專利名稱：抗菌肽Pexiganan的基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及抗菌肽的基因工程表達方法。
背景技術(shù)：
抗生素的發(fā)現(xiàn)使人們對病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無策，對保護人類健康作出了巨大貢獻。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，導致病原菌株不斷產(chǎn)生耐藥性，一些過去抗生素非常有效得到控制的傳染性疾病，近年來死灰復燃。而且由于耐藥性的不斷增強和蔓延，現(xiàn)有抗生素已經(jīng)顯得無能為力。此外抗生素的普遍濫用和藥物殘留，一些抗生素的過敏反應(yīng)等諸多問題，已日趨嚴重和日益突出，迫切需要新一類的抗菌制劑加以解決。
面臨細菌耐藥性極大的挑戰(zhàn)和目前形勢的迫切性，研究者們?nèi)μ剿髋c目前作用機制完全不同的新型抗菌藥物。
抗菌肽廣泛存在于多種生物體內(nèi)，是生物體對外界病原物侵染而產(chǎn)生的一系列免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，其分子量小，性能穩(wěn)定，具有較強的廣譜抗菌能力。這類抗菌肽作用于微生物膜(細胞膜、外膜)，破壞其屏障而達到殺傷細菌細胞的效果，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性不會誘導抗藥菌株的產(chǎn)生，有希望成為新一代抗菌劑。Pexiganan是一個由22個氨基酸殘基組成的小分子多肽，其一級結(jié)構(gòu)為Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-NN2，理論分子量為2.4Kda，來源于非洲爪蛙上皮抗菌肽magainin家族的類似物，相關(guān)研究表明，該類抗菌肽具有較寬的抗菌譜(Yigong Ge，Dorothy L.et al，In Vitro AntibacterialProperties of Pexiganan，an Analog of Magainin，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1999，43782-788.Bessalle，R.，A.Kapitkovshy，et al.All D-magaininchirality antimicrobial activity，andproteolytic resistance.FEBS Lett.274151-155)，對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌和真菌都有抗菌活性。Pexiganan目前在國外已經(jīng)進行著II期臨床試驗，主要用于糖尿病感染的治療。由于在正常細胞組織中含量有限，直接獲得Pexiganan非常困難。目前公開報道的Pexiganan均為化學合成產(chǎn)品，化學合成法工藝復雜，成本高，其生產(chǎn)過程使用大量有機溶劑，污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明旨在解決利用基因工程的方法高效表達抗菌肽Pexiganan的問題。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種基因工程生產(chǎn)Pexiganan的方法。通過分析Pexiganan的結(jié)構(gòu)，設(shè)計大腸桿菌偏好的密碼子，合成編碼Pexiganan的DNA序列，見序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，連接到適合的表達載體進行表達和純化，該表達載體可以是任何任何適合于大腸桿菌表達的載體，根據(jù)抗菌肽的分子量較小的特點，優(yōu)選融合表達載體，如pBS、pTrx、pTrxFus等，特別優(yōu)選GST融合表達載體，例如pGEX系統(tǒng)和pET系統(tǒng)的載體(購自amersham pharmaciabiotech公司)，因為GST融合蛋白易于小分子肽的融合表達，鑒于純化需要目的肽和融合蛋白之間分子量有一定的差異，這樣小肽更容易純化徹底。而且為更好的適合于目的肽的切割。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可采用常規(guī)方法用核酸自動合成儀合成。
基因工程表達的Pexiganan，對不同來源的5株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus最小殺菌濃度(MIC)為2～6ug/ml，對不同來源的5株銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa(綠膿桿菌)最小殺菌濃度(MIC)4～8ug/mL。對其它的如鏈球菌、變形桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等都具有良好的殺菌作用。
有益效果本發(fā)明提供的基因工程生產(chǎn)Pexiganan的方法，采用了在大腸桿菌中的高豐度和使用規(guī)律高的密碼子，密碼子整體序列和密碼子之間重復少，減少了在復制過程中的錯配幾率，Tm值適中，在原核細胞融合表達系統(tǒng)中表達的Pexiganan，占菌體總蛋白的48～50％。


Pexiganan表達載體的構(gòu)建過程圖示。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例，具體說明本法明。
本發(fā)明所用內(nèi)切酶、連接酶、其他分子生物學試劑和菌株E.coli DH5α購自Promega公司。電泳、感受態(tài)細胞制備、轉(zhuǎn)化等分子生物學方法采用《分子克隆實驗指南》的方法進行(薩姆布魯斯(Sambrool，J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第3版)，北京，科學出版社，2002，8)。質(zhì)粒提取，采用上海生工試劑盒K192，按照使用說明進行。
實施例1
