專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)阿維菌素的基因工程方法及其專(zhuān)用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)阿維菌素的基因工程方法及其專(zhuān)用菌株。
背景技術(shù)：
阿維菌素(avermectin，AVM)是一種由阿維鏈霉菌(Sti^ptomyces avermitilis) 發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，它有八個(gè)組分(Ala, Alb, A2a, A2b，Bla, Bib, B2a, B2b), 其中Bla組分的殺蟲(chóng)活性最強(qiáng)，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)、螨蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物具有良好的殺滅作用，殺蟲(chóng)活性比一般化學(xué)農(nóng)藥高出幾十倍。阿維菌素的作用機(jī)理與常規(guī)化學(xué)殺蟲(chóng)劑不同，它的作用靶點(diǎn)是線(xiàn)蟲(chóng)及節(jié)肢動(dòng)物類(lèi)寄生蟲(chóng)的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)Y-氨基丁酸(GABA)，對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性很小， 選擇性極高。該抗生素在植物中殘留時(shí)間很短，并且在土壤中很快被微生物分解為無(wú)毒物質(zhì)。由于阿維菌素的這些突出的優(yōu)點(diǎn)，其被公認(rèn)為是一種最為安全有效的微生物來(lái)源的殺蟲(chóng)劑，因此它在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥和獸用上具有非常廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)以阿維菌素為母體，還可以開(kāi)發(fā)出一系列活性更高、選擇性更強(qiáng)、使用更加安全的衍生新品種， 已商品化的品種包括伊維菌素、?，斁亍⒍嗬?、埃珀利諾菌素和塞拉菌素等。此外，近年來(lái)又有研究者發(fā)現(xiàn)阿維菌素有抗腫瘤的功效，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗藥性也有一定的抑制作用。目前，阿維菌素已在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但我國(guó)阿維菌素的生產(chǎn)菌株還存在著發(fā)酵單位低，生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，如何提高阿維菌素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，將為我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展起到促進(jìn)作用。此外，不僅是阿維菌素，如何篩選和優(yōu)化菌株、使產(chǎn)率和原料利用率實(shí)現(xiàn)最大化是我國(guó)微生物發(fā)酵工程面臨的普遍問(wèn)題。目前用于提高鏈霉菌的抗生素產(chǎn)量的方法主要包括兩大類(lèi)，一類(lèi)是傳統(tǒng)的誘變育種方法，通過(guò)物理化學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變，然后在誘變后代中篩選高產(chǎn)菌株；另一類(lèi)是通過(guò)遺傳學(xué)的方法，對(duì)菌株進(jìn)行直接的遺傳改變，提高抗生素的產(chǎn)量。通過(guò)物理化學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變雖然已經(jīng)取得了一定的成績(jī)，得到了大量的高產(chǎn)菌株，但它們的不足之處也很明顯，主要包括耗費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間，篩選工作比較復(fù)雜，存在一定盲目性，在引入有利變異的同時(shí)可能也會(huì)產(chǎn)生很多有害的變異，而有害的菌種變異往往會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化和放大； 這些傳統(tǒng)的菌種選育方式由于對(duì)引起功能變化的生物學(xué)基礎(chǔ)不了解，因此較難推廣應(yīng)用于其他菌種。隨著細(xì)菌基因組研究的不斷深入，對(duì)細(xì)菌基因功能的認(rèn)識(shí)不斷深刻，人們?cè)絹?lái)越傾向于用遺傳學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行改造。用遺傳學(xué)的方法可以將功能已知的基因進(jìn)行改造， 增強(qiáng)了操作的針對(duì)性，而且使工作量大大降低，篩選時(shí)間也得到縮短。因此，通過(guò)基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維菌素的產(chǎn)量，具有重要的意義。2001年Kitasato研究所完成了阿維鏈霉菌的基因組測(cè)序，對(duì)其中負(fù)責(zé)阿維菌素生物合成基因簇進(jìn)行序列和功能分析，該基因簇全長(zhǎng)821Λ，共有18個(gè)開(kāi)放閱讀框架。基因簇內(nèi)部有4個(gè)大的閱讀框架(AveAl-AveA2和AveA3-AveA4)，編碼多功能的聚酮體合成酶； aveC和aveE基因位于aveAl_aveA2和aveA3_aveA4基因之間，與聚酮體的修飾有關(guān)；在基因簇的右側(cè)鄰近aveA4的上游，是一套涉及齊墩果二糖的合成和轉(zhuǎn)移的8個(gè)基因(aveBI-aveBV III)；緊鄰aveAl的上游(左方)是編碼C5_0_甲基轉(zhuǎn)移酶的aveD，負(fù)責(zé)將甲基轉(zhuǎn)給阿維菌素B的C5的OH上而形成阿維菌素A。aveF緊鄰aveD的下游，二者轉(zhuǎn)錄方向一致，可能屬于同一轉(zhuǎn)錄單位。