專利名稱：柄型菌素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及柄型菌素(ansamitocin)，特別是能轉(zhuǎn)變?yōu)槊赖悄敬嫉谋途氐闹苽浞椒ā?br> 背景技術(shù)：
美國(guó)專利5,208,020描述了強(qiáng)細(xì)胞毒性美登木素生物堿(maytansinoid)藥物和它們的治療應(yīng)用。這些藥物能從諸如束絲放線菌屬之類的微生物發(fā)酵生產(chǎn)的柄型菌素前體制備。
在規(guī)定的培養(yǎng)條件下，珍貴束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)等束絲放線菌(Actinosynnema spp.)產(chǎn)生多種相關(guān)的柄型菌素。主要的產(chǎn)物是在C-3位置帶有異丁酰部分的柄型菌素P-3。次要產(chǎn)物是僅在C-3?；ф溨杏袇^(qū)別的其他的柄型菌素，P-1(ethionyl moiety)，P-2(丙?；糠?，P-3′(丁?；糠?，P-4(異戊?；糠?和P-4′(戊?；糠?。所有這些化合物可以通過還原裂解產(chǎn)生一種共同的產(chǎn)物美登木醇(形成P-0)。另外，還以低水平產(chǎn)生多種其他柄型菌素，它們?cè)诜肿拥钠渌奈恢帽恍揎?羥基化或n-脫甲基)。這些不能通過脫酰作用產(chǎn)生所希望的P-0。
美國(guó)專利4,162,940；4,228,239；4,356,265；和4,450,234描述了從束絲放線菌生產(chǎn)柄型菌素P-3的方法?？傊@些方法需要將助濾劑和與水混溶的溶劑加入到整個(gè)發(fā)酵液中，清除固體，用不與水混溶的溶劑萃取含水成分，濃縮和用石油醚沉淀，采用硅層析純化沉淀物，結(jié)晶后進(jìn)一步層析純化或重結(jié)晶。其它方法用Diaion HP-10吸附取代硅層析，隨后進(jìn)一步用溶劑萃取并結(jié)晶。
這些方法能獲得可接受的柄型菌素P-3的產(chǎn)率，但是這些方法涉及很多個(gè)在大規(guī)模生產(chǎn)操作中受到限制的階段，這些限制可以是柄型菌素化合物的極強(qiáng)毒性以及保證操作人員安全的必要性所造成的。因此，需要另外的，更安全、采用更少和更多受限步驟的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面是提供包括如下步驟的制備純化的柄型菌素的方法a.在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生柄型菌素的微生物；b.為便于用溶劑萃取柄型菌素而處理培養(yǎng)基；c.采用芳香烴溶劑從培養(yǎng)基中萃取柄型菌素；e.濃縮所萃取的柄型菌素和 f.通過結(jié)晶純化柄型菌素。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供包括如下步驟的制備純化的柄型菌素的方法a.在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生柄型菌素的微生物；b.采用芳香烴溶劑從培養(yǎng)基中萃取柄型菌素；c.濃縮所萃取的柄型菌素；d.通過結(jié)晶純化柄型菌素。
發(fā)明詳述本說明書中引用的所有的出版物，包括但不局限于專利和專利申請(qǐng)，已全文引入本文作為參考。
本發(fā)明提供了不含過濾步驟的制備純化的柄型菌素的方法。
這些方法包括如下步驟，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生柄型菌素的微生物，處理培養(yǎng)基，使柄型菌素從這些微生物釋放至培養(yǎng)基中，以便用溶劑萃取，用芳香烴溶劑從處理過的培養(yǎng)基中萃取柄型菌素，濃縮所萃取的柄型菌素，并用結(jié)晶法純化柄型菌素?；蛘撸梢允÷蕴幚聿襟E。
