、C10、C8和C6單體，以及C12單體占有總生物聚合物的70-85％(表6)。具有p2TG1T-755(H)的pex5突變體顯示出相似的結(jié)果(表6)。
純合pex5突變體中所合成的胞漿mcl-PHA的組成為了研究碳源對pex5突變體的PHA單體組成的影響，將啤酒酵母株pex5-3c11培養(yǎng)在含有以下一種脂肪酸的SOG1培養(yǎng)基中油酸(C18，0.5g/L)、十三烷酸(C13，0.4g/L)、十二烷酸(C12，0.4g/L)、十一烷酸(C11，0.2g/L)或癸酸(C10，0.2g/L)。表5顯示PHA單體的組成是依賴于外來脂肪酸的性質(zhì)。當(dāng)重組酵母生長在C13、C12、C11和C10脂肪酸中時，所生成的PHA相應(yīng)地主要包括C13、C12、C11和C10單體(圖8)。這些單體占有總蓄積的PHA的約45-77％(表9)。有趣的是，當(dāng)十一烷酸被用作為碳源時，除了奇數(shù)鏈PHA外，還檢測到偶數(shù)鏈PHA單體包括C12、C10、C8和C6(圖8和表9)。這些偶數(shù)鏈前體起源于脂肪酸生物合成。當(dāng)pex5突變體生長在含有甘油和油酸或僅有甘油的培養(yǎng)基中時，培養(yǎng)物所蓄積的PHA由C8和C6單體組成。這也支持脂肪酸生物合成給酵母的PHA合成提供了前體的結(jié)論。
表6.當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時不同酵母菌株所合成的mcl-PHA含量和單體組成。

nd未被檢測到表7.當(dāng)不同的偶數(shù)數(shù)目的脂肪酸被添加作為碳源時帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生產(chǎn)的胞漿PHA含量和單體組成。

nd未被檢測到表8.當(dāng)不同的奇數(shù)數(shù)目的脂肪酸被添加作為碳源時帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生產(chǎn)的胞漿PHA含量和單體組成。

nd未被檢測到表9.當(dāng)不同的脂肪酸被添加作為碳源時帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母pex5-3c11所合成的胞漿PHA含量和單體組成。

空白未被檢測到；所有的培養(yǎng)基都含有1-3％甘油討論在這個實(shí)施例中，我們在野生型酵母和pex5突變體的胞漿內(nèi)表達(dá)了食油假單胞菌mcl-PHA聚合酶。Pex5突變體阻斷了具有PTS1的過氧化物酶體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器內(nèi)，因此形成了功能性的胞漿PHA途徑。通過Pex7p轉(zhuǎn)運(yùn)子，具有PTS2的Fox3p酶可被轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體內(nèi)(圖5)。在pex5突變體中表達(dá)非靶向的食油假單胞菌mcl-PHA聚合酶，這容許在胞漿內(nèi)合成mcl-PHA。如在表6中所示，pex5雜合子酵母菌株所生產(chǎn)的PHA是帶有p2TG1T-700(H)的野生型酵母BY4743所生產(chǎn)的1.7倍。這可能是因?yàn)閜ex5雜合子酵母菌株胞漿內(nèi)積累更高濃度的β-氧化酶。Pex5突變體所合成的胞漿PHA的水平與表達(dá)導(dǎo)向過氧化物酶體的聚合酶的野生型酵母所合成的水平相似。因?yàn)樵谝吧徒湍妇闐603、YPH499和YPH500中沒有檢測到PHA，相信這些菌株在它們的脂肪酸代謝上有突變。
表達(dá)胞漿PHA聚合酶的野生型和雜合的pex5酵母都沒有從油酸(C18)生成PHA。但是，在表達(dá)導(dǎo)向過氧化物酶體的聚合酶的菌株中觀察到從油酸合成PHA(實(shí)施例3)。這些結(jié)果說明β-氧化中間物不能橫穿過氧化物酶體膜以及非靶向的mcl-PHA聚合酶不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體內(nèi)。Pex5突變體從油酸所合成的PHA只含有C10、C8和C6單體。對于胞漿表達(dá)的聚合酶不能從油酸生成PHA的可能解釋是油酸是一種含有雙鍵的不飽和脂肪酸，它的降解通過不同于飽和脂肪酸的途徑。
