專利名稱：試樣的前處理方法及使用該方法的免疫學(xué)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于通過免疫學(xué)測定法簡便、迅速且正確測定試樣中脂聯(lián)素的總量的前處理方法以及利用該方法的脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定方法。
背景技術(shù)：
脂聯(lián)素(adiponectin)(非專利文獻(xiàn)1～4)是白色脂肪組織中特異性且表達(dá)最豐富的分泌蛋白質(zhì)之一，是由244個氨基酸構(gòu)成的約30kDa的屬Clq家族的血漿蛋白質(zhì)。
脂聯(lián)素具有三聚體結(jié)構(gòu)，該三聚體結(jié)構(gòu)是由N末端側(cè)的膠原樣區(qū)和C末端側(cè)的球狀(globular球狀)區(qū)形成的單聚體，通過膠原樣區(qū)中的Gly-X-Y重復(fù)結(jié)構(gòu)形成的三螺旋(triple helix)的三聚體結(jié)構(gòu)。有報(bào)道顯示，在血中存在該三聚體之間再結(jié)合而形成的各種多聚體(以下，有時(shí)總稱為“各種多聚體”)。
近年，有報(bào)告顯示脂聯(lián)素在人血中以5～10μg/mL的高濃度存在，具有各種生理活性。特別是由于可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖以及可抑制單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，因此認(rèn)為有抑制動脈硬化的效果(非專利文獻(xiàn)5)。另有報(bào)告顯示，如果向2型糖尿病或脂肪萎縮性糖尿病的病態(tài)小鼠給予脂聯(lián)素，則胰島素抵抗性和高FFA(游離脂肪酸)血癥、高TG(中性脂肪)血癥得到改善，其作為胰島素敏感性激素具有改善糖尿病的效果(非專利文獻(xiàn)6)。另外，還有報(bào)道顯示，脂聯(lián)素血中濃度低下的腎功能不全患者的心血管并發(fā)癥發(fā)癥率高、生存率下降，對胰島素抵抗性或2型糖尿病高發(fā)病率的皮馬印地安人(Pima Indian)的研究中，發(fā)現(xiàn)血中脂聯(lián)素高值群中2型糖尿病的發(fā)病受到抑制(非專利文獻(xiàn)7)。
這些報(bào)告提示，脂聯(lián)素可能是與內(nèi)臟脂肪的過剩蓄積和胰島素抵抗性發(fā)病直接相關(guān)的內(nèi)分泌因子，認(rèn)為血中脂聯(lián)素濃度的測定作為糖尿病或動脈硬化等發(fā)病預(yù)測因子，可能成為生活習(xí)慣病的良好指標(biāo)。
作為在各種多聚體混存的血液試樣中測定脂聯(lián)素總量的方法，有進(jìn)行在十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在下煮沸，使各種多聚體中立體結(jié)構(gòu)上隱藏的抗體的識別部位暴露出的處理之后，進(jìn)行免疫學(xué)測定的方法(專利文獻(xiàn)1)的報(bào)道。但是，該方法中存在需要用于煮沸(100℃)處理的裝置、從煮沸處理到免疫學(xué)測定的兩個工序?qū)崿F(xiàn)自動化實(shí)際上是很困難的等問題。
另外，雖然市售有LINCO RESEARCH，INC.的HUMAN ADIPONECTIN RIAKIT(Cat.#HADP-61HK)，但是由于該試劑盒是利用使125I標(biāo)記的小鼠脂聯(lián)素和人脂聯(lián)素競爭來用抗脂聯(lián)素-多克隆抗體捕捉的雙抗體/PEG法，因此操作繁雜，并在安全性、特異性或試劑品質(zhì)等方面存在問題。要使以競爭反應(yīng)作為原理的本法的特異性一定，則必須使抗脂聯(lián)素-多克隆抗體與用125I標(biāo)記的小鼠脂聯(lián)素以及各種多聚體人脂聯(lián)素的反應(yīng)性為一定的，但是如上述，由于生物體試樣中混存有各種多聚體，以及各多聚體的存在比例不固定，因此存在不能正確測定脂聯(lián)素總量的問題。
還有關(guān)于識別未經(jīng)SDS或熱的變性處理的、保持特定立體結(jié)構(gòu)的脂聯(lián)素(專利文獻(xiàn)2說明書中稱為天然型)的單克隆抗體以及利用其的測定方法(專利文獻(xiàn)2)的報(bào)告，但是由于試樣中脂聯(lián)素的存在形態(tài)(有多少種三聚體，以何種形式聚集等)而與上述單克隆抗體的反應(yīng)性不同，因此存在不能正確測定各多聚體的存在比例不固定的生物體試樣中的脂聯(lián)素總量的問題。
對于脂聯(lián)素的存在形態(tài)，不是研究生物體試樣中的脂聯(lián)素而是使用重組的脂聯(lián)素來研究。由此有關(guān)于通過低pH的、二硫蘇糖醇(DTT)處理(非專利文獻(xiàn)8)或者胰蛋白酶處理(非專利文獻(xiàn)9)來使脂聯(lián)素形態(tài)變化的報(bào)道，但是沒有關(guān)于處理后的脂聯(lián)素的免疫學(xué)測定的記載。
如上所述，在試樣中的脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定中，必須進(jìn)行使各多聚體(三聚體以及三聚體之間再結(jié)合形成的各種多聚體)之間與所用抗體的反應(yīng)性一定的前處理，但是還未提出過簡便且可實(shí)現(xiàn)從前處理到免疫學(xué)測定的兩工序自動化的方法。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開2000-304748公報(bào)專利文獻(xiàn)2國際公開WO 03/016906公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Scherer P.E.，et al，J.Biol.Chem.270，26746-26749，199非專利文獻(xiàn)2Hu E.，et al，J.Biol.Chem.271，10697-10703，199非專利文獻(xiàn)3Maeda K.，et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.221，286-289，199非專利文獻(xiàn)4Nakano Y.，et al，J.Biochem.120，803-812，199非專利文獻(xiàn)5Ouchi N，et al，Circulation，102，1296-1301，2000
