專利名稱：肌酐含量測定方法及肌酐診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定肌酐含量的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細管電泳法等。
化學測定法——成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方法之一。標本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合物。此法的缺點是特異性不高，因為維生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標本分析，通常僅作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試劑盒和某些科研目的。
毛細管電泳法——血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設備和進行血清標本的預處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學測定法——主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002.11.15的專利申請公開了應用酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物。當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點在于為丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反應所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術缺點的肌酐含量的測定方法，同時給出實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行肌酐含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明測定肌酐含量的方法步驟如下1)、將樣品主要由氧化型輔酶、乙醇、肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度上升的速度，測算出肌酐含量的大小。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出肌酐含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應用肌酐酶偶聯(lián)肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐酶將肌酐變成肌酸，再通過偶聯(lián)肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶的作用，將二分子氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為二分子還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以提高還原型輔酶在340nm處吸光度上升的幅度二倍，也就是提高靈敏度二倍，通過測量340nm處吸光度上升的幅度，可以測算肌酐的含量。
用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液40--200mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l肌酐酶1000--50000U/l肌酸酶1000--50000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩沖液40--200mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l肌酸酶1000--50000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l肌酐酶1000--50000U/l
穩(wěn)定劑10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，氧化型輔酶、乙醇、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，肌酐酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40--200mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l穩(wěn)定劑10--50mmol/l試劑II緩沖液40--200mmol/l肌酸酶1000--50000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑III緩沖液40--200mmol/l肌酐酶1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，氧化型輔酶、乙醇等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，肌酸酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中。試劑III其中的成分，肌酐酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液(例如還可以是咪唑/鹽酸緩沖液6.2-7.8；磷酸氫二鈉 檸檬酸緩沖液5.0-8.0；檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液5.0-6.6；磷酸鹽緩沖液6.0-8.0；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液6.0-8.0；磷酸二氫鉀 氫氧化鈉緩沖液6.0-8.0；巴比妥鈉-鹽酸緩沖液6.8-9.6；Tris鹽酸緩沖液7.0-9.0；硼酸 硼砂緩沖液7.4-9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液8.6-10.6；砂-氫氧化鈉緩沖液9.2-10.0；碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在時不得使用)；PBS緩沖液7.0-7.6等)。
以上氧化輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上，還可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、丁二酸鹽等中選擇。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l氧化型輔酶1--5mmol/l乙醇 3--12mmol/l肌酐酶8000--20000U/l肌酸酶8000--20000U/l肌氨酸氧化酶 6000--10000U/l醛脫氫酶 8000--20000U/l過氧化氫酶5000--10000U/l穩(wěn)定劑20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的肌酐診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l氧化型輔酶1mmol/l乙醇 3mmol/l肌酐酶8000U/l
肌酸酶 8000U/l肌氨酸氧化酶 6000U/l醛脫氫酶 8000U/l過氧化氫酶 5000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出肌酐的含量。
本實施例應用肌酐酶偶聯(lián)肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐酶將肌酐變成肌酸，再通過偶聯(lián)肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶的作用，將二分子氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為二分子還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以提高還原型輔酶在340nm處吸光度上升的幅度二倍，也就是提高靈敏度二倍，通過測量340nm處吸光度上升的幅度，可以測算肌酐的含量。
實施例二(雙劑)本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l氧化型輔酶 3mmol/l乙醇8mmol/l肌酸酶 14000U/l肌氨酸氧化酶8000U/l醛脫氫酶14000U/l過氧化氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l肌酐酶 14000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)測定肌酐含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出肌酐的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的肌酐診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l氧化型輔酶5mmol/l乙醇 12mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l肌酸酶20000U/l肌氨酸氧化酶 10000U/l醛脫氫酶 20000U/l過氧化氫酶10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l肌酐酶20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出肌酐的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l氧化型輔酶2mmol/l乙醇 10mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液100mmol/l肌酐酶8000U/l肌酸酶8000U/l
肌氨酸氧化酶8000U/l醛脫氫酶20000U/l過氧化氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出肌酐的含量。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質的污染。
權利要求
1.一種肌酐含量測定方法，步驟如下1)、將樣品主要由氧化型輔酶、乙醇、肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應肌酐+水肌酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子甲醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度上升的速度，測算出肌酐含量的大小。
2.根據(jù)權利要求1所述肌酐含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速(程)度，測算出肌酐的含量。
3.根據(jù)權利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于被測肌酐樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種肌酐診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l乙醇1--30mmol/l肌酐酶 1000--50000U/l肌酸酶 1000--50000U/l肌氨酸氧化酶1000--20000U/l醛脫氫酶500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權利要求5所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0-11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述氧化輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定肌酐含量的方法，同時本發(fā)明還涉及肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩沖液、氧化型輔酶、乙醇、肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出肌酐的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1778947SQ20041006556
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司