專利名稱:一種高效表達(dá)人血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域;更具體地,本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人血清 白蛋白的方法。
背景技術(shù):
人血清白蛋白是血漿中的主要蛋白成分,由585個氨基酸組成,分子量為66kD。人 血清白蛋白在血液中主要作用是維持正常滲透壓,與鈣離子、脂肪酸、氨基酸、膽紅素和各 種藥物相結(jié)合,并起到轉(zhuǎn)運載體的作用。臨床上人血清白蛋白常用于外科手術(shù)、出血性休 克、燙傷、腎病綜合征導(dǎo)致的白蛋白缺乏癥、腫瘤肝腹水等疾病的治療。一直以來,人血清白蛋白是從人血液中純化得到的。由于血源匱乏和病毒(肝炎、 AIDS)污染等原因,基因重組人血清白蛋白在近十年中得到了國內(nèi)外大型制藥公司的重視。 近年來,采用基因重組的方法,已經(jīng)在酵母菌(USP5,330, 901、JPl 1-509525、JP6-100592)、 大腸桿菌(Lawn, R. Μ. Constructionof DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particularhuman serum albumin "European Patent App 1. ”(1983)73邛646)、轉(zhuǎn)基因牛奶(109602573六1 SEPARATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN) 中表達(dá)人血清白蛋白。盡管現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)在酵母等菌株中成功表達(dá)過人血清白蛋白,然而表達(dá)的效率 以及表達(dá)的規(guī)模仍然不夠理想。一般情況下,除了使用強(qiáng)啟動子來提高目的蛋白的表達(dá)水 平外,研究人員還經(jīng)常使用一些其它方法,最常用的方法是提高插入到酵母基因組的目的 蛋白表達(dá)盒拷貝數(shù),此法可以提高表達(dá)量。但是這個策略也有局限,提高拷貝數(shù)不一定必然 伴隨著目的蛋白表達(dá)量的增高。即使有所增高,也不呈現(xiàn)著和表達(dá)盒的拷貝數(shù)成正相關(guān)的 狀況。蛋白表達(dá)量受很多因素的制約,有轉(zhuǎn)錄階段的調(diào)控,翻譯階段的制約,以及翻譯后的 蛋白修飾等,因此特定的蛋白,需要找到合適的策略并結(jié)合大量的研究試驗工作來優(yōu)化表 達(dá)。綜上,本領(lǐng)域還有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究,以提高人血清白蛋白的表達(dá)效率,使得 人血清白蛋白真正實現(xiàn)高效地大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效表達(dá)人血清白蛋白的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供用于高效表達(dá)人血清白蛋白的重組載體和基因工程 菌株。在本發(fā)明的第一方面,提供一種重組表達(dá)人血清白蛋白的方法,所述方法包括(1)提供一種重組酵母細(xì)胞,所述酵母細(xì)胞中同時包含有由AOXl啟動子驅(qū)動的 人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒;(2)培養(yǎng)(1)的重組酵母細(xì)胞,從而表達(dá)人血清白蛋白。 在一個優(yōu)選例中,所述的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒分別位于表達(dá)載體中。在另一優(yōu)選例中,所述的表達(dá)載體是pGAPZ α表達(dá)載體或pPIC9K表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中,所述的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒位于pPIC9K 表達(dá)載體中,所述的由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒位于pGAPZ α表達(dá)載體中。在另一優(yōu)選例中,先將含有AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的PPIC9K表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞,得到重組酵母細(xì)胞1 ;之后將含有GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表 達(dá)盒的pGAPZa表達(dá)載體轉(zhuǎn)染重組酵母細(xì)胞1,得到(1)所述的重組酵母細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的人血清白蛋白的表達(dá)盒中,從5’至3’依次包括啟動子 序列,SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列(部分酵母α信號肽3’端的編碼序列),白蛋白成 熟肽編碼序列,翻譯終止子序列,這些序列操作性相連。在另一優(yōu)選例中,在啟動子序列之前以及翻譯終止子序列之后,還包括多克隆位 點(酶切位點)。