純化的柄型菌素可以還原為美登木醇，它們包括柄型菌素P-3，P-1，P-2，P-3′，P-4和P-4′。純化的柄型菌素僅含有非常少的非必需柄型菌素，它們?cè)诜肿又械钠渌恢蒙蠋в行揎?。產(chǎn)生柄型菌素的優(yōu)選微生物是束絲放線菌。特別優(yōu)選珍貴束絲放線菌ATCC 31565。也特別優(yōu)選珍貴束絲放線菌ATCC31281。按照眾所周知的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)例如美國(guó)專利4,450,234所公開的技術(shù)可培養(yǎng)這些微生物。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案通過處理微生物來促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)柄型菌素的釋放并使與細(xì)胞結(jié)合的柄型菌素更易于被溶劑萃取。處理方法實(shí)例包括超聲法，加壓法或升溫法。優(yōu)選加熱處理。熱處理可以在約60℃～80℃進(jìn)行。優(yōu)選在約75℃進(jìn)行熱處理，在這個(gè)溫度可殺死這些微生物并有助于用溶劑萃取柄型菌素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在萃取之前不進(jìn)行處理，因?yàn)楸途乜偭康慕?0％在培養(yǎng)基中。
柄型菌素可以采用芳香烴溶劑從培養(yǎng)基中萃取。這種芳香烴在眾多發(fā)酵液成分中對(duì)于柄型菌素具有特別的選擇性，從而確保只需要簡(jiǎn)單的后續(xù)處理方法就可以分離得到純產(chǎn)物。優(yōu)選的芳香烴溶劑是甲苯或二甲苯。由于甲苯更易于在低溫蒸發(fā)，因此更優(yōu)選甲苯。甲苯和二甲苯具有在重力下易于與水層分離而不需要機(jī)械分離的特性，因此使這種方法處理能力更大，并可提高操作人員的安全性。萃取可在約20℃到約60℃之間進(jìn)行。優(yōu)選萃取溫度為約45℃。萃取之前水溶液的pH應(yīng)該在3到9的范圍內(nèi)。pH優(yōu)選接近中性，也就是6到8之間。
一般情況下，萃取溶劑與整個(gè)培養(yǎng)液的體積比優(yōu)選為1∶1?？晒┻x擇的比率范圍可以是2∶1到1∶4。溶液在緩慢攪拌條件下混合，攪拌該混合物直到約80％以上的柄型菌素被萃取進(jìn)入有機(jī)層為止?；旌衔飪?yōu)選在重力作用下在15℃到50℃的溫度區(qū)間下靜置分層，優(yōu)選靜置溫度約45℃。
取出有機(jī)層，通過在真空中縮減溶劑的體積或采用本領(lǐng)域熟知的其它方法濃縮萃取物。在減少體積后，濃縮的萃取物可以任選溶于極性溶劑如甲醇中，采用例如PTFE之類的濾膜或諸如硅或氧化鋁之類的深度過濾器使之澄清。
通過減少不希望得到的柄型菌素的量，使用結(jié)晶法純化所希望得到的柄型菌素，特別是P-3。用于結(jié)晶法的優(yōu)選的溶劑混合物是乙酸乙酯和庚烷。按照常規(guī)方式進(jìn)行結(jié)晶。為了幫助固體結(jié)晶，可以在加入乙酸乙酯之前加入少量的甲醇或類似的極性溶劑，然后用大量的庚烷進(jìn)行處理，可選擇攪拌并冷卻直至得到結(jié)晶產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可以按照同樣的步驟進(jìn)行重結(jié)晶。
或者，在結(jié)晶之前，從發(fā)酵液萃取的不純的柄型菌素可以使用硅膠純化，例如將溶劑萃取溶液通過硅膠床。層析所用的溶劑可以是甲苯和甲苯-甲醇的混合物。其他的技術(shù)上眾所周知的溶劑也可以使用。收集含柄型菌素P-3的分餾物，減壓濃縮。
本發(fā)明還提供了通過HPLC分析柄型菌素的方法。柄型菌素P-3的定量和柄型菌素比率的分析都可以采用這種方法。下面的實(shí)施例采用了這些方法。
發(fā)酵液和萃取樣品中柄型菌素P-3的定量在4.6×250mm的C18 WatersQ Spherisorb S5 ODS2柱上進(jìn)行，該柱配有10mm的外層保護(hù)柱。紫外探測(cè)在252nm和205nm進(jìn)行。采用60％ MeCN(0.05％ TFA)的水溶液(0.05％TFA)以1ml/min等速流動(dòng)，注入體積為20μl。
對(duì)下游處理樣品中柄型菌素比率的分析可以在沒有防護(hù)柱的C8 WatersSymmetry Shield柱(3.9×150mm)中進(jìn)行。紫外探測(cè)在252nm和205nm進(jìn)行。使用梯度為35-45％的MeCN(0.05％ TFA)水溶液(0.05％ TFA)以1ml/min流動(dòng)30分鐘，在40℃重平衡10分鐘，注入體積為10μl。
