專利名稱：鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒及鎂(離子)的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鎂(離 子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鎂測(cè)定方法很多，概括起來有比色法、熒光法、離子層析法，離子選擇性電
極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)等。
鎂測(cè)定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，參考方法是原子吸收分光光度法 法。這些方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，不適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室和自 動(dòng)分析。
比色法是應(yīng)用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍(lán)法(MTB)、達(dá)旦黃法、 鄰甲酚酞絡(luò)合酮法(0CPC)、鈣鎂試劑(Calmagite)法、以及新近報(bào)道的2- (8，-羥基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)法。比色法操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低， 適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。但存在試劑空白吸光度高，膽紅素和其它陽離子的干擾， 試劑穩(wěn)定性差及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點(diǎn)。
離子選擇性電極法可測(cè)定生理溶液中鎂離子活度。采用中性載體(ETH7025) 液膜離子選擇電極測(cè)定準(zhǔn)確度較高。但還存在鈣干擾(生理范圍內(nèi))Ca2+最大干 擾10%等不足。
離子色譜法測(cè)定血清總鎂在測(cè)定之前需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，包括酸化稀釋和過濾。Thienpont等使用該法對(duì)五種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)學(xué)會(huì)用火焰原子吸收分 光光度法的定值血清進(jìn)行了分析，結(jié)果平均偏差僅為0.35%，認(rèn)為離子色譜法 可作為總鎂測(cè)定有價(jià)值的參考方法。
Mg2+的酶法測(cè)定技術(shù)在近幾年研究非?；钴S，取得較大進(jìn)展。已應(yīng)用于Mg" 測(cè)定的酶學(xué)方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶 聯(lián)法；④酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法；(D磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法； ⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦谷氨酰胺合成酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)法。酶法檢測(cè)鎂結(jié) 果準(zhǔn)確，干擾影響小，適合于自動(dòng)化分析。由于酶試劑不斷更新，使測(cè)定快速、 靈敏，操作簡(jiǎn)便，因而具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙 酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定鎂(離子) 濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鎂(離子)診斷/測(cè)定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn) 行鎂(離子)濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。
本發(fā)明鎂(離子)濃度測(cè)定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶/]^^2+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+
輔酶
其中，磷酸根可以用磷酸二氫鹽取代。氨離子可以用銨鹽取代。
這種方法應(yīng)用需要鎂離子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC 2.7丄2)酶(偶)聯(lián)丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、丙氨酸脫 氫酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4.1.1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)/速率比色法。在 鎂離子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶) 聯(lián)合丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶 在340nm處吸光度下降的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè) 算鎂(離子)的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
葡萄糖 20 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 3 mmol/L
磷酸根 3 mmol/L
氯化銨 3 mmol/L
本發(fā)明的鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫 酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷 酸根、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷 酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷 酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定鎂(離子)濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
葡萄糖 20 mmol/L腺苷三磷酸 草酰乙酸 磷酸根 氯化銨
3 mmol/L
3 mmol/L
mmol/L
3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)鎂(離子)樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右， 檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鎂(離子)的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔f
腺苷三磷酸
草酰乙酸
磷酸根
0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L氯化銨
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
己糖激酶
丙酮酸羧化f
500 mmol/L
6000 U/L
8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)鎂(離子)樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2
分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鎂(離子)的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L
ii草酰乙酸
磷酸根
氯化銨
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
試劑3
3 mmol/L
3 mmol/L
3 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 己糖激f
500 mmol/L
6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定鎂(離子)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8士 0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)鎂(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鎂(離子)的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015;吸光度時(shí) 間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá) 6.5 mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過士 5 %;試劑測(cè)試的精 密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.12 ± 0.04 AA/ mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鎂(離子)濃度測(cè)定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨離子+還原型輔酶 <u>丙氨酸脫氫酶</u> L-丙氨酸+水+ 輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出鎂(離子)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶己糖激酶丙酮酸羧化〗腺苷三磷酸草酰乙酸磷酸根<formula>formula see original document page 0</formula>氯化銨 1——50mmol/L其中，磷酸根可以用磷酸二氫鹽取代。如果緩沖液使用磷酸緩沖液，則 不需要加磷酸二氫鉀。氨離子可以用銨鹽取代。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、 氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨 酸脫氫酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、葡 萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶組 成；試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、 氯化銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑H000 mmol/L或0.1。/。-100n/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鎂(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鎂(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、氯化銨、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鎂(離子)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464365SQ200710192158
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司