實(shí)施例5pH對雜合pex5突變體生成mcl-PHA的作用為了最優(yōu)化帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W的培養(yǎng)條件，磷酸(5mM)和檸檬酸(5mM)緩沖液被用于控制培養(yǎng)基的pH值。培養(yǎng)基pH值從4.5到7.0不等(圖9)。不同pH值下，PHA含量均達(dá)到細(xì)胞干重的約0.025％，但是pH值高于6.0時的細(xì)胞干重顯著降低。當(dāng)考慮到細(xì)胞活性和PHA合成，最優(yōu)的pH值范圍是4.8到5.5。
實(shí)施例6fox3突變體菌株內(nèi)的胞漿mcl-PHA同聚物的合成用表達(dá)PTS1標(biāo)記的或非標(biāo)記的mcl-PHA聚合酶的質(zhì)粒(相應(yīng)地為p2TG1T-755(H)、p2TG1T-700(H))轉(zhuǎn)化啤酒酵母BY4741-YIL160C(單倍體fox3突變體菌株)。這個突變體菌株不能生長在外來脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基要添加甘油(1-3％，v/w)作為生長碳源。十二烷酸(0.4g/L)被用作為PHA合成的碳源。在培養(yǎng)5-6天后，收集細(xì)胞并分析PHA。
帶有p2TG1T-700(H)的單倍體fox3突變體酵母積累PHA到它細(xì)胞干重的約0.047％，同時聚合物只含有C12單體(同聚物)。當(dāng)mcl-PHA聚合酶被靶向于過氧化物酶體時，酵母蓄積PHA到細(xì)胞干重的近0.13％。PHA包括C12、C10和C8單體，C12占了最大部分(表10)。C10和C8單體是由脂肪酸生物合成途徑所合成提供的。
表10.當(dāng)十二烷酸(C12)被用作為碳源時，酵母fox3突變體菌株所合成的mcl-PHA含量和單體的組成。

nd未被檢測到實(shí)施例7控制酵母中所合成的PHA的單體組成此實(shí)例提供了能控制合成的PHA的單體組成的一些策略。當(dāng)將酵母pex5突變體菌株培養(yǎng)在含有C12脂肪酸的SOG1培養(yǎng)基中，外來添加的琥珀酸(5g/L)、蘋果酸(1g/L)、草酰乙酸(1g/L)、磷酸(0.5g/L)、絲氨酸(1g/L)、甘氨酸(1g/L)、牛血清白蛋白(BSA)(0.5g/L)和NaCl(5g/L)對PHA合成無明顯影響。丙酮酸(1g/L)、乙酸(0.5g/L)和甲酸(0.5g/L)被測試作為碳源，并嘗試用其減少細(xì)胞內(nèi)輔酶A的濃度，輔酶A是mcl-PHA聚合酶的強(qiáng)抑制物。丙酮酸(圖10A)、乙酸或甲酸(圖10B)作為碳源生成了更高的終生物量濃度。另外，在這些底物中生長的pex5突變體蓄積了具有C14單體的PHA(表11)。這些C14PHA前體是通過脂肪酸生物合成途徑所合成的并被胞漿內(nèi)的沒有被轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體內(nèi)的β-氧化酶所降解。同型絲氨酸代謝也涉及輔酶A。將同型絲氨酸加入到培養(yǎng)基中可減少游離輔酶A水平，使得終生物量濃度提高，但是它對PHA合成沒有顯著作用。
當(dāng)將pex5突變體生長在只含有甘油的培養(yǎng)基中時，在所合成的PHA中檢測到了C8和C6單體(表11)。另外，如果將十一烷酸(C11)用作為碳源，pex5突變體生成了含有一些偶數(shù)鏈PHA單體的PHA(實(shí)施例4)。這些偶數(shù)鏈長的單體也是經(jīng)由脂肪酸生物合成途徑所合成，然后被胞漿內(nèi)的β-氧化酶所降解。所以外來脂肪酸和天然脂肪酸生物合成途徑都為所合成的PHA提供了炭源。
表11.當(dāng)不同的脂肪酸被添加作為碳源時帶有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母所合成的胞漿PHA產(chǎn)量和單體組成。