在另一優(yōu)選例中,所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的畢赤酵母細(xì)胞是GS115亞型。在另一優(yōu)選例中,所述方法還包括步驟(3)分離(純化)所述的人血清白蛋白。在本發(fā)明的另一方面,提供一種重組表達(dá)載體的組合,所述組合中包括(a)含有由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的表達(dá)載體;和(b)含有由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面,提供一種重組酵母細(xì)胞,所述的重組酵母細(xì)胞中,包括由 AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒。在本發(fā)明的另一方面,提供所述的重組表達(dá)載體組合或所述的重組酵母細(xì)胞的用 途,用于重組表達(dá)人血清白蛋白。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
圖1 :pGAPZalpha-HSA載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 :pPIC9K-HSA載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3:兩種不同白蛋白表達(dá)克隆的發(fā)酵結(jié)果??寺≡诤视偷呐囵B(yǎng)基中生長24小 時,然后流加甲醇,發(fā)酵總時間為84小時。GAP和AOXl共同驅(qū)動的克隆表達(dá)量明顯高于 AOXl啟動子驅(qū)動的克隆。圖4 =SEC-HPLC檢測純化的重組HSA和人血清HSA。左圖為重組HSA,右圖為人血 清HSA。重組HSA的多聚體低于人血清HSA。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究,首次用兩個不同類型的啟動子在同一細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動表達(dá) 人血清白蛋白,大幅度地提高了蛋白表達(dá)的效率。如本文所用,所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)(域)”是指一種核酸序列,其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端),能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地,啟動子或 啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中,所述 的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體,其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域,進(jìn)行隨機(jī)或定點突 變等來獲得。如本文所用,所述的“操作性相連”,“可操作地連接”或“操作性連接”是指兩個 或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因 核酸序列的特定位置,使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo),從而,啟動子區(qū)域被 “可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用,所述的“表達(dá)盒”是指包含有表達(dá)目的蛋白 (本發(fā)明中為人血清白蛋白)所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng),通常其包括一下元件 啟動子、編碼蛋白的基因序列,終止子;此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等。這些元件 時操作性相連的。啟動子本發(fā)明所述的AOXl啟動子屬于AOX基因的啟動子,其是一種較多用于酵母表達(dá)的 啟動子。在商品化的PPIC9K表達(dá)載體中,攜帶有所述的AOXl啟動子。本發(fā)明的方法中,也 可使用突變后的AOXl啟動子,只要其保留了與野生型啟動子相同的功能。本發(fā)明所述的3-磷酸脫氫酶啟動子(glyceraldehide 3-phosphatedehydrogenase promoter,GAP)是一種結(jié)構(gòu)性表達(dá)啟動子。GAP啟動子的最大 特點是在細(xì)胞生長的階段就驅(qū)動重組蛋白的表達(dá)。因此不需要在培養(yǎng)中加入甲醇,在常規(guī) 的碳源如葡萄糖、甘油等非甲醇的碳源存在下目的蛋白就可以表達(dá)。這個體系更適用于大 規(guī)模生產(chǎn),因為不需要大量的甲醇。盡管以上兩種啟動子均是已知的啟動子,但本領(lǐng)域技術(shù)人員還沒有將它們有效結(jié) 合以提高蛋白表達(dá)效率的研究。蛋白的表達(dá)受很多因素調(diào)節(jié),包括轉(zhuǎn)錄,翻譯,翻譯后的修 飾,轉(zhuǎn)運等。轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是提高表達(dá)水平的一個重要環(huán)節(jié)。