非專利文獻(xiàn)6Yamautchi T，et al，Nature Med.7，941-946，200非專利文獻(xiàn)7Lindsay R.S，et al，Lancet，360，57-58，200非專利文獻(xiàn)8Utpal B.Pajvani，et al.J.Biol.Chem.278，9073-9085，200非專利文獻(xiàn)9Fruebis，J，et al.Proc.Natil.Acad.Sci.98，2005-2531，2001發(fā)明的揭示發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的是提供用于通過免疫學(xué)測定法，簡便、迅速且正確測定混存有三聚體及三聚體之間再結(jié)合形式的各種多聚體的生物體試樣中的脂聯(lián)素總量的的前處理方法以及利用該處理方法的脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定方法。
解決課題的方法本發(fā)明者為了解決上述課題經(jīng)過認(rèn)真的研究，結(jié)果確認(rèn)了用還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種處理三聚體及三聚體相互再結(jié)合形成的各種多聚體，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺濃度2-15％)(以下，記為PAGE(2-15％))分析，由此處理前存在的各種多聚體的染色帶消失或者減少的同時(shí)，在與任一處理前存在的染色帶相比的低分子側(cè)出現(xiàn)了被染色檢出的來自脂聯(lián)素的變換物(以下，稱為變換物)。確認(rèn)了該變換物具有與抗脂聯(lián)素抗體的反應(yīng)性以及使用抗脂聯(lián)素抗體可測定該變換物。
本發(fā)明者進(jìn)一步研究上述發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如用含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種的前處理劑處理試樣后，進(jìn)行免疫學(xué)測定，則試樣與前處理劑無需經(jīng)煮沸處理，就可測定出各種多聚體混在的生物體試樣中的脂聯(lián)素總量，籍此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了脂聯(lián)素測定用試樣的前處理方法，它是為免疫學(xué)測定試樣中的脂聯(lián)素總量的脂聯(lián)素測定用試樣的前處理方法，其特征在于，向含有脂聯(lián)素的試樣中加入還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種，不用與試樣一起煮沸就發(fā)生作用。
另外，本發(fā)明還提供了前處理劑，該前處理劑是含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種的、脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定用試樣的前處理劑，是不用煮沸試樣進(jìn)行前處理的前處理劑。
另外，本發(fā)明還提供了試樣中脂聯(lián)素總量的測定方法，其特征在于，向含有脂聯(lián)素的試樣中加入還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種，不需與試樣一起煮沸而使發(fā)生作用后免疫學(xué)測定脂聯(lián)素。
另外，本發(fā)明還提供了免疫學(xué)測定試劑，該試劑是由第一試劑和第二試劑組成，該第一試劑含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種，該第二試劑含有不溶性載體，該不溶性載體負(fù)載有用于測定脂聯(lián)素的抗體，其中，試樣與第一試劑的反應(yīng)不用煮沸。
發(fā)明的效果通過本發(fā)明，可簡便、迅速且正確地測定混存有各種多聚體的生物體試樣中的脂聯(lián)素總量。
附圖的簡單說明

圖1通過western blotting法的人血清中脂聯(lián)素的分析圖。
圖2顯示LTIA試劑與蛋白酶處理的脂聯(lián)素的反應(yīng)性的圖。
圖3顯示ELISA試劑與蛋白酶處理的脂聯(lián)素的反應(yīng)性的圖。
圖4使參考例3的自人血清精制的脂聯(lián)素用PAGE(2-15％)分離，用CBB蛋白染色而得的電泳圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式如上述，在生物體試樣中的脂聯(lián)素中存在各種多聚體，但是各多聚體的存在比例(比率)卻不固定。由此認(rèn)為在免疫學(xué)測定時(shí)，測定中使用的抗體與各種多聚體之間的反應(yīng)性不同，這樣情況時(shí)認(rèn)為難測定特定的多聚體。另外，在夾心免疫測定系中，假設(shè)測定試樣中各存在一分子的六聚體和三聚體，則在試樣中存在9個單體，作為測定結(jié)果認(rèn)為，在測定結(jié)果上不能區(qū)別存在2分子三聚體的情況和存在2分子六聚體的情況。任一種情況均不能得到反應(yīng)脂聯(lián)素總量的測定結(jié)果。另外，利用在SDS共存下煮沸分解多聚體的前處理的方法中，雖可得到反應(yīng)脂聯(lián)素總量的測定結(jié)果，但是前處理繁雜，接著要進(jìn)行免疫學(xué)測定，難以對兩工序進(jìn)行自動化。
通過上述認(rèn)識，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，如果在進(jìn)行免疫學(xué)測定時(shí)，測定使用的抗體與測定試樣中的各種多聚體的反應(yīng)性一定，不用煮沸試樣而使各種多聚體變?yōu)榭傻玫椒磻?yīng)脂聯(lián)素的總量的測定結(jié)果的一定形態(tài)，就可以解決上述課題。
