專利名稱：氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離 子)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用 最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler 反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造 成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散 法更準確，CV為8X 13X;離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引 起電極的PH發(fā)生變化進行測定，該方法的0/為3.5% 4.8%,回收率高。結(jié) 合具體實際，應以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅査出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯， 卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙 酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨(離子) 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨(離子)診斷/測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進 行氨(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推 廣應用。
5本發(fā)明氨(離子)濃度測定方法原理如下
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+精氨酸+還原型輔酶章魚堿脫氫酶
N2-(D-l-羧乙基)-L-精氨酸+輔酶+水 這種方法應用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)聯(lián) 丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、章魚堿脫氫酶(octopine dehydrogenase; EC 1.5丄11)酶促反應終點比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(離 子)反應產(chǎn)生磷酸根、腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸羧化酶、章魚堿 脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程 度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(離子)的濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨(離子)診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
章魚堿脫氫酶 10000 U/L腺苷三磷酸 草酰乙酸
10 mmol/L
3 mmol/L
5 mmol/L 3 mmol/L
本發(fā)明的氨(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚 堿脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶。 還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶、谷氨酸、腺
苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精
試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶。 還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶、谷氨酸、腺 苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨(離子)濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
丙酮酸羧化酶8000 U/L
章魚堿脫氫酶10000U/L
谷氨酸10 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
草酰乙酸5 mmol/L
精氨酸3 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37-C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間O分鐘，檢測時間 5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。 實施例二
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸 草酰乙酸
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/Li 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑1、 試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間0分鐘， 檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。 實施例三
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 還原型輔酶
腺苷三磷酸 草酰乙酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L
10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
畫mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L
10試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測氨(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向 為負反應(下降反應)，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到 本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器 得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0016;吸光度時 間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達2 mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過土7 %;試劑測試的精密度 (重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.60 ± 0.2AA/mmol /L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(離子)濃度測定方法，其方法原理如下氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+精氨酸+還原型輔酶 <u>章魚堿脫氫酶</u> N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+輔酶+水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-稱0 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L谷氨酰胺合成酶畫O-——訓OO U/L丙酮酸羧化酶畫0———80000 U/L章魚堿脫氫酶1000-——細OO U/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L精氨酸1_50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿 脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚 堿脫氫酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫 酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿 脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶組成；試 劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺合 成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精 氨酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑i_4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、精氨酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章魚堿脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464382SQ20071019217
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司