本發(fā)明通過找到合適的 啟動子組合,在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)了人血清白蛋白的高效表達(dá)。重組表達(dá)載體本發(fā)明構(gòu)建的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的 人血清白蛋白表達(dá)盒被轉(zhuǎn)染到同一酵母細(xì)胞中表達(dá)。在轉(zhuǎn)染時,所述的AOXl啟動子驅(qū)動的 人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒可分別由兩個表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染;或者,可選擇地,插入到同一表達(dá)載體中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP 啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒分別被插入到兩個表達(dá)載體中。較佳地,兩個表達(dá)載體 是pGAPZa表達(dá)載體或pPIC9K表達(dá)載體。更優(yōu)選地,所述的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清 白蛋白表達(dá)盒位于PPIC9K表達(dá)載體中,所述的由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒位 于pGAPZa表達(dá)載體中??上葘⒑蠥OXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的pPIC9K表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞;之后將含有GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的pGAPZ α表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染入所述重組酵母細(xì)胞。為了便于表達(dá)產(chǎn)物分泌胞外,所述的表達(dá)盒中還可帶有信號肽序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,本發(fā)明所述的人血清白蛋白的表達(dá)盒中,從5’至3’依次 包括啟動子序列,SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列(部分酵母α信號肽3’端的編碼序列),白蛋白成熟肽編碼序列,翻譯終止子序列,這些序列操作性相連。重組表達(dá)的細(xì)胞本發(fā)明用于重組表達(dá)人血清白蛋白的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。多種酵母細(xì)胞都可用于本 發(fā)明,所述的酵母例如畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、假絲酵母(Candida)或 球擬酵母(Torulopsis)等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。畢赤酵母菌體內(nèi)無天 然質(zhì)粒,所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組,將外源基因表達(dá)框架整合于染色體 中以實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。所述的外源基因表達(dá)框架包括啟動子、外源基因克隆位點、終止 序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合;由于畢赤酵 母可以以甲醇為唯一的碳源和能源,絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,因此在發(fā)酵過 程中可以減少雜菌的污染,而且大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵技術(shù)相對比較成熟。包括培養(yǎng)基、發(fā)酵方法 等已經(jīng)經(jīng)過詳盡研究,使得發(fā)酵的重現(xiàn)性和自動化程度都極為良好。白蛋白的表達(dá)中,發(fā)現(xiàn)兩拷貝的克隆表達(dá)量最高,而多拷貝的克隆表達(dá)量反而降 低。其原因有可能是同一系列內(nèi)的各種轉(zhuǎn)錄因子被分散于多拷貝啟動子內(nèi)而無法共同協(xié)調(diào) 發(fā)揮作用,使得目的蛋白的表達(dá)量反而降低。GAP啟動子所需的轉(zhuǎn)錄因子系列不同于AOXl 啟動子,在轉(zhuǎn)錄階段的調(diào)控不受AOXl啟動子所需的轉(zhuǎn)錄因子系列的制約,可以發(fā)揮可在的 作用使得白蛋白的表達(dá)獲得大幅度的提高。作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式,提供了一種人血清白蛋白(HSA)在畢赤氏酵 母(Pichia)中的重組表達(dá)方法。本發(fā)明的方法特征在于重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-HSA和 pGAPZa-HSA的構(gòu)建,本發(fā)明一個更重要的特征表現(xiàn)為在同一個宿主細(xì)胞內(nèi)同時轉(zhuǎn)染由 AOXl啟動子驅(qū)動的HSA表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的HSA表達(dá)盒。