聚羥基烷酸酯共聚物組合物及其制備方法
【專利說明】
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年12月7日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/734, 489和于2012年10 月10日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/711，825的權(quán)益，因此將這些申請(qǐng)的所有內(nèi)容都通過援引 并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容涉及聚羥基烷酸酯共聚物組合物及其制備方法，更具體而言，涉及包 含多種聚羥基烷酸酯共聚物分子的聚羥基烷酸酯共聚物組合物，其中，所述聚羥基烷酸酯 共聚物分子（i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體、（ii)具有的4-羥基丁酸 酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%、且（iii)生物源含量多80% ;并且涉及制備所 述組合物的方法，所述方法包括在一種或多種含碳原料的存在下培養(yǎng)生物體。
【背景技術(shù)】
[0004] 聚羥基燒酸醋（polyhydroxyalkanoate)是生物可降解的生物相容性熱塑性材 料，能夠由可再生資源產(chǎn)生，并且具有廣泛的工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。聚羥基烷酸酯可以制 備為均聚物，例如聚3-羥基丁酸酯（亦稱為PHB)和聚4-羥基丁酸酯（亦稱為P4HB)， 或制備為共聚物，例如聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）（亦稱為PHB-CO-4HB)。 聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）共聚物因其能夠從可再生資源產(chǎn)生并能夠 用于在聚合物共混物中賦予類似于橡膠的彈性而受到關(guān)注。因此，例如，之前在文獻(xiàn) 中已描述了利用各種微生物將大量的4HB單體引入共聚物中來產(chǎn)生聚（3-羥基丁酸 酯-co-4-羥基丁酸酯），但是，這僅在與其他碳源一起供應(yīng)4-羥基丁?；鵆oA的直接 前體（例如4-羥基丁酸、γ-丁內(nèi)酯和/或1，4_ 丁二醇）時(shí)得以實(shí)現(xiàn)。例如，Kunioka 等,Polymer Communications 29:174-176 (1988) ；Doi 等,Polymer Communications 30:169-171 (1989) ;Kimura 等，Biotechnol. Letters 14 (6):445-450 (1992); Nakamura 等，Macromolecules 25(17):4237-4241 (1992) ;Saito 和 Doi，Int.J. Biol. Macromol. 16(2):99-104(1994) ;Lee 等，Biotechnol. Letters 19(8):771-774(1997); Choi 等，Appl. Environm. Microbiol. 65 (4) : 1570-1577 (1999) ;Hsieh 等，J. Taiwan Inst. Chem. Engin. 40:143-147 (2009)。還已實(shí)現(xiàn)了在經(jīng)遺傳改造的大腸桿菌細(xì)胞中由作為唯一 碳源的葡萄糖產(chǎn)生聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）共聚物，但是報(bào)道的所得到的 共聚物中4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比較低，例如在穩(wěn)定期為12. 5%以下，除非同 時(shí)給予了其他碳源。Chen等，美國(guó)公開2012/0214213;另見Dennis和Valentin,美國(guó)專 利 6, 117, 658 ;Valentin 和 Dennis, J. Biotechnol. 58:33-38(1997)，Chen 等，中國(guó)專利申 請(qǐng)公開 CN 102382789 A ;Li 等，Metab. Eng. 12:352-359 (2010)。還描述了從經(jīng)遺傳改造的 代謝可再生原料（例如葡萄糖）的微生物生物質(zhì)中產(chǎn)生聚4-羥基丁酸酯均聚物，但是示 例性的聚4-羥基丁酸酯均聚物的滴度小于生物質(zhì)滴度的50重量％，并且在任何情況下聚 4-羥基丁酸酯均聚物的性質(zhì)都不同于聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）共聚物。Van Walsem 等，TO 2011/100601。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 提供了一種聚羥基烷酸酯共聚物組合物。該組合物包含多種聚羥基烷酸酯共聚物 分子。所述聚羥基烷酸酯共聚物分子（i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體、 (ii)具有的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%、且（iii)具有的生物 源含量多80%。
