專利名稱：從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交總rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種從動物脂肪組織中提取總RNA的方法，特別是一種涉及到提取動 物脂肪組織中總RNA樣品用于基因芯片研究的方法。
背景技術(shù)：
脂肪組織不僅是機(jī)體的能量儲存庫，還是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官。動物脂肪組織 在生后初期有細(xì)胞數(shù)量的增生，但仍以細(xì)胞體積的增大為主，特別是在后期或成年期極易 在體內(nèi)貯積。脂肪代謝包括脂肪動員(脂肪降解)、體內(nèi)運轉(zhuǎn)和脂肪貯存(脂肪合成)。動 物體脂的沉積量是脂肪合成代謝和分解代謝的一種平衡狀態(tài)。當(dāng)合成代謝增強(qiáng)，或分解代 謝降低時，會打破原有的平衡而導(dǎo)致脂肪沉積量的增加。當(dāng)脂肪分解多于合成時，則體內(nèi)脂 肪減少。深入了解脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制，將有助于控制動物脂肪的沉積量和提高胴體品質(zhì)。 為了尋找調(diào)控指脂肪沉積的關(guān)鍵新基因，將采用基因芯片、生物信息學(xué)分析、等現(xiàn)代分子生 物學(xué)技術(shù)篩選一批與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的差異表達(dá)新基因，而其首要任務(wù)則為高質(zhì)量、高 純度RNA的提取。目前RNA的提取技術(shù)已非常成熟，也有大量利用各種方法和商業(yè)化試劑成功提取 高質(zhì)量RNA的文獻(xiàn)報道，盡管這些方法和試劑具有諸多優(yōu)點，如方法簡單、提取的RNA質(zhì)量 高等，但當(dāng)遇到組織RNA的豐度極低，且RNA產(chǎn)品中常伴有基因組DNA污染等問題時，按照 常規(guī)步驟操作往往不能取得理想的結(jié)果；由于組織的特異性，脂肪組組織富含脂類物質(zhì)，單 位體積細(xì)胞數(shù)較少，成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)含有各種細(xì)胞器、細(xì)胞核以及與其他類型細(xì)胞不同的 一個大的中央脂滴。且單位細(xì)胞RNA含量也相對較少，每毫克組織樣品所含總RNA的量小 于0. 05 μ g，因而所提RNA的得率較低，這增加了從脂肪組織提取RNA的難度。而且用于基 因芯片的脂肪組織中的RNA—般都是用試劑盒提取的，價格比較昂貴，試劑盒的購買都是 來自國外，購買起來也十分不方便。因此，擺脫試劑盒的束縛，尋求一種常規(guī)、經(jīng)濟(jì)和快捷的 方法提取動物脂肪組織中的總RNA以用于基因芯片研究，并且在實際操作中應(yīng)根據(jù)試驗的 需要選擇或改進(jìn)相應(yīng)的方法，以期達(dá)到預(yù)期的目的，顯得尤為迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種方便、快捷的從動物脂肪組織中提取用于基 因芯片雜交的總RNA的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜 交的總RNA的方法，包括以下步驟1)、組織研磨和Trizol裂解選擇以下任意一種方式取0. 4 0. 6g液氮速凍脂肪，于液氮條件下研磨成組織粉末，然后將組織粉末用 5ml Trizol進(jìn)行充分裂解，得裂解組織；取Ig的脂肪，于液氮條件下進(jìn)行研磨；然后加入9 Ilml的Trizol進(jìn)行裂解，得裂解組織；2)、氯仿抽提在裂解組織中加入1. 8 2. 2ml氯仿進(jìn)行RNA提取，劇烈震蕩后于 4°C高速離心15min ；3)、氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿，氯仿與上清的體積比為 1 2 4;劇烈震蕩后于4°C高速離心15min;4)、異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相(位于上層)，加入與水相等體積的異丙 醇，均勻混合(輕柔上下顛倒5-6次)后，然后于冰上放置5分鐘，再4°C高速離心IOmin ；5)、總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質(zhì)量濃度75%的乙醇，將沉淀吹打 懸浮，于4°C高速離心8min ；質(zhì)量濃度75%的乙醇是步驟1)中Trizol體積的55 65% ；6)、總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內(nèi)進(jìn)行干燥，得總RNA沉淀； 再用RNase-free水溶解總RNA沉淀。作為本發(fā)明的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法的改進(jìn) 步驟2) 5)中的高速離心的速度為15300Xg。