專利名稱：一種基因工程菌株及利用該菌株生產(chǎn)二羥基丙酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的菌株及利用該菌株生產(chǎn)二羥基丙酮(DHA)的方法。
背景技術(shù)：
二羥基丙酮(簡稱DHA)是一種重要的化工原料，醫(yī)藥、農(nóng)藥合成中間體和功能添加劑，用途十分廣泛。二羥基丙酮是一種重要的化妝品的配方原料，尤其是作為防曬霜能阻止皮膚水分流失，起到保濕、防曬和防紫外線輻射的作用。二羥基丙酮是聯(lián)系糖代謝和脂肪代謝重要的中間產(chǎn)物，能有效調(diào)節(jié)糖代謝與脂肪代謝的關(guān)系。體外供給二羥基丙酮，能有效地減緩脂肪合成速率，從而起到減肥作用。二羥基丙酮作為飼料添加劑喂養(yǎng)禽畜動物能使脂肪含量減少，蛋白質(zhì)含量增加，從而使動物體的瘦肉率大大提高。另外，二羥基丙酮還可作為抗病毒試劑。DHA在國外已得到了工業(yè)應(yīng)用，而目前我國生產(chǎn)DHA技術(shù)仍較落后，大多依賴進口。目前，工業(yè)生產(chǎn)二羥基丙酮的方法主要是微生物轉(zhuǎn)化甘油。該方法是利用微生物自身產(chǎn)生的山梨醇脫氫酶，使甘油分子結(jié)構(gòu)上的仲位羥基進行脫氫反應(yīng)生成DHA。利用的微生物主要是醋酸桿菌屬的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans)。氧化葡萄糖酸桿菌是一種重要的工業(yè)應(yīng)用微生物，其膜上有許多多羥基化合物的脫氫酶，能夠不完全氧化許多多羥基化合物，底物無需進入胞內(nèi)即可被氧化直接排到培養(yǎng)基當(dāng)中。由于反應(yīng)快速、 消耗能量低、分離產(chǎn)物簡單，它的這些特性被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程，如生產(chǎn)維生素C、酮基葡萄糖酸、二羥基丙酮、醋酸等。最近，氧化葡萄糖酸桿菌還應(yīng)用于合成一些新的化合物， 如，L-核酮糖、D-塔格糖、米格列醇和手型的醇或酸等。2005年，氧化葡萄糖酸桿菌621H 測序成功，這有利于進一步理解代謝網(wǎng)絡(luò)和呼吸鏈機制，這必然會促進氧化葡萄糖酸桿菌在工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)過程的改善以及新方法的應(yīng)用。利用氧化葡萄糖酸桿菌生產(chǎn)二羥基丙酮過程中，高濃度的底物甘油和產(chǎn)物二羥基丙酮會對細胞造成不可逆?zhèn)Γ种萍毎L，這是工業(yè)生產(chǎn)DHA過程中遇到的一個難題。 為消除底物抑制和產(chǎn)物抑制，可以優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)酵工藝，改進培養(yǎng)方式如固定化細胞法、靜止細胞法，采用分批補料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵法。另一方面可以篩選能夠耐受高濃度底物和產(chǎn)物且具有高山梨醇脫氫酶活性的優(yōu)良菌株，以提高甘油轉(zhuǎn)化成DHA的效率。最近，氧化葡萄糖基因組測序成功，為基因工程菌的構(gòu)建提供有利條件。結(jié)合代謝工程構(gòu)建基因工程菌是一條從根本上解決二羥基丙酮生產(chǎn)過程中的抑制現(xiàn)象提高菌株生產(chǎn)能力的途徑。中國專利申請CN102146415A公開了一株能夠利用葡萄糖為唯一碳源的氧化葡萄糖酸桿菌GDHE，其是氧化葡萄糖酸桿菌的mgdh基因敲除突變菌。與過去常用的山梨醇為碳源的培養(yǎng)基相比，該菌株在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上獲得的靜息細胞能高產(chǎn)甘油脫氫酶。 本發(fā)明人在氧化葡萄糖酸桿菌GDHE的基礎(chǔ)上經(jīng)過進一步的基因工程改造獲得了一株能夠在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好，同時可但GDHE菌株不耐受高濃度甘油，其轉(zhuǎn)化甘油制備二羥基丙酮的效率有待進一步提高。本菌株能夠利用來源廣泛、供應(yīng)充足、價格便宜的葡萄糖為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有的二羥基丙酮為生物轉(zhuǎn)化法中修飾的氧化葡萄糖酸桿菌 GDHE對甘油底物不耐受的缺陷，并進一步提高其轉(zhuǎn)化率，從而提供一種利用修飾的氧化葡萄糖酸桿菌生產(chǎn)二羥基丙酮的方法及其所用的氧化葡萄糖酸桿菌的修飾菌株和載體，該修飾菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好，同時可耐受高濃度甘油并且高效率轉(zhuǎn)化甘油制備二羥基丙酮。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是一種生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，包括利用修飾的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans)將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，其中，所述的修飾的氧化葡萄糖酸桿菌經(jīng)過修飾從而增加了 sldAB基因的表達，并且敲除了 mgdh基因和madh基因。