層析分餾物和最終產(chǎn)物中柄型菌素比率的分析可以在不帶防護(hù)柱的C8Waters Symmetry Shield柱(3.9×150mm)上，采用LC-MS探測(cè)系統(tǒng)，大氣壓電噴離子化+ve離子模式進(jìn)行。采用完全掃描MS(從600到700amu with quad1)經(jīng)30V cone電壓Mass探測(cè)對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行鑒定。采用相同的梯度系統(tǒng)，通過MS-MS片段化(fragmentation)確定柄型菌素的類別。流速為1ml/min，梯度流動(dòng)相為30分鐘內(nèi)35-45％ MeCN(0.05％ TFA)的水溶液(0.05％ TFA)，在40℃重新平衡10分鐘，注入體積為10微升。
對(duì)廢液和其他低含量樣品中柄型菌素P-3的定量分析需要高的靈敏度，可在配有10mm防護(hù)柱的C18 Waters Spherisorb S5 ODS2柱(4.6×250mm)上采用LC-MS-MS大氣壓電噴離子化探測(cè)系統(tǒng)，+ve離子模式，30V cone電壓進(jìn)行。為了測(cè)定結(jié)構(gòu)類型，選擇主要種類的分子離子，觀測(cè)到的片段化模式表明，主要是N-甲基化的547離子和N-脫甲基化的533。采用60％ MeCN(0.05％ TFA)的水溶液(0.05％ TFA)作為均勻流動(dòng)相，流速為1ml/min，注入體積為20微升。
本發(fā)明的方法可用于制造細(xì)胞粘合劑/美登木素生物堿復(fù)合物，這種復(fù)合物可作為活化瘤的前體藥物使用。本發(fā)明的方法制備的柄型菌素可通過還原性裂解形成美登木醇，美登木醇可按照美國(guó)專利5,208,020的描述生產(chǎn)含N-甲基-L-丙氨酸的美登木素生物堿衍生物。這些衍生物然后與細(xì)胞粘合劑(優(yōu)選抗體)通過各種接頭例如二硫鍵進(jìn)行偶聯(lián)。
細(xì)胞粘合劑/美登木素生物堿復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例可采用含如下步驟的方法制備(1)將通過本發(fā)明方法制備的柄型菌素還原為美登木醇；(2)用N-甲基-L-丙氨酸衍生物使美登木醇酯化，形成含二硫鍵的美登木酯(maytansinoid ester)；(3)將通過步驟(2)制備的含二硫鍵的美登木酯還原為含巰基的美登木素生物堿；(4)將二硫代吡啶基引入細(xì)胞粘合劑；和
(5)將步驟(3)產(chǎn)生的含巰基的美登木素生物堿與步驟(4)的二硫代吡啶基細(xì)胞粘合劑通過二硫鍵連接。
本發(fā)明參考以下具體的、非限定的實(shí)施例進(jìn)行描述。
實(shí)施例1珍貴束絲放線菌培養(yǎng)液的萃取和柄型菌素的純化37升含有生產(chǎn)菌株珍貴束絲放線菌ATCC 31565的完整培養(yǎng)物(柄型菌素P-3 titer 86.3 mg/L)原位在75℃加熱60分鐘，以殺死微生物并使柄型菌素的溶劑萃取更容易。加入40升甲苯，將混合物加熱到45℃。攪拌，使上層相的甲苯進(jìn)入下層相的培養(yǎng)液，但未乳化或完全長(zhǎng)為均相。在16個(gè)小時(shí)內(nèi)完成萃取，在2小時(shí)內(nèi)利用重力分離。
采用虹吸管收集含80mg/L P-3的39升的甲苯，采用20升旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(浴溫40℃到45℃，速率約9L/hr)蒸發(fā)。在蒸發(fā)后，產(chǎn)生含有3.1g P-3；(27.6％w/w)的11.2g的流動(dòng)油。萃取產(chǎn)物通過溶于甲苯而轉(zhuǎn)移到燒瓶中，并重新蒸發(fā)(萃取階段產(chǎn)率＝97％)。
萃取物被萃取至120ml甲苯中并用375ml甲苯(三倍床體積，3bv)加載至硅膠柱(Kieselgel 60，125ml床體積裝載甲苯，4cm diam.x 10cm)中。用2bv甲苯洗柱，然后用2％ MeOH的甲苯溶液以2bv洗脫4次，再用4％ MeOH的甲苯溶液以1bv洗脫12次。以40ml/min的速度洗脫，產(chǎn)生緊密的色帶。將含有柄型菌素P-3的層析餾分7～10匯總并蒸發(fā)，得到3.2g的油狀固體，它含有2.5g的P-3。采用LC-MS和MS-MS分析這種物質(zhì)。
