專利名稱：棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法。
背景技術(shù)：
棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的一種維管束萎焉病害，該病菌的寄主范圍很廣，能浸染40個(gè)科600多種植物。棉子帶菌是遠(yuǎn)距離傳病的主要方式。棉花黃萎病最先在美國發(fā)現(xiàn)，二十世紀(jì)30年代隨美國棉種傳入我國，后擴(kuò)散到河南、山東、新疆等20多個(gè)省(區(qū)、市)，1995年再一次被列為全國植物檢疫對(duì)象。自上世紀(jì)90年代后期，我國棉花黃萎病的危害逐年加重，原因除了缺乏較強(qiáng)的抗耐性棉花品種、適宜的氣候條件之外，其中一個(gè)重要原因是棉子帶菌。由于棉花黃萎病菌在病田中存活時(shí)間長，一旦擴(kuò)散，將給棉花生產(chǎn)帶來毀滅性災(zāi)害。目前，對(duì)棉花黃萎病菌的檢測除常規(guī)的平板培養(yǎng)檢測外，主要采用PCR方法及免疫技術(shù)，但多是針對(duì)培養(yǎng)好的黃萎病菌，而對(duì)棉子帶菌的檢測還遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)。
棉花黃萎病菌的常規(guī)檢測方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，特異性也不高。直接利用菌體作抗原，制備抗血清進(jìn)行免疫檢測，又可能會(huì)出現(xiàn)抗血清效價(jià)偏低以及與其他具有相同抗原成分的病原菌引起交叉反應(yīng)的缺陷。棉花黃萎病菌產(chǎn)生的毒素蛋白是感病棉花品種致萎的主要原因，因此利用毒素制備抗血清就可以檢測出棉花黃萎病菌。劉鳳權(quán)等用毒素抗血清在病菌培養(yǎng)濾液、人工接種幼苗和大田病株中已能成功檢測出黃萎病菌，另外，齊俊生等的研究表明，毒素抗血清具備一定生理型特異性，用強(qiáng)致病力菌系V991毒素制備的抗血清對(duì)強(qiáng)致病力菌系毒素具有更強(qiáng)的結(jié)合力，能夠檢測出強(qiáng)致病力落葉型菌系，但還沒有利用毒素抗血清檢測棉子攜帶黃萎病菌的報(bào)道。
目前市場上流通的棉花種子大多是包衣子，而所用的包衣劑大多是針對(duì)苗病，而不是黃萎病，包衣還不能完全殺死黃萎病菌，包衣子并不是無菌子。當(dāng)前急需一套行之有效的棉子檢測技術(shù)尤其是對(duì)“藥物包衣”棉子的檢測技術(shù)來檢測棉子是否攜帶黃萎病菌。只有通過該檢測技術(shù)才能做到既堅(jiān)決保護(hù)無病區(qū)，嚴(yán)防病菌傳播，又能保證良種的合理推廣流動(dòng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前棉子攜帶黃萎病菌檢測中存在的實(shí)際問題，提供一種新的棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法，其特征在于
a、所述的棉子樣品應(yīng)取1000粒以上置于網(wǎng)袋中，沒有經(jīng)過藥物包衣的棉子，用流水搓洗，而經(jīng)藥物包衣的棉子反復(fù)搓洗至藥物包衣完全洗盡，然后將棉子于陰涼處晾干。
b、將晾干的棉子樣品加入含有適量抑制細(xì)菌生長的抗生素的查彼克培養(yǎng)液中，25℃振蕩培養(yǎng)3d后取培養(yǎng)液5000r·min-1，離心30min后的上清液，作為待測棉子樣品的培養(yǎng)液，進(jìn)行后序測試。
c、將待測棉子樣品的培養(yǎng)液用包被液1∶1稀釋后，取100μL加至酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中4℃過夜或37℃下孵育2h；并以標(biāo)準(zhǔn)抗原為陽性對(duì)照，空白培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。
