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同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度的測定方法

文檔序號(hào):6087039閱讀:177來源:國知局
專利名稱:同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測 定同型半胱氨酸濃度的測定方法,屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種,包括高效液相色譜法
(HPLC)、氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、 毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜,熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學(xué)法及酶法等等。
1.高效液相色譜法(HPLC):是經(jīng)典的參考方法,但其有操作比較 復(fù)雜,試驗(yàn)耗時(shí)比較長,試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn),在臨床應(yīng)用方 面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相 色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還 原形式,然后與熒光劑進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物, 將衍生后的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不 同,因此流動(dòng)相將其洗脫下來的次序也不同,根據(jù)這一原理將樣品中 的不同物質(zhì)分開,以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù) 合物的熒光強(qiáng)度,將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算,就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。2. 酶聯(lián)免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的 常用方法,其特點(diǎn)是操作比較方便、快捷,重復(fù)性好,方法穩(wěn)定可靠。 缺點(diǎn)是大部分操作還是手工操作,比較耗時(shí)等。酶聯(lián)免疫分析法其基 本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成S-腺
苷-L-同型半胱氨酸,然后加入酶標(biāo)的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單
克隆或多克隆抗體,采用競爭結(jié)合的原理,將不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶 標(biāo)抗體競爭結(jié)合,然后以顯色試劑和終止試劑分別進(jìn)行顯色和終止, 制作出同型半胱氨酸濃度與發(fā)色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品也按相同步驟 處理,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
3. 離子色譜法主要用于實(shí)驗(yàn)研究,臨床上較少使用。其基本分 析原理是色譜分析的一種,主要是其固定相采用離子交換物質(zhì),根據(jù) 其對(duì)不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質(zhì)分開進(jìn)行測定。
4. 毛細(xì)電泳法主要用于實(shí)驗(yàn)研究,有在臨床使用的報(bào)道。其特 點(diǎn)與高效液相色譜方法相似,如其有操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)較長和 試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)。基本分析原理先使用還原劑使血樣中 所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式,然后與熒光試劑進(jìn)行衍生 生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物,將衍生后的樣品進(jìn)行毛細(xì)電泳分
析。將樣品放置于io千伏左右的高壓電場中,因?yàn)楦鞣N物質(zhì)所帶電荷
不同,其等電點(diǎn)也不相同,因此其在電場中的遷移速度也就不同,根 據(jù)這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質(zhì)分開,再以熒光檢
測器檢測同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度,將其與標(biāo)準(zhǔn)品/ 內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算,就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5. 熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法, 該方法完全自動(dòng)化儀器分析,具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本 分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結(jié)合的同型半 胱氨酸的熒光偏振強(qiáng)度不同,將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)抗體競爭結(jié)合,采 用競爭結(jié)合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲 線,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
6. 酶法是因應(yīng)市場需求而新開發(fā)出來的測試方法,目前國內(nèi)有多
項(xiàng)專利申請(qǐng)CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半 胱氨酸含量;CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶
(E.C.2丄1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3丄1)的循環(huán)擴(kuò)增作用, 再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶 等,或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應(yīng)測定同型半胱氨酸含量; CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產(chǎn)生熒光,該方法使用 全自動(dòng)熒光分析儀測試,具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析 原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解,所形成之硫化氫產(chǎn)物再與 熒光顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成可測量之熒光化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶反應(yīng)偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)技術(shù),計(jì)量由同型半胱氨酸-cxj-裂解酶(Homocysteine-ot,Y-lyase EC 4.4丄2)裂解同型半胱氨酸產(chǎn)生的硫化氫和N,N-二丁基苯二胺在鐵氰 化鉀的輔助下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成3,7-雙(二丁基氨基)吩噻嗪-5-ium 氯,而在675nm波長處吸光度的變化,得以測定同型半胱氨酸濃度的 方法,同時(shí),本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸診斷試 劑盒,采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析 儀上進(jìn)行同型半胱氨酸濃度的測定,而且測定速度快、準(zhǔn)確度高,因
而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下
同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶硫化氫+氨+
a-氧代丁酸(2-oxobutanoate) 硫化氫+ N,N-二丁基苯二胺+鐵氰化鉀一"^
3,7-雙(二丁基氨基)吩噻嗪-5-ium氯 這種方法應(yīng)用同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)終點(diǎn)比色法。 同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶酶解同型半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫,再通過偶 聯(lián)N,N-二丁基苯二胺的化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生3,7-雙(二丁基氨基)吩 噻嗪-5-ium氯(在675nm處有吸收峰),從而得以測定675nm處 吸光度上升的程度,可以測算同型半胱氨酸濃度的大小。 實(shí)驗(yàn)表明,從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮,無論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明同型半胱氨 酸診斷試劑盒較為理想
緩沖液pH8.2 100mmol/L
禾急定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶 5000 U/L N,N-二丁基苯二胺 2.5 mmol/L
鐵氰化鉀 0.6 mmol/L
本發(fā)明的同型半胱氨酸診斷試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、N,N-二丁基苯二胺(N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA )、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)、同型半胱 氨酸漏aj-裂解酶(Homocysteine-a,Y-lyase EC 4.4.1.2)。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成 液體試劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶 (Homocysteine-aj隱lyase EC 4.4.1.2)。
試劑2
N,N- 二 丁基苯二胺 (N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA )、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成 液體試劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶 (Homocysteine-a,y-lyase EC 4,4.1.2 )。
試劑2
N,N- 二 丁基苯二胺 (N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA)。 試劑3
緩沖液、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成
液體試劑,直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑,包括
緩沖液 pH8.2 100mmol/L 穩(wěn)定劑 30 mmol/L
同型半胱氨酸-ot,Y-裂解酶 4000 U/L
N,N-二丁基苯二胺 3 mmol/L
鐵氰化鉀 1 mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進(jìn)行冷凍干燥,制成干粉試劑; 使用前,加入純凈水,復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間IO分鐘,起 始吸光度《0.1,測試主波長675nm,測試副波長800nm,被測同型半 胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),
檢測方法為終點(diǎn)法,檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生
化分析儀下,檢測主波長675nm吸光度上升的程度,從而測算出同型小.