作為以上述目的為目標(biāo)的測定試樣中的各種脂聯(lián)素的前處理方法，可例舉如向含有脂聯(lián)素的試樣中添加選自還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶的至少1種，不用和試樣一起煮沸而使其作用的處理方法。通過這些前處理方法所得的變換物的性狀可以是各前處理方法間相同，也可以不同。各種多聚體，包括全是單聚體的情況、全是三聚體的情況、全是特定的多聚體的情況。另外，通過前處理，也可以是限制在某分子量范圍的變換物。從另一方面來看，為構(gòu)筑免疫學(xué)測定系而選的抗體較好是具有能以一定的反應(yīng)性識別的性狀。
作為本發(fā)明中使用的試樣，可例舉如來自人、猴、山羊、綿羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠以及其他哺乳動物的血液、尿等體液、組織提取液或來自組織的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液等含有各種脂聯(lián)素的多聚體的生物體試樣。其中，較好為由于與糖尿病或動脈硬化性疾病的相關(guān)信息而受到關(guān)注的血液(血清·血漿)。試樣的采取方法，考慮到測定脂聯(lián)素總量的目的，如是不影響試樣中存在的脂聯(lián)素的方法就可以使用。
作為在本發(fā)明的前處理方法、前處理劑、免疫學(xué)測定方法、免疫學(xué)測定試劑中使用的還原劑，只要是具有可打開脂聯(lián)素的二硫鍵的還原能力、對免疫學(xué)測定沒有實(shí)質(zhì)影響的物質(zhì)，就可沒有特別限定地使用?？衫e如DTT(二硫蘇糖醇)、2-巰基乙醇、半胱胺、硫甘油等硫醇化合物；硼氫化物或膦類等。使用的濃度可為得到希望的變換物而適宜選擇來決定。例如是硫醇化合物時(shí)，較好使用DTT或2-巰基乙醇。作為用還原劑處理的條件，較好為4～60℃、5分鐘～24小時(shí)。
作為酸或其鹽，只要是可解離各種多聚體的脂聯(lián)素的結(jié)合的有機(jī)酸、無機(jī)酸，就可無限定地使用?？衫e如醋酸、枸櫞酸、鹽酸、甲酸、酒石酸、草酸等。使用的濃度可為得到希望的變換物而適宜選擇來決定，較好為1～1000mM，更好為10～200mM。另外也可用作緩沖液。用作緩沖液時(shí)的pH，較好為pH在4以下。作為用酸或其鹽處理的條件，較好為4～60℃、5分鐘～24小時(shí)。
作為表面活性劑，是作用于各種多聚體，使其變化為在免疫學(xué)測定時(shí)反映脂聯(lián)素總量的形態(tài)的物質(zhì)，如果可維持脂聯(lián)素與特異抗體的反應(yīng)性，則沒有離子性或非離子性等的限制，均可使用。其中，較好為陰離子性表面活性劑，十二烷基硫酸鹽等烷基硫酸鹽或十二烷基苯磺酸鹽等烷基苯磺酸鹽等較為適宜。這些表面活性劑可單獨(dú)使用也可將多個組合使用。使用濃度大致為0.01～10％，更好為0.1～5％。更好為與酸或其鹽的處理組合使用。
作為蛋白酶，如果是作用于各種多聚體，可使各種多聚體變化為在免疫學(xué)測定中反映脂聯(lián)素總量的形態(tài)的蛋白酶，則可無特別限制地使用。使用的濃度也可為了得到希望的變換物而適宜選擇來決定。蛋白酶的來源無特別的限定，可如來自微生物、來自動物、來自植物等，較好為使用來自桿菌屬、鏈霉菌屬或曲霉屬等微生物的蛋白酶。作為來自桿菌屬的蛋白酶的市售品，可例舉如蛋白酶X型(Proteasetype X)(シゲマ公司)、肌球吸附蛋白(Protin)AC、肌球吸附蛋白(Protin)PC(均來自大和化成公司)、蛋白酶S“アマノ”(アマノエンザイム公司)、スミチ一ムCP(新日本化學(xué)工業(yè)公司)等。作為來自鏈霉菌屬的蛋白酶的市售品，可例舉如ProteasetypeXIV(シゲマ公司)、鏈霉蛋白酶(ロシユ公司)、アクチナ一ゼAS(科研制藥公司)等。另外，作為來自曲霉屬的蛋白酶的市售品，可例舉如蛋白酶A“アマノ”、蛋白酶P“アマノ”、ゥマミザイム(均來自アマノエンザイム公司)、スミチ一ムMP(新日本化學(xué)工業(yè)公司)等。這些蛋白酶也可以是通過基因重組技術(shù)得到的。另外，也可實(shí)施化學(xué)修飾。生物體試樣的蛋白酶處理?xiàng)l件，隨使用的蛋白酶不同而不同，較好為在磷酸、Tris、Good’s等緩沖液中，于4～60℃進(jìn)行5分鐘～24小時(shí)。蛋白酶的使用濃度可考慮反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間來決定，大致在0.01～100mg/ml的范圍內(nèi)。
這些還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶的使用方法也沒有特別的限定?？梢詥为?dú)使用也可組合使用。例如，可使還原劑或酸與含有脂聯(lián)素的試樣作用后，再進(jìn)行蛋白酶處理。另外，使用這些還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶時(shí)，為了調(diào)整這些物質(zhì)與脂聯(lián)素作用的環(huán)境，以及提高這些物質(zhì)的保存穩(wěn)定性，也可適宜添加磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液、Good’s緩沖液等緩沖成分；不與各種多聚體作用的表面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、防腐劑(疊氮化鈉等)、鹽濃度調(diào)整劑(氯化鈉等)等。
