專利名稱：高效降解芘基因工程菌及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物修復(fù)或生態(tài)恢復(fù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種降解芘基因工程菌及其構(gòu)建。
背景技術(shù)：
在多環(huán)芳烴降解中限速步驟是開(kāi)始的苯環(huán)加氧，一旦完成苯環(huán)加氧，隨后再氧化降解就相對(duì)容易進(jìn)行。但是常見(jiàn)微生物往往缺少單加氧酶基因，或者單加氧酶不能表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效降解芘基因工程菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的高效降解芘基因工程菌是將白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1基因，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)得到pc-1的cDNA(互補(bǔ)DNA)，再將cDNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中，構(gòu)建成功能高效降解多環(huán)芳烴的基因工程菌，命名為JM413。本發(fā)明人保證從申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾提供該工程菌。白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保存中心。
高效降解芘基因工程菌的構(gòu)建方法，1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1的基因序列，選取其上下游保守序列設(shè)計(jì)上下游引物A和B，并在各引物的一端分別加上EcoR I和BamH I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列。引物A和B的核苷酸序列如下，下劃線部分為EcoR I和BamH I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列。
引物A5’-ATGGAA TTCATG GTG ACT ACT TTT ACG AG-3’引物B5’-ATGGGA TCCGGA TTG CTT CTG C-3’2)提取總RNA自白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞提取總RNA3)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)采用一步RT-PCR的方法，由總RNA開(kāi)始逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增出單加氧酶基因pc-1的cDNA4)重組質(zhì)粒將載體pUC18與單加氧酶pc-1的cDNA在連接酶的作用下雜交為一個(gè)新的質(zhì)粒。
5)轉(zhuǎn)化將雜交的新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中。(大腸桿菌JM109購(gòu)于華美生物工程公司)6)篩選和鑒別經(jīng)進(jìn)一步的篩選和鑒別確認(rèn)單加氧酶pc-1的cDNA基因轉(zhuǎn)化進(jìn)了大腸桿菌JM109中，命名為JM413。
7)性能測(cè)定用鄰苯三酚分光光度法測(cè)定基因工程菌JM413的氧化酶活性，實(shí)驗(yàn)證明JM413氧化酶活性比JM109提高135％；以典型的多環(huán)芳烴化合物-芘為降解目標(biāo)物，檢驗(yàn)基因工程菌JM413的降解特性，結(jié)果表明，在完全相同的條件下，在菌與芘作用48h后JM413的芘降解率是JM109的近20倍。
本發(fā)明將真核生物白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1的基因，經(jīng)RT-PCR技術(shù)得到cDNA，再將cDNA轉(zhuǎn)化進(jìn)原核生物大腸桿菌JM109中，構(gòu)建成功具有單加氧酶活性的基因工程菌JM413。構(gòu)建的基因工程菌JM413，除具有JM109的特性外，還具有單加氧酶基因，能高效表達(dá)產(chǎn)生氧化酶的特性。該菌具有高效降解多環(huán)芳烴的特性，在生物修復(fù)或生態(tài)恢復(fù)工程中具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
本發(fā)明的有益效果構(gòu)建的基因工程菌JM413，因具有氨芐青霉素抗性基因和單加氧酶基因，所以，適應(yīng)性強(qiáng)，容易擴(kuò)大培養(yǎng)，而且安全性高，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成任何不良影響，因此，可以廣泛應(yīng)用于生物修復(fù)和生態(tài)恢復(fù)工程，降解難降解有機(jī)物，促進(jìn)生態(tài)恢復(fù)，保持生態(tài)平衡。
測(cè)試、檢驗(yàn)結(jié)果(一).基因工程菌的氧化酶活性測(cè)定1.實(shí)驗(yàn)原理鄰苯三酚比色法，基于用鄰苯三酚(又稱焦性沒(méi)食子酸)為基質(zhì)，在有空氣氧的情況下，由于微生物的氧化酶的催化生成有色的沒(méi)食子素。產(chǎn)生沒(méi)食子素在610nm波長(zhǎng)下有最大吸光值，其含量與顏色深度(A610nm)呈正相關(guān)。以7.5mg.mL-1重鉻酸鉀水溶液的顏色對(duì)應(yīng)于1mg.mL-1的沒(méi)食子素的乙酸乙酯溶液。以單位時(shí)間內(nèi)生成沒(méi)食子素的量表示氧化酶活性。
2.測(cè)定結(jié)果(表1-1)，柱狀圖(圖1-1)表1-1 JM413與JM109氧化酶活性 測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，基因工程菌JM413的氧化酶活性是JM109氧化酶活性135％。這是由于重組菌中轉(zhuǎn)化進(jìn)了白腐真菌細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1基因，并得到了高效表達(dá)，提高了JM413的氧化能力的結(jié)果。
(二).基因工程菌JM413與JM109對(duì)芘降解特性的比較