優(yōu)選的，所述的sldAB基因編碼下述㈧或⑶所示的蛋白質(zhì)(A)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)和SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脫氫酶亞基A活性的蛋白質(zhì)，和SEQ ID NO 3所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脫氫酶亞基B活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述的S1 dAB基因是下述(a)或(b)所示的DNA (a) SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA ；(b)能夠與SEQ ID NO 1所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有山梨醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。優(yōu)選的，所述的mgdh基因編碼下述(Al)或(Bi)所示的蛋白質(zhì)(Al)SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(Bl)SEQ ID NO :5所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述的mgdh基因是下述(al)或(bl)所示的DNA (al) SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的DNA ；(bl)能夠與SEQ ID NO :4所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。優(yōu)選的，所述的mgdh基因編碼下述(A2)或(B2)所示的蛋白質(zhì)(A2) SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)SEQ ID NO :7所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述的mgdh基因是下述(a2)或(b2)所示的DNA (a2) SEQ ID NO 6所示核苷酸序列的DNA ；(b2)能夠與SEQ ID NO :6所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
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優(yōu)選的，所述的sldAB基因的表達是通過增加sldAB基因的拷貝數(shù)或通過修飾該基因的表達調(diào)控序列而得到增強的。優(yōu)選的，所述的敲除基因是通過基因打靶技術(shù)得到的。優(yōu)選的，所述的修飾的氧化葡萄糖酸桿菌還進一步經(jīng)過了在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上得適應(yīng)性進化。優(yōu)選的，所述的修飾的氧化葡萄糖酸桿菌是修飾的氧化葡萄糖酸桿菌621H。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的氧化葡萄糖酸桿菌 (Gluconobacter oxydans)的基因工程菌的制備方法，包括以下步驟1)通過基因打靶將一構(gòu)建物定點引入氧化葡萄糖酸桿菌，所述的構(gòu)建物含有兩個作為同源重組臂的mgdh基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；2)通過基因打靶將一構(gòu)建物定點引入氧化葡萄糖酸桿菌，所述的構(gòu)建物含有兩個作為同源重組臂的madh基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；3)增加氧化葡萄糖酸桿菌中的sldAB基因的表達；4)將經(jīng)過步驟1)至幻制備而得的氧化葡萄糖酸桿菌突變菌在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行適應(yīng)性進化培養(yǎng)。其中，優(yōu)選的，所述的適應(yīng)性進化培養(yǎng)是將菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天達到指數(shù)生長中期時轉(zhuǎn)接一次，直至比生長速率穩(wěn)定。步驟幻增加氧化葡萄糖酸桿菌中的膜結(jié)合PQQ依賴型乙醇脫氫酶的表達的方法是常規(guī)方法，如增加氧化葡萄糖酸桿菌中的sldAB基因的拷貝數(shù)，或者修飾該基因的表達調(diào)控序列。倍增sldAB基因，較佳的如將含有sldAB基因表達盒的重組表達載體導(dǎo)入氧化葡萄糖酸桿菌突變菌。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是一種高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的氧化葡萄糖酸桿菌的基因工程菌，其是氧化葡萄糖酸桿菌的基因敲除突變菌，其中敲除的基因是膜結(jié)合mgdh基因和madh基因，并且還含有多拷貝數(shù)的sldAB基因或者修飾的表達調(diào)控序列的sldAB基因。其中，優(yōu)選的，本基因工程菌由在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上適應(yīng)性進化而得。優(yōu)選的，所述的適應(yīng)性進化是將菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天達到指數(shù)生長中期時轉(zhuǎn)接一次，直至比生長速率穩(wěn)定。優(yōu)選的，所述的適應(yīng)性進化為25天。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是一種用于基因敲除的重組載體，其含有兩個作為同源重組臂的madh基因片段和至少一個選擇性標記基因片段。其中，優(yōu)選的，所述的標記基因是抗生素抗性基因。優(yōu)選的，所述的各同源重組臂序列長度為1 201Λ。優(yōu)選的，所述的重組載體是質(zhì)粒PSUP202。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的菌株及利用該菌株生產(chǎn)二羥基丙酮(DHA)的方法，具體地說，是關(guān)于一株能夠利用來源廣泛、供應(yīng)充足、價格便宜的葡萄糖為碳源的基因工程菌并以其細胞為催化劑提高二羥基丙酮生產(chǎn)能力的方法。二羥基丙酮產(chǎn)量可達88. 14g/L，甘油轉(zhuǎn)化率為90%。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為本發(fā)明提供的基因工程菌GAN構(gòu)建過程