本發(fā)明的免疫學(xué)測定方法中使用的抗體如果是在使選自還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少一種不需進(jìn)行煮沸處理與各種多聚體脂聯(lián)素作用之后，可測定脂聯(lián)素總量的話，則可無特別限制地使用。所述抗體中，多克隆抗體是含有與呈一定形態(tài)的脂聯(lián)素中存在的多個表位特異結(jié)合的，多個抗體的多克隆抗體。多克隆抗體可通過對適當(dāng)?shù)膭游?，例如兔子、山羊、綿羊、馬、牛、小鼠、大鼠等動物，通過自身公知的方法進(jìn)行脂聯(lián)素免疫而得。另一方面，單克隆抗體是與呈一定形態(tài)的脂聯(lián)素特異結(jié)合的1種以上的不同的單克隆抗體。單克隆抗體可以通過在細(xì)胞融合技術(shù)領(lǐng)域中，適當(dāng)選擇自身公知的方法，或組合這些方法形成產(chǎn)生單克隆抗體的融合細(xì)胞株，利用該細(xì)胞株而得。另外，與呈一定形態(tài)的脂聯(lián)素特異性結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體，也可以從市售品得到，可在本發(fā)明中使用。例如，可根據(jù)脂聯(lián)素的形態(tài)，適宜利用Goat α human Acrp30 antibody(コスモバィオ公司、GT公司)、rabbit α hu adiponectin-PoAb(コスモバイオ公司、chemicon公司)、huAcrp30-MoAb(藤澤藥品工業(yè)公司、BD公司)、Mouse α hu Adiponectin MoAb(コスモバイオ公司、chemicon公司)、抗人ACRP30單克隆抗體(AX773、AX741、Ne，Na、和光純藥工業(yè)公司)等。
作為用于得到本發(fā)明所用抗體的抗原，可以使用按照通常方法，由試樣精制、單離的脂聯(lián)素。也可使用由含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種的前處理液，不經(jīng)煮沸進(jìn)行處理后的脂聯(lián)素。另外，該抗原也可是根據(jù)其蛋白質(zhì)的基因序列信息，通過通常的基因?qū)W方法而制得的重組蛋白。
作為本發(fā)明的免疫學(xué)測定方法，可使用使與變換成一定形態(tài)的脂聯(lián)素特異結(jié)合的抗體與不溶性載體結(jié)合，通過這樣捕捉變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素，從而確定在試樣中有無存在脂聯(lián)素(定性)或定量的方法，其中，可例舉如LTIA(膠乳免疫比濁法)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、CLEIA(化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法)、RIA(放射免疫分析法)等方法。其中，LTIA較好，它是通過混合不溶性載體和變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素，該不溶性載體上負(fù)載有可與變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素特異結(jié)合的抗體，由此通過變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素引起不溶性載體的交聯(lián)(凝集)，通過光學(xué)測定該結(jié)果生成的混濁，從而確定脂聯(lián)素的有無(定性)或者定量的方法，可簡便、迅速且正確地測定脂聯(lián)素。
作為本發(fā)明所使用的不溶性載體，使用在通常的免疫學(xué)測定試劑中所使用的可工業(yè)大量生產(chǎn)的有機(jī)系不溶性載體。在LTIA中，較好為抗體的吸附性優(yōu)良且可長期穩(wěn)定保持生物學(xué)活性的聚苯乙烯系的膠乳粒子，在ELISA中較好為聚苯乙烯等的96孔微量培養(yǎng)板。
使抗體負(fù)載在上述不溶性載體的表面上的方法已知有很多種，在本發(fā)明中可適宜利用。例如，作為擔(dān)持(敏化)方法，可例舉如使抗體物理吸附在不溶性載體表面的方法、在具有官能基的不溶性載體表面上通過已知的物理結(jié)合法或化學(xué)結(jié)合法高效地敏化抗體的方法。
負(fù)載有抗體的抗體不溶性載體與變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素的反應(yīng)，如果是可引起抗原抗體反應(yīng)的條件，則該反應(yīng)條件沒有特別的限定。作為反應(yīng)液，只要是可引起與經(jīng)前處理后的變化成一定形態(tài)的脂聯(lián)素之間的抗原抗體反應(yīng)的溶液，均可使用。例如，其中可適宜溶解下列物質(zhì)作為控制pH的緩沖成分的磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液、Good’s緩沖液等；避免非特異反應(yīng)的表面活性劑或氯化鈉等；作為穩(wěn)定劑的牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、高分子多糖類等；除控制反應(yīng)性的上述物質(zhì)之外的右旋糖酐等水溶性多糖類；中和前處理劑中的還原劑或酸的中和劑；蛋白酶的鈍化劑等添加劑。
作為上述LTIA或ELISA中的檢測方法，可例舉如下方法。LTIA中測定不溶性載體的凝集程度的方法沒有特別的限定。例如，定性或者半定量測定凝集時(shí)，通過比較已知濃度試樣的混濁程度與測定試樣的混濁程度，可肉眼判斷凝集的程度。另外，定量測定該凝集時(shí)，從簡便性以及精確度的角度，較好為光學(xué)測定。作為凝集的光學(xué)測定法，可使用公知的方法。更具體地講，例如可利用所說的比濁法(將濁度增加視為凝集塊形成)、通過粒度分布的測定法(將粒度分布或平均粒徑的變化視為凝集塊的形成)、積分球濁度法(使用積分球測定凝集塊形成引起的前方散射光的變化，比較與透光強(qiáng)度的比)等各種方法。ELISA中測定來自酶標(biāo)記抗體的酶活性的，基質(zhì)與酶的反應(yīng)生成物的方法沒有特別的限定。例如，在酶反應(yīng)生成物固有波長，例如作為492nm的吸光度，可通過96孔微量培養(yǎng)板酶標(biāo)儀讀取。
實(shí)施例以下，例舉實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不限定于此。