在這個(gè)階段，產(chǎn)物含有85.1％的柄型菌素P-3，93.9％的所希望得到的柄型菌素(層析柱階段的產(chǎn)率＝80.6％)從硅膠柱獲得的產(chǎn)物放入加熱到40℃的200ml EtOAc中。加入庚烷(200mL)并冷卻溶液。在該溶液中加入1mg純的P-3晶體(在燒瓶中其他位置也自發(fā)結(jié)晶)。室溫4小時(shí)后，采用HPLC分析上清液，測(cè)量說明0.8g P-3(30％)仍然在溶液中。進(jìn)一步加入庚烷150ml并將燒瓶再放置3小時(shí)并重新分析。0.4g的P-3(16％)仍在溶液中。燒瓶在4℃下過夜。隨后的分析表明僅有70mg的P-3(3％)保留在溶液中。采用多孔濾膜流水線吸去母液。用15mL 1∶3 EtOAc庚烷清洗白色針狀晶體2次。在30℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，真空原位干燥這些晶體10小時(shí)。獲得2.5g晶體(結(jié)晶產(chǎn)率＝86％)。
最后的產(chǎn)物含有86％的柄型菌素P-3，所需?；途?P-1，P-2，P-3，P-3′，P-4，P-4′)總量為98.4％。
實(shí)施例2珍貴束絲放線菌培養(yǎng)液的萃取和柄型菌素的純化1,100L含有生產(chǎn)菌株珍貴束絲放線菌ATCC 31565的完全培養(yǎng)液(柄型菌素P-3 titer 75.1 mg/L，82.6g P-3)，在75℃原位加熱60分鐘殺死這些微生物并使柄型菌素的溶液萃取更容易。在加熱殺死微生物的過程后保留有77.6g的P-3。加入等體積的預(yù)熱到45℃的甲苯并將混合物保持45℃的溫度。攪拌，使上層相的甲苯被萃取至下層相的培養(yǎng)液中，但未乳化或完全成為均相。萃取進(jìn)行45個(gè)小時(shí)，然后在重力作用下分離30分鐘(萃取階段產(chǎn)率90.3％)。
含有柄型菌素的1127L甲苯萃取液采用降膜蒸發(fā)器(FFE)濃縮至22L。將濃縮物轉(zhuǎn)移到50L的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀并蒸發(fā)以使體積縮小(蒸發(fā)速率14.6L/hr)。采用20L甲苯洗FFE2次，并使洗液流經(jīng)蒸發(fā)儀以確保產(chǎn)物的完全轉(zhuǎn)移。濃縮物蒸發(fā)到干燥。
干的萃取物加入7.2L的含有4％甲醇的甲苯中并加載到硅膠柱(Kieselgel 60，4.8L床體積裝了含4％甲醇的甲苯，15.0cm diam.x 27.0cm，加載速率120mL/min)。采用含4％甲醇的甲苯以227-384mL/min的流速等相洗脫此柱，獲得緊密的層析帶。初始分餾物是一個(gè)床體積，分餾物3到6按半個(gè)床體積收集。采用TLC(Kieselgel 60 F254 plates，在含5％甲醇的二氯甲烷中運(yùn)行，254nm紫外顯象)監(jiān)測(cè)分餾物并用HPLC和LC-MS監(jiān)測(cè)含有柄型菌素的餾分。根據(jù)HPLC和LC-MS對(duì)于餾分的分析選擇結(jié)晶的餾分，以便最佳回收柄型菌素P-3并使不需要的柄型菌素餾分減至最小。含有柄型菌素P-3的餾分5到10被收集起來并蒸發(fā)，產(chǎn)生含有54.6g P-3的固體。在這個(gè)階段，產(chǎn)物含有77.1％的柄型菌素P-3，96.1％的全部所希望的柄型菌素(層析柱階段產(chǎn)率＝92.5％).。
將硅膠層析柱的產(chǎn)物加入預(yù)熱到46℃的91ml的甲醇中，再加入加熱到同樣溫度的546ml乙酸乙酯中。再加入等份的甲醇幫助溶解這些固體?？偭繛?66ml的甲醇被加入到所述混合物中。在剛開始產(chǎn)生云霧時(shí)加入已加熱到50℃的100ml庚烷，然后使溶液冷卻至室溫，從而開始結(jié)晶。在4小時(shí)后，再加入1324ml庚烷(室溫)。采用HPLC分析上清液，經(jīng)測(cè)定6.6g P-3仍留在溶液中。將混合物在冰上冷卻并再加入等份的庚烷(200和400ml)，直到在母液中還有3.9g的P-3(6.8％)。