圖2為madh敲除菌株⑶HE Δ adh的PCR鑒定結(jié)果示意圖，顯示madh基因已經(jīng)被敲除。其中泳道1 :DNA marker III ；泳道2 野生型621H菌株P(guān)CR產(chǎn)物(2. 3kb)；泳道3 GDHE 菌株 PCR 產(chǎn)物(2. 3kb)；泳道 4 =GDHE Δ adh 菌株 PCR 產(chǎn)物(3. 5kb)。圖3為構(gòu)建的含自身啟動子sldAB表達載體限制性內(nèi)切酶消化鑒定結(jié)果示意圖， 顯示含自身啟動子sldAB基因已經(jīng)被插入到PBBR1MCS4質(zhì)粒中得到表達載體pBBR-sldAB。 其中泳道1 :DNA marker III ；泳道2 含自身啟動子sldAB基因PCR產(chǎn)物(3. Okb)；泳道3 表達載體pBBR-sldAB經(jīng)EcoRI和)(baI消化后得到含自身啟動子sldAB基因片段(3. Okb) 及質(zhì)粒片段(5. Okb)。圖4為⑶HE Δ adh pBBR-sldAB在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的進化過程。圖5為菌株GDHE( )和GAN( ■)分別在山梨醇培養(yǎng)基(實線)和葡萄糖培養(yǎng)基(虛線)上的催化40g/L甘油底物(a)或100g/L甘油底物(b)的過程。
具體實施例方式本發(fā)明提供一株用于生物轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)二羥基丙酮的基因工程菌。初始菌⑶HE 是氧化葡萄糖酸桿菌的mgdh基因敲除突變菌。其缺失了膜結(jié)合PQQ依賴型葡萄糖脫氫酶并且在葡萄糖培養(yǎng)基上進化了 50天實驗室適應(yīng)性進化的氧化葡萄糖酸桿菌621H。由于在高濃度甘油底物濃度下，氧化葡萄糖酸桿菌膜上的PQQ依賴型的乙醇脫氫酶會將甘油轉(zhuǎn)化為甘油酸，而甘油酸會抑制細胞酶活性并且使下游分離過程復(fù)雜化。因此為了提高細胞對甘油的耐受性，消除膜結(jié)合乙醇脫氫酶催化導(dǎo)致的甘油酸積累，本發(fā)明在 GDHE的基礎(chǔ)上敲除負責(zé)編碼膜結(jié)合PQQ依賴型乙醇脫氫酶的基因madh。同時本發(fā)明過量表達負責(zé)編碼氧化甘油生成二羥基丙酮的膜結(jié)合山梨醇脫氫酶的基因sldAB。過量表達負責(zé)轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮的關(guān)鍵酶PQQ依賴型的山梨醇脫氫酶可以提高細胞酶產(chǎn)量從而提高菌株二羥基丙酮生產(chǎn)能力。過量表達蛋白破壞了胞內(nèi)代謝平衡引起細胞生長衰退，因此本發(fā)明將所得的基因工程菌進行25天葡萄糖培養(yǎng)基上的實驗室適應(yīng)進化，通過代謝進化的方法，恢復(fù)了菌株在葡萄糖上的生長能力，最終得到本發(fā)明提供的基因工程菌GAN。該菌株能夠利用葡萄糖為碳源，而且生長良好。葡萄糖培養(yǎng)基中獲得的靜息細胞比山梨醇培養(yǎng)基中獲得的靜息細胞具有更高的DHA生產(chǎn)能力?；蚬こ叹鶪AN比野生型菌株及⑶HE具有更高的DHA生產(chǎn)速率。 GAN適宜用于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，具有較高菌體得率和較強二羥基丙酮生產(chǎn)能力。用于本發(fā)明的微生物沒有特別限制，只要是選自醋酸桿菌屬。作為用于修飾菌的親本株，特別理想的是氧化葡萄糖酸桿菌科。本發(fā)明中通過常規(guī)的基因敲除的方法敲除了 mgdh基因和madh基因。例如采用基因打靶技術(shù)?；虼虬兄胁捎没蚯贸d體，該載體含有兩個作為同源重組臂的mgdh/madh 基因片段和至少一個選擇性標記基因片段。兩同源臂和基因組同源序列發(fā)生同源重組，繼而靶序列被敲除，同時載體上的選擇性標記基因插入到了基因組的靶序列附近。在兩重組臂中間是選擇性標記基因片段。所述的標記基因可以是使用已知的任何標記基因，只要方便將正確和載體起作用的宿主細胞挑選出來即可。一般采用抗生素抗性基因。所述的載體可以是常規(guī)，如質(zhì)粒PSUP202。本發(fā)明中的sldAB基因、mgdh基因和madh基因意指屬于氧化葡萄糖酸桿菌科的微生物的sldAB基因、mgdh基因和madh基因或其同源物。sldAB基因、mgdh基因和madh基因的其同源物是指這樣的基因其來源于另一種微生物，但與氧化葡萄糖酸桿菌屬的sldAB基因、mgdh基因和madh基因顯示高度的結(jié)構(gòu)相似性，且被引入宿主時，編碼具有山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶酶或者乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。sldAB基因、mgdh基因和madh基因的同源物的實例包括如在GenBank登記的基因。sldAB基因、mgdh基因和madh基因的同源物可以從一些微生物中克隆獲得，也可以從已知數(shù)據(jù)庫中基于前述序列信息獲得。