專利名稱：利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸分子雜交技術(shù)，具體地講是利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測目的基因的效率。
背景技術(shù)：
DNA分子雜交是廣泛應(yīng)用的一項分子生物學(xué)檢測目的基因的技術(shù)。其原理是單鏈DNA分子可以通過堿基互補(bǔ)形成堿基配對，使兩條具有互補(bǔ)堿基序列的DNA單鏈形成DNA雙鏈?；蛐酒峭ㄟ^這種原理將一系列具有特異性序列的單鏈分子點于基質(zhì)表面上，并與含有特定序列的目的基因DNA分子進(jìn)行雜交形成雜合DNA雙鏈分子(其中一條為目的基因鏈，另一條為探針鏈)，再經(jīng)特定的顯色技術(shù)收集雜交信號。通過雜交信號定量或定性判斷目的基因。該技術(shù)自產(chǎn)生以來，已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定、基因判讀和基因表達(dá)分析等多個領(lǐng)域，是目前世界上廣泛使用的一項新興分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)發(fā)展的熱點在于如何提高其檢測目的基因的特異性和靈敏度，以及如何使其更好地應(yīng)用于目的基因的定量分析。解決這些問題的關(guān)鍵是探針設(shè)計技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
目前國際上還沒有一種類似于本發(fā)明的探針設(shè)計方法，用以提高DNA分子雜交效率，從而提高基因芯片檢測目的基因的效率。實踐中依然運用一條探針分子同目的基因DNA分子雙鏈中的一條鏈進(jìn)行雜交的方法。這種方法造成了雜交體系中目的基因另一條單鏈大量積累，嚴(yán)重影響雜交反應(yīng)平衡向生成雜交產(chǎn)物的方向進(jìn)行，同時浪費了另一條單鏈上的信號報告基團(tuán)，使雜交信號減弱，降低雜交反應(yīng)的靈敏度。當(dāng)該方法應(yīng)用于目的基因定量分析時，由于雜交反應(yīng)平衡問題將嚴(yán)重影響定量分析的結(jié)果。
針對上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種探針設(shè)計方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的設(shè)計兩條都具有特異性的探針分別固定在基因芯片基質(zhì)表面的同一位點上，使之同目的基因的兩條鏈同時雜交。這樣，一方面避免了目的基因另一條DNA單鏈上的信號基團(tuán)的浪費，同時促進(jìn)分子雜交反應(yīng)向有利于雜交產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行。
為了具體驗證該技術(shù)的可行性，本技術(shù)首先通過選擇大腸桿菌基因組DNA中的23SrRNA基因中的DNA片段作為待檢測的目的基因，并通過設(shè)計和該基因能夠特異雜交的DNA寡核苷酸序列作為探針進(jìn)行本發(fā)明的檢測實施例。
所選擇擴(kuò)增的大腸桿菌基因組DNA中的23S rRNA基因片段的序列(988bp)如下TCAGAGGCGA TGAAGGACGT GCTAATCTGC GATAAGCGTC GGTAAGGTGATATGAACCGT TATAACCGGC GATTTCCGAA TGGGGAAACC CAGTGTGATTCGTCACACTA TCATTAACTG AATCCATAGG TTAATGAGGC GAACCGGGGGAACTGAAACA TCTAAGTACC CCGAGGAAAA GAAATCAACC GAGATTCCCCCAGTAGCGGC GAGCGAACGG GGAGGAGCCC AGAGCCTGAA TCAGTGTGTGTGTTAGTGGA AGCGTCTGGA AAGGCGCGCG ATACAGGGTG ACAGCCCCGTACACAAAAAT GCACATACTG TGAGCTCGAT GAGTAGGGCG GGACACGTGGTATCCTGTCT GAATATGGGG GGACCATCCT CCAAGGCTAA ATACTCCTGACTGACCGATA GTGAACCAGT ACCGTGAGGG AAAGGCGAAA AGAACCCCGGCGAGGGGAGT GAAAAAGAAC CTGAAACCGT GTACGTACAA GCAGTGGGAG