1、菌懸液的制備從JM109和JM413的保存斜面上各挑取一環(huán)菌體分別加入到10ml LB培養(yǎng)液中，在37℃下200r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，分別將其全部轉(zhuǎn)接入90ml新鮮的LB培養(yǎng)液中，37℃下200r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)約24h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A600約為2.0時(shí)(每mL菌液菌落數(shù)約8.0×108)，4000rpm離心10min，4℃，冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.降解實(shí)驗(yàn)移取200μL的芘-丙酮溶液(1g·L-1)至100ml錐形瓶中，向其中加入36mL滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液，在無(wú)菌條件下分別加入JM109和JM413菌懸液4mL，最終芘濃度為5mg·L-1，37℃200r·min-1振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)定溶液中芘的濃度。
3.芘含量的測(cè)定(1)取培養(yǎng)到一定時(shí)間的菌降解液，在超凈工作臺(tái)上將其全部轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，4800rpm離心10min，上清液加入20mL乙酸乙酯，沉淀加入10mL乙酸乙酯，室溫振蕩提取0.5h。
(2)將乙酸乙酯和上清液全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，劇烈混合，靜置10min，待分層后，收集乙酸乙酯層(上層)，向水相中再加入10mL乙酸乙酯，重復(fù)上述提取步驟3次，收集乙酸乙酯層，定容至100mL。
(3)將沉淀用乙酸乙酯提取，4800rpm離心10min。將乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，反復(fù)提取三次。最后合并提取液乙酸乙酯定容至50mL。
(4)將乙酸乙酯提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，用色譜級(jí)甲醇定容至10mL，用液相色譜專用膜過(guò)濾(0.45μm)，高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)定芘的濃度。
(5)高壓液相色譜法Waters1525型高壓液相色譜儀，Waters 2475MultiλFluorescence Detector(熒光檢測(cè)器)，Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱(5μm，3.9×150mm)，流動(dòng)相為乙腈/H2O(v∶v＝80∶20)，流速為1mL·min-1；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為333nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為390nm，靈敏度為2.0，進(jìn)樣量為20μl，室溫下測(cè)定，外標(biāo)法定量。檢出限為0.5μg·L-1。
4.測(cè)定結(jié)果(表1-2，圖1-2，圖1-3)表1-2芘降解試驗(yàn)結(jié)果




圖1-1是氧化酶活性對(duì)比1-2是JM413降解芘的曲線1-3是JM109與JM413降解量對(duì)比圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(一)總RNA的提取1)將白腐真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌體50mg加入500μL變性溶液和3.6μL β-巰基乙醇，混勻，用勻漿棒冰浴勻漿。
2).立即加入100μL醋酸鈉(2mol/L，pH4.0)，200μL水飽和酚和200μL氯仿/異戊醇(24∶1)。加入每種組分后，蓋上離心管蓋，輕輕振搖充分混勻，冰浴15min。
3).在4℃下10000rpm離心10min，將含RNA的水相移入一新的離心管中。
4).加入與提取液等體積的異丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。在4℃下15000rpm離心15min5).輕輕倒出異丙醇，加入100μl溶解RNA顆粒，并加入等體積異丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。
6).于4℃下15000rpm離心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重復(fù)洗滌沉離心2次。吸出殘存的乙醇，并打開(kāi)蓋子倒置幾分鐘，控干乙醇。
7).加100μLDEPC處理過(guò)的水溶解沉淀，將總RNA溶液貯存于-70℃。(實(shí)驗(yàn)中所有離心管取樣器都要用DEPC處理)。
(二)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增(RT-PCR)為防止RNA被污染，反應(yīng)皆在無(wú)菌條件下操作1).取5支PCR專用0.5mL薄壁離心管(2支樣品，3支對(duì)照)置于冰上，加入2*RT-PCR緩沖溶液25μL
模板RNA(總RNA) 終濃度10pg-1ug引物A1μL引物B1μLRT/Taq Mix 1μL無(wú)菌雙蒸水 補(bǔ)足至50μL陰性對(duì)照對(duì)照1不加模板RNA對(duì)照2不加反轉(zhuǎn)錄酶用2U Taq替代RT/Taq Mix對(duì)照3不加引物2).輕輕混勻，(瞬間離心，確保所有組分在管底)，上覆液體石蠟約50μl。
3).RT-PCR步驟與條件

(三)載體puc18DNA與cDNA的酶切與連接1).酶切(1)cDNA酶切BamH I 0.8μLEcoR I 0.8μLBuffer K2.0μLcDNA大約1.0μL(終濃度為0.1μg·μL-1)無(wú)菌雙蒸水H2O 補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μL無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL。