具體操作是宿主細(xì)胞 GS115第一次轉(zhuǎn)染用pPIC9K-HSA載體,以不含組氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一 步用測定白蛋白表達(dá)量的方法確認(rèn)轉(zhuǎn)染陽性克隆并選擇最佳克隆。緊接著白蛋白最佳表 達(dá)株在甲醇誘導(dǎo)時表達(dá)HSA最高的克隆作為第二次轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。第二次轉(zhuǎn)染系將帶 有結(jié)構(gòu)性表達(dá)的PGAPZ α -HSA載體轉(zhuǎn)染入含pPIC9K_HSA表達(dá)盒的宿主細(xì)胞內(nèi),使其同時 帶有pPIC9K-HSA表達(dá)盒和pGAPZ α -HSA表達(dá)盒。為了便于篩選,此時用含Zeocin培養(yǎng)基 進(jìn)行加壓篩選。最終獲得了一組表達(dá)白蛋白的克隆,其表達(dá)量明顯高于PGAPZ α-HSA或 PPIC9K-HSA單啟動子驅(qū)動的白蛋白表達(dá)克隆。細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白分離純化本發(fā)明的方法中,對于培養(yǎng)畢赤酵母的方法和培養(yǎng)基沒有特別的限制,可以采用 本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和培養(yǎng)基。在培養(yǎng)重組細(xì)胞分泌表達(dá)出人血清白蛋白后,還可包括步驟從培養(yǎng)產(chǎn)物(培養(yǎng) 基或發(fā)酵液)中分離白蛋白。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化維白蛋白可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的技術(shù)。例如可采用硫酸銨沉淀、DEAE-Si^pharose離子交換、凝膠過濾法純化,分子篩; 或采用親和層析法純化。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于表達(dá)量高采用本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),可獲得非常高的人血清白 蛋白表達(dá)量;
表達(dá)的蛋白接近天然采用本發(fā)明的方法表達(dá)、純化的重組人血清白蛋白在分子 量測定、N-端15個氨基酸序列、C-末端2個氨基酸序列、肽圖、CD等實驗中均與天然的人 血清白蛋白沒有區(qū)別;操作、培養(yǎng)簡單采用本發(fā)明的構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)和方法,在簡單合成培養(yǎng)基中可實 現(xiàn)高密度培養(yǎng);操作簡單、成本低廉。下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明所用材料及其來源Klenow片段多聚酶和所有使用的內(nèi)切酶均為NEB公司產(chǎn)品。pPIC9K、pGAPZ α 、Pichia pastoris GSl 1 5(his4 Mut + )為 Invitrogen ^w]
Φ 口
廣 BFI οTrizol RNA 抽提試劑盒購自 Promega 公司,YNB (ff/0 amino acid)購自 DIFCO 公司。DNA序列測定、DNA合成為英俊公司。實施例方法簡述以下實施例提供一種具有2種不同的啟動子驅(qū)動的高表達(dá)人血清白蛋白的巴斯 德畢赤酵母重組細(xì)胞的構(gòu)建的方法。在一個宿主細(xì)胞內(nèi)同時轉(zhuǎn)染由AOXl啟動子驅(qū)動的HSA表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū) 動的HSA表達(dá)盒,最終獲得了 一組表達(dá)人血清白蛋白的克隆。由人血清白蛋白的CDNA5 ’端帶有部分酵母α信號肽3 ’端的編碼序列CTCGAG AAG AGA緊接著是白蛋白成熟肽的序列,在DNA的3’端添加了翻譯終止信號和EcoRI的序列,該 DNA插入到PUC18載體中,定名為PUC18-HSA。將PUC18-HSA克隆載體中帶有部分α信號肽序列的HSA基因片段用XhoI和EcoRI 雙酶切下,瓊脂糖電泳分離,回收DNA片段。將約2Kb的帶有編碼末端的-HSA基因回收 片段與用相同酶切的PGAPZ α表達(dá)載體或pPIC9K連接,轉(zhuǎn)化E.C0li TGI感受態(tài)細(xì)胞,分別 以含有Zeocin或Kanamycin LB瓊脂板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得 質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切。得到重組質(zhì)粒pGAPZ α -HSA或pPIC9K_HSA。上述兩個重組載體在轉(zhuǎn)染中,各取2個經(jīng)Xhol和EcoRI雙酶切初步鑒定的重組克 隆,分另O用 5’ AOXl primer 禾Π 3’ AOXl primer 或 pGAP forward primer 禾Π 3’ AOXl primer 測定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列。先將pPIC9K-HSA載體轉(zhuǎn)染到畢赤酵母中,后將pGAPZ α -HSA載體轉(zhuǎn)染pPIC9K_HSA 陽性克隆中,獲得pGAPZ α -HSA載體轉(zhuǎn)染pPIC9K_HSA陽性克隆,挑選一定量陽性克隆進(jìn)行 白蛋白表達(dá)實驗,篩選獲得高表達(dá)人血清白蛋白的畢赤酵母細(xì)胞株。