[0006] 還提供了一種制備聚羥基烷酸酯共聚物組合物的方法。該組合物包含多種聚羥基 烷酸酯共聚物分子。所述聚羥基烷酸酯共聚物分子（i)包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基 丁酸酯單體、（ii)具有的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%、且（iii) 具有的生物源含量多80%。所述方法包括在下述條件下在一種或多種含碳原料的存在下培 養(yǎng)生物體，從而形成所述組合物；在所述條件下，（a)所述一種或多種含碳原料轉(zhuǎn)化為3-羥 基丁?；鵆oA和4-羥基丁?；鵆oA，并且（b)所述3-羥基丁?；鵆oA和4-羥基丁酰基CoA 聚合形成聚羥基烷酸酯共聚物分子。所述生物體已被遺傳改造成包含聚羥基烷酸酯合酶、 乙?；鵆oA乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙?；鵆oA還原酶、琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酸半醛還原酶 和CoA轉(zhuǎn)移酶的酶活性，并且不包含NAD +依賴型琥珀酸半醛脫氫酶和/或NADP +依賴型琥 珀酸半醛脫氫酶的酶活性。所述一種或多種含碳原料總共的生物源含量多80%。
【附圖說明】
[0007] 圖1是示例性大腸桿菌中心代謝途徑的示意圖，其顯示出了已在實(shí)施例中修改或 引入的反應(yīng)或者可以在今后修改的反應(yīng)。在某些實(shí)施例中通過刪除相應(yīng)的基因而消除的 反應(yīng)用"X"標(biāo)出?？s寫："PEP"，磷酸烯醇丙酮酸；"PYR"，丙酮酸；"Ac-CoA"，乙酰基CoA ; "AcAc-CoA"，乙酰乙酰基 CoA ;"3HB-CoA"，3 羥基丁酰基 CoA ;"CIT"，檸檬酸；"ICT"，異檸 檬酸；" a KG"，α -酮戊二酸；"SUC-CoA"，琥珀?；鵆oA ;"SUC"，琥珀酸；"Fum"，延胡索酸； "MAL"，L-蘋果酸；"0ΑΑ"，草酰乙酸；"SSA"，琥珀酸半醛；"4HB"，4-羥基丁酸；"4HB-P"， 4-羥基丁?；?磷酸；"4HB-C〇A"，4-羥基丁?；鵆oA ;"PHB-c〇-4HB"，聚（3-羥基丁酸 酯-co-4-羥基丁酸酯）。編號(hào)的反應(yīng)："1"，乙酰基CoA乙?；D(zhuǎn)移酶（又名β酮硫解酶）； "2"，乙酰乙?；鵆oA還原酶；"3"，琥珀酸半醛脫氫酶；"4"，α _酮戊二酸脫羧酶；"5"，琥珀 酸半醛還原酶；"6"，CoA轉(zhuǎn)移酶；"7"，丁酸激酶；"8"，磷酸轉(zhuǎn)丁?；?；"9"，聚羥基烷酸酯 合酶；"10"，琥珀酸半醛脫氫酶；"11"，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；"12"，4_羥基丁?；鵆oA硫 酯酶。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下文將描述本公開內(nèi)容的實(shí)例實(shí)施方式。
[0009] 本發(fā)明提供了一種聚羥基烷酸酯共聚物組合物。該組合物包含多種聚羥基烷酸酯 共聚物分子。所述組合物可以是例如：生物質(zhì)組合物，例如已產(chǎn)生并在其中包含多種聚羥基 烷酸酯共聚物分子的生物體；不含非聚羥基烷酸酯生物質(zhì)的組合物，例如，包含已經(jīng)從產(chǎn)生 了聚羥基烷酸酯共聚物分子的生物體中分離和/或純化出的該聚羥基烷酸酯共聚物分子 的組合物；或生物塑料（bioplastic)組合物，例如，包含聚羥基烷酸酯共聚物分子并且適 合作為生物塑料使用的均質(zhì)或共混的組合物。