空白未被檢測到；所有培養(yǎng)基都含有1-3％甘油實(shí)例中在胞漿內(nèi)或在過氧化物酶體中從脂肪酸代謝的中間物合成mcl-PHA。PHA的組成受酵母宿主的遺傳背景、聚合酶的單體特異性、其中聚合酶為活化的細(xì)胞區(qū)域和培養(yǎng)基中所提供的底物的強(qiáng)烈影響。本發(fā)明提供了控制所合成的PHA的組成以及其性能的基礎(chǔ)。例如，用表達(dá)胞漿mcl-PHA聚合酶的fox3突變體(BY4741-YIL160C)可合成同聚物。通過添加例如脂肪酸和甘油的適宜底物可控制聚合物中偶數(shù)、奇數(shù)或偶數(shù)和奇數(shù)數(shù)目單體的組合。另外，通過和脂肪酸一起添加例如丙酮酸和乙酸的底物也可影響單體的分布。所提出的策略具有合成新的聚合物的能力，并且使所合成的聚合物具有所需的物理性能。
實(shí)施例8用于將多個mcl-PHA基因引入到酵母內(nèi)的策略代謝途徑加工常需要引入多個重組基因。和原核細(xì)胞不一樣，絕大多數(shù)真核細(xì)胞常不表達(dá)多順反子信息。每個基因需要它自己的啟動子和它自己的終止序列。這使得引入多個基因更為困難。
有兩類可以用于引入并調(diào)節(jié)啤酒酵母中重組的、多基因PHA途徑的表達(dá)體系。一個選擇是GAL1-10雙向啟動子，它容許從單個中心定位的序列調(diào)節(jié)兩個的分離基因。單個序列有助于減少質(zhì)粒大小以及不引入同一啟動子之間的重組的可能性。第二個選擇是含有多個啟動子和多個基因的質(zhì)粒。
載體構(gòu)建用PCR克隆從大腸桿菌K12MG1655的基因組中擴(kuò)增得到來自大腸桿菌的編碼酰基輔酶A脫氫酶的fadE基因。所用的引物是5’-GGAATTCATGATGATTTTGAGTATTCTCGCTACGGT-3’和
5’-GGAATTCACGCGGCTTCAACTTTCCGCACTTTCTCCGGC-3’它們形成一個上游EcoRI和一個下游EcoRI的限制性位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物連接到pCR-Blunt載體(Invitrogen)并形成了質(zhì)粒pBZ101和pBZ102。
通過PCR克隆修飾fox2基因去除過氧化物酶體導(dǎo)向序列。所用的引物是5’-AACTCGAGATGCCTGGAAATTTA TCCTTCAAAG-3’和5’-ATCCCGGGTTATTTTGCCTGCGATAGTTTTAC-3’它們形成了上游XhoI和下游SmaI限制性位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物連接到pCR-Blunt載體(Invitrogen)上，形成質(zhì)粒pBZ106。
質(zhì)粒pDP306和p2DP306T在ClaI位點(diǎn)存在Dam甲基化問題。首先，設(shè)計(jì)了新的序列以消除與ClaI位點(diǎn)相關(guān)的Dam甲基化問題。質(zhì)粒pDP306被用作為構(gòu)建具有新的ClaI位點(diǎn)的GAL1-10雙向啟動子的模板。PCR上游引物5’-TTTGAATTCGGTATCGATTTTTTATTGAATT-3’含有ClaI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)。下游引物5’-CCGGTACAATTCGGGTCGACGTTAACTCTCCTT-3’含有SalI位點(diǎn)和HpaI位點(diǎn)。用SalI和EcoRI消化PCR產(chǎn)物并將其連接到經(jīng)相似消化的質(zhì)粒pDP306和p2RS306T上。所形成的質(zhì)粒被相應(yīng)地稱為pDP307和p2DP307T(圖11)。
通過用EcoRI消化將fadE基因亞克隆到質(zhì)粒p2DP307T中生成質(zhì)粒p2DP-fadE(U)。用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)去除經(jīng)消化的p2DP307T的5’磷酸以阻止克隆期間的自我連接。圖3顯示了質(zhì)粒p2DP-fadE(U)，它攜帶有2μm復(fù)制起點(diǎn)、新的GAL1-10雙向啟動子、URA3終止序列和大腸桿菌?；o酶A脫氫酶基因。