CCTCTTTTAT GGGGTGACTG CGTACCTTTT GTATAATGGG TCAGCGACTTATATTCTGTA GCAAGGTTAA CCGAATAGGG GAGCCGAAGG GAAACCGAGTCTTAACCGGG CGTTAAGTTG CAGGGTATAG ACCCGAAACC CGGTGATCTAGCCATGGGCA GGTTGAAGGT TGGGTAACAC TAACTGGAGG ACCGAACCGACTAATGTTGA AAAATTAGCG GATGACTTGT GGCTGGGGGT GAAAGGCCAATCAAACCGGG AGATAGCTGG TTCTCCCCGA AAGCTATTTA GGTAGCGCCTCGTGAATTCA TCTCCGGGGG TAGAGCACTG TTTCGGCAAG GGGGTCATCCCGACTTACCA ACCCGATGCA AACTGCGAAT ACCGGAGAAT GTTATCACGGGAGACATACG GCGGGTGCTA ACGTCCGTCG TGAAGAGGGA AACAACCCAGACCGCCAGCT AAGGTCCCAA AGTCATGGTT AAGTGGGA用PCR方法擴(kuò)增上述大腸桿菌基因組DNA樣品中的23S rRNA基因片段，同時進(jìn)行地高辛標(biāo)記。擴(kuò)增時使用的PCR引物序列如下引物序列1TCAGAGGCGATGAAGGAC引物序列2TCCCACTTAACCATGACTTTG本發(fā)明運用生物信息學(xué)方法所設(shè)計的探針序列如下探針序列3 AGGTTAACCGAATAGGGGAG探針序列4 CTCCCCTATTCGGTTAACCT探針序列5 TAGCAAGGTTAACCGAATAGGGGAGCCGAA探針序列6 TTCGGCTCCCCTATTCGGTTAACCTTGCTA探針序列7 GACTGCGTACCTTTTGTATAAT探針序列8 ATTATACAAAAGGTACGCAGTC探針序列9 GAGCCTCTTTTATGGGGTGACT探針序列10 AGTCACCCCATAAAAGAGGCTC探針序列11 GGCGAAAAGAACCCCGGCGAGG探針序列12 CCTCGCCGGGGTTCTTTTCGCC探針序列3、5、7、9和11稱為第一組探針，這組探針可以和目的基因中的一條DNA單鏈雜交(我們稱其為目標(biāo)DNA正鏈)；探針序列4、6、8、10和12稱為第二組探針，這組探針可以和目的基因中的另一條DNA單鏈雜交(我們稱其為目標(biāo)DNA負(fù)鏈)。雜交之后，運用分子雜交-酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)驗證雙分子共雜交的效率，并與常規(guī)的單探針雜交效率進(jìn)行比較。該驗證方法包括以下步驟1、用PCR方法擴(kuò)增23S rRNA基因的DNA片段，同時進(jìn)行地高辛標(biāo)記。
PCR反應(yīng)體系如下成分濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μLdNTPs 每種2.5mmol/L0.3μLDIG-dUTP1mmol/L 0.3μL模板DNA(大腸桿菌DNA) 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μL
PCR方法中擴(kuò)增程序為1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)步，重復(fù)25次9)72℃2min2、將設(shè)計的特異性寡核苷酸基因探針點在帶有正電荷的尼龍膜(Amersham公司，美國)上。分別制作三種尼龍膜，第一種膜又分兩類，一類點接0.2μL第一組探針(探針序列3、5、7、9和11)，另一類點接0.2μL第二組探針(探針序列4、6、8、10和12)，用于常規(guī)的單分子雜交，兩組探針的濃度都是10μmol/L；第二種膜是將上述兩組探針中的每一個都單獨點接在尼龍膜上，一共10個點樣點，每一個點的點樣量是0.2μL(濃度為10μmol/L)，用于雙分子單雜交；第三種膜是將探針序列3、5、7、9、11點在尼龍膜上，點好樣的尼龍膜在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10min，然后再將探針4、6、8、10、12點在尼龍膜的對應(yīng)位點上，具體對應(yīng)關(guān)系為探針序列4點在探針序列3的位點上，探針序列5點在探針序列6的位點上，探針序列7點在探針序列8的位點上，探針序列9點在探針序列10的位點上，探針序列12點在探針序列11的位點上，在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10min，用于雙分子共雜交，10種探針中的每種點樣量都是0.1μL(濃度為10μmol/L)。點好樣的尼龍膜在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10min。同時將0.2μL標(biāo)記有地高辛基團(tuán)的23S rRNA基因片段也點在每一張尼龍膜上，作為陽性對照。
3、雜交和雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色，按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。
地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物和寡核苷酸探針雜交方法如下*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到50℃，把點入寡核苷酸探針的尼龍膜放入預(yù)雜交袋中，加入預(yù)雜交液，封好口，于50℃預(yù)雜交30min。
*PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記的靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的尼龍膜放入雜交袋，加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL，再加入1mL雜交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50℃雜交1hr，溫和搖動。
*雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶連免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明書進(jìn)行。
*結(jié)果判讀尼龍膜上的深藍(lán)色斑點為陽性雜交結(jié)果，表明探針已檢出樣品中所含有的特異性序列。


圖1第一組探針與10μL(約0.1μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖2第一組探針與1μL(約0.01μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖3第二組探針與10μL(約0.1μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖4第二組探針與1μL(約0.01μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖5第一組和第二組探針點在一張膜上與10μL(約0.1μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖6第一組和第二組探針點在一張膜上與1μL(約0.01μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖7第一組和第二組探針點在一張膜上與0.2μL(約0.002μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖8雙雜交探針與10μL(約0.1μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖9雙雜交探針與1μL(約0.01μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
圖10雙雜交探針與0.2μL(約0.002μg)23S rRNA基因的雜交結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1第一組探針和第二組探針分別與標(biāo)記的23S rRNA基因的雜交1.雜交膜的制備將0.2μL的序列3、序列5、序列7、序列9和序列11(濃度為10μmol/L)分別點在尼龍膜的不同位點上，然后在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min。同樣，將0.2μL的序列4、序列6、序列8、序列10和序列12(濃度為10μmol/L)分別點在尼龍膜的不同位點上，然后在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min。以上兩種雜交膜各制備2張。
2.23S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及地高辛標(biāo)記PCR反應(yīng)體系成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一10μmol/L2μL引物序列二10μmol/L2μLdNTPs 每種2.5mmol/L0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μL模板DNA(大腸桿菌DNA) 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μLPCR擴(kuò)增條件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)回到第2)步，重復(fù)5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)回到第6)步，重復(fù)25次9)72℃ 2min3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交*預(yù)雜交將預(yù)雜交液預(yù)熱到50℃，把點入寡核苷酸探針的4張尼龍膜放入雜交袋中，加入預(yù)雜交液，封好口。于50℃水浴中預(yù)雜交30min。
*PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性將DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，保持10min，然后迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記的靶DNA分子與尼龍膜上的探針雜交把預(yù)雜交好的4張尼龍膜分別裝入4個雜交袋中，含有第一組探針和第二組探針雜交膜的雜交袋分別加入10μL(約0.1μg)和1μL(約0.01μg)變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，再分別加入1mL雜交液，封好口。50℃雜交1hr，溫和搖動。
*雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶連免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀雜交結(jié)果是，在加入10μL(約0.1μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，序列3、序列5、序列7、序列9和序列11的點樣位置上均為深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖1；在加入1μL(約0.01μg)PCR產(chǎn)物的尼龍膜上，序列3、序列5、序列7、序列9和序列11的點樣位置上均無深藍(lán)色斑點，即為陰性雜交結(jié)果，見圖2；在加入10μL(約0.1μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，序列4、序列6、序列8、序列10和序列12的點樣位置上均為深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖3；在加入1μL(約0.01μg)PCR產(chǎn)物的尼龍膜上，序列4、序列6、序列8、序列10和序列12的點樣位置上均無深藍(lán)色斑點，即為陰性雜交結(jié)果，見圖4。實驗表明，在該實驗條件下，這種僅能和目標(biāo)DNA的一條鏈(正鏈或負(fù)鏈)雜交的探針，可以檢測到10μL(約0.1μg)的目標(biāo)DNA，不能檢測到1μL(約0.01μg)的標(biāo)記產(chǎn)物。
圖1和圖2中的各個點分別是 圖3和圖4中的各個點分別是1陽性對照1陽性對照2探針序列3 2探針序列43探針序列5 3探針序列64探針序列7 4探針序列85探針序列9 5探針序列106探針序列11 6探針序列12實施例2正反義探針與23S rRNA基因的單雜交1.雜交膜的制備將濃度為10μmol/L的10種探針(第一組和第二組)各0.1μL分別獨立地點在尼龍膜上，構(gòu)成雜交用DNA微陣列，一共制備3張膜，然后在長波紫外下交聯(lián)5-10min。
2.23S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及地高辛標(biāo)記PCR反應(yīng)體系和條件同實施例1。
3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交預(yù)雜交和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性同實施例1。在進(jìn)行雜交時，3個雜交袋分別放入1個點有10種探針的雜交膜，然后分別加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL(0.1μg)、1μL(0.01μg)和0.2μL(0.002μg)，再加入1mL雜交液，封好口，50℃雜交1hr，溫和搖動。雜交斑點的酶連免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明書進(jìn)行。
*結(jié)果判讀雜交結(jié)果是，在加入10μL(0.1μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，探針序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12的位置上均出現(xiàn)深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖5；在加入1μL(0.01μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，上述10個探針序列位置也均出現(xiàn)深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖6；在加入0.2μL(0.002μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，上述10個探針序列位置均無深藍(lán)色斑點出現(xiàn)，即為陰性雜交結(jié)果，見圖7。這一結(jié)果表明，在該實驗條件下，將分別能與目標(biāo)DNA的正鏈和負(fù)鏈進(jìn)行雜交的探針點在同一張膜上的方法，可以檢測到1μL(約0.01μg)的目標(biāo)DNA，而不能檢出0.2μL(0.002μg)的標(biāo)記產(chǎn)物。相對于實施例1，其靈敏度提高10倍。
圖5、圖6和圖7中的各個點分別是
1陽性對照2探針序列33探針序列44探針序列55探針序列66探針序列77探針序列88探針序列99探針序列1010探針序列1111探針序列12實施例3正反義探針與23S rRNA基因的共雜交1.雜交膜的制備將濃度為10μmol/L的探針序列3、序列5、序列7、序列9和序列11各0.1μL獨立地點在尼龍膜上，在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min，于4℃陰干30min；然后按照上面的序列點樣順序，在已經(jīng)點樣的位置上分別點接0.1μL序列4、序列6、序列8、序列10和序列12。也就是說，第一個點樣位點含有序列3和序列4，第二個點樣位點含有序列5和序列6，第三個點樣位點含有序列7和序列8，第四個點樣位點含有序列9和序列10，第五個點樣位點含有序列11和序列12。然后，在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min，于4℃陰干30min。
