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鈉(離子)診斷/測定試劑盒及鈉(離子)濃度測定方法

文檔序號:5920211閱讀:230來源:國知局
專利名稱:鈉(離子)診斷/測定試劑盒及鈉(離子)濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種鈉(離子)診斷/測定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鈉 (離子)濃度的方法,屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
血清中鈉離子含量(簡稱"血鈉")在臨床上有著非常重要的意義,醫(yī)學(xué)
上有三個(gè)決定水平,依次為水平1——115mmo1/1,水平2——B5mmo1/1, 水平3——150mmo1/1。當(dāng)患者血鈉濃度等于或低于水平1時(shí),可出現(xiàn)神志不 清、疲勞、惡心、頭痛、嘔吐和厭食等癥狀,表明機(jī)體內(nèi)水的比例大于鈉, 應(yīng)采用相應(yīng)治療措施;當(dāng)血鈉濃度低于水平2時(shí),應(yīng)查找低鈉血癥的原因, 進(jìn)一步測定血清滲透壓、血鉀并進(jìn)行尿液分析,以確定診斷;當(dāng)血鈉濃度高 于水平3時(shí),應(yīng)檢查其它試驗(yàn)項(xiàng)目,尋找導(dǎo)致高鈉血癥的原因。
現(xiàn)有技術(shù)中測定鈉離子含量的常用方法有火焰光度計(jì)法、離子選擇電 極法、化學(xué)測定法、原子分光光度法、酶動(dòng)力學(xué)法等。
火焰光度計(jì)法——1950年開始使用并一直沿用至今,可檢測血清、尿液、 腦脊液及胸腹水中的Na+和K+,是一種發(fā)射光譜分析法,其結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 廣為臨床采用。該方法分為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較 大, 一般不采用?,F(xiàn)在主要使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法,即向標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液中加進(jìn)相同 濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行測定,操作時(shí),將含鋰的溶液作為稀釋液, 同時(shí)測定K+、 Na+和Li+的濃度,以標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的1^+/0+與&+/1^+比值, 計(jì)算Na+、 K+濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大,血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可以 忽略不計(jì)。
離子選擇電極法——簡稱ISE法,是采用靈敏的特定專用電極,在專用 儀器上進(jìn)行血清和尿等體液中的K+、 Na+的測定,因標(biāo)本用量少,快速準(zhǔn)確,
4幾乎有取代其它方法的趨勢。其測定原理是,用離子選擇電極與參比電極組 合起來,浸泡在待測標(biāo)本溶液中進(jìn)行檢測。目前已有的電極種類有①玻璃 膜電極,感應(yīng)材料為玻璃薄膜,有PH電極、K+電極和Na+電極;②固相膜電 極,由難溶性金屬物質(zhì)加壓成型,以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜,有C卜電極
和F-電極;③液態(tài)膜電極,將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀作為感應(yīng)膜,有Ca2— 電極;④用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的使用壽命,因?yàn)?電極使用一段時(shí)間后就會(huì)自動(dòng)老化,有效期長短不一。目前離子選擇電極法 應(yīng)用也較為普遍,但是電極成本昂貴。
此外,化學(xué)測定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚,作為離 子載體進(jìn)行測定。由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴,分子內(nèi)部的氧原子有未共用電子 對可與金屬離子結(jié)合,根據(jù)空穴大小,可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子, 從而達(dá)到測出離子濃度的目的;原子分光光度法也可用于檢測血清中K+、 Na + ,但操作繁雜,誤差較大,不及火焰光度法簡便。
酶法測定鈉離子含量的方法,與火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法都有較 好的一致性,這種方法抗干擾性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,但用生化分析儀不能同時(shí)測 定鈉離子和鉀離子各自的含量,導(dǎo)致這種方法不能得到推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酉每比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián) 法(Couple Reaction)技術(shù),計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化,得以測定鈉(離子)濃度的方法,同時(shí),本 發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鈉(離子)診斷/測定試劑盒,采用該試劑不 僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鈉(離子)濃度 測定,而且測定速度快、準(zhǔn)確度高,因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明鈉(離子)濃度測定方法原理如下
乳糖+水 13-半乳糖苷酶/>^+葡萄糖+半乳糖葡萄糖+磷酸根葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水 葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡糖酸內(nèi)酯磷酸+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用需要鈉離子激活的卩-半乳糖苷酶(f3-galactosidase ; EC 3.2丄23)具有乳糖酶(lactase ; EC3.2丄108)的特性,酶(偶)聯(lián)葡萄糖-6-磷 酸酶(glucose-6-phosphatase ; EC 3.1.3.9)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.49)酶促反應(yīng)速率比色法。在 鈉離子的激活下,P-半乳糖苷酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖,再通過(偶)聯(lián)合 葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用,最終將輔酶(在340nm處沒 有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原 型輔酶在340nm處吸光度上升的速度,通過測量340nm處吸光度上升的速度, 可以測算鈉(離子)的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明,從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮,無 論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明鈉(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩沖液畫mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶10000U/L
葡萄糖-6-磷酸酶12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶12000U/L
, 藩20 mmol/L
磷酸根5 mmol/L本發(fā)明的鈉(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷酸根。 試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試 劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、磷酸根。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸
脫氫酶。
輔酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷 酸根在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用 前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、磷酸根。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、(3-半乳糖苷酶。 輔酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷 酸根在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定鈉(離子)濃度的方法,其輔酶
