專利名稱：二氧化碳含量測定方法及二氧化碳診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時本發(fā)明還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血液內(nèi)二氧化碳的含量對人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩沖系統(tǒng)中以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。
血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純代謝性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根[HCO3-]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得的PH與PCO2，根據(jù)H-H方程的變換形式HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka)計算獲得。
式中PH為37℃時測得值，p ka在37℃為6.10。
目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機并與血氣分析結(jié)果一起報告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測定誤差較大。
酶法測定適合自動化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測定方法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國專利發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?6190276.0、申請日為1996.02.06的發(fā)明專利申請公開了一種用來導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然后處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動脈血中二氧化碳?xì)怏w水平。若數(shù)據(jù)為時間域，處理可將時間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體積域。該方法也經(jīng)迭代評估了多個變量的顯著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn)確地對健康人和患肺病病人進行血中氣體含量的測定。近年來，申請?zhí)枮?2282386.7、申請日為2002.10.29的實用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳酸氫根測定儀，主要由操作面板、進樣檢測機構(gòu)、定滴加液機構(gòu)、攪拌機構(gòu)和以單片機為主控元件的電器控制部分組成。
以上專利均與酶法測定無關(guān)，這從一個側(cè)面說明，國內(nèi)此方面的實驗研究十分缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點的二氧化碳(碳酸氫根)含量的測定方法。同時本發(fā)明還給出實現(xiàn)該方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳(碳酸氫根)含量測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的步驟如下1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下方法原理的反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本發(fā)明直接應(yīng)用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后產(chǎn)生磷酸根，再酶偶聯(lián)核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。這個酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點有(1)它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小，氧化型輔酶在溶液中的穩(wěn)定性比還原性輔酶高很多，因此這個系統(tǒng)的穩(wěn)定性很好。(2)這個酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確。
用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l肌苷 0.2--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000--20000U/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 l--30mmol/l過氧化氫酶500--50000U/l氧化型輔酶0.5--20mm0l/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染試劑I緩沖液40--200mm0l/l肌苷 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 1--30mmol/l過氧化氫酶500--50000U/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l醛脫氫酶 500--50000U/l
穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方。試劑II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l肌苷 0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II緩沖液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
試劑III緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l穩(wěn)定劑10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方。其中的試劑I的成分，肌苷、乙醇、氧化型輔酶可以放在試劑II中。試劑II其中的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等也可以放在試劑I中。試劑II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在試劑III中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-l-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l
磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l肌苷 1--5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000--10000U/l核苷磷酸酶6000--20000U/l黃嘌呤氧化酶 5000--20000U/l乙醇 5--15mmol/l過氧化氫酶5000--15000U/l氧化型輔酶2--6mmol/l醛脫氫酶 5000--20000U/l穩(wěn)定劑20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源磷酸根的污染，消除內(nèi)、外源磷酸根的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)、外源磷酸根已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試二氧化碳(碳酸氫根)含量所需要的磷酸根都是產(chǎn)生于二氧化碳(碳酸氫根)的作用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l
磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l肌苷 1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000U/l核苷磷酸酶6000U/l黃嘌呤氧化酶 5000U/l乙醇 5mmol/l過氧化氫酶5000U/l氧化型輔酶2mmol/l醛脫氫酶 5000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本實施例直接應(yīng)用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后產(chǎn)生磷酸根，再酶偶聯(lián)核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm 收峰的增加程度可以直接反映二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
實施例二(雙劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l肌苷 3mmol/l核苷磷酸酶13000U/l黃嘌呤氧化酶 12500U/l乙醇 10mmol/l過氧化氫酶10000U/l氧化型輔酶4mmol/l醛脫氫酶 12500U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測定二氧化碳(碳酸氫根)含量時，溫度控制在30℃，反應(yīng)時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
具體測定步驟為
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l肌苷 5mmol/l乙醇 15mmol/l氧化型輔酶6mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l核苷磷酸酶20000U/l黃嘌呤氧化酶 20000U/l過氧化氫酶15000U/l醛脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)
試劑III緩沖液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 10mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
具體測定步驟為二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l肌苷 1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l核苷磷酸酶10000U/l黃嘌呤氧化酶 10000U/l
乙醇 5mmol/l過氧化氫酶10000U/l氧化型輔酶2mmol/l醛脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水，乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種二氧化碳含量測定方法，包括以下步驟1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下方法原理的反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述二氧化碳含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速(程)度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述二氧化碳含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述二氧化碳含量測定方法，其特征在于被測二氧化碳樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種二氧化碳診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸0.2——20mmol/l肌苷 0.2——10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l核苷磷酸酶500——50000U/l黃嘌呤氧化酶 500——50000U/l乙醇 1——30mmol/l過氧化氫酶500——50000U/l氧化型輔酶0.5——20mmol/l醛脫氫酶 500——50000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/33GK1763539SQ20041006505
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中