d、取出酶標(biāo)板，棄去包被液，用PBST洗板3次，甩干，并在每孔中加入300μL封閉液，37℃保溫1h；e、取出酶標(biāo)板，棄去封閉液，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封閉液稀釋的抗血清，37℃下保溫1h；f、取出酶標(biāo)板，棄去用封閉液稀釋的抗血清，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(IgG-AP)，于37℃下保溫1h；g、取出酶標(biāo)板，棄去用封閉液稀釋的二抗，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對(duì)硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色；h、每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，用吸水紙吸干酶標(biāo)板底部，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，在405nm波長下，測定各孔的OD值。
i、按公式P/N＝樣品平均OD405值/陰性對(duì)照平均OD405值，計(jì)算ELISA檢測的P/N值。
j、以P/N≥2判為陽性，認(rèn)定該棉子樣品攜帶有黃萎病菌。
k、所述的標(biāo)準(zhǔn)抗原是用棉花黃萎病菌培養(yǎng)后獲得的毒素蛋白。
l、所述的抗血清是用標(biāo)準(zhǔn)抗原免疫小鼠或新西蘭兔制成的多克隆抗血清或單克隆抗血清。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于是以棉花黃萎病菌培養(yǎng)液中的毒素蛋白作為抗原制備抗血清，建立的可特異性檢測棉花黃萎病菌的間接ELISA方法。具有樣品前處理簡單，操作簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。采用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，有效避免了植物體內(nèi)過氧化物酶及酚類的干擾。本發(fā)明適合于各種子公司、檢疫機(jī)構(gòu)、科研單位等進(jìn)行種子攜帶黃萎病菌的檢測。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1 毒素抗血清的制備將活化后的棉花黃萎病菌菌株Bp2接種于查彼克培養(yǎng)液中，25℃振蕩培養(yǎng)16d后，5000r·min-1，離心30min，取上清，0.45μm微孔濾膜過濾后，裝入超濾離心管(Millipore公司，截留分子量為10000Da)中，反復(fù)離心直到毒素蛋白濃縮達(dá)0.1mg·L-1以上，用生理鹽水4℃透析后作為標(biāo)準(zhǔn)抗原。將標(biāo)準(zhǔn)抗原與福氏不完全佐劑以1∶1混合充分乳化后，按腹腔注射法共4次免疫BALB/C小白鼠，每次免疫間隔3周。眼球采血法采血，獲得毒素的抗血清。
實(shí)施例2 毒素抗血清的鑒定將標(biāo)準(zhǔn)抗原用包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋后，取100μL加至酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中37℃下孵育2h或4℃過夜后，用PBST洗板3次，然后加入300μL封閉緩沖液(含1％脫脂奶粉的PBST)37℃保溫1h，PBST洗板3次，每孔加入100μL用封閉緩沖液稀釋的抗血清于37℃下保溫1h，再用PBST洗板3次后，每孔加入100μL用封閉緩沖液稀釋6000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗血清(IgG-AP)于37℃下保溫1h，再用PBST洗板3次后，每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對(duì)硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色，最后加入50μL終止液(0.2mol·L-1EDTA)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測出405nm處的OD值。按公式P/N＝樣品平均OD405值/陰性對(duì)照平均OD405值計(jì)算ELISA檢測P/N值(positive/negative)。以P/N≥2判為陽性。
將毒素抗血清從1∶6400開始倍比稀釋至1∶819200，以免疫前的健康血清為陰性對(duì)照，按上述間接ELISA程序測定抗血清的效價(jià)。當(dāng)毒素抗血清稀釋至1∶204800時(shí)，測定的OD405值與陰性對(duì)照OD值之比(P/N)＞2，而當(dāng)抗血清稀釋至1∶409600時(shí)，P/N＜2，表明制備的毒素抗血清的效價(jià)為1∶204800。