所述方法詳述如下 實施例1、人血清白蛋白cDNA的獲得按照PUBMED公布的人血清白蛋白mRNA序列(GenBank登錄號AY728024),合成 cDNA。合成的cDNA 5,端帶有部分酵母α信號肽3,端的編碼序列CTC GAG AAG AGA(SEQ ID NO :3),緊接著是白蛋白成熟肽(SEQ ID NO 2)的編碼序列(SEQ ID NO :1),在DNA的 3’端添加了翻譯終止信號TAA和EcoRI酶切位點的序列GAATTC,該DNA插入到PUC18載體 (購自 New England Biolabs)中,定名為 PUC18-HSA。實施例2、重組表汰質(zhì)粒pGAPZ α -HSA和pPIC9K_HSA的構(gòu)建將PUC18-HSA克隆載體中帶有部分α信號肽序列的HSA基因片段用XhoI和EcoRI 雙酶切下,瓊脂糖電泳分離,回收DNA片段。將約2Kb的帶有編碼末端的HSA基因回收片 段與用相同酶切的PGAPZ α表達(dá)載體(購自Invitrogen,自帶GAP啟動子)或pPIC9K (購 自 Invitrogen,自帶 AOXl 啟動子)連接,轉(zhuǎn)化 E. coliTGI (購自 New England Biolabs)感 受態(tài)細(xì)胞,分別以含有Zeocin或Kanamycin LB瓊脂板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備 質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切。鑒定出重組質(zhì)粒pGAPZa -HSA或pPIC9K-HSA。上述兩個重組載體的轉(zhuǎn)染中,各取2 個經(jīng)Xhol和EcoRI雙酶切初步鑒定的重組克隆,分別用5,A0X1 primer和3,A0X1 primer 或pGAP forward primer和3’A0X1 primer測定重組質(zhì)粒HSAcDNA兩端序列。測序結(jié)果顯 示4個克隆序列正確,均含完全正確的閱讀框。引物序列分別如下5,AOXl primer(SEQ ID NO 4)5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ ;3,AOXl primer(SEQ ID NO 5)5, -CAAATGGCATTCTGACATCC-3,;pGAP forward primer(SEQ ID NO 6)
5,-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3,。實施例3、HSA在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達(dá)(l)pPIC9K-HSA 載體轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)取一個含pPIC9K-HAS載體的大腸桿菌克隆,在含Kanamycin的LB培養(yǎng)基中生長 過夜。第二天,離心收集菌體,采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化的PPIC9K-HSA載體 DNA20微克,用SalI酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20 微升純水中。GS115菌株(購自Invitrogen)在5毫升YPD中生長過夜,取其中0.5毫升加 到500毫升新鮮YPD培養(yǎng)基中生長過夜,直至培養(yǎng)液的0D_在1. 3-1. 5之間,離心去上清。 細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純水,混合物離心去上清。沉淀加250毫升無菌冰純水重懸后 再離心去上清,沉淀重懸于20毫升冰的IM山梨糖醇(sorbitol),混合物離心去上清,最后 細(xì)胞重懸于1毫升冰的IM山梨糖醇置冰浴備用。取10微升線性化DNA(10微克)和80 微升重懸GSl 15細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中,混勻后將電擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將 DNA轉(zhuǎn)染入GS115細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1毫升冰的IM sorbitol,然后轉(zhuǎn)移到15毫升無 菌管,30°C靜止培養(yǎng)1-2小時,分別取100微升、200微升酵母細(xì)胞液均勻涂布到RDB (無組 氨酸)平板,置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇100個克隆接種到5毫升YPD培養(yǎng)基,30°C, 200rpm生長2天,離心棄去上清,加5毫升YPM培養(yǎng)基(甲醇濃度為1.5% )30°C,200rpm