實(shí)施例以及試驗(yàn)例中使用的試劑及材料如下所示。
<試劑以及材料>
a.抗體結(jié)合樹脂用清洗液含0.5M NaCl的0.1M NaHCO3-NaOH(pH 8.3)。
b.抗體結(jié)合樹脂用提取液0.1M Glycine-HCl(pH 2.5)。
c.抗體結(jié)合樹脂用中和液2M Tris-HCl(pH 8.0)。
d.膠乳平均粒徑0.2μm的聚苯乙烯粒子膠乳(固形分10％(w/v)、積水化學(xué)工業(yè)公司)。
e.負(fù)載的抗體膠乳調(diào)制用緩沖液20mM Tris-HCl(pH 8.0)。
f.阻斷用緩沖液含2％BSA的20mM Tris-HCl(pH 8.0)。
g.LTIA用緩沖液(R1)含0.15％BSA、0.15M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 8.0)。
h.ELISA用板96孔微量培養(yǎng)板(NUNC公司)。
i.ELISA用抗體敏化溶液PBS(pH 7.4)。
j.ELISA用緩沖液1％BSA，含0.1％Tween 20的PBS(pH 7.4)。
k.Goat α human Acrp30 antibodyコスモバイオ公司、GT公司、Cat No.421065(抗人脂聯(lián)素-多克隆抗體的市售品)。
l.hu Acrp30-MoAb藤澤藥品工業(yè)公司、BD Transduction Laboratories公司、商品編號A12820(抗人脂聯(lián)素-單克隆抗體的市售品)。
m.Goat α rabbit IgG HRP標(biāo)記抗體コスモバイオ公司、capple公司。
n.ELISA用清洗液含0.05％Tween 20的PBS(pH7.4)。
o.ELISA用緩沖液21％BSA，含0.05％Tween 20的PBS(pH7.4)。
參考例1.大腸菌重組小鼠球狀脂聯(lián)素(rMgAd)的調(diào)制在含有6×His標(biāo)記的pQE30載體的BamHI、HindIII中插入小鼠脂聯(lián)素的基因序列(NCBI accession #U37222)的球狀區(qū)序列(相當(dāng)于104-247殘基)，植入到大腸菌中。對表達(dá)重組小鼠球狀脂聯(lián)素(rMgAd)的大腸菌，按照如下方法進(jìn)行rMgAd的精制。即，在4℃、16小時(shí)的條件下將大腸菌的可溶成分添加到Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN公司)中，使rMgAd結(jié)合后，通過咪唑逐步提取，回收含有脂聯(lián)素的成分，在3日內(nèi)用PBS進(jìn)行透析。所得的rMgAd的蛋白質(zhì)濃度使用Bio-Rad DC protein assay kit求得。
參考例2.抗rMgAd抗體的調(diào)制將上述1得到的rMgAd50μg與等量的弗氏的完全佐劑混合，對2只兔子以2周為間隔免疫6次制作抗血清?？寡逯械奶禺惪贵w(IgG)的精制可使用Protein A樹脂通過常用方法進(jìn)行(抗rMgAd抗體)。
參考例3.來自人血中的脂聯(lián)素(mAd)的精制使由上述參考例2制作的抗rMgAd抗體500mg與CNBr-activated Sepharose 4B(アマシヤムバイオサイエンス公司)50mL結(jié)合，制作抗rMgAd抗體結(jié)合Sepharose4B樹脂。向抗rMgAd抗體結(jié)合Sepharose 4B樹脂中添加人血清2.5L，用抗體結(jié)合樹脂用清洗液充分清洗后，用抗體結(jié)合樹脂用提取液提取人血清脂聯(lián)素(mAd)成分，向提取成分中加入1/10容量的抗體結(jié)合樹脂用中和液進(jìn)行中和。再將經(jīng)中和的提取成分添加到Protein A樹脂中，將對Protein A樹脂的非吸附成分作為精制mAd進(jìn)行回收，通過人脂聯(lián)素ELISA試劑盒(大塚制藥公司)測定脂聯(lián)素含量。
參考例4.抗人脂聯(lián)素單克隆抗體制作將由上述參考例3所得的精制mAd20μg與等量的弗氏完全佐劑混合，對2只小鼠以2周為間隔進(jìn)行3或4次免疫，在細(xì)胞融合3日前再次給予。從該免疫小鼠提取脾臟細(xì)胞，使用聚乙二醇通過常用方法進(jìn)行與P3U1骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合。產(chǎn)生抗人脂聯(lián)素單克隆抗體的融合細(xì)胞的選擇，是通過如下的常用方法進(jìn)行，即，經(jīng)ELISA法選擇與mAd的反應(yīng)性高的孔，接著用極限稀釋法進(jìn)行選擇。抗人脂聯(lián)素單克隆抗體是將選擇的融合細(xì)胞給予經(jīng)降植烷(pristane)處理的小鼠腹腔內(nèi)，再作為腹水回收。來自腹水的特異抗體(IgG)的精制可使用Protein A樹脂通過常用方法來進(jìn)行。通過上述，得到用識別編號64401-64411識別的11個產(chǎn)生單克隆抗體的融合細(xì)胞和單克隆抗體。
參考例5.抗體變應(yīng)化膠乳的調(diào)制在1體積的膠乳液中混入4體積的負(fù)載抗體膠乳調(diào)制用緩沖液，調(diào)制稀釋膠乳液。另一方面，通過用負(fù)載抗體膠乳調(diào)制用緩沖液稀釋使抗rMgAd抗體或抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)至1mg/mL來調(diào)制稀釋抗體液。一邊攪拌1體積上述稀釋膠乳液，一邊分別添加·混合上述2種稀釋抗體液，再次攪拌之后，再添加阻斷用緩沖液2體積，繼續(xù)攪拌。得到的抗體變應(yīng)化膠乳分別作為負(fù)載抗rMgAd抗體膠乳原液以及負(fù)載抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)膠乳原液。