aveF編碼C5酮基還原酶，催化阿維菌素B的生成。aveR位于 aveF的下游(但轉(zhuǎn)錄方向相反)，屬于途徑特異性調(diào)控基因，是阿維菌素生物合成全基因簇的正調(diào)控基因。在抗生素產(chǎn)生過(guò)程中基因水平的分子調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，通過(guò)遺傳學(xué)方法對(duì)鏈霉菌進(jìn)行改造，提高抗生素產(chǎn)量。主要是通過(guò)改造抗生素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)基因來(lái)進(jìn)行的，有既與抗生素生物合成相關(guān)又與形態(tài)分化相關(guān)的調(diào)控基因，如bldA，relC, relA等；也有參與抗生素生物合成的全局性調(diào)控基因，如absA，absB, afsR等；還有參與抗生素生物合成的特異性調(diào)控基因，如ActII-0RF4，aveR, dnrl，redD，sanG，ccaR等。對(duì)抗生素生物合成起正調(diào)節(jié)作用的基因，可以通過(guò)提高它在菌株中的拷貝數(shù)或者改變啟動(dòng)子提高其表達(dá)量來(lái)提高抗生素的產(chǎn)量，對(duì)起負(fù)調(diào)節(jié)作用的基因，則可以通過(guò)敲除該基因來(lái)提高抗生素的產(chǎn)量。但是， 通過(guò)提高拷貝數(shù)的方法得來(lái)的菌株往往穩(wěn)定性較差，因?yàn)楦呖截惖倪z傳載體往往不穩(wěn)定， 容易丟失，若考慮到后期的工業(yè)生產(chǎn)，可能更多嘗試通過(guò)同源重組整合到染色體上，更加穩(wěn)定的維持高產(chǎn)相關(guān)基因在工程菌株的穩(wěn)定存在。對(duì)能同時(shí)調(diào)控多種抗生素產(chǎn)量的調(diào)節(jié)基因進(jìn)行改造比改造只調(diào)控單一抗生素產(chǎn)量的調(diào)節(jié)基因更加有效。在阿維鏈霉菌中，對(duì)aveC隨機(jī)突變后能夠得到多拉菌素“1”組分含量提高的突變株；對(duì)途徑特異性調(diào)控基因aveR，增加拷貝數(shù)并未提高阿維菌素產(chǎn)量，反而使得宿主菌株不再產(chǎn)生阿維菌素。在aveR基因的上游存在負(fù)調(diào)控基因aveRl和aveR2，這兩個(gè)基因中的任何一個(gè)基因或同時(shí)兩個(gè)基因失活都會(huì)使阿維菌素產(chǎn)量有大幅度的提高。(美國(guó)專(zhuān)利 US619759UtutZman-EngWall)。位于阿維菌素生物合成基因簇中的調(diào)控基因外，研究人員也致力于尋找其它調(diào)控基因，特別是全局性調(diào)控基因(global regulatorygene)，如afsR2 和orfX，從而更有效地提高阿維菌素的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與阿維鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素相關(guān)的蛋白。本發(fā)明提供的蛋白，是突變后的HrdB蛋白，具體是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。為了使1)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)編碼序列如序列表中序列3所示；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的基因的重組載體、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將含有啟動(dòng)子和權(quán)利要求2或3所述的基因的DNA片段插入質(zhì)粒PSET152的多克隆位點(diǎn)中，得到的重組表達(dá)載體；所述含有啟動(dòng)子和權(quán)利要求2或3所述的基因的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的基因的重組菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的阿維鏈霉菌中得到的重組菌。
8.如權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于所述目的阿維鏈霉菌為阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)ZLX6003 CGMCC Ns .3229。
9.如權(quán)利要求6-8中任一所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)ZLX6056 CGMCC Ns .3796。
10.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的基因或者權(quán)利要求6-9中任一所述的重組菌在生產(chǎn)阿維菌素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)阿維菌素的基因工程方法及其專(zhuān)用菌株。本發(fā)明提供的蛋白，是突變后的HrdB蛋白，具體是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的突變后的hrdB基因?qū)隯LX6003菌株中后得到的重組菌，在搖瓶培養(yǎng)240小時(shí)后的阿維菌素產(chǎn)量可達(dá)5732.05±91.26μg/ml。本發(fā)明工程菌ZLX6056，在180噸罐上的生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明該基因工程菌保持了原高產(chǎn)菌株的優(yōu)良形狀，產(chǎn)量達(dá)到6382ug/ml。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102241750SQ20101017318
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者劉梅, 卓英, 周賢龍, 張立新, 高弘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所