此外，用于本發(fā)明的sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因并不限于野生型基因， 其可為編碼SEQ ID NO :2、3、5、7中一個或多個位置上包含一個或多個氨基酸殘基的取代、 缺失、插入、添加而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的突變體或人工修飾基因，只要所編碼的蛋白質(zhì)的具有山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶或者乙醇脫氫酶活性。此外，作為sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因，可使用與序列SEQ ID N0:1、 4、6的全核苷酸序列顯示80%或更多同源性，優(yōu)選94%或更多同源性并編碼具有山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶或者乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。此外，sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因的密碼子可用方便sldAB基因、mgdh 基因和/或madh基因引入的宿主使用的密碼子替代。而且，sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因還可為在嚴格條件下更夠分別與SEQ ID NO :1、4或6的核苷酸序列互補的序列，或可從這些序列制備的探針雜交，并編碼具有山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶或者乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明中所指的“嚴格條件”是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。實例包括如彼此顯示高度同源性的DNA，例如顯示不少于80%同源性，優(yōu)選不少于94%同源性的DNA彼此雜交，而低于上述水平的同源性的DNA不彼此雜交的條件，以及一般Southern雜交中的洗滌條件，即在 60°C, IXSSC,0. 1% SDS的條件下系第一次或多次。本發(fā)明中，“基因表達的增加”意指所屬基因的轉(zhuǎn)錄和/或基因翻譯的增加。用于增強sldAB基因的表達的修飾可通過利用例如基因重組技術(shù)增加所述基因在細胞中的拷貝數(shù)來獲得。如，通過將含有sldAB基因的DNA片段連接于在宿主細胞中起作用的載體(優(yōu)選多拷貝載體)，制備重組載體并將其引入氧化葡萄糖酸桿菌，來增加基因的拷貝數(shù)。在宿主細胞中起作用的載體包括可在氧化葡萄糖酸桿菌自主復(fù)制的載體。在氧化葡萄糖酸桿菌中較佳的可以選擇pBBRlMCS系列載體。pBBRlMCS是一類用于革蘭氏陰性菌的廣宿主克隆載體，帶有不同的抗性篩選標記。由不同的抗性分別有PBBRIMCS-I、 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-3、pBBRlMCS-4。此外，還可以根據(jù)抗性等情況選擇其它適用于革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒。為了將所述的制備的重組載體引入氧化葡萄糖酸桿菌，可使用迄今為止報道的任何已知的方法。例如采用大腸桿菌-真菌穿梭載體攜帶sldAB基因，制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，在幫助菌的幫助下和氧化葡萄糖酸桿菌進行三親本接合，獲得的接合子。也可以用電轉(zhuǎn)化法，如將氧化葡萄糖酸桿菌受體菌種子以的接種量，在IOOml山梨醇培養(yǎng)基 (山梨醇 80g/L，酵母粉 20g/L, KH2P041. 5g/L, (NH4)2S041. 5g/L 和 MgS04 · 7H20 0. 5g/ L)里，30°C，220rpm，培養(yǎng)18h，然后離心，用無菌10 %甘油洗滌，離心，反復(fù)3次，最后懸浮在lmll0%甘油里，使細胞濃度達到lOlOcells/ml為宜，50 μ 1分裝，-80°C保存。使用6 -Rad，MicroPulserTM, U.S.A.)電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化，50 μ 1 感受態(tài)細胞液與 0. 5μ g左右的核酸混勻，冰浴30min，然后混合液移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，經(jīng)過1. 8千伏，6. 0 毫秒的脈沖，細胞立即用0.9ml山梨醇培養(yǎng)液稀釋，轉(zhuǎn)入試管，150rpm，3(TC培養(yǎng)4h。然后， 細胞液涂布到有抗性的山梨醇固體培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)，篩選出重組菌。也可以通過將如上所述的SldAB基因的多拷貝整合入氧化葡萄糖酸桿菌基因組， 如通過靶向基因組的同源重組，將所述基因以串聯(lián)形式連接于基因組sldAB基因旁側(cè)，或者將所述基因引入基因組中的非必須基因中，從而使所述基因以多拷貝數(shù)存在。除了如上所述通過增加基因拷貝書之外，還可以通過用強啟動子來替代基因組或質(zhì)粒上sldAB基因的表達調(diào)控序列啟動子。本發(fā)明所述的氧化葡萄糖酸桿菌經(jīng)過基因敲除和倍增后，在葡萄糖培養(yǎng)基上出現(xiàn)生長衰退現(xiàn)象，為此進行了實驗室適應(yīng)性進化培養(yǎng)。實驗室適應(yīng)性進化培養(yǎng)是常規(guī)的方法， 如在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天達到指數(shù)生長中期時轉(zhuǎn)接一次，直至獲得最大比生長速率穩(wěn)定的菌株。進化培養(yǎng)時間本發(fā)明優(yōu)選25天左右。