(試驗(yàn)例1)通過Western blotting對人血清中的多聚體脂聯(lián)素的解析使用PAGE(2-15％)分別分離來自8名健常者的血清0.2μL，通過半干轉(zhuǎn)移裝置(semi-dry blotting)復(fù)制至PVDF膜后，進(jìn)行免疫染色。免疫染色的順序如下。首先，用含有5％脫脂乳及0.1％NaN3的PBS液(pH7.4)阻斷復(fù)制后的膜，用含有0.1％Tween20(pH7.4)的PBS液清洗，使之與市售的抗人脂聯(lián)素-單克隆抗體(huAcrp30-MoAb；藤澤藥品工業(yè)公司、BD Transduction Laboratories公司)1μg/mL在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。接著，用含0.1％Tween20的PBS液(pH7.4)充分清洗后，用Vector ABC kit(Mouse)及DAB基質(zhì)試劑盒(フナコシ公司)使其顯色。結(jié)果，作為主要的條帶的3種條帶被染色檢出。這樣清楚了血中存在的各種多聚體脂聯(lián)素主要有3種(圖1)。相當(dāng)于這3種染色帶的脂聯(lián)素，從電泳圖的上部(高分子側(cè))開始，分別是HMW-Ad、MMW-Ad以及LMW-Ad成分。
實(shí)施例1 精制mAd的由還原劑、酸或其鹽以及蛋白酶的處理將由參考例3所得的精制mAd作為試樣，使還原劑、酸或其鹽以及蛋白酶單獨(dú)或組合發(fā)生作用來進(jìn)行處理，觀察精制mAd的形態(tài)變化。
1)還原劑、酸處理對含有精制mAd的50mM各種緩沖液(Tris-HCl pH8.5、醋酸鈉pH3.0以及pH4.0)，在添加10mM DTT作為還原劑或不添加的條件下，在37℃保持60分鐘。處理后的液體用PAGE(2-15％)分離，通過CBB進(jìn)行蛋白染色。以Tris-HCl pH8.5、不添加DTT(處理?xiàng)l件1)的染色圖作為對照，觀察在各處理?xiàng)l件下的相當(dāng)于HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad各成分的條帶的增減以及新的變換物條帶的生成(表1)。
結(jié)果，在不添加還原劑的處理?xiàng)l件下，在pH3.0及pH4.0的醋酸鈉緩沖液(處理?xiàng)l件3、5)時(shí)，確認(rèn)HMW-Ad成分的染色帶消失，增加MMW-Ad成分。在添加還原劑的處理?xiàng)l件下，當(dāng)pH3.0及pH4.0的醋酸鈉緩沖液(處理?xiàng)l件4、6)時(shí)，確認(rèn)HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad3成分均染色帶消失，同時(shí)各成分的變換物的新染色帶出現(xiàn)。在Tris-HCl(pH8.5)(處理?xiàng)l件2)時(shí)，確認(rèn)各成分的變換物的新染色帶出現(xiàn)，但HMW-Ad成分沒有完全消失。
以上確認(rèn)了，使多聚體脂聯(lián)素(HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad)與還原劑、酸或其鹽作用，由多聚體脂聯(lián)素生成新的變換物。通過上述處理生成的變換物推測是三聚體脂聯(lián)素。
表1


(+)＝減少(++)＝不變(+++)＝增加或生成變換物(-)＝消失或未生成變換物2)蛋白酶處理向50mM磷酸緩沖液(pH8.0)中添加精制mAd及各種蛋白酶(均是市售品)，在37℃保持60分鐘。用PAGE(2-15％)分離處理后的液體，通過CBB進(jìn)行蛋白染色。以Tris-HCl(pH8.5)、不添加DTT(處理?xiàng)l件1)的染色圖作為對照，觀察在各處理?xiàng)l件下，相當(dāng)于HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad各成分的條帶的增減以及新變換物條帶的生成(表2)。
在處理?xiàng)l件7～9中確認(rèn)了HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad3成分均染色帶消失，同時(shí)在低分子量域出現(xiàn)了各成分的變換物的新染色帶。在處理?xiàng)l件10～12中，確認(rèn)了LMW-Ad及MMW-Ad成分消失，在低分子量域出現(xiàn)各成分的變換物的新染色帶。這時(shí)，HMW-Ad成分的染色帶未見變化。
以上確認(rèn)了，通過使多聚體脂聯(lián)素(HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad)與蛋白酶作用，由多聚體脂聯(lián)素生成了新變換物。這些變換物在PAGE(2-15％)上的染色帶檢出位置，隨作用的蛋白酶而不同，但是在30～42kDa的范圍內(nèi)。
另外，關(guān)于處理?xiàng)l件10～12的蛋白酶可知，不進(jìn)行酸或其鹽的處理，使HMW-Ad成分變換成MMW-Ad成分后，通過進(jìn)行蛋白酶處理，所有的成分均可變換成新的變換物。
表2


(+)＝減少(++)＝不變(+++)＝增加或生成變換物(-)＝消失或未生成變換物實(shí)施例2 膠乳試劑與各脂聯(lián)素的反應(yīng)性使用ELISA用緩沖液1/5、1/25倍稀釋經(jīng)蛋白酶處理的精制mAd，將其作為檢體。另外，將在參考例5中調(diào)制的各種膠乳原液用負(fù)載抗體膠乳調(diào)制用緩沖液稀釋至1/10倍，將其作為試劑2在測定中使用，在如下的測定條件檢體量10μL、試劑1(LTIA用緩沖液(R1))100μL、試劑2100μL、測定波長570nm、測光點(diǎn)(point)18-34，用生化學(xué)自動分析裝置日立7170形(日立制作所公司)進(jìn)行測定。測定結(jié)果示于圖2。
抗rMgAd抗體及抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)的膠乳試劑的吸光度依賴于人血清脂聯(lián)素的濃度而變化，該人血清脂聯(lián)素是經(jīng)Protin AC、蛋白酶X型的蛋白酶處理的。
確認(rèn)了肌球吸附蛋白(Protin)AC、蛋白酶X型的蛋白酶可使多聚體脂聯(lián)素以保持抗rMgAd抗體及抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)所識別的抗體識別部位的狀態(tài)，變換成新的變換物，也確認(rèn)了它們可以使用于為測定試樣中的脂聯(lián)素總量的前處理中。