8誘導(dǎo)表達(dá)3天。第3天末,離心取10微升培養(yǎng)上清用SDS-PAGE檢測白蛋白的表達(dá)。選擇 表達(dá)量最高的1株克隆作為下一輪轉(zhuǎn)染的母株(PPIC9K-HSA陽性克隆)。(2) pGAPZ α -HSA 載體轉(zhuǎn)染 pPIC9K_HSA 陽性克隆取一個含pGAPZ α -HSA載體的大腸桿菌克隆,在含Zeocin的LB培養(yǎng)基中生長過 夜。第二天,離心收集菌體,采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化的pGAPZ α-HSA載體 DNA 20微克,用AvrII酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶 于20微升純水中,-20°C保存?zhèn)溆?。pPIC9K-HSA陽性克隆在5毫升YPD中生長過夜,取其 中0. 5毫升加到500毫升新鮮YPD培養(yǎng)基中生長過夜,直至培養(yǎng)液的0D_在1. 3-1. 5之間, 離心去上清。細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純水,混合物離心去上清。沉淀加250毫升無菌 冰純水重懸后再離心去上清,沉淀重懸于20毫升冰IM山梨糖醇(sorbitol),混合物離心 去上清,最后細(xì)胞重懸于1毫升冰IM山梨糖醇,置冰浴備用。取10微升線性化DNA(10微 克)和80微升重懸pPIC9K-HSA陽性克隆細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中,混勻后將電擊杯在冰 浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉(zhuǎn)染入pPIC9K-HSA陽性克隆細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1毫升 冰IM sorbitol,然后轉(zhuǎn)移到15毫升無菌管,30°C靜止培養(yǎng)1_2小時,取200微升酵母細(xì)胞 液均勻涂布于含100微克/毫升Zeocin的YPD平板上,置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇 100個克隆接種到5毫升YPD培養(yǎng)基,30°C,200rpm生長2天,離心取培養(yǎng)上清用SDS-PAGE 檢測目的蛋白的表達(dá)量。選擇表達(dá)量最高的5株克隆(克隆1、克隆2、克隆3、克隆4、克隆 5)作為工程細(xì)胞的候選株。(3) pGAPZ α -HSA 載體轉(zhuǎn)染 GSl 細(xì)胞取一個含pGAPZ α -HSA載體的大腸桿菌克隆,在含Zeocin的LB培養(yǎng)基中生長過 夜。第二天,離心收集菌體,采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化的pGAPZ α-HSA載 體DNA20微克,用AvrII酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶 于20微升純水中,_20°C保存?zhèn)溆?。GSl 15克隆在5毫升YPD中生長過夜,取其中0. 5毫升 加到500毫升新鮮YPD培養(yǎng)基中生長過夜,直至培養(yǎng)液的0D_在1. 3-1. 5之間,離心去上 清。細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純水,混合物離心去上清。沉淀加250毫升無菌冰純水重 懸后再離心去上清,沉淀重懸于20毫升冰IM sorbitol,混合物離心去上清,最后細(xì)胞重懸 于1毫升冰IM sorbitol,置冰浴備用。取10微升線性化DNA(10微克)和80微升重懸GS 115細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中,混勻后將電擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉(zhuǎn)染入 GS 115細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1毫升冰IM sorbitol,然后轉(zhuǎn)移到15毫升無菌管,30°C靜 止培養(yǎng)1-2小時,取200微升酵母細(xì)胞液均勻涂布于含100微克/毫升Zeocin的YPD平板 上,置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇100個克隆接種到5毫升YPD培養(yǎng)基,300C,200rpm生 長2天,離心取培養(yǎng)上清用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)量。選擇表達(dá)量最高1株的克隆 作為pGAPZ α -HSA克隆對照株。實施例4、高表達(dá)克隆的比較(I)DNA水平上的確認(rèn)為了進(jìn)一步確認(rèn)重組克隆的基因組內(nèi)插入了目的蛋白表 達(dá)盒,提取上述實施例3中(2)獲得的5株工程細(xì)胞候選株的基因組DNA,同時也提取了用 作轉(zhuǎn)染pGAPZ α-HSA用的母株(pPIC9K_HSA陽性克隆)的基因組DNA和GS115的基因組 DNA。這7種細(xì)胞的基因組DNA作為模板,分別用5,A0X1 primer/3,A0Xl primer引物對和 pGAP forward primer/3'A0Xl primer引物對進(jìn)行PCR。PCR結(jié)果顯示除GS115細(xì)胞株夕卜,其它6株用5’A0X1 primer/3’A0Xl primer引物對均能獲得插入的目的基因信號。用pGAP forwardprimer/3'A0Xl primer 引物對進(jìn)行 PCR 檢測,pGAPZ α -HSA 用的母株(pPIC9K_HSA 陽性克隆)和GS115株無插入的目的基因信號,而5株工程細(xì)胞候選株均呈現(xiàn)插入的目的
