專利名稱：鎂(離子)診斷/測定試劑盒及鎂(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鎂(離 子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鎂測定方法很多，概括起來有比色法、熒光法、離子層析法，離子選擇性電
極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)等。
鎂測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，參考方法是原子吸收分光光度法 法。這些方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，不適合常規(guī)實驗室和自 動分析。
比色法是應(yīng)用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍(lán)法(MTB)、達(dá)旦黃法、 鄰甲酚酞絡(luò)合酮法(0CPC)、鈣鎂試劑(Calmagite)法、以及新近報道的2- (8， -羥基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)法。比色法操作簡便，費(fèi) 用低，適合常規(guī)實驗室應(yīng)用。但存在試劑空白吸光度高，膽紅素和其它陽離子 的干擾，試劑穩(wěn)定性差及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點。
離子選擇性電極法可測定生理溶液中鎂離子活度。采用中性載體(ETH7025) 液膜離子選擇電極測定準(zhǔn)確度較高。但還存在鈣干擾(生理范圍內(nèi))Ca2+最大干 擾10%等不足。
離子色譜法測定血清總鎂在測定之前需對樣本進(jìn)行預(yù)處理，包括酸化稀釋和過濾。Thienpont等使用該法對五種國際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)學(xué)會用火焰原子吸收分 光光度法的定值血清進(jìn)行了分析，結(jié)果平均偏差僅為0.35%，認(rèn)為離子色譜法 可作為總鎂測定有價值的參考方法。
Mg2+的酶法測定技術(shù)在近幾年研究非?；钴S，取得較大進(jìn)展。已應(yīng)用于Mg" 測定的酶學(xué)方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶 聯(lián)法；④酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法；⑤磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法; ⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)法。酶法檢測鎂結(jié)果準(zhǔn) 確，干擾影響小，適合于自動化分析。由于酶試劑不斷更新，使測定快速、靈 敏，操作簡便，因而具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙 酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鎂(離子) 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鎂(離子)診斷/測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn) 行鎂(離子)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推 廣應(yīng)用。
本發(fā)明鎂(離子)濃度測定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶^^+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸
丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+
輔酶
這種方法應(yīng)用需要鎂離子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1; EC 2.7丄2)酶(偶)聯(lián)丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC 2.7丄40)、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4丄1)酶促反應(yīng)逢續(xù)監(jiān)測/速率比色法。在鎂離子的激活下， 己糖激酶酶解腺苷三磷酸反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸激酶、 丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔 酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nrn處吸光度下 降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算鎂(離子)的濃度 大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鎂(離子)診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
己糖激酶6000 U/L
丙酮酸激酶8000 U/L
丙氨酸脫氫酶10000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
氯化銨 3 mmol/L
本發(fā)明的鎂(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙 酮酸、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙 酮酸、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直
接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鎂(離子)濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
己糖激酶6000 U/L
丙酮酸激酶8000 U/L
丙氨酸脫氫酶10000 U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸3 mmol/L
氯化銨3 mmoI/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。 實施例二
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
氯化銨
畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
己糖激酶
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
10丙酮酸激酶
8000 U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2
分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸 磷酸烯醇式丙酮f
氯化銨
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100腿ol/L 500 mmol/L
ii丙酮酸激酶 8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定鎂(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度1.8± 0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鎂(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng)方 向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器 得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0014;吸光度時 間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá) 6.5mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±6%;試劑測試的精密 度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.12 ± 0.04 AA/ mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鎂(離子)濃度測定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸丙酮酸+氨離子+還原型輔酶 <u>丙氨酸脫氫酶</u> L-丙氨酸+水+ 輔酶其中，氨離子可以用氯化銨或其他銨鹽代替。將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出鎂(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括-緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶己糖激酶丙酮酸激酶 腺苷三磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 50 mmol/L 50 mmol/L氯化銨 1- 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸 脫氫酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、 腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶組成; 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑H000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鎂(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化銨、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464375SQ200710192168
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司