作為本發(fā)明的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法的改進(jìn) 步驟1) 步驟6)在無RNA酶污染狀態(tài)下進(jìn)行。且上述所有步驟連續(xù)無間隔的進(jìn)行；若因 突發(fā)事件無法繼續(xù)試驗，可暫將Trizol裂解后的組織液(即步驟1)所得的裂解組織)直 接保存于-80°C保存。在本發(fā)明中，步驟3)為必須的一個關(guān)鍵步驟。在本發(fā)明中，動物是是畜類，優(yōu)選豬。本發(fā)明方法的檢測結(jié)果表明所得總RNA樣品完全滿足RT-PCR、構(gòu)建cDNA文庫， 制基因芯片等相關(guān)實驗的要求，為進(jìn)一步從分子水平研究豬脂肪沉積及其代謝特性提供方 法上的參考依據(jù)。本發(fā)明具有如下有益效果1.通過此方法提取的總RNA，質(zhì)量高，Ig脂肪組織中約可提出120 μ g總RNA，濃度 達(dá)1 μ g/μ 1，可以完全滿足并可直接用于后續(xù)研究基因芯片雜交用。2.本方法操作簡單，所用試劑經(jīng)濟(jì)實惠，方法簡單易行。3、本方法相對于昂貴的試劑盒提取總RNA用于基因芯片實驗，成本低。


結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明圖1是本發(fā)明的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解結(jié)果；圖 2 是 Agilent 2100bioanalyzer 檢測 RNA 的完整性結(jié)果。
具體實施例方式實施例1、一種從豬皮下脂肪中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，依次進(jìn)行 以下步驟，下述步驟1) 步驟6)均在無RNA酶污染的狀態(tài)下進(jìn)行1)、組織研磨和Trizol裂解將豬皮下脂肪組織切取IOOmg左右放入研缽，在液氮環(huán)境中研成粉末，裝入1. 5ml 的印pendorf管，再加入Iml的Trizol劇烈搖晃約5min ；使其充分裂解，得裂解組織；
2)、氯仿抽提在步驟1)所得的裂解組織中加入200 μ 1氯仿進(jìn)行RNA提取，劇烈振蕩3分鐘待 其充分混合后，于室溫放置5min，再于4°C，15300rmp離心15min ；離心后可見明顯分層，吸 取上層清澈液體(即上清，約600 μ 1)；3)、氯仿再次抽提在步驟2)所得的上清中加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩片刻(約3分鐘)后，于室溫 放置5min，于4°C，15300rmp離心15min，離心后可見明顯分層，吸取上層清澈液體(作為水 相，約 500 μ 1)；4)、異丙醇沉淀在步驟3)所得的水相中加入等體積的異丙醇輕輕混勻(輕柔上下顛倒5-6次)， 然后于冰上放置5分鐘，再于4°C，15300rmp離心IOmin ；5)、總 RNA 洗滌棄步驟4)所得的上清，在步驟4)所得的沉淀中加入質(zhì)量濃度75%乙醇(經(jīng)DEPC 處理，無RNA酶)0. 6ml，振蕩混勻后，4°C，15300rmp離心8min ；6)、總 RNA 溶解棄步驟5)所得的上清，將步驟5)所得的沉淀用濾紙吸干殘余液體，置超凈臺面自 然風(fēng)干(約20min左右)；加入20 30 μ 1 RNase-free水溶解。實施例2、提取的總RNA濃度測定和以期用于基因芯片雜交的質(zhì)量檢測(以實施例 1所得的溶液作為樣品)l)nanodrop-1000spectrophotometry 測定樣品在 260、280 及 230nm 的光密度及 RNA濃度，并計算RNA的純度。2)電泳檢測① RNA 變性取 RNase-free 1. 5ml 離心管，加入 1. 5 μ L RNA, 5. 5 μ L RNA變性緩沖液，65°C變性20min，稍離心，加入1. 5μ L 6 X loading buffer (RNA專用)。②瓊脂糖凝膠電泳配制2%的瓊脂糖凝膠，100V恒壓，IOmin電泳。③RNA電泳 圖拍照及分析。3) RNA完整性分析Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA的完整性，并對RNA質(zhì)量 進(jìn)行評分。總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進(jìn)行檢測，所獲 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.60-1. 90之間。RNA濃度在eOO-lOOOng/yL之間。所獲得的濃度及產(chǎn)量完全滿足基因芯 片雜交的要求。因此，可推算得知實施例1所得的總RNA為12 20 μ g。通過電泳結(jié)果檢測，發(fā)現(xiàn)RNA基本沒有降解，電泳條帶清晰無拖尾現(xiàn)象，且純度 高、完整性好。進(jìn)一步RNA完整性檢測結(jié)果顯示，RNA完整性好，總RNA質(zhì)量評分均在8. 0以上， 完全可滿足并可直接用于基因芯片雜交的要求。上述樣品耗費不超過10元，大大節(jié)約了成 本。對比例1、將同實施例1的IOOmg左右的豬皮下脂肪組織按照目前常規(guī)的Trizol/ 氯仿一次性12000 Xg離心提取法提取RNA，結(jié)果如下總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進(jìn)行檢測，所獲得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.00-1. 30之間。所提取的RNA量小于2 μ g。所得產(chǎn)物不適宜直接用于芯片雜交。