本發(fā)明進化培養(yǎng)后的菌株生長速率穩(wěn)定，在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好。將該菌株擴大培養(yǎng)，分離出靜息細胞，懸于緩沖液中，加入甘油進行催化反應(yīng)生成DHA。 這些都可通過已知的現(xiàn)有技術(shù)完成。本發(fā)明的DHA高產(chǎn)菌株構(gòu)建方法的一較佳實施方式包括以下步驟1.構(gòu)建madh基因敲除的菌株⑶HEAadh。參見文獻，以質(zhì)粒pSUP202為載體， 依次連接上adhl基因、卡那抗性基因、adh2基因得到質(zhì)粒pSUP202-3-adhA Km (Wei, L. J. , Χ.P.Yang, et al.Characterization of Enzymes in the Oxidation of 1, 2-Propanediol to d-(-)-Lactic Acid by Gluconobacter oxydans DSM 2003. Molecular Biotechnology. 2010,46(1) :26-33.)。以含單基因敲除載體 pSUP202_3-adhA: :Km 的大腸桿菌為供體，氧化葡萄糖酸桿菌GDHE為受體，含質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌為幫助菌進行三親本接合，獲得的接合子即為madh基因敲除菌GDHE Δ adh。2.構(gòu)建含單基因表達載體pBBR-sldAB的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。以氧化葡萄糖酸桿菌 621H的基因組為模板擴增包含自身啟動子的sldAB基因。將上述片段插入到有氨芐西林抗性的質(zhì)粒PBBR1MCS4上，獲得單基因表達載體pBBR-sldAB。將上述載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，獲得含單基因表達載體PBBR-sldAB的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。3.構(gòu)建過表達sldAB基因的菌株⑶HE Δ adh pBBR-sldAB。以含表達載體pBBR-sldAB的大腸桿菌為供體，氧化葡萄糖酸桿菌GDHEAadh為受體，含質(zhì)粒 PRK2013的大腸桿菌為幫助菌進行三親本接合，獲得的接合子即為sldAB過表達重組菌 ⑶HE AadhpBBR-s IdAB。4.由于⑶HE Δ adh pBBR-sldAB在葡萄糖培養(yǎng)基上出現(xiàn)生長衰退現(xiàn)象，將上述菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天達到指數(shù)生長中期時轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)25天實驗室適應(yīng)性進化后獲得最大比生長速率穩(wěn)定的菌株GAN。GAN在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好。5.采用獲得的GAN靜息細胞催化甘油生成DHA。將GAN接種到以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長末期。上述培養(yǎng)液12，OOOrpm在4°C離心10分鐘后收集菌體用pH = 6. 0的磷酸緩沖液洗滌，重復(fù)上述步驟3次后，細胞重懸于磷酸緩沖液。在該重懸液中加入甘油進行催化反應(yīng)生成DHA。mgdh基因，膜結(jié)合PQQ依賴型葡萄糖脫氫酶；madh基因，膜結(jié)合PQQ依賴型乙醇脫氫酶；sldAB基因，膜結(jié)合山梨醇脫氫酶。SEQ ID NO 1 :sldAB 基因；SEQ ID NO :2 :sldAB 基因表達的蛋白，SldA ;SEQ ID NO :3 :sldAB 基因表達的蛋白，SldB ;SEQ ID NO :4 :mgdh 基因；SEQ ID NO :5 :mgdh 基因表達的蛋白，⑶H;SEQ ID NO :6 :madh基因；SEQ ID NO :7 :madh基因表達的蛋白，ADH。下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》中所述的條件進行，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1敲除菌株⑶HE Δ adh的構(gòu)建利用同源交換的方法進行氧化葡萄糖酸桿菌GDHE基因組中膜結(jié)合乙醇脫氫酶 (madh)基因的敲除。膜結(jié)合乙醇脫氫酶能夠?qū)⒁掖佳趸梢胰?，乙醛?jīng)膜結(jié)合的乙醛脫氫酶進一步氧化為乙酸。具體如下1. 1 敲除載體 pSUP202-3_adhA: :Km 的構(gòu)建參見文獻，以質(zhì)粒pSUP202為載體，依次連接上adhl基因、卡那抗性基因、adh2 基因得到質(zhì)粒 pSUP202-3-adhA:Km(Wei, L. J.，X. P. Yang, et al.Characterization of Enzymes in the Oxidation of 1,2-Propanediol to d-(_)-Lactic Acid by Gluconobacter oxydans DSM 2003. Molecular Biotechnology. 2010,46(1) :26-33.)。1. 2將敲除載體導(dǎo)入氧化葡萄糖酸桿菌胞內(nèi)完成基因敲除①供體菌的建立用重組質(zhì)粒pSUP202-3_adhA: :Km轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli JM109(購買自Novagen公司)，得到含有重組質(zhì)粒pSUP202-3_adhA: :Km的Ε. coli JM109。