(2)載體puc18DNA的酶切BamH I 0.8μLEcoR I 0.8μLBuffer K 2.0μLpUC18DNA 大約1.0μL(終濃度為0.1μg·μL-1)
ddH2O 補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μl無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL，-20℃保存。
2)cDNA與pUC18DNA的連接目的DNA 3.0μL載體DNA 1.0μLT4連接酶1.0μL10*Buffer1.0μL無(wú)菌雙蒸水 補(bǔ)足至10.0μL恒溫16℃，過(guò)夜，-20℃保存。
(四)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液體培養(yǎng)液中，37℃振搖過(guò)夜，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入25mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至A600約為0.3～0.4，取1.5mL培養(yǎng)液于4℃下5000rpm離心10min，棄去上清，倒置控干。
2)加入0.5mL 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，冰浴10min，于4℃下10000rpm離心10min，棄去上清。
3).再向菌體中加入1ml 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，混合均勻，分裝成100μL/管，-20℃保存。
4).取cDNA與pUC18DNA的連接液5μL加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后，42℃熱激90s，取出后立即冰浴1～2min。
5).向其中加入800μL含氨芐青霉素(0.1％)的LB培養(yǎng)液，37℃70r·min-1恒溫培養(yǎng)45min，4℃，10000rpm離心10min，棄去部分上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (五)用X-gal和IPTG篩選陽(yáng)性重組子菌落——藍(lán)白斑篩選1).在含有氨芐青霉素的預(yù)制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。
2).用一個(gè)滅菌的涂布器將X-gal和IPTG溶液涂布均勻，使之均勻分散于培養(yǎng)基表面。37℃放置0.5h至培養(yǎng)基表面無(wú)液體。
3).接種100μL(四)制備的轉(zhuǎn)化菌懸液，用無(wú)菌涂布器涂布均勻，待接種液完全吸收后，倒置培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
4).取出培養(yǎng)板于4℃放置0.5～1h，使菌落顯色充分。
5).篩選出白色的菌落，即為基因工程菌，命名為JM413。
實(shí)施例二(一)總RNA的提取1)將白腐真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌體100mg500μL變性溶液和3.6μL β-巰基乙醇，混勻，用勻漿棒冰浴勻漿。
2).立即加入100μL醋酸鈉(2mol/L，pH4.0)，200μL水飽和酚和200μL氯仿/異戊醇(24∶1)。加入每種組分后，蓋上離心管蓋，輕輕振搖充分混勻，冰浴15min。
3).在4℃下10000rpm離心10min，將含RNA的水相移入一新的離心管中。
4).加入與提取液等體積的異丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。在4℃下15000rpm離心15min5).輕輕倒出異丙醇，加入100μl溶解RNA顆粒，并加入等體積異丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。
6).于4℃下15000rpm離心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重復(fù)洗滌沉離心2次。吸出殘存的乙醇，并打開(kāi)蓋子倒置幾分鐘，控干乙醇。
7).加100μLDEPC處理過(guò)的水溶解沉淀，將總RNA溶液貯存于-70℃。(實(shí)驗(yàn)中所有離心管取樣器都要用DEPC處理)。
(二)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增(RT-PCR)為防止RNA被污染，反應(yīng)皆在無(wú)菌條件下操作1).取5支PCR專用0.5mL薄壁離心管(2支樣品，3支對(duì)照)置于冰上，加入2*RT-PCR緩沖溶液 25μL模板RNA(總RNA) 終濃度10pg～1ug引物A 2μL引物B 2μLRT/Taq Mix 2μL無(wú)菌雙蒸水 補(bǔ)足至50μL陰性對(duì)照對(duì)照1不加模板RNA對(duì)照2不加反轉(zhuǎn)錄酶用2U Taq替代RT/Taq Mix對(duì)照3不加引物2).輕輕混勻，(瞬間離心，確保所有組分在管底)，上覆液體石蠟約50μl。
3).RT-PCR步驟與條件

(三)載體puc18DNA與cDNA的酶切與連接1).酶切(1)cDNA酶切BamH I 0.8μLEcoR I 0.8μLBuffer K 2.0μLcDNA 大約1.0μL(終濃度為0.1μg·μL-1)無(wú)菌雙蒸水H2O 補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μL無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL。
(2)載體puc18DNA的酶切BamH I 0.8μLEcoR I 0.8μLBuffer K 2.0μLpUC18 DNA大約1.0μL(終濃度為0.1μg·μL-1)ddH2O 補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μl無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL，-20℃保存。
2)cDNA與pUC18DNA的連接目的DNA3.0μL載體DNA1.0μLT4連接酶 1.0μL10*Buffer 1.0μL無(wú)菌雙蒸水 補(bǔ)足至10.0μL
恒溫16℃，過(guò)夜，-20℃保存。