轉(zhuǎn)化和搖瓶培養(yǎng)用醋酸鋰方法(R.Soni et al.，Curr Genet1.24，455-459(1993))將質(zhì)粒p2DP-fadE(U)和p2TEF1-700(H)共引入到啤酒酵母pex5-3c11的胞漿內(nèi)。在含有無尿嘧啶和組氨酸的SD培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化株。在搖瓶試驗(yàn)，使用了SOG1培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有100μg/ml遺傳霉素、100mg/L亮氨酸、0.67％無氨基酸的酵母氮基、1％甘油、0.1％酵母浸液、0.4％Tween 80和0.24g/L適宜的脂肪酸。生產(chǎn)PHA時，離心收集生長于葡萄糖培養(yǎng)基中處于生長停滯期的菌體，在水中洗滌細(xì)胞一次并將細(xì)胞按1∶10稀釋重懸于新鮮SOG1培養(yǎng)基中。為了誘導(dǎo)GAL1-10啟動子，在培養(yǎng)物中加入半乳糖使得其終濃度為0.4％。將培養(yǎng)物在SOG1培養(yǎng)基中再生長5-6天，然后在收集分析PHA。
將帶有p2DP-fadE(U)和p2TEF1-700(H)的啤酒酵母菌株pex5-3c11生長于含有0.24g/L十二烷酸作為碳源的培養(yǎng)基中。Mcl-PHA聚合酶和酰基輔酶A脫氫酶的胞漿表達(dá)造成PHA的生成達(dá)到細(xì)胞干重的0.1％-0.3％。
組成型表達(dá)體系組成型表達(dá)體系是含有多個組成型啟動子和多個基因的質(zhì)粒。所構(gòu)建的質(zhì)粒含有表達(dá)所有PHA合成基因的組成型GAP啟動子。從Invitrogen得到畢赤酵母載體pGAPZ B。載體pGAPZ B含有以下構(gòu)件GAP啟動子、具有單一限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)、C末端myc抗原決定簇、C末端多組氨酸標(biāo)記、AOX1轉(zhuǎn)錄終止(TT)區(qū)、TEF1啟動子、EM7(合成的原核啟動子)、Sh ble基因(Streptoalloteichus hindustanus ble基因)、CYC1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和pUC起點(diǎn)。GAP啟動子允許在酵母和畢赤酵母中的高水平的表達(dá)。具有單一限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)允許所需的基因插入到表達(dá)載體中。
為了構(gòu)建多基因表達(dá)載體，必須使用載體pGAPZ B的BamHI和BglII表達(dá)框。BamHI和BglII是兩種不同的限制性內(nèi)切酶，兩者都識別中間四個堿基對應(yīng)為5′-GATC-3′的6個堿基對的DNA靶點(diǎn)。如果將BamHI和BglII所切得的末端連接在一起，那么BamHI和BglII位點(diǎn)都變?yōu)槭Щ睢榱藰?gòu)建含有多基因表達(dá)框的載體，每個基因都必須被插入到pGAPZ-B的多克隆位點(diǎn)中。它遵循著我們能利用BamHI和BglII表達(dá)框的性能將整個表達(dá)框依次地插入到單個質(zhì)粒中。
與mcl-PHA生物合成相關(guān)的頭三種脂肪酸β-氧化酶在其基因中部都具有BamHI限制性位點(diǎn)。Faa2基因有兩個BamHI位點(diǎn)；fadE基因有一個BamHI位點(diǎn)；fox2基因有一個BamHI位點(diǎn)。因此，在將基因克隆進(jìn)pGAPZ-B之前，必須去除所有的BamHI位點(diǎn)。本實(shí)施例使用了定位誘變技術(shù)。
在本實(shí)施例中所用的定向誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)容許在任何的雙鏈質(zhì)粒上進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變，因此消除了亞克隆和ssDNA解救的需要。另外，定向誘變不要求特異的載體、獨(dú)特的限制性位點(diǎn)、多轉(zhuǎn)化或體外甲基化處理的步驟。