2.23S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及地高辛標(biāo)記PCR反應(yīng)體系和條件同實施例1。
2.PCR擴(kuò)增及地高辛標(biāo)記2.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交預(yù)雜交和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性同實施例1。在進(jìn)行雜交時，3個雜交袋分別放入1個點有10種探針的雜交膜，然后分別加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL(0.1μg)、1μL(0.01μg)和0.2μL(0.002μg)，再加入1mL雜交液，封好口，50℃雜交1hr，溫和搖動。雜交斑點的酶連免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明書進(jìn)行。
*結(jié)果判讀雜交結(jié)果是，在加入10μL(0.1μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，由探針序列3和序列4、序列5和序列6、序列7和序列8、序列9和序列10以及序列11和序列12形成的5個位置上均出現(xiàn)深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖8；在加入1μL(0.01μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，上述5個位置也均出現(xiàn)深藍(lán)色斑點，即為陽性雜交結(jié)果，見圖9；在加入0.2μL(0.002μg)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的尼龍膜上，上述5個位置同樣出現(xiàn)深藍(lán)色斑點，即為陰性雜交結(jié)果，見圖10。這一結(jié)果表明，在該實驗條件下，采用正反義探針共雜交方法，可以檢測到0.2μL(約0.002μg)的目標(biāo)DNA。與實施例1中常規(guī)單雜交探針相比，其靈敏度提高50倍，與實施例2中的正反義探針單雜交相比，其靈敏度提高5倍。
圖8、圖9和圖10中的各個點分別是1陽性對照2探針序列3和探針序列4混合樣品；3探針序列5和探針序列6混合樣品；4探針序列7和探針序列8混合樣品；5探針序列9和探針序列10混合樣品；6探針序列11和探針序列12混合樣品。
權(quán)利要求
1.利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法，其特征在于，設(shè)計兩條分別能和所檢測的目的基因的兩條核酸鏈同時雜交的探針，與目的基因的兩條鏈同時雜交形成核酸雜合分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法，其特征在于，它包括正反義探針共雜交方法，其簡要步驟如下將分別能和目的基因的正鏈和負(fù)鏈進(jìn)行雜交的一對寡核苷酸探針先后固定在芯片基質(zhì)的同一個位點上，然后與標(biāo)記的被檢測樣品進(jìn)行雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法，其特征在于，它包括正反義探針單雜交方法，其簡要步驟如下將分別能和目的基因的正鏈和負(fù)鏈進(jìn)行雜交的一對寡核苷酸探針同時固定在芯片基質(zhì)的不同位點上，然后與標(biāo)記的被檢測樣品進(jìn)行雜交。
4.利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法在基因芯片和所有核酸雜交反應(yīng)中的應(yīng)用。
5.正反義探針共雜交技術(shù)的稱謂，其特征在于，僅將把能和目的基因的兩條核酸鏈分別雜交的兩條探針同時應(yīng)用在同一雜交反應(yīng)體系中的探針設(shè)計和基因芯片設(shè)計方法，稱為正反義探針共雜交技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用正反義探針共雜交技術(shù)提高基因芯片檢測效率的方法，屬于核酸分子雜交技術(shù)領(lǐng)域。其技術(shù)方案是通過設(shè)計兩條能夠和目的基因的核酸雙鏈分別雜交的探針，形成穩(wěn)定的探針—目的基因雜交產(chǎn)物，促進(jìn)雜交反應(yīng)向形成產(chǎn)物的方向進(jìn)行，大幅度提高雜交信號的強(qiáng)度。應(yīng)用該方法設(shè)計的正反義探針?biāo)苽涞碾s交膜，可以大大提高探針與目的基因的結(jié)合效率。在相同條件下，與常規(guī)的單探針雜交相比，檢測目的基因的靈敏度提高50倍。該方法可應(yīng)用于高靈敏度基因檢測芯片的制備和所有核酸雜交實驗。
文檔編號C12Q1/68GK1766122SQ200510014860
公開日2006年5月3日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日
發(fā)明者黃熙泰, 劉寅, 李永君, 鄭澤軍, 魏曉娜 申請人:南開大學(xué)