(四)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液體培養(yǎng)液中，37℃振搖過(guò)夜，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入25mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至A600約為0.3～0.4，取1.5mL培養(yǎng)液于4℃下5000rpm離心10min，棄去上清，倒置控干。
2)加入0.5mL 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，冰浴10min，于4℃下10000rpm離心10min，棄去上清。
3).再向菌體中加入1ml 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，混合均勻，分裝成100μL/管，-20℃保存。
4)cDNA與pUC18DNA的連接液5μL加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后，42℃熱激90s，取出后立即冰浴1～2min。
5)其中加入800μL含氨芐青霉素(0.1％)的LB培養(yǎng)液，37℃70r·min-1恒溫培養(yǎng)45min，4℃，10000rpm離心10min，棄去部分上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (五)用X-gal和IPTG篩選陽(yáng)性重組子菌落——藍(lán)白斑篩選1).在含有氨芐青霉素的預(yù)制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。
2).用一個(gè)滅菌的涂布器將X-gal和IPTG溶液涂布均勻，使之均勻分散于培養(yǎng)基表面。37℃放置0.5h至培養(yǎng)基表面無(wú)液體。
3).接種100μL(四)制備的轉(zhuǎn)化菌懸液，用無(wú)菌涂布器涂布均勻，待接種液完全吸收后，倒置培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
4)將培養(yǎng)板于4℃放置0.5～1h，使菌落顯色充分。
5).篩選出白色的菌落，即為基因工程菌，命名為JM413。
實(shí)施例三(一)總RNA的提取1)將白腐真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌體80mg500μL變性溶液和3.6μL β-巰基乙醇，混勻，用勻漿棒冰浴勻漿。
2).立即加入100μL醋酸鈉(2mol/L，pH4.0)，200μL水飽和酚和200μL氯仿/異戊醇(24∶1)。加入每種組分后，蓋上離心管蓋，輕輕振搖充分混勻，冰浴15min。
3).在4℃下10000rpm離心10min，將含RNA的水相移入一新的離心管中。
4).加入與提取液等體積的異丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。在4℃下15000rpm離心15min5).輕輕倒出異丙醇，加入100μl溶解RNA顆粒，并加入等體積異丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間。
6).于4℃下15000rpm離心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重復(fù)洗滌沉離心2次。吸出殘存的乙醇，并打開(kāi)蓋子倒置幾分鐘，控干乙醇。
7).加100μLDEPC處理過(guò)的水溶解沉淀，將總RNA溶液貯存于-70℃。(實(shí)驗(yàn)中所有離心管取樣器都要用DEPC處理)。
(二)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增(RT-PCR)為防止RNA被污染，反應(yīng)皆在無(wú)菌條件下操作1).取5支PCR專用0.5mL薄壁離心管(2支樣品，3支對(duì)照)置于冰上，加入2*RT-PCR緩沖溶液 25μL模板RNA(總RNA)終濃度10pg～1ug引物A 2μL引物B 2μLRT/Taq Mix2μL無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL陰性對(duì)照對(duì)照1不加模板RNA對(duì)照2不加反轉(zhuǎn)錄酶用2U Taq替代RT/Taq Mix對(duì)照3不加引物2).輕輕混勻，(瞬間離心，確保所有組分在管底)，上覆液體石蠟約50μl。
3).RT-PCR步驟與條件

(三)載體puc18DNA與cDNA的酶切與連接1).酶切(1)cDNA酶切BamH I 0.8μL
EcoR I0.8μLBuffer K 2.0μLcDNA 大約1.0μL(終濃度為0.1μg·μL-1)無(wú)菌雙蒸水H2O補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μL無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL。
(2)載體puc18DNA的酶切BamH I 0.8μLEcoR I 0.8μLBuffer K 2.0μLpUC18 DNA大約1.0μl(終濃度為0.1μg·μL-1)ddH2O 補(bǔ)足至20μL37℃恒溫水浴1h，加入50μl無(wú)水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm離心10min，棄去上清液，倒置20min，加入無(wú)菌雙蒸水10μL，-20℃保存。
2)cDNA與pUC18DNA的連接目的DNA3.0μL載體DNA1.0μLT4連接酶 1.0μL10*Buffer 1.0μL無(wú)菌雙蒸水 補(bǔ)足至10.0μL恒溫16℃，過(guò)夜，-20℃保存。
(四)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液體培養(yǎng)液中，37℃振搖過(guò)夜，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入25mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至A600約為0.3～0.4，取1.5mL培養(yǎng)液于4℃下5000rpm離心10min，棄去上清，倒置控干。
2)加入0.5mL 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，冰浴10min，于4℃下10000rpm離心10min，棄去上清。
3).再向菌體中加入1ml 0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2，混合均勻，分裝成100μL/管，-20℃保存。