通過電泳結(jié)果檢測，發(fā)現(xiàn)RNA基本沒有降解，電泳條帶較為清晰無拖尾現(xiàn)象，純度
一般，完整性一般。 進(jìn)一步RNA完整性檢測結(jié)果顯示，RNA完整性一般，總RNA質(zhì)量評分均在7. 0-8. 0 之間，不可直接用于基因芯片雜交的要求。對比例2、將同實施例1的IOOmg左右的豬皮下脂肪組織按照Qiagen公司生產(chǎn)的 RNeasyLipid Tissue Mini Kit試劑盒進(jìn)行提取RNA (3580元/kit)，每個樣品制備至少需 要70元，結(jié)果如下總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進(jìn)行檢測，所獲 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1. 70-2. 00之間。約500mg的脂肪組織樣品提取的RNA量約在12-25 μ g左右。所得產(chǎn)物可 直接用于芯片雜交。通過電泳結(jié)果檢測，發(fā)現(xiàn)RNA完全沒有降解，電泳條帶清晰無拖尾現(xiàn)象，純度高、 完整性好。進(jìn)一步RNA完整性檢測結(jié)果顯示，RNA完整性好，總RNA質(zhì)量評分均在8. 5-9. 5之 間，并完全滿足且可直接用于基因芯片雜交的要求。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，其特征是包括以下步驟1)、組織研磨和Trizol裂解選擇以下任意一種方式取0.4～0.6g液氮速凍脂肪，于液氮條件下研磨成組織粉末，然后將組織粉末用5ml Trizol進(jìn)行充分裂解，得裂解組織；取1g的脂肪，于液氮條件下進(jìn)行研磨；然后加入9～11ml的Trizol進(jìn)行裂解，得裂解組織；2)、氯仿抽提在裂解組織中加入1.8～2.2ml氯仿進(jìn)行RNA提取，震蕩后于4℃高速離心15min；3)、氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿，氯仿與上清的體積比為1∶2～4；震蕩后于4℃高速離心15min；4)、異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相，加入與水相等體積的異丙醇，均勻混合后，然后于冰上放置5分鐘，再4℃高速離心10min；5)、總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質(zhì)量濃度75％的乙醇，將沉淀吹打懸浮，于4℃高速離心8min；所述質(zhì)量濃度75％的乙醇是步驟1)中Trizol體積的55～65％；6)、總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內(nèi)進(jìn)行干燥，得總RNA沉淀；再用RNase free水溶解總RNA沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法， 其特征是所述步驟2) 5)中的高速離心的速度為15300X g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法， 其特征是所述步驟1) 步驟6)在無RNA酶污染狀態(tài)下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，包括以下步驟1)組織研磨和Trizol裂解；2)氯仿抽提在裂解組織中加入氯仿進(jìn)行RNA提??；3)氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿抽提；4)異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相，加入與水相等體積的異丙醇，均勻混合；5)總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質(zhì)量濃度75％的乙醇，將沉淀吹打懸浮；6)總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內(nèi)進(jìn)行干燥，得總RNA沉淀；再用RNase-free水溶解總RNA沉淀。采用該方法提取用于基因芯片雜交的總RNA具有方便、快捷的特點。
文檔編號C12N15/10GK101984054SQ20101055178
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者伍婷, 汪以真, 袁章琴 申請人:浙江大學(xué)