母液采用多孔濾膜裝配線吸去。用2×150mL 1∶3乙酸乙酯∶庚烷洗滌晶體。使這些晶體在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中30℃原位干燥88.5小時(shí)，干燥始于低真空，然后高真空(1.0-1.3mbar)。獲得76.4g晶體。
最終產(chǎn)物含有74.5％柄型菌素P-3(56.9g)，所希望?；谋途乜偭繛?7.8％(總產(chǎn)率＝69％)。
實(shí)施例3柄型菌素的硅膠層析和結(jié)晶基本如實(shí)施例1所述對(duì)含有64.8mg/L柄型菌素P-3的1008L珍貴束絲放線菌完整培養(yǎng)液進(jìn)行加熱處理，用甲苯萃取并蒸發(fā)。
將含34.5g柄型菌素P-3的濃縮液加入3L甲苯中，加載至硅膠層析柱(Kieselgel 60，3.0L床體積充填甲苯，13.8cm diam.x 16.6cm)。柱用4cm的沙封頂。用5L甲苯洗柱，然后用20L2％MeOH的甲苯溶液洗柱，收集5L餾分。層析柱然后用20L4％的MeOH甲苯溶液洗脫，收集2.5L餾分。柄型菌素洗脫在餾分9到15。根據(jù)HPLC和LC-MS對(duì)于餾分的分析選擇結(jié)晶的餾分，使柄型菌素P-3的回收最佳并使不希望的柄型菌素量最少。將餾分10到12匯總并經(jīng)蒸發(fā)干燥，產(chǎn)生含有32.5g柄型菌素P-3的油。
在這個(gè)階段產(chǎn)物含有91.8％的柄型菌素P-3，含有總量為95.3％的所希望獲得的?；途?層析柱階段產(chǎn)率＝94.2％)。
來自匯總的硅餾分的濃縮物在50℃水浴中預(yù)溫，并用最小體積的熱甲醇/乙酸乙酯(50℃)溶解。先加入60ml甲醇，然后慢慢加入300ml乙酸乙酯。進(jìn)一步加入20ml熱的甲醇，此時(shí)濃縮物完全溶解。加入200ml熱的庚烷(50℃)并從水浴中移出結(jié)晶溶液。結(jié)晶開始，在200ml等份中加入庚烷直到加入的總體積為800ml。混合物在冰浴內(nèi)冷卻18個(gè)小時(shí)。通過HPLC分析母液來監(jiān)測(cè)結(jié)晶。在18個(gè)小時(shí)的時(shí)候，母液中保有6.3％的柄型菌素P-3。再加入200ml庚烷，并進(jìn)一步將混合物冷卻5小時(shí)。HPLC分析表明4.0％柄型菌素保持在母液中。
通過吸出暗褐色的母液而回收晶體。所述晶體用50ml的庚烷∶乙酸乙酯3∶1洗三遍并在真空(0.8mBar)中干燥過夜。晶體是均勻、細(xì)小、米色針狀，含28.2g柄型菌素P-3(結(jié)晶階段產(chǎn)率＝86.9％)。
最終的產(chǎn)物含93.1％的柄型菌素P-3和總量98.4％的所希望的?；途?。
實(shí)施例4從甲苯萃取物中純化和結(jié)晶柄型菌素基本如實(shí)施例1所述，對(duì)含有74.5g/L柄型菌素P-3的1001L珍貴束絲放線菌完整培養(yǎng)液進(jìn)行加熱處理，用甲苯萃取并蒸發(fā)，得到含有54.7g柄型菌素P-3的9.5L濃縮萃取物。
將此濃縮物加熱到45℃并用33分鐘加入14.5L庚烷，以便柄型菌素沉淀。混合物在冰上冷卻。再加入5L庚烷并將混合物靜置過夜。吸出母液并用10L甲苯∶庚烷1∶1的溶液沖洗沉淀。HPLC分析表明母液含有6.5％的柄型菌素P-3，清洗液含1.8％P-3。沉淀溶于2L甲醇中，用0.2微米的過濾器過濾。
使甲醇溶液蒸發(fā)干燥，重新溶于50℃的85ml甲醇中。向該溶液中加入510ml乙酸乙酯，再加入200ml庚烷。將混合物冷卻到室溫，當(dāng)結(jié)晶開始時(shí)緩慢加入990ml庚烷。母液中含有4.14g柄型菌素P-3。再加入400ml庚烷并在冰上冷卻。母液中保留有2.7g的柄型菌素P-3。
吸出母液并在50℃將晶體溶于110mL的甲醇和520ml的乙酸乙酯中。再加入兩個(gè)75ml等份的庚烷，混合物冷卻到環(huán)境溫度并再加入900ml。再加入400ml的庚烷并將混合物在冰上冷卻，靜置過夜，使其結(jié)晶。HPLC分析表明母液中留有2.3g的柄型菌素P-3。吸出母液并用庚烷∶乙酸乙酯＝3∶1的溶液沖洗晶體，在真空(0.6mBar)下干燥過夜。47.8g晶體含有84.3％的柄型菌素P-3，和總量97.0％的所希望的酰化柄型菌素。
實(shí)施例5用二甲苯萃取珍貴束絲放線菌培養(yǎng)液并純化柄型菌素220mL加熱處理過的珍貴束絲放線菌與44μg/ml柄型菌素P-3放在45℃的水浴中，加入等體積的二甲苯?；旌细飨?，使二甲苯進(jìn)入下層液相中但未形成乳液。在20小時(shí)后，64％的柄型菌素P-3被萃取至二甲苯相中。