幫助菌的建立用質(zhì)粒pRK2013 (購于Clontech公司)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli HBlOl (購買自Novagen公司)，得到含有幫助質(zhì)粒pRK2013的Ε. coli HBlOl。②菌體培養(yǎng)分別將供體菌、幫助菌接種在加有卡那霉素抗性100mg/L的LB中培養(yǎng)約8小時。受體菌氧化葡萄糖酸桿菌GDHE (參見CN102146415A)接種在山梨醇培養(yǎng)基 (山梨醇 80g/L，酵母粉 20g/L，KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4L 5g/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，頭孢菌素100mg/L)中培養(yǎng)約18小時。③三親接合取上述供體菌、幫助菌及受體親本菌液12000rpm離心，倒掉上清收集菌體，用生理鹽水懸浮，重復(fù)上述步驟洗滌兩次。按照1 1 1的比例將上述三株菌混合，離心收集菌體后，用山梨醇培養(yǎng)基洗一次，倒掉一部分上清，在剩下的少量培養(yǎng)基中用微量移液器將細胞混勻，轉(zhuǎn)移到不加抗生素的固體山梨醇培養(yǎng)基上涂布，30°c倒置培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒pSUP202-3-adhA: :Km可以在幫助菌的幫助下進入氧化葡萄糖酸桿菌 GDHE，由于其上帶有膜結(jié)合乙醇脫氫酶的同源片段(adhl，adM)，因此可以和氧化葡萄糖酸桿菌⑶HE染色體上的madh DNA片段發(fā)生雙交換，將含卡那霉素抗性基因的madh片段整合到氧化葡萄糖酸桿菌GDHE的染色體上，從而使膜結(jié)合乙醇脫氫酶基因失活。④接合子的篩選將培養(yǎng)過夜的三親接合菌體用無菌雙蒸水從固體山梨醇培養(yǎng)基上洗下，涂布到加入慶大霉素和卡那霉素各100mg/L的固體山梨醇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2 4天。氧化葡萄糖酸桿菌GDHE本身具有慶大霉素抗性，慶大霉素用于殺死三親本結(jié)合過程中沒有慶大霉素抗性的大腸桿菌。質(zhì)粒PSUP202是自殺質(zhì)粒，進入受體菌后不久就不能存在，只有含卡那霉素抗性基因的madh片段整合到染色體上的氧化葡萄糖酸桿菌GDHE才具卡那霉素抗性，因此通過慶大霉素和卡那霉素來篩選三親接合子。1. 3敲除菌的篩選和驗證將篩選到的接合子接種于山梨醇培養(yǎng)基上，以其各自全基因組DNA為模板， 利用以下引物分別做菌落PCR驗證。引物1 5 ‘ -ACTTCTGGTCTACTGAC-3 ‘；引物2 5' -TCTCAGATACCAGCCTG-3'。如圖2所示，由于敲除菌的adh基因中插入卡那霉素抗性基因，所以敲除菌PCR產(chǎn)物較原始菌621H及突變株GDHE的PCR產(chǎn)物滯后。根據(jù)此原則，去除初篩中得到的假陽性菌落，挑取目的片段滯后的菌落即得到敲除菌GDHE Δ adh。實施例2過表達菌株⑶HE Δ adhpBBR-sldAB的構(gòu)建1.表達載體pBBR-sldAB的構(gòu)建及其供體菌的建立提取氧化葡萄糖酸桿菌621H(購買自德國DSMZ股份有限公司)的全基因組DNA， 以其為模版，利用以下引物對PCR擴增帶有自身啟動子的sldAB基因片段。引物1:5' -CG CTCTAGAACAACACCTGGTTCTGGAT-3‘，帶下劃線的堿基為XbaI 酶切位點；引物2 5' -GCTTCC CACCCGAATTCTGGAAAAAACG-3 ‘，帶下劃線的堿基為EcoRI酶切位點。回收PCR產(chǎn)物，XbaI和EcoRI雙酶切，連接到載體pBBRlMCS_4 (參考文獻Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, Roop RM, and Peterson KM. Four new derivatives of the broad-hostrange cloning vector pBBRlMCS carrying different antibioticresistance cassettes. Gene. 1995,166 :175-176.向美國路易斯安那州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心微生物學(xué)與免疫學(xué)系Kovach ME教授索取。)上，從而得到重組質(zhì)粒pBBR-sldAB。 用重組質(zhì)粒pBBR-sldAB轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli JM109 (購買自Novagen公司)，篩出具有氨芐西林抗性的E. coli JM109菌株作為初篩菌。以)(bal和EcoRI兩種限制性內(nèi)切酶消化初篩菌的質(zhì)粒。如圖3所示，由于陽性克隆的質(zhì)粒上插入自身啟動子的sldAB基因片段(3. Okb), 所以雙酶切后得到兩條條帶，其一是帶有自身啟動子的sldAB基因片段(3. Okb)。根據(jù)此原則，去除初篩中得到的假陽性菌落。陽性菌落即為供體菌。2.將表達載體導(dǎo)入氧化葡萄糖酸桿菌胞內(nèi)完成基因過表達①幫助菌的建立用質(zhì)粒pRK2013(購于Clontech公司)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli HBlOl (購買自Novagen公司)，得到含有幫助質(zhì)粒pRK2013的Ε. coli HBlOl。②菌體培養(yǎng)分別將供體菌、幫助菌接種在各加有氨芐西林抗性100mg/L和卡那霉素抗性100mg/L的LB中培養(yǎng)約8小時。