專利名稱：肌酐含量測定方法及肌酐診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定肌酐含量的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定肌酐主要有化學(xué)測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細管電泳法等。
化學(xué)測定法——成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方法之一。標本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點是特異性不高，因為維生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標本分析，通常僅作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試劑盒和某些科研目的。
毛細管電泳法——血清標本用高速離心作預(yù)處理，尿液標本可用低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設(shè)備和進行血清標本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學(xué)測定法——主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002.11.15的專利申請公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物。當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應(yīng)一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結(jié)果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點的肌酐含量的測定方法，同時給出實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行肌酐含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定肌酐含量的方法步驟如下1)、將樣品與主要由還原性輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用肌酐酶偶聯(lián)肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及蘋果酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐酶將肌酐變成肌酸，再通過偶聯(lián)肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的幅度，通過測量340nm處吸光度下降的幅度，可以測算肌酐的含量。
實現(xiàn)本發(fā)明方法的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40——200mmol/l還原性輔酶 0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l肌酐酶 1000——50000U/l肌酸酶 1000——50000U/l尿素酶 1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源肌酸、尿素、碳酸氫根污染試劑I緩沖液 40——200mmol/l還原性輔酶 0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l肌酸酶 1000——50000U/l尿素酶 1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)試劑II緩沖液 40——200mmol/l肌酐酶 1000——50000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)
雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，還原性輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，肌酐酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源肌酸、尿素、碳酸氫根污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40——200mmol/l還原性輔酶0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)試劑II緩沖液40——200mmol/l肌酸酶1000——50000U/l尿素酶1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)試劑III緩沖液40——200mmol/l肌酐酶1000——50000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，還原性輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中。試劑III其中的成分，肌酐酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想緩沖液80——120mmol/l還原性輔酶0.2——0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2——8mmol/l肌酐酶6000——10000U/l肌酸酶6000——10000U/l尿素酶20000——40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000——20000U/l蘋果酸脫氫酶 10000——20000U/l
穩(wěn)定劑20——50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源肌酸、尿素、碳酸氫根的污染，消除內(nèi)、外源肌酸、尿素、碳酸氫根的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)、外源肌酸、尿素、碳酸氫根已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試肌酐含量所需要的肌酸、尿素、碳酸氫根都是產(chǎn)生于肌酐的含量。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的肌酐診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l還原性輔酶0.2mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l肌酐酶6000U/l肌酸酶6000U/l尿素酶20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l蘋果酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出肌酐的含量。
本實施例本發(fā)明應(yīng)用肌酐酶偶聯(lián)肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及蘋果酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐酶將肌酐變成肌酸，再通過偶聯(lián)肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的幅度，通過測量340nm處吸光度下降的幅度，可以測算肌酐的含量。
實施例二(雙劑)本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l還原性輔酶 0.25mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸5mmol/l肌酸酶 8000U/l
尿素酶30000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶15000U/l蘋果酸脫氫酶 15000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l肌酐酶8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測定肌酐含量時，溫度控制在30℃，反應(yīng)時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
具體測定步驟為肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出肌酐的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的肌酐診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l
還原性輔酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l肌酸酶10000U/l尿素酶40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶20000U/l蘋果酸脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l肌酐酶10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
具體測定步驟為肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出肌酐的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l還原性輔酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 4mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液100mmol/l肌酐酶6000U/l肌酸酶6000U/l尿素酶40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶20000U/l蘋果酸脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出肌酐的含量。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種肌酐含量測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由還原性輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氫根+氨離子碳酸氫根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌酐含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，測算出肌酐的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于被測肌酐樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種肌酐診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l還原性輔酶 0.15--0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l肌酐酶 1000--50000U/l肌酸酶 1000--50000U/l尿素酶 1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐含量的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、還原性輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出肌酐的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/31GK1766641SQ200410065168
公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中