用于突變fadE基因的引物是5’-CCGGCGTGAGCGGAATCCTGGCGATTA-3’和5’-TAATCGCCAGGATTCCGCTCACGCCGG-3’它用GGA取代了原始密碼子GGG以去除BamHI位點(diǎn)。用于突變fox2基因的引物為5’-AAGGTAGTTGTAAATGACATCAAGGACCCTTTTTCAGTTGTTGAAG AAATA-3’和5’-TATTTCTTCAACAACTGAAAAAGGGTCCTTGATGTCATTTACAACT ACCTT-3’它用GGA取代了原始密碼子GAT以去除BamHI位點(diǎn)。所有的引物都是5’磷酸化的，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。
為了構(gòu)建含有多個PHA基因表達(dá)框的載體，必須將faaa2、fadE和fox2基因插入到pGAPZ-B的多克隆位點(diǎn)中。利用BamHI和BglII表達(dá)框的特性將整個表達(dá)框依次插入到單個質(zhì)粒中。將酵母的2μm復(fù)制起點(diǎn)插入到該質(zhì)粒中，以形成單個的含有多個PHA合成基因的酵母質(zhì)粒。使用組成型表達(dá)體系表達(dá)全部PHA合成酶，可以進(jìn)一步提高mcl-PHA在酵母胞漿中的產(chǎn)量。
實(shí)施例9重組酵母中的scl-PHA的生產(chǎn)克隆過程用ClaI和EcoRI從質(zhì)粒pPT 500(Jackson，Recombinant Modulation of the phbCAB OperonCopy Number in Ralstonia eutropha and Modification of the Precursor Selectivity of thePseudomonas oleovorans Polymerase I.Masters Dissertation.University of Minnesota.St.Paul，Minn.，(1998))分離得到羅氏真養(yǎng)菌scl-PHA合酶基因，并將其連接到經(jīng)相似消化的p2TG1T(H)中。所生成的質(zhì)粒被命名為p2TG1T-500(H)并被描述于圖12中。質(zhì)粒p2TG1T-500(H)含有TEF1啟動子、2μm起點(diǎn)、HIS3標(biāo)記物和URA3終止序列并表達(dá)羅氏真養(yǎng)菌scl-PHA合酶。含有過氧化物酶體導(dǎo)向序列的羅氏真養(yǎng)菌scl-PHA合酶可使用PCR克隆從p2TG1T-500(H)得到。所用的引物為5’-ATTATCGATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGC-3’和5’-GGAATTCACAATCTAGCCACAGCTCTTGCCTTGGCTTTGACGTAT-3’在J.J.Hahn et al.，Biotechnol Prog，15，1053-1057(1999)中顯示，將6個氨基酸的肽(ARVARL)添加到phbC基因的3’末端修飾，將scl-PHA合酶靶向到玉米的過氧化物酶體中。這里使用了同樣的信號肽序列。用ClaI和EcoRI消化PCR產(chǎn)物，并將其連接到經(jīng)相似消化的p2TG1T(H)中以生成如圖12所描述的p2TG1T-566(H)。質(zhì)粒p2TG1T-566(H)含有具有過氧化物酶體導(dǎo)向序列(PTS)的羅氏真養(yǎng)菌scl-PHA合酶。用醋酸鋰方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到啤酒酵母菌株中。
羅氏真養(yǎng)菌scl-PHA合酶在胞漿和過氧化物酶體內(nèi)的表達(dá)用非靶向的或靶向的PHA合酶質(zhì)粒(相應(yīng)地為p2TG1T-500(H)或p2TG1T-566(H))轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株BY4743。將重組酵母培養(yǎng)在含有油酸(1g/L)作為碳源的培養(yǎng)基中。Scl-PHA合酶的胞漿表達(dá)造成了PHA的合成，PHA蓄積到細(xì)胞干重的0.02％。在表達(dá)導(dǎo)向過氧化物酶體酶的菌株中，PHA含量為細(xì)胞干重的近0.8％。