受體菌氧化葡萄糖酸桿菌GDHE Δ adh接種在山梨醇培養(yǎng)基(山梨醇 80g/L，酵母粉 20g/L, KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4L 5g/L andMgS04 · 7H20 0. 5g/L，慶大霉素100mg/L，卡那霉素lOOmg/L)中培養(yǎng)約18小時。③三親接合取上述供體菌、幫助菌及受體親本菌液12000rpm離心，倒掉上清收集菌體，用生理鹽水懸浮，重復(fù)上述步驟洗滌兩次。按照1 1 1的比例將上述三株菌混合，離心收集菌體后，用山梨醇培養(yǎng)基洗一次，倒掉一部分上清，在剩下的少量培養(yǎng)基中用微量移液器將細胞混勻，轉(zhuǎn)移到不加抗生素的固體山梨醇培養(yǎng)基上涂布，倒置30°c培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒pBBR-sldAB可以在幫助菌的幫助下進入氧化葡萄糖酸桿菌⑶HE Δ adh。④接合子的篩選將培養(yǎng)過夜的三親接合菌體用無菌雙蒸水從固體山梨醇培養(yǎng)基上洗下，涂布到加入慶大霉素、卡那霉素和氨芐西林各100mg/L的固體山梨醇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2 4天。氧化葡萄糖酸桿菌GDHE Δ adh具有慶大霉素和卡那霉素抗性，慶大霉素及卡那霉素用于殺死三親本結(jié)合過程中沒有慶大霉素和卡那霉素抗性的大腸桿菌。含氨芐西林抗性的質(zhì)粒pBBR-sldAB，進入受體菌后才能在含有慶大霉素、卡那霉素和氨芐西林的固體山梨醇培養(yǎng)基平板上生長。得到能夠同時耐受慶大霉素、卡那霉素和氨芐西林的氧化葡萄糖酸桿菌 GDHE Δ adhpBBR-sldAB。實施例3⑶HE Δ adhpBBR-sldAB在葡萄糖培養(yǎng)基上的適應(yīng)性進化在250ml的搖瓶中放置50ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，酵母粉20g/ L，KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4L 5g/L and MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，慶大霉素 100mg/L，卡那霉素 100mg/L，氨芐西林100mg/L。接種⑶HE Δ adhpBBR-sldAB，接種比例為1 100(體積比)， 大約M小時轉(zhuǎn)接一次(培養(yǎng)過程中隨菌體倍增時間的改變而改變初始接種量或者轉(zhuǎn)接時間)，30°C搖床培養(yǎng)，每2小時測一次OD6tltl值，計算菌株每天在葡萄糖培養(yǎng)基上的最大比生長速率。如圖4所示，菌株的最大比生長速率逐漸提高最后趨于穩(wěn)定。將培養(yǎng)第25天的菌株命名為GAN。實施例4在山梨醇培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基上的生長情況分別將氧化葡萄糖酸桿菌突變體⑶HE、⑶HE Δ adhpBBR-sldAB和GAN在山梨醇培養(yǎng)基中活化到OD6tltl = 1. 0，以的接種量分別轉(zhuǎn)接到50ml新鮮的山梨醇培養(yǎng)基或葡萄糖培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)，每2小時測一次0D_值，計算在不同培養(yǎng)基上各株菌的最大比生長速率。待細菌生長到穩(wěn)定期末期，確定菌體的最大細胞生長量(Cmax)計算對應(yīng)的干重，測定發(fā)酵液中的山梨醇或葡萄糖殘余量。如表1所示，經(jīng)過實驗室適應(yīng)性進化GAN恢復(fù)了在葡萄糖培養(yǎng)基上的生長能力，與GDHE相似。GAN在葡萄糖培養(yǎng)基上的最大細胞生長量(Cmax) 為0. 974gCDW/L，接近于在山梨醇培養(yǎng)基上的最大細胞生長量，關(guān)于葡萄糖的細胞得率為 0. 165gCDW/g，而關(guān)于山梨醇的細胞得率僅為0.013gCDW/g，說明可以用20g/L葡萄糖代替 80g/L山梨醇作為氧化葡萄糖酸桿菌突變株的碳源。表1.菌株分別在山梨醇培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基上的生長情況
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，包括利用修飾的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans)將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，其特征在于，所述的修飾的氧化葡萄糖酸桿菌經(jīng)修飾增加了 sldAB基因的表達，并且敲除了 mgdh基因和madh基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因編碼下述㈧或⑶所示的蛋白質(zhì)(A)SEQID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)和SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)SEQID NO :2所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脫氫酶亞基A活性的蛋白質(zhì)，和SEQ ID NO 3所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脫氫酶亞基B活性的蛋白質(zhì)；所述的mgdh基因編碼下述(Al)或(Bi)所示的蛋白質(zhì) (Al)SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(Bl)SEQ ID NO :5所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、 