一種重組蛋白ie1包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法及定量檢測(cè)人血漿hcmv中和抗體試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組蛋白IE1包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法及定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒，涉及一種新的重組抗原IE1包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法，以及在其基礎(chǔ)上制備ELISA定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒。所述方法包括用基因工程方法制備特異性重組HCMVIE1抗原、蛋白純化、酶標(biāo)反應(yīng)板包被以及定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體ELISA試劑盒的組裝。與其它市售ELISA試劑盒相比，本發(fā)明能夠高度特異、敏感、快速地檢測(cè)血漿中具有中和作用的HCMV特異性IgG抗體滴度，檢測(cè)的結(jié)果與微量中和試驗(yàn)的結(jié)果高度一致。本發(fā)明主要供實(shí)驗(yàn)室研究、臨床篩查和血制品企業(yè)篩選高滴度HCMV靜脈注射丙種球蛋白生產(chǎn)原料使用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種重組蛋白IE1包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法及定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、診斷試劑和血液制品研發(fā)領(lǐng)域，特別是涉及一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法及定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)屬于人類(lèi)皰疫病毒β亞科病毒，在人群中的感染極為普遍，呈世界性分布，血清流行病學(xué)調(diào)查表明，40?100%成人有HCMV抗體。目前的研究表明HCMV是人類(lèi)先天性感染最常見(jiàn)的病原體之一，對(duì)孕婦及胎兒影響巨大，常造成流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、發(fā)育遲緩及遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等疾病。
[0003]孕婦在孕期(尤其是妊娠早期)因激素水平的急劇變化、心理和免疫水平等改變，使原發(fā)性感染機(jī)會(huì)增加，激活潛伏的HCMV、或感染新的HCMV毒株產(chǎn)生再發(fā)感染，病毒經(jīng)胎盤(pán)傳給胎兒，引起胎兒先天性感染。先天性HCMV感染是引起出生缺陷最常見(jiàn)和最重要的病毒病因，主要表現(xiàn)為神經(jīng)損傷如引起小腦畸形、室周鈣化、腦水腫、小眼畸形等。非遺傳性感音神經(jīng)聽(tīng)覺(jué)喪失(sensorineural hearing loss, SNHL)是先天性HCMV感染最常見(jiàn)的后遺癥表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)達(dá)國(guó)家先天性HCMV感染率比發(fā)展中國(guó)家低，如意大利為
0.47%(Cl:0.22 - 1.0%);瑞典為 0.46%(Cl:0.37 - 0.58%);而岡比亞則高達(dá) 13.6%。在美國(guó)，每年約有40000新生兒發(fā)生先天性HCMV感染，其中10%?15%發(fā)生遲發(fā)性后遺癥，主要為SNHL、智力障礙、學(xué)習(xí)能力低下等神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，其中因SNHL每年付出高達(dá)10億美元的醫(yī)療帳單。2011年，我國(guó)出生人口約1615萬(wàn)，按照發(fā)達(dá)國(guó)家先天性HCMV感染率來(lái)計(jì)算，我國(guó)每年約有16.2萬(wàn)例先天性HCMV感染，家庭和國(guó)家都將為此支出高昂的成本。根據(jù)目前的臨床資料顯示，實(shí)際上先天性HCMV感染的人數(shù)可能是16.2萬(wàn)人/年的2?3倍。此夕卜，HCMV感染也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一。
[0004]鑒于HCMV對(duì)人類(lèi)的巨大危害，人們一直在尋找更好的治療方法。最常用的抗病毒藥物為更昔洛韋，但是由于長(zhǎng)期使用目前已經(jīng)出現(xiàn)了很多耐藥毒株，尤其是在移植患者和艾滋病患者中更為常見(jiàn)。具有高中和滴度的特異性HCMV IgG已被證明具有良好的治療作用，而且不產(chǎn)生耐藥性。因此，篩選含高HCMV中和滴度的血漿，制備靜脈丙種球蛋白制劑，將有助于對(duì)HCMV感染的治療。HCMV雖然在人群中的感染率很高，HCMV特異性IgG的含量也不低，但是體外病毒中和實(shí)驗(yàn)證明只有約5%的高滴度血漿才具中和病毒的能力。目前雖有部分用于檢測(cè)人血漿中HCMV IgG滴度的ELISA試劑盒，但其結(jié)果與病毒中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致。因此，用這些試劑盒篩選的高滴度血漿并不能用于特異性靜脈丙種球蛋白制劑生產(chǎn)。這與ELISA試劑盒選用的包被抗原有關(guān)，HCMV感染機(jī)體主要由ppl50蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，因此市售的ELISA試劑盒多采用ppl50蛋白作為包被抗原，但針對(duì)ppl50蛋白的抗原并不具有中和病毒的能力。IEl基因是HCMV的立即早期基因，控制病毒DNA的復(fù)制，它在病毒感染2h即開(kāi)始表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示IEl的單克隆抗體可以阻斷HCMV感染易感細(xì)胞。鑒于此，我們選取了編碼IEl基因的部分序列基因(1006?1521nt)，采用基因重組技術(shù)，原核表達(dá)，親和層析后獲得一種融合IEl重組蛋白。經(jīng)過(guò)改造過(guò)的IEl重組蛋白既保留了其抗原性，又提高原核表達(dá)量。采用該重組蛋白包被ELISA板，我們成功地用間接ELISA法，快速篩查出中和抗體含量更高的人血漿，其結(jié)果與中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致率大于96.0%

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的就是為了彌補(bǔ)已有技術(shù)的缺陷，提供一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法及定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，包括以下步驟:
[0008](1)將IEl蛋白抗原用pH為9-10的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔板，IOOng/孔，置濕盒中4°C，22-24小時(shí)，PBST洗板3次，每次2_4min，然后拍干；
[0009](2)每孔加入100 μ I含1%BSA和10%小牛血清的PBS，37°C孵育lh，洗板3次后密封，即得所述的重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0010]一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，所述的重組蛋白IEl的氨基酸殘基序列如SEQ N0.1所示。
[0011]一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，所述的重組蛋白IEl的DNA核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
[0012]一種ELISA定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒，所述的試劑盒使用的酶標(biāo)反應(yīng)板為權(quán)利要求1所述的重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0013]本發(fā)明中所述的IEl重組蛋白的氨基酸序列(SEQ N0.1):
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將IEl蛋白抗原用pH為9-10的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔板，1OOng/孔，置濕盒中4°C，22-24小時(shí)，PBST洗板3次，每次2_4min，然后拍干； (2)每孔加入100μ 1含1% BSA和10%小牛血清的PBS，37°C孵育Ih，洗板3次后密封，即得所述的重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，其特征在于，所述的重組蛋白IEl的氨基酸殘基序列如SEQ N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，其特征在于，所述的重組蛋白IEl的DNA核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
4.一種ELISA定量檢測(cè)人血漿HCMV中和抗體試劑盒，其特征在于所述的試劑盒使用的酶標(biāo)反應(yīng)板為權(quán)利要求1所述的重組蛋白IEl包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103901209SQ201410056988
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】王明麗, 甘霖 申請(qǐng)人:王明麗, 甘霖