專利名稱：肌酐診斷試劑盒及肌酐濃度的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃
度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
祖旦肚士 冃豕?jié)h不
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法 和毛細管電泳法等。
化學測定法一一成本低廉，操作簡便，是目前國內測定肌酐最常 用的方法之一。標本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌 酐復合物。此法的缺點是特異性不高，因為維生素C、丙酮、乙酰乙 酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質和一些抗生素如青霉素G、 頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通 過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。 此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標本分析， 通常僅作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試劑盒和 某些科研目的。
毛細管電泳法——血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用 低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定 235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊 設備和進行血清標本的預處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學測定法^主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase ) 和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、
申請日為2002.11.15的專利申請公開了應用酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰
胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反 應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙
酰胺輔酶或其類似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系 統(tǒng)，通過在試劑內形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，
將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其 類似物。當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時， 該發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉移酶、天門 冬氨酸氨基轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的 特點在于為丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿 素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內源 合成丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素養(yǎng)試 劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應所需要的底物一還原型 煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反應所需要的還原型煙 酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基 轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確 性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段 時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩 不濟急的結果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯(lián)反應生成 吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye),所導 致在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定肌酐濃度的方法，
同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試
劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行肌酐濃
度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實
的推廣應用。
本發(fā)明肌酐濃度測定方法原理如下
肌酐+水+ H+肌酐脫亞胺酶 N-甲基海因+氨離子
氨離子+ a-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸 ' +輔酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨離子+ a-酮戊二酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
這種方法應用肌酐脫亞胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)將 肌酐酶解產(chǎn)生氨。
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11) 使氨不斷地被重復循環(huán)利用，并同時不斷地循環(huán)擴增產(chǎn)出過氧化氫。
過氧化物酶將過氧化氫與還原型色原體組合作用，最終將無色的還 原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器， 在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染 料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)， 含量高低的光吸收大小，通過測量400~700nm (根據(jù)還原型色原體組 合的不同而定)處吸光度上升的速度，得出肌酐濃度大小測定結果。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 肌酐脫亞胺酶
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸 過氧化物酶 還原型色原體組合A 抗干擾劑
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 5000 U/L 100000U/L 8000 U/L 16 mmol/L 30000 U/L 6 mmol/L 30 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任-
個組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基""N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發(fā)明的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、OC-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸 脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、 過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨 酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑1或試劑2中的位
置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、Ot-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、抗干擾劑。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸氧化酶。
a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨 酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合在試劑l、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的肌酐診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
肌酐脫亞胺酶 8000 U/L
谷氨酸脫氫酶 150000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/Lot-酮戊二酸 16mmol/L 過氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 2 mmol/L
石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間IO分鐘，測 試主波長505nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為 1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于 生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出肌 酐的濃度大小。 實施例二
本實施例的肌酐診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 120000 U/L
ot-酮戊二酸 16mmol/L 過氧化物酶 30000 U/L
2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
肌酐脫亞胺酶 4000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C,反應時間10分鐘，測試 主波長546nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/20， 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出肌酐的 濃度大小。
實施例三肌酐診斷試劑為三試劑，包括-試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶
ot-酮戊二酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
0.25 mmol/L 100000U/L 16 mmol/L 0.6 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
試劑3
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
雙甲基苯胺
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶 谷氨酸氧化酶
50 mmol/L 40000 U/L 2 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L 5000 U/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，測試
主波長578nm，測試副波長660nm，被測樣品與試劑的體積比例為1/30，
反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l
分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于
生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出肌
酐的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實
施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好。
權利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法(Enzymatic Recycling Method)的肌酐濃度測定方法，其方法原理如下肌酐+水+H+ 肌酐脫亞胺酶 N-甲基海因+氨離子氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸+輔酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨離子+α-酮戊二酸+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出肌酐濃度大小測定結果。肌酐脫亞胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)作為作用酶，功能為產(chǎn)生氨。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環(huán)酶，將氨不斷地被重復循環(huán)利用，并同時不斷地擴增產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶作為顯色酶，將過氧化氫與還原型色原體組合作用發(fā)生顯色反應。
2. —種肌酐診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑還原型輔酶肌酐脫亞胺fo.i-50 mmol/L-0.35 mmol/L200--50000 U/L2000——500000 U/L2000——500000 U/L2-畫20 mmol/L500~^500000 U/L0.1"——20mmol/L1-50 mmol/L谷氨酸氧化酶 a-酮戊二酸 過氧化物酶 還原型色原體組合 抗干擾劑其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物酶(EC 1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3、 EC 1.4丄4)、谷氨酸氧化酶 (Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物酶(EC1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成雙劑試劑；試劑1， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、過 氧化物酶、還原型色原體組合及抗干擾劑組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸氧化酶及抗干擾劑組成。a-酮戊二 酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、 過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶 (Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶 (Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、過氧化物酶(EC 1.11丄7)、還原型色原體組合及抗干擾劑組成多劑試劑；試劑1， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、oc-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合及抗 干擾劑組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸 氧化酶組成。a-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫 氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧化物酶及抗干擾劑在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 齊廿1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
7. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色 原體組合可以是下列28個組合中的任一個組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻哇酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻挫-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶循環(huán)擴增法的肌酐診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、α-酮戊二酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩(wěn)定劑及抗干擾劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出肌酐濃度的大小。
文檔編號G01N21/78GK101097198SQ20061008558
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優(yōu)先權日2006年6月26日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司