專利名稱：一種基因工程包涵體的洗滌方法
一種基因工程包涵體的洗滌方法技術領域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種基因工程包涵體的洗滌方法，特別涉及了一種利用中空纖維濾膜對基因工程包涵體進行洗滌的方法。
背景技術：
基因重組技 術可以用來大量生產自然界極其微量的功能蛋白或多肽，大腸桿菌等原核生物因其生長速度快，營養(yǎng)要求低，通常作為基因重組技術的首選宿主菌。然而，用大腸桿菌高效表達的重組蛋白常常會形成不溶性的且無活性的包涵體。包涵體是重組基因在表達過程中因蛋白質的二級結構錯誤折疊所形成的一種致密性的結構，這種結構有利于重組蛋白不被胞內蛋白酶水解，保證了重組蛋白的高效表達。基因工程包涵體可以通過變性劑將其溶解，再緩慢除去變性劑，從而使其恢復天然活性。
由于基因包涵體不僅僅含有重組蛋白，還有外膜蛋白，質粒DNA和其他雜質，因此為了提高包涵體的質量，增加其中重組蛋白的含量，以利于重組蛋白重新折疊恢復其天然構象，通常需要將包涵體經過充分洗滌，以除去細胞膜等脂溶性組分，雜蛋白，核酸等物質， 提高包涵體的純度。包涵體洗滌的傳統(tǒng)方法為第一次洗滌加入含一定比例去垢劑(曲拉通、吐溫等)的緩沖液，將包涵體懸液攪拌洗滌一定時間后離心去除上清，收集沉淀；第二次洗滌加入含低濃度變性劑(2-4M脲、1-2M鹽酸胍)的緩沖液，將包涵體懸液攪拌洗滌一定時間后離心去除上清，收集沉淀；根據需要再洗滌第三次或第四次，同樣離心去除上清，收集沉淀。李曉紅等在《重組人胰島素制備工藝》(《四川大學學報》，2007年)中報道了重組人胰島素原包涵體的收集和洗滌，包涵體先用含2 M尿素的緩沖液洗滌第一次，4度17000g 離心收集沉淀；沉淀再用含2%脫氧膽酸鈉的緩沖液洗滌第二次，4度17000g離心收集沉淀；沉淀再用Tris緩沖液洗洚兩次，同樣4度17000g離心收集沉淀。但對洗漆得到的包涵體的純度和收率沒有詳細的數據報道。許崇利等在《重組人Y-干擾素純化工藝的建立》 (《中國獸藥雜志》，2012年)中報道了 Y-干擾素包涵體的純化，加入洗滌液洗滌四次，以 10000r/m離心收集包涵體，電泳檢測其純度達90%。
傳統(tǒng)洗滌方法需要使用高速離心機或者連續(xù)流離心機來完成，由此帶來一系列的問題如成本高昂、操作繁瑣、容易產生污染、維修成本高、工藝放大困難。雖然獲得的包涵體純度較高，但包涵體的收率較低。中空纖維過濾膜以其獨特的開放式流路結構，溫和低剪切力，可以很好地滿足對剪切力敏感的生物大分子以及成分較復雜的生物樣品不同規(guī)模的濃縮和過濾需要，廣泛用于單抗、病毒類疫苗、菌苗、多糖、核酸、中草藥、生化藥以及乳品飲料等各個領域。中空纖維膜開放式的流路，可以直接處理菌體發(fā)酵液或高密度細胞培養(yǎng)液等含有固體的復雜料液而不會堵塞流路，省去離心等繁瑣的前處理步驟。然而，目前還沒有將中空纖維濾膜用于包涵體洗滌的文獻報道。發(fā)明內容
為了解決現在基因工程包涵體洗滌工藝中存在的問題，達到減少復雜操作，易于工業(yè)化生產的目的，本發(fā)明人經過大量創(chuàng)造性試驗研究，提供一種利用中空纖維濾膜進行基因工程包涵體洗滌的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現的
一種基因工程包涵體的洗滌方法，包括如下步驟
a、膜平衡取中空纖維膜，用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時，L/ m2 /hr、LMH)為 10 30 LMH ；
b、第一次洗滌配制洗滌緩沖液I，按5 15 :1 (V/W)加入包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力(trans-membrane pressure、TMP)為 5 15 bar，透過通量(Flux，單位升/平米/小時，L/m2/hr、LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液I的組成為20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ_100，ρΗ9· 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐溫-20，ρΗ9· O ；
C、第二次洗滌配制洗滌緩沖液II，按5 15:1 (V/W)加入步驟b處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力 (trans-membrane pressure>TMP)為 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時， L/ m2 /hr、LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液II的組成為20 100 mM Tris_HCl，2 4 M尿素，pH9. 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 3 M 鹽酸胍，ρΗ9· O ；
d、第三次洗滌配制洗滌緩沖液III，按5 15:1 (V/W)加入步驟c處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力為 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時，L/ m2 /hr,LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液； 所述洗滌緩沖液III的組成為20 100 mM Tris-HCl, pH9. O。
中空纖維濾膜的材質會顯著影響濾膜的化學耐受性、過濾速度、吸附性能，因此本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌所用的中空纖維濾膜進行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的材質為聚醚砜(PES)，或是再生纖維素(RC)，或是醋酸纖維素(CA)，或是親水性聚偏氟乙烯(PVDF)。
中空纖維濾膜同時具有多種纖維管內徑可選，應用于不同性質的料液，因此本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌的中空纖維濾膜的纖維管內徑進行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的纖維管內徑為O. 75-1. 75mm。
另外，本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌的中空纖維濾膜的濾膜孔徑進行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的濾膜孔徑為750 k、 O. I μπι、0. 2 μ m 或 O. 45 μ m。
本發(fā)明與現有技術相比具有如下優(yōu)點和顯著的進步
中空纖維膜開放式的流路，可以直接處理菌體發(fā)酵液或高密度細胞培養(yǎng)液等含有固體的復雜料液而不會堵塞流路，省去離心等繁瑣的前處理步驟。本發(fā)明利用中空纖維膜處理基因工程包涵體的洗滌，可實現連續(xù)自動操作，工藝過程簡單，操作方便，提高了生產效率，得到的包涵體純度高、收率高、特別適合于大規(guī)模工業(yè)化生產上的應用。
具體實施方式
現通過以下實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，實施例僅用于例證的目的， 不限制本發(fā)明的范圍，同時本領域普通技術人員根據本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內。
實施例I大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將3 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通-Χ_100，pH9. O)加入O. 2公斤大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為 10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將5 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl,pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經計算為87%。
實施例2大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 5%吐溫_20，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將45 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 3 M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將45 L洗滌緩沖液IIKlOO mM Tris_HCl，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為91%，包涵體收率經計算為86%。