Pexiganan的基因工程表達表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化子的獲得按常規(guī)方法分別將核酸SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQID NO.5合成在質(zhì)粒pUC18載體上，依照說明書用SmaI(ccc/ggg)+EcoRI(g/aattc)對SEQ IDNO.1-pUC18酶切，低熔點瓊脂糖法(《分子克隆》)回收小片斷，用PhsAI(gacNN/NNgtc)+EcoRI(g/aattc)對載體pET42a(+)進行酶切，低熔點瓊脂糖法回收大片斷，依照說明書用T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物，即可獲得含編碼Pexiganan的DNA序列的表達載體，將表達載體轉(zhuǎn)化入新制備的大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，篩選并鑒定轉(zhuǎn)化子，常規(guī)方法提取質(zhì)粒，經(jīng)序列測定序列無誤。
誘導表達，檢測鑒定轉(zhuǎn)化子對照pET42a(+)BL21(DE3)plys S分別劃線含卡那霉素30ug/ml的LB平板，37℃培養(yǎng)的單個菌落接種含卡那霉素30ug/ml的LB肉湯20ml；以及空白對照BL21(DE3)plys S菌落接種不含抗生素的LB肉湯20ml。當OD值達0.6時，分別加IPTG至終濃度1mM，37℃誘導表達2～3小時。5,000g離心5分鐘，保留上清，用20mM TrisHCl(pH8.0)洗滌，5,000g離心5分鐘，上清和沉淀保存于-80℃用于電泳檢測。在28～29KDa.分子量有條帶，即為融合蛋白(分子量約28.4KDa)，融合蛋白表達量分別是48％、50％、35％、45％和40％。
純化將GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF(high sub)(GE Healthcare-formerly AmershamBiosciences-Products)柱連接使用，使用AKTA Prime(amersham pharmacia biotech公司儀器)在線處理，樣品切割和Factor Xa去除一步完成。按GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF(high sub)說明書，配合使用Prime在線處理，濃縮得到pexiganan，按照小肽分子的SDS-PAGE方法(石繼紅等，應(yīng)用SDS-PAGE顯示小分子多肽技術(shù)的探討，生物工程進展，2001，Vol21，No.1，38～41)，SDS-PAGE電泳銀染檢測其分子量約為2.4KDa，序列測定與文獻報道一致。
實施例2抗菌效果檢測方法通過抑菌圈和殺菌濃度測定(美國專利6,337,314，2002年1月8日)。
按照實施例1的方法得到基因工程表達的Pexiganan，對不同來源(標準菌株金黃色葡萄球菌S.aureus，CMCC(B)26003和醫(yī)院臨床病例分離金黃色葡萄球菌菌株)的5株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus最小殺菌濃度(MIC)為2～6ug/ml(國外實驗及化學合成產(chǎn)品MIC殺菌濃度為16～32ug/ml)，對不同來源(標準菌株銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaMignla，CMCC(B)10104和醫(yī)院臨床病例分離銅綠假單胞菌菌株)的5株P(guān)seudomonasaeruginosa銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)最小殺菌濃度(MIC)4～8ug/mL(國外實驗及化學合成產(chǎn)品MIC殺菌濃度為8～32ug/mL)。
核苷酸序列表SEQ ID NO.1gggatcggca aattcctgaa gaaagcgaag aaattcggca aggcgttcgt gaaaatcctg60aagaaa 66SEQ ID NO.2gggatcggca agttcctgaa gaaggcgaag aagttcggca aggcgttcgt gaagatcctg60aagaag 66SEQ ID NO.3gggataggta agtttcttaa aaaggccaaa aagtttggaa aagcatttgt aaagatactt60aaaaag 66SEQ ID NO.4gggatcggta agttcctgaa gaaggctaag aaattcggta aggctttcgt gaagatcctg60aagaag 66SEQ ID NO.5gggatcggta aattcctgaa aaaagctaaa aaattcggta aggctttcgt gaaaatcctg60aaaaaa 6權(quán)利要求
1.一種Pexiganan的基因工程生產(chǎn)方法，包括合成編碼Pexiganan的DNA序列，連接到適合的表達載體進行表達和純化，其中編碼Pexiganan的DNA序列為序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
2.按照權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)Pexiganan的方法，其中所用的表達載體是融合表達載體。
3.按照權(quán)利要求4的生產(chǎn)Pexiganan的方法，其中所用的表達載體是GST載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及抗菌肽Pexiganan的基因工程表達方法包括合成編碼Pexiganan的DNA序列，連接到適合的表達載體進行表達和純化，其中編碼Pexiganan的DNA序列，采用了在大腸桿菌中的高豐度和使用規(guī)律高的密碼子，密碼子整體序列和密碼子之間重復少，減少了在復制過程中的錯配幾率，T
文檔編號C12P21/02GK1920020SQ20051001483
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者楊旭, 吳全忠, 高峰, 姜燕 申請人:天津天士力制藥股份有限公司