專利名稱：用于鑒定黃瓜黑星病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的DNA序列，及其利用DNA序列鑒定黃瓜黑星病抗性的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜黑星病是危害黃瓜、影響黃瓜品質(zhì)和產(chǎn)量的一個重要因素。它是隨著黃瓜種子的引進(jìn)而產(chǎn)生出的一種新的危險性病害。70年代以前，僅在東北溫室零星發(fā)生，80年代后，隨著保護(hù)地栽培的發(fā)展，首先在東北三省不少城市的保護(hù)地黃瓜上嚴(yán)重發(fā)病，并逐年擴展，危害加重，發(fā)病率高達(dá)90％-100％，產(chǎn)量損失輕者20％-30％，重者達(dá)78％。后來在山西、甘肅、內(nèi)蒙、海南、河北、山東、北京等地相繼發(fā)生。它主要發(fā)生在保護(hù)地黃瓜上，嚴(yán)重影響黃瓜的商品性。病菌侵染幼苗，在子葉上產(chǎn)生黃白色圓形斑點，進(jìn)而腐爛，嚴(yán)重時整株腐爛死亡。由于黃瓜黑星病是種傳病害，所以被列為檢疫對象。
培育抗黑星病黃瓜新品種是解決問題的關(guān)鍵。隨著分子標(biāo)記及相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種已經(jīng)成為目前研究的熱點之一。而且與常規(guī)育種相比，分子標(biāo)記輔助育種具有準(zhǔn)確、快速、效率高等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于鑒定黃瓜黑星病抗性的引物序列；本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種用于鑒定黃瓜黑星病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；
(3)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將擴增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無，鑒定黃瓜黑星病的抗性。
本發(fā)明鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)95％，(數(shù)據(jù)見表1)而且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，在黃瓜黑星病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價值。


圖1為鑒定黃瓜黑星病抗性的電泳圖；圖2顯示了19bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No1)；圖3顯示了19bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No2)；具體實施方式
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性200秒，94℃變性60秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，30個循環(huán)，再72℃延伸350秒，擴增完成；(3)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將擴增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在擴增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無，鑒定黃瓜黑星病的抗性。由于抗病單株經(jīng)擴增以后產(chǎn)生分子量大小約為120bp的DNA片段，而感病單株沒有該條帶，因此很容易通過特異條帶的有無對黃瓜黑星病材料的抗性進(jìn)行快速鑒定。如圖1所示P1和P2分別為抗病親本和感病親本，1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp；2為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp，1～7為抗病單株；8～14為感病單株，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，抗性株有帶，感性株無帶。
實施例2一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性180秒，94℃變性60秒，50℃退火60秒，72℃延伸60秒，25個循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴增完成；(3)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將擴增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在擴增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無，鑒定黃瓜黑星病的抗性。
實施例3一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性300秒，94℃變性60秒，59℃退火40秒，72℃延伸120秒，35個循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將擴增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在擴增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無，鑒定黃瓜黑星病的抗性。
表1 F2單株田間抗病表現(xiàn)及標(biāo)記分離統(tǒng)計

續(xù)表2

注R抗?。籗感??；+有條帶；-無條帶；*交換單株由表中可以看出，共有交換單株7株，所以吻合率為140/147＝95.2％。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定黃瓜黑星病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，其特征是它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將擴增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無，鑒定黃瓜黑星病的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定黃瓜黑星病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列是由具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列的上游引物和具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列的下游引物組成；一種鑒定黃瓜黑星病抗性的方法，其步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及SEQ ID No2所述的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴增；(3)PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的有無鑒定黃瓜黑星病的抗性，本發(fā)明鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)95％，且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，在黃瓜黑星病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/11GK1727496SQ200510014669
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者張桂華, 李淑菊, 孫小紅, 杜勝利, 王慧哲, 韓毅科, 魏愛民, 張厲 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司