可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
本實(shí)施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶 10000 U/L
葡萄糖-6-磷酸酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
乳糖 20 mmol/L
磷酸根 5 mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進(jìn)行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前, 加入純凈水,復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始吸光度 《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測鈉(離子)樣品與試劑 的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約2分鐘左 右,檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉(離子)的濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為雙試劑,包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
輔酶
乳糖
50 mmol/L 3 mmol/L
20 mmol/L 5 mmol/L
試劑2
二 ^始
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 P-半乳糖苷酶 葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
50 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始吸光度
《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測鈉(離子)樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大
約2分鐘左右,檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉(離子)的濃度大
9實(shí)施例三
本實(shí)施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為三試劑,包括:
試劑1
=f餘
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
乳糖 磷酸根
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
葡萄糖-6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
試劑3
穩(wěn)定劑
(3-半乳糖苷酶
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
試劑全
配好后,分裝入瓶,制成液體」
500 mmol/L 10000U/L
:試劑,可以直接使用
測定鈉(離子)濃度時(shí),在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)
間10分鐘,起始吸光度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被 測鈉(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約2分鐘左右,檢測時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
10下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉(離子)的濃度大 小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同,不另一一例舉。
總之,實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀
器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.021;吸光度 時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn);試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可 達(dá)50—200mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度,其相對偏差不超過±5%;試劑測 試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.00016 ± 0.00008 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,足 以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶比色法及酶聯(lián)法的鈉(離子)的濃度測定方法,其方法原理如下乳糖+水 <u>β-半乳糖苷酶/Na</u><u>+</u> 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+磷酸根 <u>葡萄糖-6-磷酸酶</u> 葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖-6-磷酸+輔酶 <u>葡萄糖-6-磷酸脫氫酶</u> 葡糖酸內(nèi)酯磷酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,測算出鈉(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2 一種鈉(離子)診斷/測定試劑盒,主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L輔酶1——6 mmol/L(3-半乳糖苷酶IOOO-——80000 U/L葡萄糖-6-磷酸酶1000——80000 U/L葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1000———80000 U/L乳糖l一50 mmol/L磷酸根1—50 mmol/L如果使用磷酸緩沖液,則不需要另外加磷酸根成分。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內(nèi)效果較好,在此范圍外,試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒,其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶、乳糖、磷酸根組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷酸根組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、乳糖、磷酸根組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、P-半乳糖苷酶、 葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成。輔酶、P-半乳糖苷酶、葡萄 糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷酸根在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、磷酸根組成多劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、乳糖、磷酸根組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖-6-磷酸酶、 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、P-半乳糖苷酶組 成。輔酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳糖、 磷酸根在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒,其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1—4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鈉(離子)診斷/測定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鈉(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乳糖、磷酸根、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的速度,從而測算出鈉(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464355SQ200710192148
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
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