專利名稱:肌酐診斷試劑(盒)及肌酐的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑(盒),同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方法,屬
于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
測(cè)定肌酐主要有化學(xué)測(cè)定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法 等。 化學(xué)測(cè)定法成本低廉,操作簡(jiǎn)便,是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高,維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。 高效液相層析法(HPLC),肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷,通過(guò)陽(yáng)離子交換層析柱 可與其他成分很好分離,在234nm測(cè)定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好,但本法 不適于大批量臨床標(biāo)本分析,通常作為肌酐測(cè)定的參考方法,用于評(píng)價(jià)市售肌酐測(cè)定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn),申請(qǐng)?zhí)枮?0106198. 0、申請(qǐng)日為1990. 12. 18的中國(guó)專利 申請(qǐng)公開了用高效液相色譜直接測(cè)定人尿中假尿嘧啶核苷(簡(jiǎn)稱假尿苷),再通過(guò)分光光 度法同時(shí)測(cè)出肌酐,分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標(biāo)志物。(這個(gè)專利 和我們的無(wú)關(guān)) 毛細(xì)管電泳法,血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理,尿液標(biāo)本可用低速離心,除去有形 成分,上清液用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳分離后測(cè)定235nm處吸光度。本法測(cè)定線性范圍寬,操
作較為簡(jiǎn)便,但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理,臨床常規(guī)使用困難。 酶學(xué)測(cè)定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類。 檢索發(fā)現(xiàn),申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專利申請(qǐng)公開了應(yīng)用 酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè) 定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物,而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類 似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng),通過(guò)在試劑內(nèi)形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng),將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類似物,當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí),該發(fā) 明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為,這個(gè)系統(tǒng)在生成反 應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí),也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性,造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是,該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間,以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶, 這樣一來(lái)就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果,給測(cè)試帶來(lái)很大的不便。 據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專利介紹,該系統(tǒng)由于不斷生成 測(cè)定所需的NADH或NADPH,從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性,并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其 實(shí)在試劑中加入NADH或NADra的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問(wèn)題,反而比在試劑中 增加一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)要經(jīng)濟(jì)得多。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出 一 種利用間接酶循環(huán)擴(kuò)增法 (IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔 酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化,得以測(cè)定肌酐濃度的方法,同時(shí),本發(fā)明還將給出用以 實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑(盒),采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自 動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行肌酐濃度測(cè)定,而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高,因而可以得到切實(shí)的推廣 應(yīng)用。 本發(fā)明肌酐濃度測(cè)定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨 氨+含氧酸+過(guò)氧化氡氨某酸氧化酶氨某酸+水+氧 氨基酸+水+輔酶氨基酸脫氫酶含氧酸+氨+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶(偶)聯(lián) 氨基酸氧化酶(amino acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)、氨基酸脫氫酶(aminoacid dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 5 ;EC 1. 4. 99. 1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。肌酐脫亞胺酶及氨基酸 氧化酶作為作用酶,功能為將肌酐酶解產(chǎn)生氨,再生成丙氨酸。氨基酸脫氫酶作為循環(huán)酶 氨基酸脫氫酶的酶促作用使丙氨酸再次變回氨,使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。氨基酸脫氫 酶又作為顯色酶,將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰),從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度,通過(guò)測(cè)量340nm處吸光 度上升的速度,可以測(cè)算出肌酐的濃度。 實(shí)驗(yàn)表明,從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮,無(wú)論是單 劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L肌酐脫亞胺酶10000U/L氨基酸氧化酶12000U/L氨基酸脫氫酶12000U/L含氧酸15mmol/L過(guò)氧化氫10mmol/L 本發(fā)明的肌酐診斷試劑(盒)可以是單劑,包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化氫。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、含氧酸、過(guò)氧化氫。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化氫在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以 配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、含氧酸、過(guò)氧化氫。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化氫在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑,直接使用。 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測(cè)定肌酐濃度的方法,其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一 本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為單試劑,包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 肌酐脫亞胺酶 10000U/L 氨基酸氧化酶 12000U/L 氨基酸脫氫酶 12000U/L 含氧酸 15mmol/L 過(guò)氧化氫 10mmol/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進(jìn)行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前,加入純凈 水,復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始吸光度《0. l,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)?br>
正反應(yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約3分鐘左右,檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下,檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度,從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為雙試劑,包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
過(guò)氧化氫 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶
100,1/L 50mmol/L 3mmol/L 15mmol/L 1Ommol/L
鹽酸緩沖液
100,1/L 50mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始吸光度《0. l,測(cè) 試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)肌酐樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5, 反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約3分鐘左右,檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下,檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度,從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為三試劑,包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L含氧酸15mmol/L過(guò)氧化氫10mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩(wěn)定劑500,1/L氨基酸氧化酶12000U/L氨基酸脫氫酶12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,1
穩(wěn)定劑 500mmol/L 肌酐脫亞胺酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。測(cè)定肌酐濃度時(shí),在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:,反應(yīng)時(shí)間IO分鐘,起始
吸光度《0. 1,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)肌酐樣品與試劑1、試劑2、試劑3
的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約3分鐘左右,檢測(cè)
時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下,檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度,從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的,鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同,不另一一例舉。 總之,實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn);試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)2mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度, 其相對(duì)偏差不超過(guò)±4%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈 敏度可達(dá)O. 4±0. 2 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存,活性可以穩(wěn)定一年;——本發(fā)明靈敏 度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩(wěn)定期長(zhǎng),足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的肌酐的濃度測(cè)定方法,其方法如下肌酐+水 肌酐脫亞胺酶 N-甲基海因+氨氨+含氧酸+過(guò)氧化氫 氨基酸氧化酶 氨基酸+水+氧氨基酸+水+輔酶 氨基酸脫氫酶 含氧酸+氨+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度,測(cè)算出肌酐的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種肌酐診斷試劑(盒),主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶肌酐脫亞胺酶20-1— 1——500,1/L -4000mmol/L -6mmol/L1000 1000 10001— 1—-50mmol/L -50mmol/L過(guò)氧化氫試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內(nèi)效果較好,在此范圍外,試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液 體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化 氫組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化 氫組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、含氧酸、過(guò)氧化氫組成;試劑2,由緩沖 液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶組成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸 氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化氫在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化 氫組成多劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、含氧酸、過(guò)氧化氫組成;試劑2,由緩沖 液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶組 成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、含氧酸、過(guò)氧化氫在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑(盒),其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmo1/ L或O. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷試劑(盒),同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、含氧酸、過(guò)氧化氫、肌酐脫亞胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度,從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101762504SQ20081024420
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司