添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)； 所述的madh基因編碼下述(A2)或(B2)所示的蛋白質(zhì) (A2) SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)SEQ ID NO :7所示氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、 添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因是下述(a)或(b)所示的DNA (a)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA ；(b)能夠與SEQID NO :1所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有山梨醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；所述的mgdh基因是下述(al)或(bl)所示的DNA (al) SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的DNA ；(bl)能夠與SEQ ID NO :4所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ； 所述的mgdh基因是下述(a2)或(b2)所示的DNA (a2) SEQ ID NO 6所示核苷酸序列的DNA ；(b2)能夠與SEQ ID NO :6所示核苷酸序列互補的序列或者與可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因的表達是通過增加sldAB 基因的拷貝數(shù)或通過修飾該基因的表達調(diào)控序列而得到增強的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的敲除基因是通過基因打靶技術(shù)得到的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修飾的氧化葡萄糖酸桿菌還進一步經(jīng)過了在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的適應(yīng)性進化。
7.一種高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans)的基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)通過基因打靶將一構(gòu)建物定點引入氧化葡萄糖酸桿菌，所述的構(gòu)建物含有兩個作為同源重組臂的mgdh基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；2)通過基因打靶將一構(gòu)建物定點引入氧化葡萄糖酸桿菌，所述的構(gòu)建物含有兩個作為同源重組臂的madh基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；3)增加氧化葡萄糖酸桿菌中的sldAB基因的表達；4)將經(jīng)過步驟1)至幻制備而得的氧化葡萄糖酸桿菌突變菌在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行適應(yīng)性進化培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的適應(yīng)性進化培養(yǎng)是將菌株在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天達到指數(shù)生長中期時轉(zhuǎn)接一次，直至比生長速率穩(wěn)定。
9.一種高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的氧化葡萄糖酸桿菌的基因工程菌，其特征在于，其是氧化葡萄糖酸桿菌的基因敲除突變菌，其中敲除的基因是膜結(jié)合mgdh基因和madh基因， 并且還含有多拷貝數(shù)的sldAB基因或者修飾的表達調(diào)控序列的sldAB基因。
10.如權(quán)利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌由在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上適應(yīng)性進化而得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的菌株及利用該菌株生產(chǎn)二羥基丙酮(DHA)的方法，利用修飾的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，該修飾的氧化葡萄糖酸桿菌經(jīng)修飾增加了sldAB基因的表達，并且敲除了mgdh基因和madh基因。該修飾的氧化葡萄糖酸桿菌還進一步經(jīng)過了在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的適應(yīng)性進化。本發(fā)明的基因工程菌能夠在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好，克服了野生型氧化葡萄糖酸桿菌只能利用價格相對較高的山梨醇、甘露醇作為有效碳源的不足，節(jié)約了生產(chǎn)成本。而且，在葡萄糖上培養(yǎng)的基因工程菌GAN比在山梨醇上培養(yǎng)的基因工程菌GAN具有更高的生產(chǎn)二羥基丙酮(DHA)的能力。
文檔編號C12P7/26GK102392056SQ201110409078
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者盧磊芳, 張加奇, 張敏華, 潘鵬程, 章輝, 花強, 蒿珍珍, 韋柳靜, 馬娜 申請人:華東理工大學(xué)