實(shí)施例3 ELISA試劑與各脂聯(lián)素的反應(yīng)性在ELISA板中用ELISA用抗體變應(yīng)化溶液稀釋Goat α human Acrp30 antibody或者抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)至1μg/mL后、進(jìn)行變應(yīng)化。用ELISA用緩沖液阻斷后，將使用ELISA用緩沖液1/2、1/20、1/200倍稀釋經(jīng)蛋白酶處理的mAd而得的檢體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用ELISA用緩沖液清洗板之后，將使用ELISA用緩沖液1/10000倍稀釋的抗rMgAd抗體液在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，用ELISA用緩沖液清洗板，將使用ELISA用緩沖液1/1000倍稀釋的Goat α rabbit IgG HRP標(biāo)記體液在室溫反應(yīng)1小時(shí)。使用ELISA用緩沖液清洗板之后，通過使用TMB(四甲基聯(lián)苯胺)和過氧化氫的HRP酶反應(yīng)使其顯色，添加2N硫酸使反應(yīng)停止后，測定450nm的吸光度。測定結(jié)果示于圖3。
抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)與抗rMgAd抗體的組合以及Goat α humanAcrp30 antibody與抗rMgAd抗體組合的ELISA試劑的吸光度依賴于經(jīng)肌球吸附蛋白(Protin)AC、蛋白酶X型的蛋白酶處理的人血清脂聯(lián)素的濃度而變化。
明確了肌球吸附蛋白(Ptotin)AC、蛋白酶X型的蛋白酶可使多聚體脂聯(lián)素在保持Goat α human Acrp30 antibody、抗人脂聯(lián)素單克隆抗體(64401)及抗rMgAd抗體所識別的抗體識別部位的狀態(tài)下，變換成新的變換物，也確認(rèn)了它們可用于為測定試樣中的脂聯(lián)素總量的前處理中。
(試驗(yàn)例2)來自人血中的多聚體脂聯(lián)素的解析用PAGE(2-15％)分離按照參考例3新調(diào)制的精制mAd，通過考馬斯亮藍(lán)(CBB)蛋白染色(圖4)。再通過與試驗(yàn)例1相同的操作，使用市售的抗人脂聯(lián)素-單克隆抗體(huAcrp30-MoAb)進(jìn)行免疫染色。自染色圖的分析結(jié)果明確了，自人血清精制的多聚體脂聯(lián)素中，除試驗(yàn)例1中確認(rèn)的3種以外，還有1種被檢出雖然是量非常少，即，至少存在4種。相當(dāng)于這4種CBB染色帶的脂聯(lián)素自電泳圖的上部開始(高分子側(cè))，分別是HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad及ULMW-Ad成分。
實(shí)施例4 精制mAd的由還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶的處理將在試驗(yàn)例2中解析的精制mAd作為試樣，使還原劑、酸或其鹽、表面活性劑以及蛋白酶單獨(dú)或組合發(fā)生作用來進(jìn)行處理，觀察精制mAd的形態(tài)變化。
1)還原劑、酸處理的組合對于含有精制mAd的100mM的各種緩沖液(Tris-HCl pH8.5、枸櫞酸鈉pH3.0～6.0)，在添加10mM 2-巰基乙醇作為還原劑或不添加的條件下，于37℃保持30分鐘。用PAGE(2-15％)分離處理后的溶液，通過CBB進(jìn)行蛋白染色。將Tris-HCl pH8.5、不添加2-巰基乙醇(處理?xiàng)l件13)的染色圖作為對照，觀察在各處理?xiàng)l件下，相當(dāng)于HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad、ULMW-Ad各成分的條帶的增減以及新的變換物條帶的生成(表3)。
結(jié)果、在不添加還原劑的處理?xiàng)l件下，pH4.0以上的枸櫞酸鈉緩沖液(處理?xiàng)l件15，17，19)時(shí)確認(rèn)了，HMW-Ad成分的染色帶隨著枸櫞酸鈉緩沖液的酸性化顯示消失的趨勢，且MMW-Ad成分有增加。在pH3.0(處理?xiàng)l件21)下，新確認(rèn)了比ULMW-Ad電泳距離長的變換物的染色帶。另一方面，在添加還原劑的處理?xiàng)l件下，在pH6.0以上(處理?xiàng)l件14，16)時(shí)，HMW-Ad的染色帶殘存，但是在pH5.0及4.0的處理?xiàng)l件18，20下，所有成分的染色帶均消失，在與ULMW-Ad幾乎相同的位置，新確定了寬染色帶。另外，在pH3.0(處理?xiàng)l件22)下，在與處理?xiàng)l件2l幾乎相同的位置上，新確認(rèn)了變換物的寬的條帶。
通過以上確認(rèn)了，使多聚體脂聯(lián)素(HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad及ULMW-Ad)與還原劑、酸或其鹽作用，則由多聚體脂聯(lián)素生成新的變換物。分別推定，在處理?xiàng)l件21所生成的變換物是二聚體、在添加還原劑的條件(14，16，18，20)下生成的變換物為三聚體、在處理?xiàng)l件22生成的變換物為單體。通過切出條帶的解析確認(rèn)了ULMW-Ad為三聚體、LMW-Ad是與白蛋白結(jié)合的三聚體脂聯(lián)素。
表3


(+)＝減少(++)＝不變(+++)＝增加或生成變換物(-)＝消失或未生成變換物2)蛋白酶處理向50mM磷酸緩沖液(pH8.0)中添加精制mAd及各種蛋白酶(均是市售品)至1mg/ml，在37℃保持60分鐘。用PAGE(2-15％)分離處理后的溶液，通過CBB進(jìn)行蛋白染色。將Tris-HCl(pH8.5)、不添加DTT(處理?xiàng)l件1)的染色圖作為對照，觀察在各處理?xiàng)l件下相當(dāng)于HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad及ULMW-Ad的各成分的條帶的增減及新的變換物色帶的生成(表4)。