[0010] 所述聚羥基烷酸酯共聚物分子包含3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體。因 此，每種聚羥基烷酸酯共聚物分子都既包含3-羥基丁酸酯單體又包含4-羥基丁酸酯單體。 這些分子可以通過例如由PHA合酶介導(dǎo)的3-羥基丁酰基CoA與4-羥基丁?；鵆oA的共聚 來合成，所述共聚產(chǎn)生共聚物（例如聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）共聚物）的分 子。示例性的適合的PHA合酶將在下文的實(shí)施例中描述。每種聚羥基烷酸酯共聚物分子還 可以可選地包含其他額外單體，例如，5-羥基戊酸酯單體，例如，當(dāng)由PHA合酶介導(dǎo)的3-羥 基丁?；鵆oA與4-羥基丁酰基CoA的共聚過程中還存在所述額外單體的聚合性前體時(shí)就 會(huì)如此。
[0011] 聚羥基烷酸酯共聚物分子中的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~ 75%。因此，聚羥基烷酸酯共聚物分子的單體單元的總共23. 5%~75%是4-羥基丁酸酯 單體，而聚羥基烷酸酯共聚物分子的單體單元中其余25%~76. 5%則為3-羥基丁酸酯單 體和可選的其他額外單體。在一些實(shí)施方式中，單體單元中其余25%~76. 5%基本上全部 (例如，彡95%或彡99% )是3-羥基丁酸酯單體，而剩下的則是其他額外單體。在一些實(shí) 施方式中，單體單元的其余25 %~76. 5 %全部都是3-羥基丁酸酯單體，因此聚羥基烷酸酯 共聚物分子不包含其他額外單體。因此，例如，特別是就聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁 酸酯）共聚物而言，對(duì)于4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比為23. 5%~75%的聚羥基 烷酸酯共聚物分子，該聚羥基烷酸酯共聚物分子的單體單元的其余25%~76. 5%為3-羥 基丁酸酯單體。確定聚羥基烷酸酯共聚物分子的3-羥基丁酸酯單體和4-羥基丁酸酯單體 的單體摩爾百分比的適合的示例方法在下文的實(shí)施例中有所描述。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，聚羥基烷酸酯共聚物分子中的4-羥基丁酸酯單體的單體摩 爾百分比為25%~70%。聚羥基烷酸酯共聚物分子中的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百 分比可以為例如30%~40%、40%~50%、50%~60%或60%~70%。
[0013] 聚羥基烷酸酯共聚物分子中的4-羥基丁酸酯單體的單體摩爾百分比影響其組合 物的性質(zhì)，例如在熔融溫度、斷裂伸長(zhǎng)率、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等方面影響其組合物的性質(zhì)。例 如，當(dāng)聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）共聚物分子的4-羥基丁酸酯單體的單體摩 爾百分比增加到超過10%時(shí)，熔融溫度會(huì)下降至低于130°C，且斷裂伸長(zhǎng)率會(huì)增加至超過 400%。Saito Y.等，39 Polym. Int. 169(1996)。因此，4-羥基丁酸醋單體的單體摩爾百分 比在上述各范圍內(nèi)的聚羥基烷酸酯共聚物分子可以用來調(diào)整組合物以獲得特定的所需性 質(zhì)。
[0014] 聚羥基烷酸酯共聚物分子的生物源含量多80%。本文所用的術(shù)語(yǔ)"生物源含量 (biobased content) "是指材料或產(chǎn)品中的生物源碳的量占該材料或產(chǎn)品的總有機(jī)碳的重 量（質(zhì)量）百分比，如ASTM D6866-12 "使用放射性碳分析來確定固體、液體和氣體樣品中 的生物源含量的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法"（ASTM International, U. S.，2012)(通過援引將其并入本 文中）中所定義的。如ASTM D6866-12所述，總有機(jī)碳可包括生物源碳和化石碳。生物源 碳是指包含放射性碳（即14C)的有機(jī)碳，其中所述放射性碳的含量表明最近通過了現(xiàn)存生 物圈循環(huán)，例如，最近發(fā)生的大氣CO 2(包含已知百分比的14C)并入有機(jī)碳中。化石碳是指 不含或幾乎不含放射性碳的有機(jī)碳，這是因?yàn)榛嫉哪挲g（從大氣〇) 2并入時(shí)開始計(jì)算） 遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于14C的半衰期，即，全部或基本上全部所并入的14C都已衰變。因此，當(dāng)應(yīng)用于聚羥 基烷酸酯共聚物分子時(shí)，生物源含量是指該聚羥基烷酸酯共聚物分子中的生物源碳的量占 該聚羥基烷酸酯共聚物分子中的總有機(jī)碳的重量（質(zhì)量）百分比。聚羥基烷酸酯共聚物分 子的生物源含量可以例如根據(jù)ASTM D6866-12并特別基于以下方法來測(cè)量：確定