為測試不同的碳源對過氧化物酶體產(chǎn)生的scl-PHA的單體組成的影響。將重組酵母生長在含有以下一種脂肪酸的SOG1培養(yǎng)基中十二烷酸(C12，0.5g/L)、十三烷酸(C13，0.5g/L)、0.25g/L十二烷酸和0.25g/L十三烷酸的混和物。在表12中總結(jié)了結(jié)果。當(dāng)用偶數(shù)鏈脂肪酸喂養(yǎng)表達(dá)導(dǎo)向過氧化物酶體酶的菌株時，所蓄積的PHA是由近97-99％C4單體組成的，剩余的是C8、C6和C5單體。相似地，添加奇數(shù)數(shù)目的C13脂肪酸生成由近6％C4和94％C5單體組成的PHA聚合物。當(dāng)用C12和C13脂肪酸的混和物喂養(yǎng)酵母時，聚合物水平達(dá)到了細(xì)胞干重的近7％。在過氧化物酶體所合成的PHA是由84％C4和16％C5單體組成，剩余的是C6和C8單體。
表12.當(dāng)不同的脂肪酸被添加作為碳源時，帶有p2TG1T-566(H)的啤酒酵母BY4743所合成的過氧化物酶體PHA含量和單體組成。

nd未被檢測到本實(shí)例的產(chǎn)率大約是現(xiàn)有報(bào)道的100倍(V.C.De Oliveira et al.，Appl Environ Microbiol705685-5687，(2004))。我們的實(shí)施方案在宿主菌株、表達(dá)體系以及培養(yǎng)方法上都有很大的提高。
實(shí)施例10制備用于生產(chǎn)PHA的酵母宿主酵母菌株用雜合pex5二倍體酵母菌株的啤酒酵母菌株BY4743-YDR244W(Mata/αhis3Δ1 leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4)制備用于生產(chǎn)PHA的合適的宿主。
培養(yǎng)基使用KAC培養(yǎng)基(乙酸鉀1％，酵母浸液0.1％)、KAC 100K培養(yǎng)基(蛋白胨2％、酵母浸液1％、KCl 0.75％)和YPD 100K培養(yǎng)基(葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母浸液1％、KCl0.75％)。
孢子形成在適宜的環(huán)境條件下，二倍體酵母細(xì)胞將進(jìn)行減數(shù)分裂，再一次將它們的染色體分裂為單倍體組，并將其包裝成四個、更小的、分離的單倍體細(xì)胞，可在顯微鏡下清楚地看到這些細(xì)胞并進(jìn)行微處理。單輪減數(shù)分裂所形成的四個單倍體細(xì)胞的微小集落(稱為“孢子”)都一起存在一個稱為子囊的結(jié)構(gòu)中。這使得操作者能將它們識別為同胞孢子的四分體。在用合適的酶將子囊壁消化后，用非常細(xì)的玻璃針可以將每個孢子挑離分開。然后每四個單倍體細(xì)胞可生長為同一細(xì)胞的獨(dú)立克隆，它可被用于研究它們所攜帶的基因。
將啤酒酵母二倍體菌株BY4743-YDR244W放置于KAC培養(yǎng)盤中，它有著低濃度的氮。這引起二倍體孢子化，或通過減數(shù)分裂形成單倍體孢子的四分體。當(dāng)嘗試將酵母菌株孢子化時，將二倍體從YPD 100K轉(zhuǎn)移到KAC。為了最好的結(jié)果，要非常細(xì)地劃抹酵母。將培養(yǎng)盤在臺面上放置3天，然后將它轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中24個小時。24個小時后，將其放回到臺面上，并將其用于分割。