在處理?xiàng)l件23～25中，確認(rèn)了HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad及ULMW-Ad4成分所有的染色帶均消失，同時(shí)在低分子量域出現(xiàn)了各成分的變換物的新染色帶。在處理?xiàng)l件26～28中，確認(rèn)了ULMW-Ad、LMW-Ad及MMW-Ad成分消失，同時(shí)在低分子量域出現(xiàn)了各成分的變換物的新染色帶。此時(shí)，HMW-Ad成分的染色帶未見變化。
通過上述，確認(rèn)了使多聚體脂聯(lián)素(HMW-Ad、MMW-Ad、LMW-Ad及ULMW-Ad)與蛋白酶作用，則由多聚體脂聯(lián)素生成新的變換物。這些變換物的在PAGE(2-15％)上的染色帶的檢出位置，雖然會隨作用的蛋白酶而有所不同，但是在30～42kDa的范圍。通過將這些變換物的凝膠切出進(jìn)行氨基酸分析結(jié)果明確了，它們?yōu)榍驙钪?lián)素。
另外，關(guān)于處理?xiàng)l件26～28的蛋白酶可知，不進(jìn)行酸或其鹽的處理，使HMW-Ad成分變換成MMW-Ad成分后，通過進(jìn)行蛋白酶處理，所有的成分均可變換成新的變換

的吸收。從標(biāo)準(zhǔn)品的顯色值，換算經(jīng)各前處理液的血清中的脂聯(lián)素總量(濃度)，與經(jīng)50mM Tris-HCl(pH6.8，2％SDS)溶液煮沸處理的條件對照，進(jìn)行相關(guān)分析(表5)。
結(jié)果可知，不添加表面活性劑的酸處理?xiàng)l件中，相關(guān)系數(shù)良好，回歸式中的斜率為0.45，與對照的換算值相比為低值。在表面活性劑共存的情況下，相關(guān)系數(shù)提高的同時(shí)，測定值具有接近于對照的換算值的傾向。特別是，陰離子性表面活性劑共存的情況，該效果顯著，如使用本發(fā)明的前處理方法，則不用煮沸試樣，就可能測定試樣中的脂聯(lián)素總量。
表5


(對照)50mM Tris-HCl pH6.8(2％SDS)煮沸處理
權(quán)利要求
1.脂聯(lián)素測定用試樣的前處理方法，所述前處理方法是用于免疫學(xué)測定試樣中脂聯(lián)素總量的脂聯(lián)素測定用試樣的前處理方法，其特征在于，向含有脂聯(lián)素的試樣中添加還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種，不用與試樣一起進(jìn)行煮沸而起作用。
2.如權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征還在于，免疫學(xué)測定方法是利用負(fù)載有抗脂聯(lián)素抗體的不溶性載體的方法。
3.如權(quán)利要求1或2所述的前處理方法，其特征還在于，蛋白酶是來自微生物的蛋白酶或通過基因重組而得到的蛋白酶。
4.如權(quán)利要求3所述的前處理方法，其特征還在于，微生物是選自桿菌屬、鏈霉菌屬及曲霉屬的微生物。
5.前處理劑，所述前處理劑含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種，是脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定用試樣的前處理劑，其特征在于，不用與試樣一起進(jìn)行煮沸而作用于試樣。
6.如權(quán)利要求5所述的前處理劑，其特征還在于，免疫學(xué)測定方法是利用負(fù)載有抗脂聯(lián)素抗體的不溶性載體的方法。
7.如權(quán)利要求5或6所述的前處理劑，其特征還在于，蛋白酶是來自微生物的蛋白酶或由基因重組技術(shù)而得的蛋白酶。
8.如權(quán)利要求7所述的前處理劑，其特征還在于，微生物是選自桿菌屬、鏈霉菌屬及曲霉屬的微生物。
9.試樣中脂聯(lián)素總量的測定方法，其特征在于，向含有脂聯(lián)素的試樣中加入還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種，不用與試樣一起進(jìn)行煮沸而起作用后，進(jìn)行免疫學(xué)測定脂聯(lián)素。
10.如權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征還在于，免疫學(xué)測定方法是利用負(fù)載有抗脂聯(lián)素抗體的不溶性載體的方法。
11.如權(quán)利要求9或10所述的測定方法，其特征還在于，蛋白酶是來自微生物的蛋白酶或通過基因重組技術(shù)而得的蛋白酶。
12.如權(quán)利要求11所述的測定方法，其特征還在于，微生物是選自桿菌屬、鏈霉菌屬及曲霉屬的微生物。
13.測定試劑，所述測定試劑是由第一試劑和第二試劑形成的脂聯(lián)素總量的免疫學(xué)測定試劑，所述第一試劑含有還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種，所述第二試劑含有負(fù)載有測定脂聯(lián)素用抗體的不溶性載體，其特征還在于，在不用煮沸進(jìn)行試樣與第一試劑的反應(yīng)的方法中使用該測定試劑。
全文摘要
提供了為了通過免疫學(xué)測定法可簡便、迅速且正確測定混存有各種多聚體的生物體試樣中的脂聯(lián)素的前處理方法。它是用于免疫學(xué)測定試樣中的脂聯(lián)素總量的脂聯(lián)素測定用試樣的前處理方法，其特征在于，使含有脂聯(lián)素的試樣與還原劑、酸或其鹽、表面活性劑及蛋白酶中的至少1種作用。
文檔編號G01N33/74GK1864067SQ200480029098
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者海老沼宏幸, 矢后弘和, 秋元優(yōu)夏, 宮崎修, 門脇孝, 山內(nèi)敏正 申請人:第一化學(xué)藥品株式會社, 株式會社東京大學(xué)Tlo