半胱氨酸濃度的大 實(shí)施例二
本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑,包括:
試劑1
緩沖液pH 8.2
穩(wěn)定劑
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
100mmol/L 40 mmol/L 3000 U/L
試劑2
N,N-二丁基苯二胺 鐵氰化鉀
2.5 mmol/L
0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始 吸光度《0.1,測試主波長675nm,測試副波長800nm,被測同型半胱 氨酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上 升反應(yīng)),檢測方法為終點(diǎn)法,檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測主波長675nm吸光度上升的程度,從而測算出同型半 胱氨酸的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑,包括:
試劑1
緩沖液 pH 8.2
穩(wěn)定劑
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶 試劑2
N,N-二丁基苯二胺 試劑3
100 mmol/L 50 mmol/L 5000 U/L
2 mmol/L
緩沖液 pH8.2 100mmol/L 鐵氰化鉀 1 mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。 測定同型半胱氨酸濃度時(shí),在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定:溫度37°C ,
反應(yīng)時(shí)間IO分鐘,起始吸光度《0.1,測試主波長675nm,

長800nm,被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比 例為4/40/5/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),檢測方法為終點(diǎn)法, 檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測主波長675nm吸光度上升的程度,從而測算出同型半 胱氨酸濃度的大小。
總之,實(shí)驗(yàn)證明,釆用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結(jié)果,并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外 源物質(zhì)的污染,便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種同型半胱氨酸濃度測定方法,其方法原理如下同型半胱氨酸+水 同型半胱氨酸-α,γ-裂解酶硫化氫+氨+α-氧代丁酸(2-oxobutanoate)硫化氫+N,N-二丁基苯二胺+鐵氰化鉀-→3,7-雙(二丁基氨基)吩噻嗪-5-ium氯將最終反應(yīng)物3,7-雙(二丁基氨基)吩噻嗪-5-ium氯(3,7-bis(dibutyl amino)phenothiazine-5-ium chloride)置于可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下,檢測主波長675nm吸光度上升的大小程度,測算出同型半胱氨酸濃度大小測定結(jié)果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒,主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶 N,N-二丁基苯二胺鐵氰化鉀20-500 mmol/L1- 50mmol/L500——20000 U/L0.2-20 mmol/L0,1- 8mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑,直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、N,N-二丁基苯二胺(N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA)、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)、同型半 胱氨酸-a,Y-裂解酶(Homocysteine-aj-lyase EC 4.4.1.2)組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、N,N-二丁基苯二胺(N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA)、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)、同型半 胱氨酸-a,Y-裂解酶(Homocysteine-a,Y-lyase EC 4.4.1.2 )組成雙劑 試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶組成; 試劑2,由N,N-二丁基苯二胺、鐵氰化鉀組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、N,N-二丁基苯二胺(N,N-Dibutyl phenylene diamine , DBPDA)、鐵氰化鉀(Potassium ferricyanide)、同型半 胱氨酸-a,Y-裂解酶(Homocysteine-aj-lyase EC 4.4.1.2)組成多劑 試齊l」;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶組成; 試劑2,由N,N-二丁基苯二胺組成;試劑3,由緩沖液、鐵氰化鉀 組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒,其特征在于還 包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、N,N-二丁基苯二胺、鐵氰化鉀、同型半胱氨酸-α,γ-裂解酶及穩(wěn)定劑,這些成分可以配成單劑試劑盒、雙劑試劑盒及三劑試劑盒;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于可見光分析儀下,檢測主波長675nm處吸光度上升的大小程度,從而測算出同型半胱氨酸的濃度。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101097187SQ20061008557
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司
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