基因信號。(2)蛋白表達(dá)水平上的確認(rèn)為了驗證雙啟動子的要比單啟動子的轉(zhuǎn)染時的目的 蛋白的表達(dá)量高。設(shè)計了幾組實驗。第一組上述8個克隆(包括GS115、實施例3中(2)獲得的5株工程細(xì)胞候選株、 PPIC9K-HSA陽性克隆和pGAPZ α -HSA克隆對照株)在30°C,200rpm條件下,5毫升YPD培 養(yǎng)基中生長2天,離心取培養(yǎng)上清檢測白蛋白的含量和細(xì)胞密度。在這一組實驗中,各株的 細(xì)胞密度基本相同,GSl 15株和pPIC9K-HSA陽性克隆株沒有檢測到白蛋白的表達(dá),而5株工 程細(xì)胞候選株都檢測到白蛋白的表達(dá),其表達(dá)量在70-80毫克/升的范圍內(nèi)。pGAPZ α -HSA 克隆對照株也檢測到白蛋白的表達(dá),其表達(dá)量與5株工程細(xì)胞候選株相似,為76毫克/升。第二組上述8個克隆(包括GS115、實施例3中(2)獲得的5株工程細(xì)胞候選株、 pGAPZ α -HSA克隆對照株和pPIC9K_HSA陽性克隆)均在30°C,200rpm條件下,5毫升YPD 培養(yǎng)基中生長2天,離心取沉淀,加含1 %甲醇的YP培養(yǎng)基,使各株的細(xì)胞密度相同,體積均 為5毫升,仍置于30°C,200rpm條件下培養(yǎng)3天,每天取上清檢測白蛋白的含量(取第3天 作為最終含量)。在這個實驗中,GSl 15沒有目的蛋白的表達(dá),PPIC9K-HSA陽性克隆株的表 達(dá)量為187毫克/升,pGAPZ α -HSA克隆對照株的表達(dá)量為112毫克/升、5株工程細(xì)胞候 選株的表達(dá)量在250-280毫克/升之間,明顯高于pPIC9K-HSA陽性克隆株。第三組上述8個克隆(包括GS115、實施例3中(2)獲得的5株工程細(xì)胞候選株、 pGAPZ α -HSA克隆對照株和pPIC9K_HSA陽性克隆)均在5毫升YPD培養(yǎng)基中生長2天,培 養(yǎng)條件為30°C,200rpm。第2天末,各添加5毫升含2%甲醇的YP培養(yǎng)基,在相同條件下繼 續(xù)生長3天,每天取樣品檢測白蛋白的表達(dá)水平(取第3天作為最終含量)。檢測結(jié)果表明 GSl 15株沒有白蛋白表達(dá),PPIC9K-HSA陽性克隆pPIC9K_HSA陽性克隆株的表達(dá)量為132毫 克/升,5株工程細(xì)胞候選株表達(dá)量為240-260毫克/升之間,pGAPZ α -HSA克隆對照株表 達(dá)量為138毫克/升。實驗結(jié)果符合預(yù)想的狀況。實施例5、工程細(xì)胞株表達(dá)的白蛋白確認(rèn)為了在蛋白分子結(jié)構(gòu)水平上確認(rèn)與天然的人血白蛋白一致。工程細(xì)胞株之一(克 隆1)在200毫升YPD培養(yǎng)基中生長2天,然后添加200毫升含2%甲醇的YP培養(yǎng)基繼續(xù) 生長3天,培養(yǎng)條件為30°C,200rpm。培養(yǎng)結(jié)束后離心,收集培養(yǎng)上清。上清液用醋酸調(diào)pH 至3.5,過pH 3. 5,20mM醋酸鈉緩沖液平衡過的SP-S^harose FF離子交換柱,目的蛋白 用pH 7.0,含500mM氯化鈉,20mM磷酸鈉緩沖液洗脫。洗脫蛋白過用pH 7.0,含50福氯 化鈉,20mM磷酸鈉緩沖液平衡的Si^phadex G-25凝膠柱,進(jìn)行緩沖液交換。交換了緩沖液 后的SP-S^harose FF洗脫蛋白過pH 7. 0,含50mM氯化鈉,20mM磷酸鈉緩沖液平衡過的 DEAE-Sepharose FF層析柱,白蛋白為pH 7. 0,含500mM氯化鈉,20mM磷酸鈉緩沖液洗脫下 來的組分。DSD-PAGE顯示其純度大于98%。
純化的重組白蛋白用TRYPSIN消化后用C18柱進(jìn)行肽圖分析,結(jié)果與人血清白蛋 白的TRYPSIN酶切肽圖完全一致。N-端15個氨基酸序列測定結(jié)果為Asp-Ala-His-Lys-S er-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly(SEQ ID NO 7), C-末端兩氨基酸的序列 測定結(jié)果為Gly-Leu,與人血清白蛋白的C-末端兩個氨基酸相同。純化的重組白蛋白還進(jìn) 行了園二色譜檢測,檢測的結(jié)果與人血清白蛋白一致。上述實驗確認(rèn)本發(fā)明的方法可以高效正確地表達(dá)人血白蛋白。實施例6、工稈細(xì)胞株的發(fā)酵罐發(fā)酵工藝研究將工程細(xì)胞株(克隆1)接種到Y(jié)PD平板生長2天,挑取單克隆接種到裝有400毫 升YPD培養(yǎng)基的搖瓶中,30°C 250-300rpm條件下生長16-24個小時直到0D600在2_6之 間。發(fā)酵罐內(nèi)加含4 %甘油的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液8升,加熱高壓滅菌。設(shè)置發(fā)酵溫度30 V、 pH控制5. 