消化和分割需要分割和分析所形成的單倍體孢子的四分體。分割過程的第一步時消化圍繞于四分體的子囊。將50μl按1∶10稀釋的儲備裂解酶放置于微試管中。第二步，用無菌牙簽從KAC培養(yǎng)盤中得到孢子化的酵母。第三步，將牙簽放置于試管中的50μl裂解酶中，并渦旋牙簽約30秒。最后，容許酶再消化30秒，然后加入1ml無菌水滅活酶。得到一個YPD 100K分割盤，用黑色標(biāo)記筆和尺子畫好線，通過將接種環(huán)穿過本生燈的火焰來消毒接種環(huán)。將接種環(huán)浸泡于經(jīng)消化酵母的溶液中并將其沿黑線劃抹在分割盤上。重復(fù)這個步驟四次。翻轉(zhuǎn)盤并將其放置在右邊所示的微操作器的平臺的環(huán)中。調(diào)整這個平臺的位置使得針頭位于盤的遠(yuǎn)離任何細(xì)胞的大片開闊區(qū)域。用最低倍鏡找到針頭。其次，在顯微鏡下尋找并四周移動操縱桿，直到看到針頭。瓊脂被一層非常薄的水膜所覆蓋，當(dāng)針頭觸及該膜時，在針頭周圍可看到暗色的環(huán)。一旦找到針頭，用操縱桿抬高針頭，重新定位平臺并開始尋找四分體。尋找四個孢子的組并用微操作器針頭將其拾起。移動平臺使得孢子被放置于盤的大片的空白部分。一個盤上可放十二個四分體。
進(jìn)行雜交為了進(jìn)行雜交，將少量的兩種你欲雜交的相反雜交型的單倍體菌株放置在YPD盤中，相隔近1cm。下一步，在它們之間放置約20μl水。下一步，取無菌牙簽并混和兩個單倍體菌株，然后在水中將它們旋渦攪拌。將盤放置在塑料袋中，將其放在30℃的培養(yǎng)箱中，在4小時后收集所形成的二倍體。
在表13中列出了可用于PHA合成途徑表達(dá)的酵母宿主。例如，在實(shí)施例4中采用了酵母pex5-3c11。
表13.來自孢子形成的酵母菌株的列表。

1pex5-3c11通過雜交pex5-3-4和pex5-11-2得到。
2pex5-10c11通過雜交pex5-10-3和pex5-11-2得到。
權(quán)利要求
1.一種導(dǎo)入了聚羥基烷酸酯聚合酶的酵母菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母菌株，其為野生型。
3.權(quán)利要求1的酵母菌株，其包括pex5、pex7、pex8、pex13、pex14、pex18、pex21和/或fox3突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母菌株，其中聚羥基烷酸酯聚合酶存在于胞漿中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母菌株，其中聚羥基烷酸酯聚合酶被表達(dá)在過氧化物酶體內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的酵母菌株，其中聚羥基烷酸酯聚合酶是中等鏈長度聚羥基烷酸酯聚合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的酵母菌株，其中聚羥基烷酸酯聚合酶是短鏈長度聚羥基烷酸酯聚合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的酵母菌株，其進(jìn)一步導(dǎo)入了異源?；o酶A氧化酶和/或異源反-2-烯?；o酶A水合酶II。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的酵母菌株，其還包括聚羥基烷酸酯。
10.一種用于在酵母菌株中生產(chǎn)聚羥基烷酸酯的方法，包括給酵母菌株供應(yīng)碳源，其中酵母菌株包括可操縱地編碼聚羥基烷酸酯聚合酶的異源核酸；在不同的培養(yǎng)策略下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞以引起聚羥基烷酸酯的生成；以及從酵母細(xì)胞中分離出聚羥基烷酸酯。
全文摘要
用于生產(chǎn)聚羥基烷酸酯(PHA)的轉(zhuǎn)基因酵母菌株和方法。在一些野生型酵母菌株、pex5突變體和fox3突變體的胞漿內(nèi)表達(dá)經(jīng)遺傳學(xué)加工的食油假單胞菌聚羥基烷酸酯(PHA)聚合酶。PHA的組成受酵母宿主的遺傳學(xué)背景、聚合酶的單體特異性、其中聚合酶為活化的細(xì)胞區(qū)域、以及培養(yǎng)基中所供應(yīng)的底物的影響。提供了培養(yǎng)策略和進(jìn)一步的代謝途徑加工技術(shù)。這個平臺提供了控制所合成的PHA的組成以及特性的基礎(chǔ)。
文檔編號C12P7/62GK1800349SQ20051008828
公開日2006年7月12日 申請日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者張波, 羅斯·卡爾森, 弗雷德里希·斯瑞恩克 申請人:張波