實施例3大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為O. 2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為10 bar，透過通量為20 LMH。將75 L洗滌緩沖液 I (100 mM Tris-HCl, 5%曲拉通-Χ_100，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將45 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl,4 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為88%，包涵體收率經計算為85%。
實施例4大腸桿菌表達重組人Y -干擾素包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH0將3 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通-X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人Y-干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將25 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為89%，包涵體收率經計算為86%。
實施例5大腸桿菌表達重組人Y -干擾素包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 1%吐溫-20，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人Y -干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將15 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, I M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將45 L洗滌緩沖液IIKlOO mM Tris_HCl，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為85%，包涵體收率經計算為89%。
實施例6大腸桿菌表達重組人Y -干擾素包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將25 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 5%曲拉通X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人Y-干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 4 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經計算為85%。
實施例7大腸桿菌表達重組人粒 細胞集落刺激因子包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將I L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通X_100，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人粒細胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將I. 5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將7. 5 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl,pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為92%，包涵體收率經計算為89%。
實施例8大腸桿菌表達重組人粒細胞集落刺激因子包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 5%吐溫_20，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人粒細胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進液。
將25 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 3 M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液III加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為87%，包涵體收率經計算為88%。
實施例9大腸桿菌表達重組人粒細胞集落刺激因子包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質，纖維管內徑為I mm，濾膜孔徑為O. 2 ym)先用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將25 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl，5%曲拉通X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達重組人粒細胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液II (20 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液， 攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH,包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。
將75 L洗滌緩沖液III加入上 述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進液。收集得到的包涵體經變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經計算為87%。
權利要求
1.一種基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于包括如下步驟a、膜平衡取中空纖維膜，用純化水潤洗平衡，調整進水流速使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH ；b、第一次洗滌配制洗滌緩沖液I，按5 15:1 (V/W)加入包涵體，攪拌使成懸浮液， 將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH, 包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液I的組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ-100，ρΗ9· 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐溫-20，pH9. O ；C、第二次洗滌配制洗滌緩沖液II，按5 15 :1 (V/W)加入步驟b處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH,包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液II的組成為20 100 mM Tris_HCl，2 4 M尿素，pH9. O，或者組成為20 100 mM Tris-HCl，I 3 M 鹽酸胍，pH9. O ；d、第三次洗滌配制洗滌緩沖液III，按5 15 1 (V/W)加入步驟c處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液III的組成為20 100 mM Tris-HCl, ρΗ9· O。
2.根據權利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的材質為聚醚砜、再生纖維素、醋酸纖維素或親水性聚偏氟乙烯。
3.根據權利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的纖維管內徑為O. 75 I. 75mm。
4.根據權利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的濾膜孔徑為 750 k、0. I μπκθ.2 μ m 或 O. 45 μ m。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程包涵體的洗滌方法，該方法采用中空纖維膜處理基因工程包涵體的洗滌，可實現連續(xù)自動操作，工藝過程簡單，操作方便，提高了生產效率，得到的包涵體收率高、純度高、特別適合于大規(guī)模工業(yè)化生產上的應用。
文檔編號C07K1/34GK102977183SQ20121053305
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2012年12月11日
發(fā)明者趙志全, 熊繼元, 柳常青 申請人:魯南新時代生物技術有限公司