專利名稱：血氨含量測定方法及血氨診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定血氨含量的方法，同時本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8％--13％；離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5％--4.8％，回收率高，但均需專門的儀器，不適合我國的具體實際。
檢索中國專利，僅查出87105593.7號專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術缺點的血氨含量的測定方法，同時給出用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行血氨含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明測定血氨含量的方法步驟如下1)、將樣品與主要由2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的幅度，測算出血氨的含量。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出血氨的含量。
以上樣品與試劑的混合比例為按體積1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
這種方法應用谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法。氨、2-酮戊二酸酯與還原型輔酶通過谷氨酸脫氫酶的作用，產生谷氨酸，谷氨酸通過谷氨酸脫羧酶催化產生二氧化碳，二氧化碳再和磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下產生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性大小。本發(fā)明的優(yōu)點是反應利用了二個分子的還原型輔酶，也產生了二個分子的氧化型輔酶，因此吸光度有二倍的變化速度，靈敏度也就提高了二倍。
用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l還原型輔酶0.15--0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脫氫酶 1000--50000U/l谷氨酸脫羧酶 1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶500--20000U/l蘋果酸脫氫酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內、外源谷氨酸、二氧化碳污染試劑I緩沖液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l還原型輔酶0.15--0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脫羧酶 1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶500--20000U/l蘋果酸脫氫酶 1000--50000U/l
穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l谷氨酸脫氫酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，谷氨酸脫氫酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內、外源谷氨酸、二氧化碳污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l還原型輔酶 0.15--0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II緩沖液 40--200mmol/l谷氨酸脫羧酶 1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 500--20000U/l蘋果酸脫氫酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III
緩沖液40--200mmol/l谷氨酸脫氫酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中，試劑III其中的成分，谷氨酸脫氫酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，就在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液(例如還可以是咪唑/鹽酸緩沖液6.2-7.8；磷酸氫二鈉 檸檬酸緩沖液5.0-8.0；檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液5.0-6.6；磷酸鹽緩沖液6.0-8.0；磷酸氫二鈉一磷酸二氫鉀緩沖液6.0-8.0；磷酸二氫鉀 氫氧化鈉緩沖液6.0-8.0；巴比妥鈉-鹽酸緩沖液6.8-9.6；Tris鹽酸緩沖液7.0-9.0；硼酸 硼砂緩沖液7.4-9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液8.6-10.6；砂-氫氧化鈉緩沖液9.2-10.0；碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在時不得使用)；PBS緩沖液7.0-7.6等)。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上，還可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、丁二酸鹽等中選擇。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發(fā)明血氨診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l2-酮戊二酸酯 6--30mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2--8mmol/l谷氨酸脫氫酶 6000--10000U/l谷氨酸脫羧酶 6000--10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000--8000U/l蘋果酸脫氫酶 6000--10000U/l穩(wěn)定劑20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內、外源谷氨酸、二氧化碳的污染，消除內、外源谷氨酸、二氧化碳的作用發(fā)生在整個反應時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內、外源谷氨酸、二氧化碳已經被消耗殆盡，而在后半段時間測試血氨含量所需要的谷氨酸、二氧化碳都是產生于血氨的含量。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的血氨診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l2-酮戊二酸酯 6mmol/l還原型輔酶0.2mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l谷氨酸脫氫酶 6000U/l谷氨酸脫羧酶 6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000U/l蘋果酸脫氫酶 6000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
本實施例應用谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法。氨、2-酮戊二酸酯與還原型輔酶通過谷氨酸脫氫酶的作用，產生谷氨酸，谷氨酸通過谷氨酸脫羧酶催化產生二氧化碳，二氧化碳再和磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下產生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性大小。
實施例二(雙劑)本實施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l2-酮戊二酸酯 18mmol/l還原型輔酶0.25mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l谷氨酸脫羧酶 8000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶5000U/l蘋果酸脫氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)
試劑II緩沖液100mmol/l谷氨酸脫氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測定血氨含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的血氨診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l2-酮戊二酸酯 30mmol/l還原型輔酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l
穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l谷氨酸脫羧酶 10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l蘋果酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l谷氨酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l2-酮戊二酸酯 10mmol/l還原型輔酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 3mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液100mmol/l谷氨酸脫氫酶 6000U/l谷氨酸脫羧酶 6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l蘋果酸脫氫酶 6000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的污染。
權利要求
1.一種測定血氨含量的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的幅度，測算出血氨的含量。
2.根據權利要求1所述測定血氨含量的方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出血氨的含量。
3.根據權利要求1或2所述測定血氨含量的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據權利要求1或2所述測定血氨含量的方法，其特征在于被測樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種血氨診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯1--50mmol/l還原型輔酶 0.15--0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸1--10mmol/l谷氨酸脫氫酶1000--50000U/l谷氨酸脫羧酶1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 500--20000U/l蘋果酸脫氫酶1000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據權利要求2所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據權利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據權利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據權利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定血氨含量的方法，同時本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩沖液、2－酮戊二酸酯、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出血氨的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1778946SQ200410065558
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司