4)cDNA與pUC18DNA的連接液5μL加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后，42℃熱激90s，取出后立即冰浴1～2min。
5)向其中加入800μL含氨芐青霉素(0.1％)的LB培養(yǎng)液，37℃70r·min-1恒溫培養(yǎng)45min，4℃，10000rpm離心10min，棄去部分上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (五)用X-gal和IPTG篩選陽(yáng)性重組子菌落——藍(lán)白斑篩選1).在含有氨芐青霉素的預(yù)制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。
2).用一個(gè)滅菌的涂布器將X-gal和IPTG溶液涂布均勻，使之均勻分散于培養(yǎng)基表面。37℃放置0.5h至培養(yǎng)基表面無(wú)液體。
3).接種100μL(四)制備的轉(zhuǎn)化菌懸液，用無(wú)菌涂布器涂布均勻，待接種液完全吸收后，倒置培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
4)將培養(yǎng)板于4℃放置0.5～1h，使菌落顯色充分。
5)篩選出白色的菌落，即為基因工程菌，命名為JM413。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開(kāi)大學(xué)<120>高效降解芘基因工程菌及其構(gòu)建<130>20050720<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>JM413<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(29)<223>
<400>1atggaattca tggtgactac ttttacgag29<210>2<211>22<212>DNA<213>JM413<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>
<400>2atgggatccg gattgcttct gc 2權(quán)利要求
1.一種高效降解芘基因工程菌，其特征在于，它是將白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1基因，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增反應(yīng)得到pc-1的cDNA，再將cDNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中，構(gòu)建成功能高效降解多環(huán)芳烴的基因工程菌，命名為JM413。
2.一種高效降解芘基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下述步驟1)引物設(shè)計(jì) 根據(jù)白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc-1的基因序列，選取其上下游保守序列設(shè)計(jì)上下游引物A和B，并在各引物的一端分別加上EcoRI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列。引物A和B的核苷酸序列如下，下劃線部分為EcoRI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列；引物A5’-ATGGAA TTCATG GTG ACT ACT TTT ACG AG-3’引物B5’-ATGGGA TCCGGA TTG CTT CTG C-3’2)提取總RNA自白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞提取總RNA；3)逆轉(zhuǎn)錄-DNA擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)采用一步RT-PCR的方法，由總RNA開(kāi)始逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增出單加氧酶基因pc-1的cDNA；4)重組質(zhì)粒 將載體pUC18與單加氧酶pc-1的cDNA在連接酶的作用下雜交為一個(gè)新的質(zhì)粒；5)轉(zhuǎn)化 將雜交的新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中；6)篩選和鑒別 經(jīng)進(jìn)一步的篩選和鑒別確認(rèn)單加氧酶pc-1的cDNA基因轉(zhuǎn)化進(jìn)了大腸桿菌JM109中，命名為JM413。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物修復(fù)或生態(tài)恢復(fù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種降解芘基因工程菌及其構(gòu)建。本發(fā)明的高效降解芘基因工程菌是將白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的細(xì)胞色素P450單加氧酶pc－1基因，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄－DNA擴(kuò)增反應(yīng)得到pc－1的cDNA，再將cDNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109中，構(gòu)建成功能高效降解多環(huán)芳烴的基因工程菌，命名為JM413。構(gòu)建的基因工程菌JM413，因具有氨芐青霉素抗性基因和單加氧酶基因，所以，適應(yīng)性強(qiáng)，容易擴(kuò)大培養(yǎng)，而且安全性高，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成任何不良影響，因此，可以廣泛應(yīng)用于生物修復(fù)和生態(tài)恢復(fù)工程，降解難降解有機(jī)物，促進(jìn)生態(tài)恢復(fù)，保持生態(tài)平衡。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1746293SQ20051001458
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者張清敏, 侯樹宇, 多淼, 韓津 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)