將毒素抗原從2mg·L-1開始逐步稀釋至0.0039mg·L-1，按上述間接ELISA程序檢測靈敏度。以判為陽性的最大抗原稀釋倍數(shù)作為檢測靈敏度。當(dāng)毒素抗原稀釋至7.81μg·L-1時(shí)，測定的OD405值與陰性對(duì)照OD值之比(P/N)＞2，而當(dāng)毒素抗原稀釋至3.91μg·L-1時(shí)，P/N＜2。因此，建立的間接ELISA方法對(duì)毒素抗原的最低檢測量達(dá)7.81μg·L-1。
以建立的間接ELISA方法測定抗血清與棉花黃萎病菌菌株T9、02SY3、02XZH3、02GY3、02YD5、VD8、02NJ2、V151、02FN8、02DT6、02XY3和02CS3以及棉花立枯病菌、棉花紅腐病菌、小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌培養(yǎng)液的反應(yīng)，以確定抗血清的特異性。結(jié)果如表1所示，棉花黃萎病菌的美國標(biāo)準(zhǔn)菌株T9以及從江蘇省各地采集的棉花黃萎病菌菌株的培養(yǎng)液均可與毒素抗血清發(fā)生陽性反應(yīng)，而抗血清與非黃萎病菌的培養(yǎng)液的反應(yīng)呈陰性。由此認(rèn)為該抗血清對(duì)棉花黃萎病菌的培養(yǎng)液有較高的特異性，可用于毒素的檢測。
表1毒素抗血清特異性的測定

實(shí)施例3 培養(yǎng)濾液中毒素的測定將活化的菌株Bp2和T9分別接種于查彼克培養(yǎng)液中，25℃振蕩培養(yǎng)，分別在1、3、5、7、9、11d后取培養(yǎng)液，按上述間接ELISA程序測定培養(yǎng)液中的毒素，以未接菌的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。菌株Bp2、T9在培養(yǎng)1d后就可從培養(yǎng)液中檢測到毒素。在培養(yǎng)至3d后，OD405值已分別達(dá)到1.407、1.371，P/N值分別為9.05、8.82，并且在11d內(nèi)，OD405值都保持較高的數(shù)值。表明所建立的間接ELISA方法能夠快速檢測棉花黃萎病菌培養(yǎng)液中的毒素。
實(shí)施例4 在棉子檢測上的應(yīng)用對(duì)江蘇省植保站送檢的81份懷疑帶菌的棉子樣品進(jìn)行測定。其程序?yàn)槊糠菝拮訕悠贩謩e取100g置于網(wǎng)兜中，分開浸泡清洗。毛子用流水搓洗兩至三遍，藥物包衣的棉子反復(fù)搓洗至藥物包衣完全洗盡，然后將種子于陰涼處晾干。將晾干的每份棉子樣品平均分成五份分別加入150mL含有適量氯霉素的查彼克培養(yǎng)液中，25℃振蕩培養(yǎng)3d后取培養(yǎng)液5000r·min-1，離心30min后的上清液，按上述間接ELISA方法進(jìn)行檢測，以菌株Bp2的毒素抗原為陽性對(duì)照，未接菌的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。結(jié)果表明62份包衣子中4份帶菌，17份毛子中8份帶菌，2份光子中沒有檢查出帶菌。在帶菌的棉子中，也并不是每個(gè)三角瓶中(含20g棉子)的培養(yǎng)液中都呈反應(yīng)陽性，結(jié)果如表2所示。根據(jù)陳吉棣等的研究，病鈴內(nèi)成熟種子的帶菌率為0.025％，本發(fā)明對(duì)于棉子攜帶黃萎病菌的檢測，采取每個(gè)樣品隨機(jī)取棉子100g，即1200粒左右，培養(yǎng)時(shí)平均置于5個(gè)三角瓶中培養(yǎng)，可能并不是每個(gè)三角瓶中都裝有攜帶有黃萎病菌的棉子，因此，間接ELISA檢測結(jié)果表現(xiàn)出有的三角瓶培養(yǎng)液呈陽性，有的呈陰性。目前棉子所用的包衣劑大多是針對(duì)苗病，而不是黃萎病，本發(fā)明從包衣子中檢測到棉花黃萎病菌，說明包衣還不能完全殺死黃萎病菌，包衣子并不是無菌子。但檢測結(jié)果也顯示出，經(jīng)硫酸脫絨后的光子和包衣子，其黃萎病菌的帶菌率已經(jīng)明顯低于毛子。
將間接ELISA檢測為陽性的棉子按照上述方法洗凈晾干后，每份各稱100g，分別裝入600mL含有適量氯霉素的PDB培養(yǎng)基中，陽性對(duì)照選用棉花黃萎病菌Bp2，25℃，150r·min-1，培養(yǎng)6d后，2000r·min-1離心10min取上清，用針刺接種的方法接種于2片真葉期的泗棉3號(hào)棉苗的莖基部。20d后劈桿調(diào)查發(fā)病率。本發(fā)明采用100g棉子置于同1個(gè)三角瓶中培養(yǎng)，用其培養(yǎng)液針刺接種棉苗，以驗(yàn)證間接ELISA檢測結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明12份間接ELISA檢測為陽性的棉子培養(yǎng)液針刺棉苗，都可使棉苗發(fā)病，表明本發(fā)明的研究結(jié)果可靠。