6、轉(zhuǎn)速200-1500rpm、通氣條件為0. 1-1. Ovvm空氣,用28%氫氧化銨調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培 養(yǎng)鹽培養(yǎng)液PH到5. 6,每升培養(yǎng)液加4. 35ml PTMl痕量鹽。待發(fā)酵罐內(nèi)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液的溫 度降至30°C后,將400毫升來自搖瓶中培養(yǎng)的0D600在2_6之間的種子液.加入發(fā)酵罐。 啟動發(fā)酵罐溫度、PH、通氣和攪拌等裝置使酵母細(xì)胞生長,繼續(xù)細(xì)胞生長直到甘油消耗完 畢。一旦所有的甘油都消耗完畢,啟動甘油流加步驟來增加細(xì)胞的量,甘油補(bǔ)料中甘油的濃 度為50%,每升甘油補(bǔ)料內(nèi)需含有12毫升PTMl痕量鹽溶液,設(shè)置補(bǔ)料速度為18. 15ml/hr/ liter (起始體積),甘油流加持續(xù)4小時。甘油流加結(jié)束后開始流加甲醇,流加的甲醇補(bǔ)料 含100%甲醇,每升甲醇添加12毫升PTMl痕量鹽。設(shè)置流加速度為3ml/hr每升起始發(fā)酵 體積。4小時后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升發(fā)酵體積,以此速度補(bǔ)加2小時后甲醇補(bǔ) 加速度調(diào)整至9ml/hr每升起始發(fā)酵體積,此補(bǔ)料速度一直維持到發(fā)酵結(jié)束,整個甲醇流加 時間為60小時。發(fā)酵結(jié)束后,放罐收集發(fā)酵液,發(fā)酵液通過陶瓷過濾膜過濾方法分離發(fā)酵 上清,含重組白蛋白的發(fā)酵上清用離子交換,分子篩等方法進(jìn)行進(jìn)一步處理。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
權(quán)利要求
一種重組表達(dá)人血清白蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括(1)提供一種重組酵母細(xì)胞,所述酵母細(xì)胞中同時包含有由AOX1啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒;(2)培養(yǎng)(1)的重組酵母細(xì)胞,從而表達(dá)人血清白蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白 表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒分別位于表達(dá)載體中。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述的表達(dá)載體是pGAPZα表達(dá)載體或 PPIC9K表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋 白表達(dá)盒位于PPIC9K表達(dá)載體中,所述的由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒位于 pGAPZ α表達(dá)載體中。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的人血清白蛋白的表達(dá)盒中,從5’至 3’依次包括啟動子序列,SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列,白蛋白成熟肽編碼序列,翻譯 終止子序列,這些序列操作性相連。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法還包括步驟(3)分離(純化)所述的人血清白蛋白。
8.一種重組表達(dá)載體的組合,其特征在于,所述組合中包括(a)含有由AOXl啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的表達(dá)載體;和(b)含有由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒的表達(dá)載體。
9.一種重組酵母細(xì)胞,其特征在于,所述的重組酵母細(xì)胞中,包括由AOXl啟動子驅(qū)動 的人血清白蛋白表達(dá)盒和由GAP啟動子驅(qū)動的人血清白蛋白表達(dá)盒。
10.權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體組合或權(quán)利要求9所述的重組酵母細(xì)胞的用途,用 于重組表達(dá)人血清白蛋白。全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人血清白蛋白的方法。本發(fā)明首次用兩個不同類型的啟動子在同一細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動表達(dá)人血清白蛋白,大幅度地提高了蛋白表達(dá)的效率。本發(fā)明的方法表達(dá)的蛋白接近天然,且操作簡單、成本低廉。
文檔編號C12R1/84GK101974587SQ201010551018
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者孫九如, 朱威, 陳忠, 項煒 申請人:上海安睿特生物醫(yī)藥科技有限公司