專利名稱：氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用;離子交換法比擴散法更準確，CV為8X 13X;離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5X 4.8X，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨(離子)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨(離子)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明氨(離子)濃度測定方法原理如下
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡糖酸內(nèi)酯磷酸+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用谷氨酰按合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)聯(lián)葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase; EC3丄3.9)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.49)酶促反應(yīng)終點法。谷氨酰按合成酶酶解氨(離子)反應(yīng)產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酰按合成酶 10000 U/L
葡萄糖-6-磷酸酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
谷氨酸 8 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
葡萄糖 5 mmol/L
本發(fā)明的氨(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰按合成酶。輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直
接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨(離子)濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
谷氨酰按合成酶10000U/L
葡萄糖-6-磷酸酶12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶12000 U/L
谷氨酸8 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
葡萄糖5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。腺苷三磷酸
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nrn吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
實施例二
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
8 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰按合成酶葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
幽mmol/L50 mmol/L10000 U/L12000 U/L12000U/L腺苷三磷酸
下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
8 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰按合成酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定氨(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37r，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方
100mmol/L500 mmol/L12000 U/L12000 U/L
100mmol/L500謹ol/L10000U/L向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nrn吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0016;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達2.0mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士 6%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達0.65 ±0. 2AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶比色法及酶聯(lián)法的氨(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+葡萄糖 <u>葡萄糖-6-磷酸酶</u> 葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖-6-磷酸+輔酶 <u>葡萄糖-6-磷酸脫氫酶</u> 葡糖酸內(nèi)酯磷酸+ 還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000腿ol/L輔酶1_6 mmol/L谷氨酰按合成酶1000———80000 U/L葡萄糖-6-磷酸酶1000-——80000 U/L葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1000-——80000 U/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L葡萄糖1_50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖 -6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖組成雙劑試劑；試劑l，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶組成。輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖在試劑1或試劑2中的位置可以不P艮。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖 -6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖組成多劑試劑；試劑l，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成；試劑3， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰按合成酶組成。輔酶、谷氨酰按合成酶、葡萄 糖_6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于:還包括 穩(wěn)定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、葡萄糖、谷氨酰按合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464349SQ20071019214
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司