專(zhuān)利名稱(chēng)：血氨含量測(cè)定方法及血氨診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血氨含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測(cè)定的方法有微量擴(kuò)散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測(cè)定儀分析法。
擴(kuò)散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴(kuò)散法更準(zhǔn)確，CV為8％--13％；離子選擇電極法是利用NH3擴(kuò)散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進(jìn)行測(cè)定，該方法的CV為3.5％--4.8％，回收率高，但均需專(zhuān)門(mén)的儀器，不適合我國(guó)的具體實(shí)際。
檢索中國(guó)專(zhuān)利，僅查出87105593.7號(hào)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種血氨測(cè)定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的血氨含量的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行血氨含量測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定血氨含量的方法步驟如下1)、將樣品與主要由谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，測(cè)算出血氨的含量。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出血氨的含量。
以上樣品與試劑的混合比例為按體積1/10到1/100，以上過(guò)程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用谷氨酰胺合成酶偶聯(lián)偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)(EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40或EC1.1.1.83之一)反應(yīng)比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸產(chǎn)生磷酸根，磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，二氧化碳(碳酸氫根)再和丙酮酸經(jīng)蘋(píng)果酸脫氫酶脫羧作用后產(chǎn)生蘋(píng)果酸，并將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的幅度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的幅度，可以測(cè)算二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶500--60000U/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 500--80000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根、二氧化碳污染試劑I緩沖液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 500--80000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l
谷氨酰胺合成酶500--60000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根、二氧化碳污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmol/l穩(wěn)定劑10--50mmol/l試劑II緩沖液40--200mmol/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 500--80000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑III緩沖液40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶500--60000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、還原型輔酶等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中，試劑III其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液(例如還可以是咪唑/鹽酸緩沖液6.2-7.8；磷酸氫二鈉 檸檬酸緩沖液5.0-8.0；檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液5.0-6.6；磷酸鹽緩沖液6.0-8.0；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液6.0-8.0；磷酸二氫鉀 氫氧化鈉緩沖液6.0-8.0；巴比妥鈉-鹽酸緩沖液6.8-9.6；Tris 鹽酸緩沖液7.0-9.0；硼酸 硼砂緩沖液7.4-9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液8.6-10.6；砂-氫氧化鈉緩沖液9.2-10.0；碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在時(shí)不得使用)；PBS緩沖液7.0-7.6等)。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上，還可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、丁二酸鹽等中選擇。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明血氨診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l谷氨酸6--10mmol/l腺苷三磷酸2--12mmol/l丙酮酸5--15mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶6000--12000U/l丙酮酸氧化酶 6000--12000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 8000--16000U/l穩(wěn)定劑20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒(méi)有污染環(huán)境問(wèn)題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源磷酸根、二氧化碳的污染，消除內(nèi)、外源磷酸根、二氧化碳的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源磷酸根、二氧化碳已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試血氨含量所需要的磷酸根、二氧化碳都是產(chǎn)生于血氨的含量。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l谷氨酸6mmol/l腺苷三磷酸2mmol/l丙酮酸5mmol/l還原型輔酶0.2mmol/l谷氨酰胺合成酶6000U/l丙酮酸氧化酶 6000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，從而測(cè)算出血氨的含量。
本實(shí)施例應(yīng)用谷氨酰胺合成酶偶聯(lián)偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)(EC1.1.1.38或EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40或EC1.1.1.83之一)反應(yīng)比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸產(chǎn)生磷酸根，磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，二氧化碳(碳酸氫根)再和丙酮酸經(jīng)蘋(píng)果酸脫氫酶脫羧作用后產(chǎn)生蘋(píng)果酸，并將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的幅度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的幅度，可以測(cè)算二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l谷氨酸8mmol/l腺苷三磷酸7mmol/l丙酮酸10mmol/l還原型輔酶0.25mmol/l丙酮酸氧化酶 9000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 12000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l谷氨酰胺合成酶9000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測(cè)定血氨含量時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測(cè)定步驟為氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，從而測(cè)算出血氨的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l谷氨酸10mmol/l腺苷三磷酸12mmol/l丙酮酸15mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l丙酮酸氧化酶 12000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 16000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III
緩沖液 120mmol/l谷氨酰胺合成酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測(cè)定步驟為氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，從而測(cè)算出血氨的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l谷氨酸10mmol/l腺苷三磷酸2mmol/l丙酮酸15mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l
試劑II緩沖液100mmol/l谷氨酰胺合成酶7000U/l丙酮酸氧化酶 10000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，從而測(cè)算出血氨的含量。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定血氨含量的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧化)蘋(píng)果酸+氧化型輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的幅度，測(cè)算出血氨的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定血氨含量的方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出血氨的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定血氨含量的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定血氨含量的方法，其特征在于被測(cè)樣品與試劑的比例控制在1/10到1/100。
5.一種血氨診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 500--60000U/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l蘋(píng)果酸脫氫酶 500--80000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血氨含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出血氨的含量。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1778945SQ20041006555
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司