在重力作用下分離混合物并取出170ml二甲苯。將二甲苯萃取物蒸發(fā)干燥。采用硅膠層析純化二甲苯萃取物。使萃取物溶于2ml含4％甲醇的甲苯溶液，加載并用相同的溶劑混合物洗脫。收集餾分(0.5ml)，采用TLC(Kieselgel 60 F254 plates，在20∶1的二氯甲烷∶甲醇中)進(jìn)行分析。采用前面的實(shí)施例所述的方案使含柄型菌素P-3的餾分結(jié)晶。結(jié)晶產(chǎn)物與發(fā)酵液的甲苯萃取所得結(jié)晶產(chǎn)物在色澤和純度方面品質(zhì)相當(dāng)。
本發(fā)明可以收錄到其他的形式而不脫離總的精神或基本貢獻(xiàn)，因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)參考附加的權(quán)利要求，而不是前述說明。
權(quán)利要求
1.一種制備純化的柄型菌素的方法，包括如下步驟a.在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生柄型菌素的微生物；b.處理這些培養(yǎng)基以便有助于用溶劑萃取柄型菌素；c.用芳香烴溶劑從培養(yǎng)基中萃取柄型菌素。d.濃縮所萃取的柄型菌素；e.采用結(jié)晶法純化柄型菌素。
2.一種制備純化的柄型菌素的方法，包括如下步驟a.在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生柄型菌素的微生物；b.用芳香烴溶劑從培養(yǎng)基中萃取柄型菌素；c.濃縮所萃取的柄型菌素；d.采用結(jié)晶法純化柄型菌素。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中產(chǎn)生柄型菌素的微生物是束絲放線菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的束絲放線菌是珍貴束絲放線菌ATCC31565。
5.權(quán)利要求3的方法，其中的束絲放線菌是珍貴束絲放線菌ATCC31281。
6.權(quán)利要求1的方法，其中的處理是在約75℃進(jìn)行熱處理。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中的溶劑是甲苯。
8.權(quán)利要求7的方法，其中甲苯與熱處理后培養(yǎng)基的比例是約1∶1。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的萃取溫度是約45℃。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中的溶劑是二甲苯。
11.權(quán)利要求10的方法，其中的二甲苯與熱處理后培養(yǎng)基的比例是約1∶1。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的萃取溫度是約45℃。
13.權(quán)利要求1或2的方法，其中的柄型菌素包括能通過還原性裂解形成美登木醇的?；途亍?br> 14.采用權(quán)利要求1或2的方法制備的柄型菌素。
15.一種細(xì)胞粘合劑美登木素生物堿復(fù)合物，其通過將權(quán)利要求1或2的方法制備的柄型菌素轉(zhuǎn)化為細(xì)胞粘合劑美登木素生物堿復(fù)合物而制備。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞粘合劑美登木素生物堿復(fù)合物，其是一種抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了純化柄型菌素的改良方法。
文檔編號(hào)C12P21/04GK1432068SQ0181037
公開日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2001年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月12日
發(fā)明者馬克·富爾斯頓, 安娜·斯特范斯卡, 簡(jiǎn)·瑟克特爾 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼公司