表2檢測出的帶菌棉子舉例

權(quán)利要求
1.一種棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法，其特征在于a、所述的棉子樣品應(yīng)取1000粒以上置于網(wǎng)袋中，沒有經(jīng)過藥物包衣的棉子，用流水搓洗，而經(jīng)藥物包衣的棉子反復(fù)搓洗至藥物包衣完全洗盡，然后將棉子于陰涼處晾干。b、將晾干的棉子樣品加入含有適量抑制細(xì)菌生長的抗生素的查彼克培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)3d后取培養(yǎng)液5000r·min-1，離心30min后的上清液，作為待測棉子樣品的培養(yǎng)液，進(jìn)行后序測試。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法，其特征在于a、將待測棉子樣品的培養(yǎng)液用包被液1∶1稀釋后，取100μL加至酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中4℃過夜或37℃下孵育2h；并以標(biāo)準(zhǔn)抗原為陽性對(duì)照，空白培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。b、取出酶標(biāo)板，棄去包被液，用PBST洗板3次，甩干，并在每孔中加入300μL封閉液，37℃保溫1h；c、取出酶標(biāo)板，棄去封閉液，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封閉液稀釋的抗血清，37℃下保溫1h；d、取出酶標(biāo)板，棄去用封閉液稀釋的抗血清，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(IgG-AP)，于37℃下保溫1h；e、取出酶標(biāo)板，棄去用封閉液稀釋的二抗，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對(duì)硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色；f、每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，用吸水紙吸干酶標(biāo)板底部，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，在405nm波長下，測定各孔的OD值。g、按公式P/N＝樣品平均OD405值/陰性對(duì)照平均OD405值，計(jì)算ELISA檢測的P/N值。h、以P/N≥2判為陽性，認(rèn)定該棉子樣品攜帶有黃萎病菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)抗原是用棉花黃萎病菌培養(yǎng)后獲得的毒素蛋白。所述的抗血清是用標(biāo)準(zhǔn)抗原免疫小鼠或新西蘭兔制成的多克隆抗體或單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法，其特征在于取種子樣品1000粒以上置于網(wǎng)袋中，沒有經(jīng)過藥物包衣的種子，用流水搓洗，而經(jīng)藥物包衣的種子反復(fù)搓洗至藥物包衣完全洗盡后，將種子于陰涼處晾干。然后將晾干的種子樣品加入含有適量抑制細(xì)菌生長的抗生素的查彼克培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將預(yù)先處理的種子樣品培養(yǎng)液與包被液等體積混合，溫育處理；洗板，加入封閉液，溫育；洗板，加入抗血清，溫育；洗板，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，溫育；洗板，加入底物液，溫育；加入終止液終止反應(yīng)。在405nm波長下，測定各孔的OD值，并計(jì)算樣品平均OD
文檔編號(hào)G01N33/577GK1869634SQ200610085398
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月13日
發(fā)明者林玲, 周益軍, 顧本康 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院